CN111263662A - 利用磁性颗粒使生物分子固定化的装置和方法 - Google Patents

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本发明涉及借助磁性颗粒(4)使生物分子可逆固定化的装置，其中所述装置(1)包括可被含有生物分子的液体填充的容器(5，51)和磁铁(3)。所述磁铁(3)这样布置在所述容器(5，51)处，以使得可在所述容器(5，51)中排列且所述生物分子可在其上固定化、特别是可逆固定化的磁性颗粒(4)可被固定在所述容器(5，51)中。可通过所述磁铁(3)的布置产生作用于位于所述容器(5，51)中的磁性颗粒(4)的不均匀磁场，以使得所述磁性颗粒(4)由于所述不均匀磁场的影响结构化排列。

Description

利用磁性颗粒使生物分子固定化的装置和方法
本发明涉及根据独立权利要求1的前序部分所述的使生物分子可逆固定化的装置。本发明进一步涉及根据独立权利要求13的前序部分所述的使生物分子可逆固定化的方法。本发明进一步涉及根据独立权利要求15的前序部分所述的包括使生物分子可逆固定化的装置的对生物分子进行自动化处理的设备。
现有技术已知多种纯化DNA和其他生物分子的方法。纯化的一种类型是DNA提取，其中DNA在非极性环境中沉淀。DNA还可通过例如在细胞破碎后离心或电泳法来纯化。
生物分子还可通过在不可溶载体上固定化来合成和纯化。用于使生物分子固定化的常见基材是玻璃以及其他较不常见的基材，诸如金、铂、氧化物、半导体和各种聚合物基材。
因为人工纯化和处理在众多操作时需要过多时间，所以当今的方法是全自动化的。因此所谓的“磁珠(magnetic beats)”(磁性颗粒)在实验室方法的自动化中起重要作用。“基于磁珠的纯化”和“基于磁珠的标准化”是广泛使用的对核酸进行固定化、纯化和浓度调节的方法。这些方法的典型应用领域是在DNA测序或DNA检测(例如借助PCR、即聚合酶链式反应)情形下的样品制备。
在现有技术中，通常用围绕容器的环形磁铁将磁性颗粒保持在容器中。由此含有杂质的溶液可被吸取，而带有结合的生物分子的磁性颗粒保留在容器中。
Whitehead研究所在1995年开发了磁性颗粒(磁珠)用于纯化PCR产物。磁性颗粒大部分是顺磁性的，并且可例如由涂布有铁的聚苯乙烯组成。然后，具有羧基的不同分子可安置在铁上。这些羧基可以可逆结合DNA分子。由此，DNA分子被固定化。
利用磁性颗粒的方法通常包括以下步骤。首先，PCR产物被结合至磁性颗粒。随后，带有附着的PCR产物的磁性颗粒与杂质分离(该步骤例如通过从固体上吸取溶液来实现)。然后，洗涤带有附着的PCR产物的磁性颗粒。在洗涤后，将PCR产物从磁性颗粒上洗脱并转移至新平板。
在全自动化方法中，在原材料已被引入分离过程中之后，所需试剂被自动吸移至样品并借助移液管尖再次移除。结合磁性颗粒的核酸在腔体的底部和边缘处集中，并且取决于程序通过优化的吸出和吸取再次溶解。最后，DNA或RNA被洗脱至带盖的单独的容器中以直接存储或进一步应用。
现有技术中也已知吸附法，其中例如在微酸性环境中DNA结合至硅胶。
生物分子的合成、标准化和纯化的最重要的方法之一是利用磁性颗粒的方法。在此生物分子结合至磁性颗粒的表面。然后，借助磁铁使磁性颗粒固定，并且副产物和杂质存在于其中的溶液可被容易地分离出。因此可简单且快速地纯化并分离生物分子。磁性小球的优点在于，小球可在试验批料中自由移动，这对于结合步骤而言是重要的。例如，如果想要在洗涤步骤中将液体从容器中移除，简单地将磁铁保持在容器处和然后可分离出液体。
