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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Sortierung
von Partikeln nach deren Magnetisierbarkeit.
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Aus
dem Artikel „Design of Integrated Microfluidic
Device for Sorting Magnetic Beads in Biological Assays" von
Tondra et. al. in IEEE Transactions an Magnetics Vol 37, No. 4 July
2001 Seite 2621–2623 ist ein Verfahren und eine
Vorrichtung bekannt, mit denen Partikel nach ihrer Magnetisierbarkeit
getrennt werden können. Dabei wird eine Flüssigkeit,
die magnetisierbare Teilchen enthält, durch einen Kanal
geleitet, in dem ein Magnetfeld durch Spulen induziert wird. Dadurch
verteilen sich die Partikel nach ihrer Magnetisierbarkeit entlang
des Magnetfeldgradienten innerhalb des Querschnittes der Strömung.
Die Strömung wird nach Durchlaufen des Magnetfeldgradienten
in zwei Teilströme aufgeteilt, die Partikel verschiedener
Magnetisierbarkeit entsprechend der Verteilung der Partikel im Magnetfeldgradienten
enthalten. Dadurch wird eine Separation bewirkt.
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Das
Verfahren und die Vorrichtung nach dem Stand der Technik führt
zu einer groben Trennung der Partikel nach der Magnetisierbarkeit,
so dass für eine feinere Trennung mehrere Durchlaufe erforderlich sind.
Die Herstellung der Vorrichtung ist aufwendig und teuer, da Leiterbahnen
integriert werden müssen.
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Es
ist daher die Aufgabe der Erfindung ein Verfahren und eine Vorrichtung
zu schaffen, die eine größere Auflösung
der Trennung von technisch monodispersen Partikeln verschiedener
Magnetisierbarkeit ermöglichen. Die Vorrichtung soll weniger
aufwendig und billiger herzustellen sein.
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Ausgehend
vom Oberbegriff des Anspruch 1 wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst
mit den im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Markmalen.
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Die
erfindungsgemäße Vorrichtung ist einfach herzustellen
und arbeitet in einem Durchgang. Mit dem erfindungsgemäßen
Verfahren können magnetisierbare Partikel sehr genau mit
großer Auflösung getrennt werden. Auf Wiederholungsdurchläufe kann
verzichtet werden.
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Die
Figuren zeigen die Erfindung in schematischer Form.
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Es
zeigt:
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1:
Eine erfindungsgemäße Vorrichtung.
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2:
Einen beispielhaften zeitlichen Verlauf einer Dreiecksfunktion nach
der die Stärke eines homogenen von außen angelegten
Magnetfeldes geändert wird.
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3:
Ausschnitt aus dem Kanal bei maximaler und kleiner Magnetfeldstärke.
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In 1 ist
die erfindungsgemäße Vorrichtung mit einem Kanal 1 dargestellt,
durch den eine mit magnetisierbaren Partikeln 2 gefüllte
Flüssigkeit geleitet wird. Der Kanal 1 hat eine
rechteckige Querschnittsgeometrie mit den Seiten a, b, c und d.
Die Seite a ist auf der Innenseite des Kanals 1 mit magnetischen
oder magnetisierbaren Bereichen 3 beaufschlagt. Die Seiten
a und b des Kanals 1 befinden sich zwischen Mitteln zur
Erzeugung eines homogenen Magnetfeldes 4, welche im Innenraum
des Kanals 1 ein homogenes Magnetfeld erzeugen. Bezugszeichen 5 bezeichnet
einen Probenzugeber. Durch die Pfeile 6 wird die Flussrichtung
einer Flüssigkeit angegeben.
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2 zeigt
einen möglichen zeitlichen Verlauf des sich ändernden äußeren
Magnetfeldes. In ihr ist t die Abszisse und die Magnetfeldstärke
die Ordinate. Die Skalen für die Zeit t und die Magnetfeldstärke
sind dimensionslos angegeben.
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3 zeigt
einen Ausschnitt aus dem Kanal, bei dem gleiche Merkmale dieselben
Bezugszeichen haben. Auf der linken Seite haften alle magnetisierten Partikel 2,
entsprechend einem starken Magnetfeld, an den magnetisierten oder
magnetischen Bereichen 3 an. Auf der rechten Seite haftet
nur ein Teil der Partikel 2, entsprechend einem niedrigeren
Magnetfeld, an den magnetischen oder magnetisierbaren Bereichen 3 an.
