DE1931466B2 - Kupfer (ID-komplexe von 6-Niederalkoxy-t-phenazinol- 5,10 - dioxiden - Google Patents

Description

in der R niederes Alkyl darstellt.

2. Verbindungen gemäß Anspruch 1, worin R Methyl darstellt

3. Verfahren zur Herstellung von Kupferkomplexen gemäß den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise eine Lösung eines 6-Niederalkoxy-l-phenazinol-5,10-dioxides mit einer Lösung eines Kupfer(II)-saI-zes behandelt

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine gesättigte Lösung des 6-Niederalkoxy-l-phenazinol-5,10-dioxides in einem inerten organischen Lösungsmittel mit einer gesättigten Lösung eines Kupfer(II)-salzes in demselben inerten organischen Lösungsmittel behandelt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 und 4, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kupfer(ll)-salz einer Säure mit einem p*a von etwa 4,2 oder mehr verwendet.

6. Mittel mit antimikrobieller Wirksamkeit, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Kupfer(II)-komplexen von 6-Niederalkoxy-1-phenazinol-5,10-dioxiden gemäß den Ansprüchen 1 und 2.

7. Mittel nach Anspruch 6 für die Bekämpfung von Mastitis in Rindern, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff eine wirksame Menge des Kupfer(Il)-komplexes gemäß Anspruch 1 im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthält.

8. Mittel nach einem der Ansprüche 6 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Kupfer(II)-komplex der Formel I enthält, in der R Methyl darstellt.

Die Erfindung betrifft Kupfer(II)-komplexe von 6-Niederalkoxy-l-phenazinol-5,10-dioxiden entsprechend der allgemeinen Formel I im obigen Anspruch 1.

Unter niederem Alkyl ist insbesondere Methyl, Äthyl oder Propyl zu verstehen. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen und Mittel mit antimikrobieller Wirksamkeit enthaltend diese Verbindungen.

Die bevorzugte Verbindung ist der Kupfer(II)-Komplex von Myxin, dem 6-Methoxy-l-phenazinol-5,10-dioxid.

Die erfindungsgemäßen Kupfer(II)-kompIexe von 6-Niederalkoxy-l-phenazinoI-5,10-dioxiden weisen gegenüber dem strukturell ähnlichen, beispielsweise aus Can. J. MicrobioL 12 (1966), S. 221-230 und Tetrahedron Letters Nr. 8 (1967), S. 715-718 als antimokrobiell wirksamem Mittel bekannten 6-Methoxy-l-phenazinol-5,10-dioxid (Myxin) überraschende Eigenschaften auf, da sie bei etwa gleichbleibender antimokrobieller Wirkung das Körpergewebe bedeutend weniger reizen, was insbesondere bei der "> Behandlung von Mastitis, einer ökonomisch wichtigen Rinderkrankheit, einen bedeutsamen und Oberraschenden Vorteil darstellt.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formel I ist dadurch gekenn-

i» zeichnet, d?.ß man in an sich bekannter Weise eine Lösung eines ö-Niederalkoxy-l-phenazinol-S.lO-dioxides mit einer Lösung eines Kupfer(ll)-salzes behandelt

Die Kupfer(ll)-komplexe können in kristalliner Form aus der Mutterlauge isoliert werden.

ι") Die Auswahl eines geeigneten Lösungsmittels für die Reaktionspartner wird durch Bestimmung der relativen Löslichkeiten getroffen und ist jedem Fachmann geläufig. Als Lösungsmittel werden bevorzugt solche verwendet, in denen sowohl das 6-NiederaIkoxy-l-phe-

2i) nazinol-5,10-dioxid als auch das Kupfer(II)-salz löslicher sind als das erhaltene Kupfer(II)-komplex. Als Beispiele für zweckmäßige Lösungsmittel, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar sind, können inerte organische Lösungsmittel, z. B. Acetonitril, Dimethyl-

_':"> formamid oder Dioxan, genannt werden.

Ein beliebiges Kupfer(II)-salz kann als Ausgangsmaterial verwendet werden. Es ist jedoch zu beachten, daß bei der Bildung des Kupfer(II)-komplexes der Formel I die dem Kupfer(ll)-salz entsprechende Säure ebenfalls gebildet wird. Da der Kupfer(H)-komplex unter stark sauren Bedingungen wenig stabil ist, ist die Verwendung eines Kupfer(II)-salzes einer schwachen Säure bevorzugt. Bevorzugte Kupfer(II)-salze sind solche, die mit einer beliebigen, schwachen Säure, z. B. mit Säuren mit