磁性颗粒（也称为磁珠）是小型的顺磁性或铁磁性小球，被涂布有使其获得所需性质的不同材料。通常使用涂布有塑料的镍颗粒。
例如，DNA探针和基因也可在自动化固相法中合成。正如多肽，DNA链可通过将活化单体顺序连接到结合至不可溶基质(磁性颗粒)的生长的链上来合成。在此可将受保护的亚磷酰胺用作活化单体。
这种程序允许以极佳的产率分离高纯生物分子。此外，磁性颗粒分离的基础方法可在所用提取容器的腔体中全自动化进行。
在全自动化方法中，在原材料已被引入分离过程中之后，所需试剂被自动吸移至样品并借助例如移液管再次移除。结合磁性颗粒的核酸在腔体的底部和边缘处集中，并且取决于程序通过优化的吸出和吸取再次溶解。最后，DNA或RNA被洗脱至带盖的单独的容器中以直接存储或进一步应用。
在现有技术中，通常用围绕容器的环形磁铁将磁性颗粒保持在容器中。由此，磁性颗粒在内部容器中环形排列。
现有技术的显著缺点是由于使用环形磁铁，容器中的磁性颗粒也成环排列。这不仅使液体更难以被移除，而且在固体环上还总是保留不能被移除的液体残留物。液体的不完全移除降低了纯化效率并减少了洗脱后的可用体积。
因此，本发明的目的在于提供避免现有技术中已知的不利效果的使生物分子固定化的装置、使生物分子可逆固定化的方法以及包括使生物分子固定化的装置的对生物分子进行自动化处理的设备。
这一目的通过具有独立权利要求1的特征的使生物分子可逆固定化的装置、具有独立权利要求13的特征的使生物分子可逆固定化的方法、以及具有独立权利要求15的特征的包括使可逆固定化的装置的对生物分子进行自动化处理的设备来实现。
根据本发明，提出了一种借助磁性颗粒使生物分子可逆固定化的装置。这种装置包括可被含有生物分子的液体填充的容器和磁铁。磁铁这样布置在容器处，以使得可在容器中排列且生物分子可在其上固定化、特别是可逆固定化的磁性颗粒可被固定在容器中。可通过磁铁的布置产生作用于位于容器中的磁性颗粒的不均匀磁场。磁性颗粒由于不均匀磁场的影响可结构化排列。
对本发明重要的是通过磁铁的布置产生磁场中的不均匀性。因此，通过磁铁的布置产生作用于布置在容器中的磁性颗粒的不均匀磁场，以使得通过在不均匀磁场中磁性颗粒的结构化排列，液体可更容易地从磁性颗粒上流走。如果受不均匀磁场控制的磁性颗粒以孤立的岛排列在容器壁上，液体可容易在磁性颗粒之间流走，并且因此可从容器中更容易地移除液体。
在本发明的范围内，磁铁的布置可被理解为各种构型。磁铁的布置指的是产生作用于容器中磁性颗粒的这种不均匀磁场的功能，以使得磁性颗粒以根据本发明的结构排列在容器壁上。通过使磁铁的磁通密度转向，磁性颗粒在容器中这样排列使得液体可更容易流走并且可被更容易地移除。“根据本发明的结构”在此应理解为允许液体从容器中的磁性颗粒上更容易地流走的结构。因此，“根据本发明的结构”或“结构化排列” 可被理解为例如磁性颗粒以孤立的岛的排列，但是排列不限于此。磁性颗粒也可例如金字塔形或槽形排列。所有上文所描述的磁性颗粒在容器壁上的结构化排列允许液体可容易在磁性颗粒上或磁性颗粒之间流走。为了给出磁铁的布置的构型的实例，下文是磁铁的布置的不同可能性。在本发明的范围内，磁铁的布置可被理解为磁铁的特殊形状，其中该形状可指的是永磁铁的外部设计或电磁铁中线圈的绕组。此外，磁铁的布置可被理解为导磁模块，利用其磁通密度被改变并因此产生不均匀磁场。磁铁的布置也可被理解为多个磁铁以可预定距离(离容器的距离和磁铁彼此的距离)围绕容器布置，以使得不均匀磁场形式的所得磁场作用于容器中的磁性颗粒。在此，所得不均匀磁场在一些区域中较强地作用于磁性颗粒，并且在其他区域中较弱地作用于磁性颗粒。毫无疑问，在其他布置中有相同的效果，也是利用导磁模块和磁铁的形状，容器的一些区域中的磁场较强地作用于处于容器中的磁性颗粒。这些可能性在下文的描述以及附图的描述中更详细地被说明。还应再一次注意的是，结构化排列不意指现有技术已知的磁性颗粒的环形或类似排列。