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Im
Folgenden soll die Erfindung in ihrer allgemeinen Form beschrieben
werden.
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Erfindungsgemäß findet
eine Trennung von Partikeln 2 in einer Flüssigkeit
nach ihrer Magnetisierbarkeit statt.
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Hierzu
durchströmt eine Flüssigkeit, welche magnetisierbare
Partikel enthält, einen Kanal 1.
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Der
Kanal 1 besteht erfindungsgemäß aus einem
nicht magnetisierbaren Material.
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Als
nicht magnetisierbare Materialien kommen beispielsweise Kunststoffe,
Glas, nicht magnetisierbare Metalle, wie Aluminium oder Kupfer,
in Frage.
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Der
Kanal 1 wird in ein homogenes Magnetfeld eingebracht, welches
von Mitteln zum Erzeugen eines Magnetfeldes 4 erzeugt wird.
Bei einem homogenen Magnetfeld im Sinne der Erfindung handelt es sich
um ein technisch homogenes Feld.
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Die
Mittel zur Erzeugung eines homogenen Magnetfeldes können
beispielsweise mindestens eine Spule, insbesondere eine Helmholtzspule
sein.
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Der
Kanal 1 kann grundsätzlich jede beliebige Querschnittsgeometrie
aufweisen.
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Besonders
bevorzugt ist eine rechteckige Querschnittsgeometrie mit den Seiten
a, b, c und d, die diese einen Ausschnitt mit einem möglichst
homogenen Magnetfeld ermöglicht und besonders einfach herzustellen
ist.
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Die
rechteckige Querschnittsgeometrie kann quadratisch oder in eine
Richtung gestreckt sein, so dass beispielsweise die Seiten a und
b, die vorzugsweise senkrecht zum von außen angelegten
Magnetfeld verlaufen und länger sind als die Seiten c und
d, die parallel zum Magnetfeld verlaufen.
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Für
den Querschnitt des Kanals 1 ist auch eine Kreisgeometrie,
beispielsweise in Form einer Kapillare, oder eine andere Geometrie
möglich.
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Der
Durchmesser des Kanals 1 oder die Länge einer
der Seiten a und b oder c und d, kann zwischen 1 μm bis
1 mm liegen.
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Bei
diesen Abmessungen des Durchmessers oder der Seitenlängen
können Flüssigkeitsströme aufrechterhalten
werden, die laminare Strömungsverhältnisse aufweisen.
Diese Querschnitte ermöglichen auch ein Innenvolumen des
Kanals 1 in dem ein sehr homogenes Magnetfeld aufrechterhalten
werden kann.
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Insbesondere
für industrielle Anwendungen sind jedoch auch andere, größere
Kanalquerschnitte bzw. Kanalabmessungen möglich.
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Erfindungsgemäß umfasst
mindestens eine Seite des Querschnitts des Kanals 1 mindestens
in einem Teilbereich magnetische oder magnetisierbare Bereiche 3,
die ein Anhaften von im Magnetfeld magnetisierten Partikel 2,
die sich in der Flüssigkeit befinden ermöglichen,
wenn das äußere Magnetfeld auf den Flüssigkeitsstrom 6 einwirkt.
Die magnetischen oder magnetisierbaren Bereiche 3 dienen
dazu, das von außen angelegte homogene Magnetfeld zu konzentrieren.
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Die
magnetischen oder magnetisierbaren Bereiche 3 können
auf die Innenseite des Kanals 1 oder auf die Außenseite
des Kanals 1 aufgebracht sein oder in das Material des
Kanals 1 eingelagert sein.
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Die
magnetischen oder magnetisierbaren Bereiche 3 können
aus Schichten bestehen, die auf die Oberflächen der Innenseite
oder der Außenseite des Kanals 1 aufgebracht werden
oder aus Schichten, die als Bereiche in das Material des Kanals 1 eingelagert
werden.
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Als
Schicht oder Bereich 3 im Sinne der magnetischen oder magnetisierbaren
Bereiche 3 können auch körnige Strukturen
verstanden werden, welche einzeln, oder in einer Ansammlung magnetische
oder magnetisierbare Bereiche bilden.