J5 einem ρκ₃ von etwa 4,2 oder mehr gebildet werden. Als Beispiele für solche Säuren können organische Säuren, z. B. die niederen Alkancarbonsäuren, z. R Essigsäure oder Propionsäure, Benzoesäure usw, genannt werden. Es können ebenfalls Kupfer(II)-salze von Mineralsäuren verwendet werden, wie z. B. Kupfer(I I)-sulfat Wenn ein Mineralsäuresalz verwendet wird, wird bevorzugt gleichzeitig ein gepuffertes Lösungsmittelsystem eingesetzt, um stark saure Bedingungen zu vermeiden. Der Kupfer(H)-komplex der Formel I kann durch einfaches Zusammengeben einer gesättigten Lösung des als Ausgangsverbindung eingesetzten 6-Niederalkoxy-lphenazinol-5,10-dioxids in einem geeigneten Lösungsmittel mit einer gesättigten Lösung eines Kupfer(H)-salzes in demselben Lösungsmittel bei Zimmertemperatur

■~>o und anschließendes Isolieren des ausfallenden Kupfer(II)-komplexes hergestellt werden. Temperaturen über Zimmertemperatur erleichtern die Auflösung und verringern die Menge des benötigten Lösungsmittels. Die Ausfällung des Komplexes kann durch Abkühlen erleichtert werden. Der ausgefällte kristalline Komplex wird wie üblich durch Entfernen des Lösungsmittels isoliert, z. B. durch Filtrieren, Lösungsmittelverdrängung gefolgt von Filtrieren etc.

Die als Ausgangsverbindungen eingesetzten 6-Niederalkoxy-l-phenazinol-5,10-dioxide sind bekannte Verbindungen oder Analoge hiervon. Sie können durch selektive Alkylierung des bekannten 1,6-Phenazindiol-5,10-dioxids (Iodinin) hergestellt werden. Die selektive Alkylierung kann durch Behandeln von l,6-Phenazindiol-5,10-dioxid mit einem Alkylierungsmittel, z. B. mit einem Di-nieder-alkylsulfat in Gegenwart von wäßrigem Alkali, wie Natriumhydroxid, durchgeführt werden (DE-OS 17 95 724). In einer

bevorzugten Ausführungsform dieses Verfahrens wird zuerst das Natriumsalz des l,6-Phenazindiol-5,10-dioxides hergestellt, das anschließend mit einem Alkylierungsmittel in einem nichtwäßrigen Lösungsmittel behandelt wird (DE-OS 20 16 467).

Die erfindungsgemäßen Kupfer(II)-komplexe besitzen ein breites Spektrum antimikrobieller Wirksamkeit. Insbesondere Kupfer-myxin, der Kupfer(ll)-komplex von 6-Methoxy-l-phenazinol-5,10-dioxid zeigt eine starke Wirkung gegen eine Vielzahl von sowohl Gram-positiven als auch Gram-negativen Bakterien, wie Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Diplococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Klebsieila pneumoniae, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhosa, Salmonella schottmuelleri, Pasteurella multocida, Moraxella bovis, Erysipelothrix insidiosa, Mycobactei ium tuberculosis und Mycoplasma gallisepticum. Sie sind ebenfalls wirksam gegen Pilze und Hefen, wie Candida albicans, Trichophyton mentagrophytes, Microsporum canis, Microsporum audouini, Ustilago zeae, Fusarium oxysporum, Botrytis paeoniae, Aspergillus flavus und Aspergillus niger; gegen Protozoen, wie Trichomonas vaginalis und Trichomonas foetus; und gegen Helminthes wie Syphacia obvelata und Ascaris suum. Die erfindungsgemäßen Kupfer(II)-komplexe sind ebenfalls gegen Krankheitserreger der Pflanzen wirksam und können als Blätterfungicide oder als Erdfungicide verwendet werden. Die Verbindungen zeigen z. B. eine starke Wirksamkeit gegenk Phytophthora infestans, den Erreger von Braunfäule der Tomate, gegen Xanthomonas vesicatoria, das verursachende Agens der bakteriellem Blattfleckenkrankheit bei Tomaten und gegen Piricularia oryzae, den die Brusone-Krankheit (»rotten neck of rice«) verursachenden Pflanzenpathogen.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind bei der Behandlung von Pflanzen- und Tierkrankheiten mikrobiellen Ursprungs besonders wertvoll, weil sie eine niedere Toxizität bei Säugetieren und Pflanzen aufweisen. Wenn die neuen erfindungsgemäßen Verbindungen zur Behandlung von mikrobiellen Infektionen, z. B. von bakteriellen, Helminthes- und/oder Protozoen-Infektionen sowie von ectoparasitischen Infektionen oder Befallen eingesetzt werden, so werden sie zweckmäßig in Verbindung mit geeigneten Trägermaterialien als chemotherapeutische Agentien für die Bekämpfung von Säugetierekrankheiten verwendet. Die Mittel können dadurch hergestellt werden, daß man die Verbindungen in einem Arzneistoffträger homogen verteilt, der mit der einzusetzenden Verbindung chemisch verträglich ist, den aktiven Wirkstoff nicht hemmt und im wesentlichen für Körpergewebe unter den Verwendungsbedingungen nicht schädlich ist. Die neuen Verbindungen der Formel I werden, sofern sie als Mittel für die äußerliche Verwendung bestimmt sind, bevorzugt in Mengen im Bereich von etwa 0,1 bis etwa 0,5 Gewichtsprozent der chemotherapeutischen Komposition verwendet Für die äußerliche Verwendung können die erfindungsgemäßen Verbindungen in verschiedenen Zubereitungsformen verwendet werden, z. B. als feste Zubereitungen, z. B. als feinverteiltes Pulver oder als Granulat, in flüssigen Zubereitungsformen, z. B. als Suspensionen, Konzentrate, Aufschlämmungen, Tinkturen oder Aerosole. Die jeweilige Form ist abhängig von der gewünschten Applikation und den gewählten Zubereitungsmedien. Die äußeren Zubereitungsformen können als Creme, GeL Geleen, Salben, Pasten etc. verwendet werden. Wenn Zubereitungsformen verwendet werden, worin die erfindungsgemäße Verbindung partielle Löslichkeit hat, z. B. solche, die Propylenglycol enthalten, wird das molare Verhältnis zwischen Myxin und Kupfer(Ii) im gelösten Komplex geändert, weil ein Teil das anwesenden Materials, z. B. des Lösungsmittels, als Ligand wirken kann. Die vorliegende Erfindung schließt auch solche Mittel ein.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung der neuen Kupfer(II)-komplexe für eine