磁铁也可这样可移动地布置在容器处，以使得磁性颗粒可在反应步骤期间在容器中自由移动，以及在洗涤步骤期间通过改变磁铁位置被固定在容器中。特别地，磁铁可为这样可移动的，以使得磁铁被布置在容器处的第一位置并固定磁性颗粒，并且通过移动磁铁至容器处或围绕容器的第二位置，磁性颗粒变得可移动。毫无疑问，例如在自动化装置中，容器也可相对于磁铁移动并实现相同的效果。
在本发明的范围内，术语生物分子应理解为DNA、RNA、核酸、蛋白、生物分子的起始序列、单体或其他生物活性分子。
在下文中，洗涤步骤一般而言是其中通过驱动阀使液体从容器中排出并且其中杂质从带有附着的生物分子的磁性颗粒分离出的方法步骤。洗涤步骤还可包括用洗涤溶液(水或其他)洗涤。
在下文中，反应步骤一般而言是其中结合至磁性颗粒的生物分子被转化、结合至颗粒或延长(链延长，例如PCR“聚合酶链式反应”)的方法步骤。
在下文中，杂质一般而言是未完全反应或未结合至磁性颗粒的物质、溶剂、副产物和污染物，以及上述中的两种或更多种的混合物。
在本发明的范围内，液体可为溶液，特别是生物分子和/或试剂和/或杂质的反应混合物。
在下文中，磁性颗粒（也是“磁珠”）一般而言可为微米或毫米范围内的颗粒。磁性颗粒也可为多孔的。在下文中，生物分子一般而言可经由巯基和/或氨基和/或羟基和/或羧基和/或羰基和/或酯基和/或腈基和/或胺基和/或任何其他官能团结合至磁性颗粒的表面。磁性颗粒还可为涂布的镍颗粒或者任何其他铁磁性或顺磁性颗粒。磁性颗粒通常具有约1微米的直径。在本发明的范围内，约1微米应理解为0.5至1.5微米、特别是0.7至1.3微米、尤其是0.9至1.1微米。
根据本发明的装置和根据本发明的方法的优点如下：
-由于更快的流走，过程时间短，
-高产率，
-更纯的产物，
-有效且成本有利的，
-可容易自动化的，
-也用于尺寸减小的装置，
-允许容易地改良现有机器，
-分离可被转换而不需移动可处理件(Disposable)(仅利用电磁铁)。
在实践中，所述装置和方法可用于连接后纯化。
根据本发明的装置的磁铁可被设计为永磁铁和/或电磁铁。在永磁铁中，形状影响磁场的均匀性，而电磁铁的均匀性可经由绕组决定。因此，永磁铁的形状可确保磁场不均匀到磁性颗粒受其影响而结构化排列的程度。结构化排列可例如指的是液体可良好地从其流走的多个空间上彼此分离的岛的排列。然而，如果使用电磁铁，通过部分地更密的绕组，可产生部分地更强的磁场，以使得也产生了其中磁性颗粒结构化排列的不均匀磁场。
磁铁的布置也可这样实施使得磁铁包括导磁模块，以使得由导磁模块产生作用于位于容器中的磁性颗粒的不均匀磁场。因此，导磁模块必须这样影响磁铁的磁场的场力线，以使得磁性颗粒以根据本发明的结构排列。出于这一目的，磁铁的磁场可通过导磁模块在容器的可预定位置处增强或减弱，以使得磁性颗粒在容器的增强区域中增多排列或在容器的减弱区域中减少排列。以这种方式，可在容器中产生具有增强或减弱的磁场的交替的子区域。也可想到导磁模块在可预定区域处增强磁铁的磁场，并在非增强区域处减弱磁场。还可调整磁铁的形状以使得磁场在容器的可预定区域处增强并在非增强区域处减弱。