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Die
magnetischen oder magnetisierbaren Bereiche 3 bilden Strukturen
aus, deren Projektion auf die Oberfläche einer Seite des
Kanals 1 ein Muster abbildet, welches keine durchgehende
Fläche darstellt.
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Die
Projektionen der magnetischen oder magnetisierbaren Bereiche 3 auf
die Oberfläche einer Seite des Kanals 1 kann punktförmig
sein oder Linien bzw. gekrümmte Strukturen oder Gitterstrukturen ausbilden.
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Die
Projektion der magnetischen oder magnetisierbaren Bereiche 3 auf
die Oberfläche einer Seite des Kanals 1 muss für
eine gute Trennung der magnetisierbaren Partikel 2 eine
Größe aufweisen, die größer
ist als die zu trennenden Teilchen.
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Typische
Größen für die Abmessung der magnetischen
oder magnetisierbaren Bereiche 3 liegen zwischen 100 nm–10 μm.
Die Größe bzw. der Durchmesser der magnetisierbaren
oder magnetischen Bereiche 3 kann beispielsweise zwischen
100 nm und 5 μm, vorzugsweise zwischen 100 nm und 2 μm, liegen.
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Vorzugsweise
bilden die magnetischen oder magnetisierbaren Bereiche 3 punktförmige
oder im Wesentlichen punktförmige Projektionen auf die Oberfläche
einer Seite des Kanals 1 aus.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform befinden sich die magnetischen
oder magnetisierbaren Bereiche 3 nur in einem Teilabschnitt
der Kanallänge, besonders bevorzugt nur an der Stelle des
Kanals 1 an der das Magnetfeld homogen ist, so dass der
Kanal 1 nicht über die gesamte Länge
mit magnetischen oder magnetisierbaren Bereichen 3 versehen
ist. Dies hat den Vorteil, dass eine Separation nur an den Stellen
des Kanals 1 erfolgt, an denen eine möglichst genaue
Separation möglich ist.
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Als
permanentmagnetische Bereiche 3 kommen beispielsweise Eisenpartikel
in Betracht.
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Magnetisierbare
Bereiche 3 können beispielsweise aus Magnetit
(Fe3O4) bestehen.
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Besonders
einfach ist die Beaufschlagung der Innenwand oder eines Teils der
Innenwand des Kanals 1 mit Ferrofluiden, die zum Beispiel
mit Stempeltechniken auf die Innenoberfläche des Kanals 1 aufgetragen
werden oder die photolithographische Herstellung einer strukturierten
magnetisierbaren Schicht. Dieses Verfahren ist besonders gut bei
Kanälen 1 zu praktizieren, welche eine rechteckige Querschnittesgeometrie
haben, da dort auf die Innenseite mindestens einer Seite Ferrofluide
durch Stempeltechnik aufgetragen werden können. In dieser einfachen
Herstellbarkeit der Beaufschlagung der Innenseite des Kanals 1 liegt
weiterhin der Vorteil eines Kanals einer rechteckigen Querschnittsgeometrie.
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Die
sich auf der Innenseite des Kanals 1 befindenden magnetischen
oder magnetisierbaren Bereiche 3 befinden sich mindestens
auf einer der Seiten a, b, c oder d oder in einem Teilbereich des
Kanals 1 einer anderen Querschnittsgeometrie. Bei einer
Kreisgeometrie können sich die Partikel 2 entweder über
den gesamten Kreisumfang oder mindestens einen Winkelbereich verteilen.
Gleiches gilt für andere Geometrien, die von der exakten
Kreisform abweichen. Vorzugsweise sind die magnetischen oder magnetisierbaren
Bereiche 3 über die gesamte Breite mindestens
einer der Seiten a, b, c und/oder d verteilt.
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Bei
einem rechteckigen Kanalquerschnitt oder bei einem Kanalquerschnitts
in Form eines Parallelogramms befinden sich die magnetischen oder magnetisierbaren
Bereiche 3 vorzugsweise auf den Seiten a und/oder b, die
senkrecht zu den Feldlinien des von außen angelegten Magnetfeldes
verläuft. Damit tritt das Magnetfeld in eine mit magnetischen oder
magnetisierbaren Bereichen 3 beaufschlagte Fläche
ein, die die Magnetlinien auf Grund der permanentmagnetischen Eigenschaften
oder der Magnetisierbarkeit der Bereiche 3, beispielsweise
in Punkten, bündeln.