ίο Vielzahl von industriellen, antimikrobiellen Applikationen. Diese Komplexe sind aufgrund ihrer chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften für folgende Verwendungen geeignet: Schutz von Stoffen, wie Textilien, Segeltücher und andere gewobene oder

ι ^r> nichtgewobene Materialien gegen Mehltau; als Farbenfungizide; als Brennstoffzusätze für die Bekämpfung von mikrobieliem Wachstum; als Konservierungsmittel für Kleider und Schuhe; als äußerliches Antisepticum; als Desinfektionsmittel; als Pflanzen- und Baumspritzmittel; als antimycotische Mittel in Seifen; als Mittel für den Schutz von Plastic, Karton, Faserstoffplatten, Papier etc. gegen Mehltau; als Schleimverhütungsmittel in Pulpflüssigkeiten etc; als Konservierungszusätze in Nahrungsmitteln; als Zusätze in Seifen und Waschmitteln etc.; als Zusätze in Kosmetica, Shampoos, Desodorierungsmitteln, Mundwässern etc.

Der Ausdruck »antimikrobielle Wirksamkeit« umfaßt im Rahmen der vorliegenden Anmeldung alle die vorstehend erwähnten Wirksamkeiten.

Die erfindungsgemäßen Kupfer(II)-komplexe, insbesondere Kupfer-myxin sind besonders stark wirksam gegen phatogene Organismen, sowohl in vitro als in vivo, insbesondere gegen diejenigen Bakterien und Hefen, die Mastitis bei Rindern verursachen. Bekannte Antimastitismittel sind nicht vollständig zufriedenstellend, da ihre Wirksamkeit dadurch limitiert ist, daß sie verhältnismäßig enge antimokrobielle Wirkungsspektren haben, und des weiteren Irritationen verursachen können. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind

•to besonders effektiv als Antimastitismittel, da sie ein kräftiges und breites antimikrobielles Wirkungsspektrum haben und nicht irritierend wirken. Die erfindungsgemäßen Verbindungen, insbesondere der Kupfer-myxin, sind bei Erkrankungen von Eutern von Wiederkäuern, insbesondere von Kühen, nichtirritierende, starke Antimastitismittel. Für die Verwendung als Antimastitismittel können die Verbindungen der Formel I direkt den Eutern der Tiere durch äußerliche Administration verabreicht werden, z. B. durch Einführung in den Zitzenkanal oder durch intrazisternale Infusion.

Eine spezifische Ausführungsform der Erfindung betrifft Mittel für die Bekämpfung von Mastitits bei Rindern, enthaltend eine Verbindung der Formel I zusammen mit Trägermaterialien, die für äußerliche oder intrazisternale Administration geeignet sind. Für die Verwendung als Antimastitismittel werden die Verbindungen der Formel I bevorzugt in Mengen zwischen etwa 5 und etwa 50 mg pro Dosis verwendet, wobei die Mittel zweimal täglich während etwa 1 bis 2 Tage verabreicht werden können oder so lange bis ein therapeutischer Effekt auftritt, was sogar nach einer einzigen Verabreichung erfolgen kann. Ein bevorzugter Dosierungsbereich liegt zwischen etwa 5 und etwa 40 mg pro Dosis, wobei der Wirkstoff im Gemisch mit einem geeigneten Arzneistoffträger in einer Dosis von 20 ml vorliegt. Die optimale Dosis ist eine einzige Dosis, die 20 mg Wirkstoff enthält.