另外，导磁模块可作为构件布置在磁铁上，或者导磁模块可被实施为磁铁的内置元件。因此，导磁模块可为磁铁的顶部结构(Aufsatz)，并且也是布置在容器与磁铁之间的元件。例如，在环形磁铁中，导磁模块可被布置为容器与磁铁之间更小的环，具有凹处或其他变形。
一般而言，导磁模块可被直接布置在磁铁上或处于离磁铁可预定的距离。通过导磁模块，磁铁的均匀磁场被转换成不均匀磁场。
导磁模块可被实施为磁性增强模块和/或抗磁性模块。磁铁的磁场通过磁性增强模块在容器的可预定区域中被增强，并且磁铁的磁场通过抗磁性模块在容器的可预定区域中减弱。抗磁性模块还可被设计为多个抗磁性盾，其这样布置在磁铁上以使得容器中磁铁的磁场部分地被屏蔽并因此减弱。
抗磁性模块在此由相对磁导率< 1的诸如石墨的抗磁性材料组成。磁性增强模块由相对磁导率> 1的铁磁性和/或顺磁性材料组成。典型的铁磁性材料是例如铁、镍和钴。典型的顺磁性材料是例如碱土金属。在本发明的实施方案中，还可使用抗磁性模块与磁性增强模块的混合物，其中模块具有不同的抗磁性和铁磁性/顺磁性子区域。
在实践中，磁铁的形状可适应于容器的形状，以使得容器可被引入导磁模块。毫无疑问，导磁模块的形状也可适应于容器。另外，磁铁可包括孔和/或隆起用以插入容器。导磁模块也可包括孔和/或隆起用以插入容器。
容器可以任何方式成形。在本发明的实施方案中，容器可为多孔板，其中多孔板具有多个凹槽。特别地，多孔板也可为微量滴定板。特别有利地，容器还可包括毛细管，其中含有磁性颗粒的液体通过毛细力保持和/或液体通过压力被移除。
磁铁可布置在多孔板的多个凹槽处。以这种方式，磁性颗粒可同时被固定在多个凹槽中。
磁铁的布置也可被这样实施，使得第二磁铁这样布置在该磁铁上，使得磁铁的第一磁场可受第二磁铁的第二磁场影响，以使得产生作用于位于容器中的磁性颗粒的不均匀磁场。如果多个永磁铁被用作第二磁铁，永磁铁可这样被布置在磁铁上以使得磁铁的磁场在一些位置处被减弱和/或增强。电磁铁也可被用作第二磁铁，其利用其第二磁场以所需方式使磁铁的磁场不均匀。
在本发明的实施方案中，磁铁的布置也可被这样实施使得磁铁具有一个或多个切口，以使得不均匀磁场由磁铁的切口产生。在磁铁切口的位置处，在容器中产生较弱的磁场，以使得较少或无磁性颗粒在切口的位置处集中。
在实践中，装置可包括用于移除液体的仪器，以使得在使生物分子固定化在磁性颗粒的表面上之后可从容器中移除液体。用于移除液体的仪器可以特别是移液管、阀、压缩空气或另一种合适的仪器。
根据本发明，进一步提出了使生物分子可逆固定化的方法。在此，该方法包括以下步骤。首先，将磁性颗粒和含有生物分子的液体布置在容器中。然后，使生物分子结合、特别地可逆结合至磁性颗粒。
在由磁铁的布置所产生的不均匀磁场中，带有已固定化的生物分子的磁性颗粒被固定在容器中，以使得磁性颗粒结构化排列。随后，利用移除液体的仪器来移除液体，其中通过磁性颗粒的结构化排列，液体从磁性颗粒上流走，以使得无或仅少的液体残留物保留在容器中和磁性颗粒上。结合至磁性颗粒的生物分子可从磁性颗粒的表面脱离并且然后被进一步使用。
上述方法优选利用根据本发明的装置来进行。
根据本发明，还提出了包括根据本发明的装置的对生物分子进行自动化处理的设备。例如，在对生物分子进行自动化处理的设备中，可进行根据本发明的方法。这种设备的优点在于，可将含有生物分子的液体和磁性颗粒通过合适的元件引导至容器中以及从容器中移除。另外，任选可改变容器处的磁铁位置，用以例如将磁性颗粒从容器中移除。在对生物分子进行自动化处理的设备中，多孔板通常被用作容器。
在下文中，参考附图，借助实施例更详细地说明本发明和现有技术。
图1是具有多孔板和导磁模块的使生物分子可逆固定化的装置的示意性图示，