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Die
zu trennenden magnetisierbaren Partikel 2 können
unterschiedliche Größen besitzen. So können
die Partikel 2 eine Größe von 100 nm
bis 5 μm aufweisen.
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Als
Flüssigkeit, welche die voneinander zu trennenden Partikel 2 beinhaltet,
kommen alle möglichen Flüssigkeiten in Betracht.
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Als
Flüssigkeiten, die zu trennende magnetisierbare Partikel 2 enthalten,
können beispielhaft aber nicht beschränkend Wasser,
physiologische Lösungen, Pufferlösungen, Flüssigkeiten,
welche biologischen Ursprungs sind, oder Öle, genannt werden.
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Die
Flüssigkeit kann den Kanal 1 mit einer Geschwindigkeit
von beispielsweise 50 μm/min bis 1 m/min durchströmen.
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Das
zur Separation herangezogene Magnetfeld wird erfindungsgemäß zeitlich
in seiner Feldstärke variiert.
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Das
sich zeitlich ändernde Magnetfeld kann von niedrigeren
zu höheren Magnedfeldstärken hin ansteigen oder
von höheren zu niedrigeren abnehmen.
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Vorzugsweise
ist die zeitliche Veränderung aus Gründen der
Einfachheit linear und nimmt gleichförmig zu oder ab.
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In
einer vorteilhaften Ausführungsform ändert sich
die Magnetfeldstärke, indem sie zunimmt und abnimmt, bevorzugt
periodisch zunimmt und abnimmt. Beispiele für lineare Verläufe
sind Dreiecks- oder Sägezahnkurven, bei denen das Magnetfeld
alternierend stärker oder schwacher wird.
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Es
sind auch andere zeitliche Muster der Magnetfeldänderung,
wie beispielsweise eine Sinusform möglich.
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Ein
alternierendes Zunehmen und Abnehmen des von außen angelegten
Magnetfeldes hat den Vorteil, dass die Auflösung der Trennung
durch die Wiederholung erhöht wird. Weiterhin wird eine unspezifische
Adsorption von Partikeln 2 minimiert, die dadurch zu Stande
kommt, dass Partikel 2, welche durch die auf sie einwirkende
Kraft des Magnetfeldes an die Oberfläche einer Seite des
Kanals 1 gedrückt werden, an der Innenwand der
Kanals 1 anhaften und dort verbleiben.
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Das
zur Separation der magnetisierbaren Partikel 2 herangezogene
Magnetfeld kann eine Feldstärke von beispielsweise 10–9 Tesla bis 10–1 Tesla
bezüglich der Minimal- und Maximalwerte haben. Bevorzugt
sind insbesondere 10–3–10–1 Tesla für beispielsweise
1 μm große Partikel.
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Für
die Separation wird eine Flüssigkeit durch den Kanal 1 durch
das sich zeitlich ändernde Magnetfeld geleitet. Über
einen Probenzugeber 5 können die zu trennenden
Partikel 2 an einer Eingabestelle entweder als Feststoffpulver
oder in einer Flüssigkeit suspendiert eingegeben werden,
so dass Teilabschnitte des Flüssigkeitsvolumenstroms die
zu trennenden Partikel 2 beinhalten. Bei einer die Partikel
enthaltenden Flüssigkeit, die zugegeben wird, kann es sich
um die gleiche Flüssigkeit handeln die durch den Kanal 1 strömt
und keine Partikel 2 beinhaltet, also beispielsweise Wasser
als die den Kanal 1 durchströmende Flüssigkeit
und Wasser, welches die Partikel 2 enthält als
die durch den Probenzugeber 5 hinzugefügte Flüssigkeit.
Alternativ kann die durch den Probenzugeber 5 zugegebene
Flüssigkeit, welche die Partikel 2 enthält,
auch eine andere Flüssigkeit als diejenige sein, die den
Kanal 1 durchströmt. Beispielsweise kann durch
den Kanal 1 Wasser strömen und durch den Probenzugeber
eine mit Partikeln 2 beladene Flüssigkeitsmenge
physiologische Kochsalzlösung eingeführt werden.