Typische Ausführungsformen für Präparate zur intrazisternalen Infusion enthalten öl-dispergierbate oder wasser-dispergierbare Arzneistoffträger. Die Arzneistoffträger bestehen aus inerten Ingredienzien, z. B. oberflächenaktiven Mitteln oder Antioxidantien, mit vegetabilischen, öligen oder wäßrigen Trägern. Typische Ingredienzien, die für die Verwendung in Mitteln zu intrazisternaler Infusion pharmazeutisch verträglich sind, sind

Natriumeitrat, Citronensäure,

Magnesiumaluminiumsilicat,

Carboxymethylcellulose,

Polyoxyäthyien(20)sorbitanmonooleat,

Sorbitol, Glycerin,

mikrokristalline Cellulose,

Propylenglycol, Benzylalkohol,

Polyoxyäthylen(20)natriummonostearat,

butyliertes Hydroxyanisol,

butyliertes Hydroxytoluol, Lecithin

feinverteilte Kieselerde, hydriertes Rizinusöl,

Methylparaben, Propylparaben, Chlorbutanof,

Aluminiummonostearat, Sorbitanmonostearat,

modifiziertes 1-Hydroxystearin,

Glycerol-monostearat,

Polyoxyäthylen-sorbitoltristearat,

Dichlordifluormethan,

Kohlenstofftetrafluorid

und

Dimethyipolysiloxan.

Mäuse, die in vivo mit Mastitisisolaten infiziert sind, haben sich als gute Testobjekte für die Feststellung der Wirkung von bekannten Antimastitismitteln erwiesen. Die Resultate von solchen Testen stehen in guter Beziehung zu der Antimastitiswirkung bei Tieren, die zu Mastitisinfektionen neigen, z. B. bei Milchkühen. Das Testverfahren beinhaltet die Bestimmung der Wirkung in Gegenwart von Milch, um die Wirksamkeit in Gegenwart von organischen Flüssigkeiten zu erhärten. Die Testmethode zur Bestimmung der Antimastitiswirkung der Verbindungen der Formel I in vivo wird wie folgt durchgeführt:

Material und Methodik
Medium

Sterile Milch, enthaltend weniger als 1 Bakterium pro 5 ml.

Kulturen

Die zur Kontaminierung der Milch verwendeten bakteriellen Stämme sind Feldisolate von Rinder-Mastitis. Sie werden auf Tryptoseagar aufbewahrt. Zur Kontaminierung der Milch werden 24 Stunden alte Kulturen von Tryptoseager verwendet. Die Endkonzentration der Organismen in der Milch beträgt bei:

a) Streptococcus agalactiae — 5xlO⁷ Organismen

pro ml

b) Staphylococcus aureus — 2 χ 10⁹ Organismen

pro ml

c) Escherichiacoli —2 χ 10⁹ Organismen

pro ml

d) Pseudomonas aeruginosa —5 χ 10⁸ Organismen

pro ml

Subkutane Injektion von 0,5 ml Milch — kotaminiert mit den obenerwähnten Stämmen — induziert bei 18—20 g schweren Mäusen Verletzungen. Die mit Streptococcus agalactiae zu infizierenden Mäuse sind mit Triamcinolonacetonid präkonditiociiert um wohldefinierte Verletzungen zu zeigea

Testmethodik

50 mg Kupfer-Myxin werden in 10 ml sterilem, destilliertem Wasser, (pH 7 bis 7,2) mit Hilfe eines Teflonzerkleinerers vermählen. Weitere Verdünnungen, enthaltend 1,0,2, 0,04 und 0,008 mg der Verbindung pro

ίο ml, werden in sterilem, destilliertem Wasser hergestellt. 0,5 ml jeder Verdünnung der Verbindung wird in ein 4,5 ml kontaminierte Milch enthaltendes Rohr (1 Rohr pro Verdünnung) gegeben, so daß die Endkonzentration der Verbindung in der Milch 500, 100, 20, 4 und 0,8 Mikrogramm pro ml beträgt Nach heftigem Schütteln, um gleichmäßige Verteilung der Verbindung in der Milch zu gewährleisten, werden 0,5 ml jeder Kombination (kontaminierte Milch plus Verbindung) subcutan vier 18—20 g schweren weißen Mäusen injiziert Normale Mäuse werden für die Staphylococcus-, CoIi- und Pseudomonas-Infektion verwendet, wohingegen präkonditionierte Mäuse (24 Stunden vorher mit 1 mg Triamcinolonacetonid subcutan injiziert) für die Streptococcus-Infektion verwendet werden. Jede Gruppe der Mäuse wird in einem separaten Käfig gehalten und erhält normales, pelletiertes Futter und Wasser ad libitum. Die Tiere werden zweimal pro Tag während 2 Tage nach der Injektion beobachtet und am dritten Tag getötet. Symptome und Todesfälle werden registriert

jo Alle Mäuse, die während des Testes sterben und alle Überlebenden, die am dritten Tag des Testes getötet werden, werden autopsiert Die Wirksamkeit der Verbindung gegen die vier bakteriellen Stämme wird wie folgt bestimmt:

Bei Streptococcus: Fehlen von Eiter und Nekrose an der Injektionsstelle; bei Staphylococcus: Fehlen von Nekrose an der Injektionsstelle und Fehlen von Symptomen und Todesfällen; bei CoIi: Fehlen von schweren fibrinösen Infiltrationen an der Injektionsstel-Ie; bei Pseudomonas: Fehlen von gelatinösem Oedum und Nekrose an der Injektionsstelle, Fehlen von Symptomen und Todesfällen.