图2是磁铁和导磁模块的不同形状的示意性图示，
图3是使生物分子可逆固定化的装置的另一个实施例的示意性图示，
图4是具有王冠形导磁模块的磁铁的示意性图示，
图5是现有技术与本发明相比的俯视图、以及本发明的实施方案的侧视图的示意性图示，
图6是具有作为磁性增强模块和抗磁性模块的导磁模块的环形磁铁的示意性图示。
图1示出具有多孔板51和导磁模块2的使生物分子可逆固定化的装置1的示意性图示。在所示装置1中，磁铁3的布置被实施有导磁模块2。导磁模块2作为顶部结构这样布置在磁铁3上，以使得模块2位于磁铁3与多孔板51的凹槽50之间。
由于上述具有导磁模块2的磁铁3的布置，磁性颗粒4结构化排列在容器中。在操作状态下，在使生物分子在磁性颗粒的表面上固定化之后，可利用移除液体的仪器(在此未示出)将液体移除，并且液体可容易在结构化排列的磁性颗粒之间流走。
图2示出磁铁3和导磁模块2的不种形状的示意性图示。例如，磁铁3可被设计为王冠形磁铁201、波形磁铁202和锯齿状磁铁203。毫无疑问，导磁模块也可设计为王冠形、波形或具有切口。由于王冠形，磁性颗粒以多个孤立的岛排列。磁性颗粒的岛数对应于王冠的齿数。在波形中，磁性颗粒也将这样排列。然而，在切口的情况下，磁性颗粒以两个孤立的岛排列。
图3示出使生物分子可逆固定化的装置1的另一个实施例的示意性图示。示出其中填充了含有生物分子的液体6的容器5。
在操作状态下，生物分子将被固定化在磁性颗粒(在此未示出)的表面上。随后，将从容器中移除液体6。
此外，图3示出了具有导磁模块2的磁铁3可布置在容器处。在此，导磁模块2被实施为王冠形顶部结构。替代地，王冠形磁铁201也可被布置在容器处。所示的两种布置具有适应于容器5的形状的形状，以使得容器可部分引入磁铁或导磁模块。
图4示出具有王冠形导磁模块2的磁铁的示意性图示。在此，导磁模块2被设计为磁铁3的顶部结构。导磁模块2具有孔20，容器可插入孔20以紧固。
图5示出现有技术A与本发明B相比的容器5的俯视图以及本发明的实施方案C的容器5的侧视图的示意性图示。
在现有技术A中，通过磁铁的均匀磁场，磁性颗粒4成环排列在容器5的边缘处。在移除时液体保留在该环上，因为液体不能流走。
在本发明B中，通过磁铁的不均匀磁场，磁性颗粒4结构化排列在容器壁上。通过如此处所示的磁性颗粒4以多个孤立的岛的排列，液体可容易在磁性颗粒4之间流走。
在图5的C部分中，示出了磁性颗粒4在根据本发明的不均匀磁场中在容器5的容器壁上的排列可能性的三个实施例。示出了以多个略圆的岛的排列，以及磁性颗粒4的槽形和金字塔形排列。所有这些排列仅为示例性而非限制性的。仅应指出相异的可能性。在根据本发明的不均匀磁场中，毫无疑问，磁性颗粒可以允许液体简化流走的任何合适的结构排列。
图6示出具有作为磁性增强模块和抗磁性模块的导磁模块2的环形磁铁3的示意性图示。
在图6的A部分中，导磁模块2是磁性增强模块。磁性增强模块被设计为环形磁铁3的插入件，并且被布置在环形磁铁3与容器5之间。由于磁性增强模块，环形磁铁3的磁场在不具有间隙23的区域中被更多地增强，并因此变得不均匀。因此，磁性颗粒5结构化排列在容器5的壁上介于间隙23之间。
在图6的B部分中，导磁模块2是抗磁性模块。抗磁性模块被设计为环形磁铁3的插入件，并且被布置在环形磁铁3与容器5之间。由于抗磁性模块，环形磁铁3的磁场在不具有间隙23的区域中被更强地减弱，并因此变得不均匀。因此，磁性颗粒5结构化排列在容器5的壁上在间隙23中。

Claims (15)