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Bezeichnet
man die den Kanal 1 durchströmende Flüssigkeit
als Transportflüssigkeit und die Flüssigkeit in
der sich die Partikel 2 befinden als Probenflüssigkeit,
so können Transport- und Probenflüssigkeit gleich
oder verschieden sein. Damit kann die Zusammensetzung des Puffers
geändert werden. Die Flüssigkeiten sollten die
Partikel 2 vorzugsweise nicht auflösen. Daher
können die Flüssigkeiten je nach Beschaffenheit
der Partikel unterschiedliche Stoffe sein. Beispielsweise Wasser,
polare Lösungsmittel, unpolare Lösungsmittel,
polarisierbare Lösungsmittel, organische Lösungsmittel
oder Öle.
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Durchlauft
das mit Partikeln 2 beladene Volumenelement des Flüssigkeitsstroms 6 das
sich zeitlich ändernde Magnetfeld, so bleiben beispielsweise die
leicht magnetisierbaren Partikel in der Phase der kleinen Magnetfeldstärke
an den magnetischen oder magnetisierbaren Bereichen 3 hängen,
während die schwer magnetisierbaren Partikel 2 durch
die hydrodynamischen Kräfte des Flüssigkeitsstroms
weitergeleitet werden. Die magnetischen Anziehungskräfte werden
von den hydrodynamischen Kräften dominiert. Durch Steigerung
des Magnetfeldes findet so eine Separation nach Magnetisierbarkeit
statt.
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Das
Volumenelement, des Flüssigkeitsstroms, welches die zu
trennenden Partikel 2 trägt, wird dadurch räumlich
auseinander gezogen, so dass die verschiedenen resultierenden Fraktionen unterschiedlicher
Magnetisierbarkeit nach freiem Belieben abgetrennt werden können.
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Dies
kann beispielsweise durch nacheinander erfolgendes Auffangen der
Fraktionen erfolgen.
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Beispiel:
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Periodische
magnetische Punktmuster, welche z. B. durch Mikrokontaktprinting
oder anderen Mikrofabrikationsverfahren auf die innere Fläche
eines Mikrokanals erzeugt werden, konzentrieren ein extern angelegtes
homogenes Magnetfeld. Das lokale Feld nahe den Punkten (Nahfeld)
ist dabei inhomogen und zieht daher magnetisierbare Partikel 2 an.
Im Fernfeld hingegen bleibt das Feld homogen und orientiert lediglich
die Partikel 2 ohne sie zu bewegen. Bei Hinzuschalten einer
präzise kontrollierten Strömung werden die Partikel 2 entlang
des Mikrokanals – besonders einfach realisierbar in Mikrofluidsystemen – mitgeführt.
Das externe homogene Magnetfeld wird nun angelegt und durch eine
Dreiecksfunktion moduliert. Wenn das linear ansteigende Feld ausreichend
stark wird, werden die Partikel auf den Punkten zurückgehalten.
Bei abfallender Flanke lösen sich die Partikel 2 erst
wieder, wenn das Feld ausreichend schwach geworden ist. Diese zeitliche
begrenzte Immobilisierung verzögert die in der Strömung
transportierte Partikel 2 größerer Suszeptibilität
mehr, als kleinerer Suszeptibilität, wodurch ein Sortiereffekt
erreicht wird. Da der Effekt kumulativ ist, wird die Separation
mit jeder Periode immer besser. Dieses Verfahren kann problemlos
hockskaliert werden, wodurch es für industrielle Anwendungen
interessant wird. Erforderlich ist jedoch, dass die Partikel 2 monodispers
bezüglich Größe und Form sind, da der
Separationsparameter das Verhältnis der magnetischen Kraft
zum hydrodynamischen Widerstand des Partikels 2 ist.
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Das
erfindungsgemäße Hochdurchsatz-Sortiersystem kann
für Hersteller von Nano- und Mikropartikel verwendet werden.
Mit gut charakterisierten magnetischen Partikeln 2 kann
dieses System auch dazu verwendet werden Zellen oder Organellen
nach Größe zu sortieren.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- - „Design
of Integrated Microfluidic Device for Sorting Magnetic Beads in
Biological Assays” von Tondra et. al. in IEEE Transactions
an Magnetics Vol 37, No. 4 July 2001 Seite 2621–2623 [0002]