Kontrollversuche

Folgende Kontrollversuche werden parallel mit jedem Test durchgeführt:

1. Bestimmung der Sterilität der im Test verwendeten Milch, der Salzlösung und des destillierten Wassers;

2. Auszählung der Bakterien in der kontaminierten Milch;

3. Bestimmung der Reinheit der für die Kontaminierung der Milch verwendeten Stämme;

4. Titration des für die Infektion an Mäusen bestimmten Inoculums;

5. Untersuchung auf Fehlen pathogencr Affekte bei nichtkontaminierter Milch.

Auswertung der Ergebnisse

Unter Verwendung der beschriebenen Methode werden folgende Kriterien und Parameter erhalten:

1. Schutz der Tiere vor lokalen Verletzungen, indiziert durch lnoculierung von Milch, kontaminiert mit Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus, Escherichia coli und Pseudomonas aeruginosa;

2. Schutz vor Todesfällen und klinischen Symptomen induziert durch Staphylococcus und Pseudomonas.

Ergebnisse

Unter Verwendung dieser Methode wird die Wirksamkeit der Antimastitiszubereitungen gegen vier Bakterienstämme festgestellt. Im folgenden sind die Ergebnisse der Prüfung von Verbindungen, die in den erfindungsgemäßen Mitteln verwendbar sind, festgehalten. Die Tabelle 1 und II zeigen die antibakterielle Wirksamkeit, sowohl in vitro als auch in vivo.

Tabelle 1

In vitro Wirksamkeit von Kupfer(II)-komr.riexen von 6-Alkoxy-l-phenazinol-5,10-dioxiden

Organismus

Mindesthemmkonzcntration, mcg/ml

Kupfer(ll)-

komplex von

6-Methoxy-

1-phenazinol-

5,10-dioxid

(Kupfer-Myxin)

Kuplerdl)-komplex von 6-Äthoxy-I-phenazinol-3,10-dioxid

Streptococcus
agalactiae
Staphylococcus aureus

Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa

Tabelle II

weniger als weniger als 0,16
0,16

2,4
12

weniger als 4

20 100

Verbindung Antibakterielle Wirksamkeit

in vivo als ED50, mcg/ml

S. aga- S. S. S. aeru-

lactiae aureus coli ginosa

Kupfer-myxin

0,8

12

60

Außer als Antimastitismittel können die Verbindungen der Formel I auch bei der Behandlung einer Vielzahl von Tier- und Pflanzenirifektionen eingesetzt werden. Es wurde gefunden, daß die Verbindungen der Formel 1 besonders für die Behandlung von lokalen, tierischen Infektionen — verursacht durch eine Vielzahl von Organismen — verwendbar sind. Die erfindungsgemäßen Kupfer(II)-komplexe können deshalb in der medizinischen Therapie wirksam eingesetzt werden, so z. B. bei der Behandlung von bakteriellen, Hefe- und/oder mycotischen Infektionen bei Menschen und Tieren, bei denen die Haut, das Haar, die Nägel und/oder andere Bereiche: des Körpers infiziert sind.

Demnach betrifft eine andere Ausführungsform der Erfindung neue Mittel enthaltend die Verbindungen der Formel I für die Behandlung von Infektionen der Haut, des Ohrs, des Auges und der Genitalien von Tieren. Die antibakterielle Wirkung dieser Verbindungen gegen Hautinfeklionen verursacht durch Staphylococcus aureus und Pseudomonas aeruginosa in vivo wurde durch die folgenden Teste belegt:

Antibakterielle Wirksamkeit

Ritzung von Kaninchenohr. Anschließend Infektion mit Staphylococcus aureus und Pseudomonas aeruginosa. Zwei Kaninchen pro Infektion. Behandlungsdauer 4 Tage, totale Behandlungsdauer 7 Tage. Die therapeutische Wirksamkeit ergibt sich aus den klinischen Observationen nach 1, 2 und 3 Behandlungstagen und 3 Tage nach dem Ende der Behandlung sowie durch Vergleich der behandelten mit den nichtbehandelten und den placebobehandelten Bereichen der Haut.

Verbindung

Therapeutische Wirksamkeit, % S. aureus P. aeruginosa

Kupfer-myxin

0,5%
0,1 %

48
78

Die Wirksamkeit gegen Hefe wurde durch den folgenden Test an Tieren demonstriert:

Neuseeländische weiße Kaninchen präkonditioniert mit Triamcinolonacetonid wurden durch Ritzen mit einem Stamm von Candida albicans infiziert und während 2 Cyclen von je 5 Tagen mit Zubereitungen behandelt. Die therapeutische Wirksamkeit wird durch die Bewertung der Verletzungen in bezug auf die Remission in wöchentlichen Intervallen und durch den Vergleich der behandelten mit den nichtbehandelten und den placebobehandelten Bereichen der Haut ermittelt.