1.借助磁性颗粒(4)使生物分子可逆固定化的装置(1)，其中所述装置(1)包括可被含有生物分子的液体填充的容器(5，51)和磁铁(3)，其中所述磁铁(3)这样布置在所述容器(5，51)处，以使得可在所述容器(5，51)中排列且所述生物分子可在其上固定化、特别是可逆固定化的磁性颗粒(4)可被固定在所述容器(5，51)中，
其特征在于，
可通过所述磁铁(3)的布置产生作用于位于所述容器(5，51)中的磁性颗粒(4)的不均匀磁场，以使得所述磁性颗粒(4)可由于所述不均匀磁场的影响结构化排列。
2.根据权利要求1所述的装置(1)，其中这样实施所述磁铁(3)的布置，使得所述磁铁(3)包括导磁模块(2)，从而使得可由所述导磁模块(2)产生作用于位于所述容器中的磁性颗粒的不均匀磁场。
3.根据权利要求2所述的装置(1)，其中所述导磁模块(2)作为构件布置在所述磁铁(3)上，或所述导磁模块(2)被实施为所述磁铁(3)的内置元件。
4.根据权利要求2或3所述的装置(1)，其中所述导磁模块(2)是磁性增强模块(21)和/或抗磁性模块(22)。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的装置(1)，其中所述磁铁(3)的形状适应于所述容器(5，51)的形状，以使得所述容器(5，51)可被引入所述导磁模块(2)。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的装置(1)，其中所述容器(5)是多孔板，并且所述多孔板具有多个凹槽。
7.根据权利要求6所述的装置(1)，其中磁铁(3)被布置在所述多孔板的多个凹槽处。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的装置(1)，其中所述磁铁(3)包括孔和/或隆起用以插入所述容器(5)。
9.根据权利要求1或6所述的装置(1)，其中这样实施所述磁铁(3)的布置，使得第二磁铁这样布置在所述磁铁(3)上，以使得所述磁铁(3)的第一磁场可受所述第二磁铁的第二磁场影响，从而使得可产生作用于位于所述容器中的磁性颗粒的不均匀磁场。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的装置(1)，其中这样实施所述磁铁(3)的布置，使得所述磁铁(3)具有切口，以使得可由所述磁铁(3)的切口产生不均匀磁场。
11.根据前述权利要求中任一项所述的装置(1)，其中所述磁铁(3)是永磁铁和/或电磁铁。
12.根据前述权利要求中任一项所述的装置(1)，其中所述装置(1)包括用于移除所述液体的仪器(6)。
13.使生物分子可逆固定化的方法，
其特征在于，
所述方法包括以下步骤：
a)将磁性颗粒(4)和含有生物分子的液体(6)布置在容器(5，51)中，
b)使所述生物分子结合、特别是可逆结合至所述磁性颗粒(4)，
c)在由所述磁铁(3)的布置所产生的不均匀磁场中，使所述磁性颗粒(4)固定在所述容器(5)中，以使得所述磁性颗粒(4)结构化排列，
d)利用移除液体的仪器移除所述液体，其中通过所述磁性颗粒(4)的结构化排列，所述液体从所述磁性颗粒(4)上流走，
e)使所述生物分子从所述磁性颗粒(4)上脱离。
14.根据权利要求13所述的方法，其中使用根据权利要求1至12中任一项所述的装置(1)。
15.对生物分子进行自动化处理的设备，所述设备包括根据权利要求1至12中任一项所述的装置(1)。
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