Verbindung

Therapeutische
Wirksamkeit, %

1 Woche 2 Wochen 1 Woche nach Be-

Behand- Behänd- handlung lung lung

Kupfer-myxin-

Gel-placebo

Kupfer-myxin-

creme

0,5
0,1
0,02

0,1

Creme-placebo

Kupfer-myxin- 0,5
Vaselinbase
Vaselin-placebo —

73
47
60

40
50

58
34
92

0
44

22
89

11

100
45
89

11
33

12
100

33

Antifunguswirkung wurde an Tieren durch folgenden Test demonstriert.

Albino-Meerschweinchen präkonditioniert mit Triamcinolonacetonid wurden durch mehrfaches Einstechen mit einer Sporensuspension von Trichophyton mentagrophytes infiziert und während zwei Cyclen von je 5 Tagen mit Zubereitungen behandelt. Therapeutische Wirksamkeit wird durch die Behandlung der Verletzungen in bezug auf die klinischen Remissionen in wöchentlichen Intervallen und durch den Vergleich der behandelten mit den nichtbehandelten und den placebobehandelten Bereichen der Haut ermittelt.

Wirkung gegen Trichophyton mentagrophytes

Verbindung	%	Therapeutische Wirkung, %	nach Be	2 Wocher
		2 Wochen I Woche	handlung	nach Be
		Behänd	99,5	handlung
		lung	77	98,5
Kupfer-myxin-	0,5	96	65	71
gel	0,1	75	86	61
	0,05	65	82	94
Kupfer-myxin-	0,5	87	6	81
creme	0,1	42	89	32
Creme-placcbo	-	23		79
Kupfer-myxin	0,5	78	-20
in Vaselinbase			-30
Vaselin-placebo	-	-11

Die Wirksamkeit der neuen erfindungsgemäßen m Komplexe als Blätterfungizide wurde in Standardtesten für Blätterfungizidwirkung demonstriert. Beispiele für entsprechende Ergebnisse mit dem Kupfer-myxin sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt:

Verbindung	Konzen	Pfianzenpathogen
	tration
	(PPM)	Prozent Kontrolle zu
		Pflanzenbeschädigung*)
Kupfer-	100	Phytophthora infestans
myxin		74:0
		Xanthomonas vesicatoria
		82:0
		Priicularia oryzae
		66:0

*) 0 bedeutet keinen sichtbaren Effekt.

■10

Die Wirksamkeit gegen Protozoen wurde durch die folgenden Teste an Tieren, die mit Trichomonas vaginalis infiziert wurden, demonstriert:

Gruppen von 7 bis 8 18—20 g schweren Albino-Mäusen wurden am Abdomen mit etwa 500 000 Zellen subciitan infiziert. Die Tiere wurden am Tage der Infektion und am Tage nach der Infektion in die Infektionsstelle mit Dosen der Verbindung der Formel I von 2 meg bis 1000 meg pro ml Lösung infiltriert. Die ■>» Tiere wurden am dritten Tag nach der Infektion in bezug auf Verletzungen bei der Infektionsstelle untersucht. Die Anzahl Tiere mit Verletzungen und die Anzahl der verletzungsfreien Tiere wurde für jede getestete Dosis bestimmt. »

Der CDso-Wert wurde mit Hilfe der Methode von Reed und Muench berechnet (American Journal Hygiene, Vol. 27, Seite 493 [1938]).

Wl

Ver	Dosis	keine	Ver	Kumulativ	Ver
bindung		Ver	letzung	keine	letzung
		letzung		Ver
	mcg/ml			letzung
	S.C.				5
Kupfer-	1000	35	5	121	15
myxin	400	22	10	86

Ver	Dosis	keine	Ver	Kumulativ	Ver
bindung		Ver	letzung	keine	letzung
		letzung		Ver
	mcg/ml			letzung
	S.C.

Kupfermyxin

200

100

40

20

10

19

5
5
5
1
5
6

64

45

34

23

12

27
32
37
42
43
48
54

Das CDso-Wert ist 48 mcg/ml s.c. basierend auf den Daten der Teste.

Beispiel 1

Herstellung des Kupfer(II)-komplexes von
6-Methoxy-l-phenazinol-5,10-dioxid (Kupfer-myxin)

Eine Lösung von 6 g e-Methoxy-l-phenazinol-5,10-dioxid in 3000 ml Acetonitril wird unter Rühren mit einer 75⁰C heißen Lösung von 3 g Kupfer(II)-acetatmonohydrat in 900 ml Acetonitril versetzt. Nach dem Erkalten wird das erhaltene Gemisch bei Zimmertemperatur 3 Stunden stehengelassen. Der ausgefällte Kupfer(II)-komplex wird durch Filtrieren isoliert und gründlich gewaschen, zuerst mit Acetonitril und anschließend mit Äther. Auf diese Weise wird der Kupfer(II)-komplex in Form von dunkelgrünen Kristallen erhalten. Absorptionsbänder im IR-Spektrum: 1365cm-' (in Fluorolube); 1059, 776, 578cm-¹ (in Nujol). UV-Absorptionsmaxima in Dimethylsulfoxid:

287 ΐημ - (ε = 68,500)
300 πιμ - (ε = 63,200)
356ΐημ-(ε= 10,000)
408ΐημ-(ε = 10,400)
610πιμ-(ε = 9,500)

Analyse für C^Hi₈N₄O₈Cu-

Berechnet: C 54,03, H 3,14, N 9,69, Cu 10,99;
Gefunden: C 53,71, H 3,31, N 9,66, Cu 10,92.

Beispiel 2

Wird in Beispiel 1 als Ausgangsverbindung 6-Äthoxyl-phenazinol-5,10-dioxid verwendet, so erhält man unter sonst gleichen Bedingungen den Kupfer(II)-komplex von6-Äthoxy-l-phenazinol-5,10-dioxid.

Analyse für C28H22N.1O8CU —
Berechnet: N 9,25;
Gefunden: N 9,12.

Beispiel 3

Eine 6-ml-Suspension wird durch Vermischen der folgenden Ingredienzien hergestellt:

Kupfer-myxin 10 mg

Äthylendiamin 57 mg

Destillierte Monoglyccridc 60 mg

Polyäthylcnglycol400 q.s.

Die so erhaltene 6-ml-Suspension kann zur Infusion in den Zitzenkanal eines infizierten Rindes verwendet

werden. Die Behandlung kann notwendigenfalls nach 12 und/oder 24 Stunden wiederholt werden.

Beispiel 4

20-ml-Suspensionen mit der folgenden Zusammensetzung werden hergestellt:

a) Kupfer-myxin	20 mg
Carboxymethylcellulose	2 Prozent
Methylparaben	0,1 Prozent
Propylparaben	0,025 Prozent
Destilliertes Wasser	q.s.
b) Kupfer-myxin	30 mg
Carboxymethylcellulose	2 Prozent
Methylparaben	0,1 Prozent
Propylparaben	0,025 Prozent
Polyoxyäthylen(20)sorbitan-
monooleat	2 Prozent
Destilliertes Wasser	q.s.
c) Kupfer-myxin	40 mg
Carboxymethylcellulose	2 Prozent
Chlorbutanol	0,5 Prozent
Destilliertes Wasser	q.s.
d) Kupfer-myxin	10 mg
Carboxymethylcellulose	2 Prozent
Chlorbutanol	0,5 Prozent
Polyoxyäthylen(20)sorbitan-
monooleat	2 Prozent
Destilliertes Wasser	q.s.

Milchabsondernde Kühe werden mit 20 ml der Suspension unmittelbar nach der Melkung in jedem infizierten Viertel behandelt. Die Suspension wird in dem Viertel bis zur nächsten Melkung belassen. Die Behandlung wird notwendigenfalls in Intervallen von 24 Stunden wiederholt.

Beispiel 5
Kupfer-myxin-Antimastitispräparat — 0,1 Prozent

Beispiel 6

Kupfer-myxin — Creme für äußere Behandlung — 0,1 Prozent

Gramm pro Kilo mg pro Gramm

Teil 1: Stearylalkohol 125,00

ίο Vaselin 100,00

Nipasol 0,50

Polyoxyäthylenglycol 40,00

Das Polyoxyäthylenglycol soll in Wasser und Äthanol |-> löslich, in Baumwollsamenöl und Mineralöl unlöslich und in Propylenglycol milchig sein.

Teil 11: Kupfer-myxin 1,00

Destilliertes Wasser 612,00

2«i Propylenglycol 120,00

Nipagin 2,00

Der Stearylalkohol, das Vaselin, das Nipasol und das Polyoxyäthylenglycol werden in einem rostfreien Stahlbehälter auf 75⁰C erhitzt.

Das destillierte Wasser, das Propylenglycol und das Nipagin werden in einem separaten rostfreien Stahlbehälter auf 75⁰C erhitzt und gut gemischt. Das Kupfer-myxin wird dann zugegeben. Das Gemisch wird gut gerührt.

Teil Il wird langsam unter kontinuierlichem Rühren zu Teil I gegeben. Das Rühren wird bei niedriger Geschwindigkeit fortgesetzt bis die Creme auf 35° C abgekühlt ist.

Die Creme wird in geeigneten Milchglasbehältern verpackt. Cremen für die äußerliche Behandlung enthalten normalerweise zwischen etwa 0,1 und etwa 1 Gewichtsprozent des Wirkstoffes, bevorzugt zwischen etwa 0,1 und etwa 0,5 Gewichtsprozent.

	Gramm/Liter
Kupfer-myxin	1,00
Polyoxy äthylen(20)sorbitan-
monooleat	60,00
Sorbitanmonooleat	40,00
Benzylalkohol	10,00
Natriumacetat	2,00
Nichtionische
Hydroxypropylcellulose	19,0
Destilliertes Wasser q.s.	1 Liter

Das Kupfer-myxin wird mit dem Benzylalkohol in einem rostfreien Stahlbehälter zu einer Paste verrieben. Dann werden Polyoxyüthylen(20)sorbitanmonooleat, das Sorbitanmonooleat und das Natriumacetat in der erwähnten Reihenfolge langsam unter konstantem Rühren zugegeben. Die Hydroxypropylcellulose wird in 850 ml destilliertem Wasser bei 5O⁰C suspendiert und anschließend auf 3O⁰C abgekühlt. Die Suspension wird zu den vorhergenannten Ingredienzien gegeben und gerührt, bis das Gemisch homogen ist. Die Zubereitung wird anschließend mit destilliertem Wasser auf das Endvolumen gebracht.

Vergleichsversuch

■π Der Kupfer(Il)-komplex von 6-Methoxy-l-phenazinol-5,10-dior.id (Kupfer-myxin), hergestellt gemäß Beispiel 1, wurde mit ö-Methoxy-l-phenazinol-S.lO-dioxid, d. h. Myxin, bekannt aus Can. J. Microbiol., 12 (1966), S. 221-230 und Tetrahedron Letters Nr. 8 (1967), S.

in 715-718, hinsichtlich der bakteriellen Aktivität und der Reizung von Körpergewebe verglichen.

Die bakterielle Aktivität wurde wie folgt untersucht: Zweifache Verdünnungen von Myxin wurden in IOO%igem DMSO aus 1000 bis 8 mcg/ml hergestellt,

Vi ebenfalls zweifache Verdünnungen von Kupfer-myxin in Milch, so daß identische, äquivalente Konzentrationen von Myxin/ml erhalten wurden.

Volumina von 0,5 ml der verschiedenen Verdünnungen wurden in Reagensgläser gegeben, welche 4,5 ml

w) rohe Kuhmilch enthielten, die mit 4 Bakterienstämmen beimpft waren, und das Ganze wurde bei 37⁰C inkubiert.

Nach östiindiger Inkubation wurde eine Schleife Milch aus jedem Reagensglas auf eine Platte von

hi Tryptoseagar aufgestrichen. Die Platten wurden bei 37°C inkubiert und hinsichtlich des Wachstums 24 Stunden später untersucht. Hierbei wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Bakterielle Aktivität (mcg/ml) von Myxin und
Kupfer-myxin in Anwesenheit von Milch bei 37 C

Bakterien

Myxin

Kupfer-myxin

S. agalactiae
S. aureus
E. coli
P. aeruginosa

1,5
<0,8
25
100

1,5

1.5
3
100

Diese Ergebnisse zeigen, daß beide Verbindungen etwa die gleiche bakterielle Aktivität besitzen.

Die Reizung von Körpergewebe wurde wie folgt untersucht: Die Reizung des Kuheuters wurde durch Infusion von Myxin- und Kupfer-myxin-Ansätzen innerhalb des Euters untersucht. Als Träger wurden 20 ml einer Zusammensetzung verwendet, die bestand aus:

Polyoxyäthylenderivat von
Sorbitanhydrid, teilweise mit
Fettsäure verestert (Emulgator)
Sorbitanmonooleat
(nichtionisierendes Tensid)

6% 4%

Benzylalkohol
Natriumacetat

Hydroxypropylcellulose · HCI
dest. Wasser

1%
0,2%
2%
q.s.

Die Reizung des Euters wurde durch visuelle Beobachtung und Palpitation bestimmt.

Die Applikation von 20 mg Myxin erzeugte eine starke Reizung des Euters, die 12 bis 84 Stunden andauerte. Die Myxindosis mußte auf 10 mg vermindert werden, um die Reizung auf eine milde Reizung zu reduzieren, die 12 bis nicht mehr als 60 Stunden anhielt.

Im Gegensatz hierzu konnte Kupfer-myxin in einer Dosis von 40 mg appliziert werden, ohne daß mehr als eine milde, verübergehende Reizung, die 36 bis 40 Stunden anhielt, auftrat.

Hieraus ist ersichtlich, daß Kupfer-myxin etwa viermal weniger stark reizend ist als Myxin.

Obwohl Kupfer-myxin daher etwa die gleiche bakterizide Aktivität als das vorbekannte Myxin hat, ist es dennoch überraschend, daß die Reizung bei der Applikation beim Kuheuter etwa vierfach geringer ist, so daß das erfindungsgemäße Kupfer-myxin zur Behandlung von Kuh-Mastitis überraschenderweise besonders geeignet ist.

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Kupfer(II)-komplexe von 6-Niederalkoxy-lphenazinol-5,10-dioxirlen der allgemeinen Formel

R-O

O<-N

(I)

N-O.

Cu
Q/ Ό<-Ν N-O