DE1925375C3 - Verfahren zur Gewinnung eines Urokinaseinhibitors - Google Patents

Description

Volumina vop Urokinaselösung mit einer bestimmten Aktivität und einer Probe erzeugt wurde, kleiner als diejenige, die durch gleiche Volumina von Urokinaselösung und der entsprechenden Menge Lösungsmittel (beispielsweise 0,9prozentiger Salzlösung) entsteht, so ist daraus zu schließen, daß die Urokinaseaktivität durch die Probe inhibiert worden ist. Das Ausmaß der Inhibierung wird durch die Konzentration der Probe bestimmt, die eine 50prozentige Inhibierung der Urokinaseaktivität ergibt.

Bei der praktischen Durchführung hatte die Urokinaselösung eine Aktivität von 20 Ploug-Einheiten/ml. Die zur Inhibierung einer Ploug-Einheit der Urokinaseaktivität notwendige Menge wird als Inhibitoreinheit definiert. Die Inhibitoraktivität wurde also durch Multiplikation des für 50prozentige Inhibierung gefundenen Verdünnungsfaktors mit 10 erhalten.

Es folgt ein Beispiel für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. ao

Beispiel

200 unmittelbar nach der Abstoßung eingefrorene und so konservierte menschliche Placenta wurden mit 501 einer 0,9prozentigen Salzlösung versetzt und mit einem Fleischwolf zerkleinert, wodurch der Auftauvorgang gefördert wird. Zu dieser Masse wurden weitere 1501 0,9prozentige Salzlösung hinzugefügt und unter Rühren gut durchmischt. Durch Zentrifugieren dieser Mischung erhielt man einen rohen wäßrigen Extrakt als überstehende Flüssigkeit, der von den unlöslichen festen Bestandteilen getrennt ist.

Dieser Extrakt kann an sich in der vorliegenden Form weiterverarbeitet werden, für die nachfolgende Reinigung erweist es sich jedoch als günstigem, wenn man ihn zunächst mit Wasser auf das Sfache Volumen verdünnt. Der so verdünnte Extrakt würde dann unter Rühren mit Salzsäure auf einen pH-Wert von 3,5 gebracht und nach 30 Minuten mit Natriumhydroxyd wieder neutralisiert. Der dabei erhaltene Niederschlag wurde durch Zentrifugieren abgetrennt. Er bestand zur Hauptsache aus Mucopolysaccharide^ Die Abtrennung dieser Mucopolysaccharide erleichtert die weitere Reinigung.

Für diese vorangehende Ausfällung von Verunreinigungen liegt der pH-Wert im sauren Bereich zweckmäßigerweise zwischen 3 und 4, da bei pH-Werten von 3 und darunter eine merkliche Inaktivierung des Urokinaseinhibitors eintritt, während bei pH-Werten von 4 und höher die Entfernung der Mucopolysaccharide unzureichend wird.

Die nach Abzentrifugieren der Ausfällung erhaltene Flüssigkeit wurde mit Ammoniumsulfat bis zur Erreichung 50prozentiger Sättigung versetzt und der dabei erzeugte Niederschlag durch Filtrieren oder Zentrifugieren gesammelt. Durch diese Behandlung wird der Urokinaseinhibitor ausgefällt, was von einer Endkonzentration von 30% Ammoniumsulfatsättigung an erreicht werden kann. Die besten Ergebnisse werden jedoch mit SOprozentiger Sättigung erhalten.

Dieser ammoniumsulfathaltige Niederschlag wurde zur Entsalzung in einer kleinen Wassermenge suspendiert, in einen Schlauch aus regenerierter Cellulose gebracht und gegen Wasser dialysiert. Nach vollständiger Abtrennung des Ammoniumsulfats (Dialvse bis mindestens 20 000 Ω cm oder mehr) wurde der noch verbleibende Rückstand abgetrennt und die überstehende Flüssigkeit gesammelt

Diese wurde mit einem mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH 6,2) equilibrierten Pulver aus mikroskopisch kleinen Perlen aus Carboxymethyldextran (mit etwa 6 '/o Epichlorhydrin zu einem dreidimensionalen Netzwerk mit funktionellen ionischen Gruppen vernetzte Dextranketten) in einer Menge von 20 Gewichtsprozent/Volumprozent Naßgewicht versetzt und die Mischung gut durchmischt und dann filtriert.

Das Filtrat dieser Kationenaustauscherbehandlung wurde gesammelt. Der pH-Bereich, bei dem diese Kationenaustauscherbehandlung durchgeführt wird, ist nicht notwendigerweise auf einen bestimmten engen Bereich beschränkt, sondern er liegt zwischen 5 und 7,5. Bei pH-Werten von 5 und darunter wird der Urokinaseinhibitor stark adsorbiert, während bei pH-Werten von 7,5 und höher keine ausreichende Reinigung mehr erzielt werden kann. Statt des Carboxymethyldextrans können auch andere Kationenaustauscherharze verwendet werden, wie z. B. Cellulosephosphat oder kleine Perlen eines schwach sauren Ionenaustauscherharzes auf der Basis eines Vinylpolymeren mit Carboxylgruppen, das z. B. unter dem geschützten Warennamen Amberlite IRC-50 ® im Handel erhältlich ist, jedoch ist die Reinigung bei Verwendung von Carboxymethyldextran besser.

Das Filtrat der Kationenaustauscherbehandlung wurde durch ein geeignetes Verfahren, wie Gefriertrocknen, eingeengt und einer Gelfiltration durch eine Säule mit einem unlöslichen Gelpulver aus mikroskopischen Perlen aus einem mit etwa 6 % Epichlorhydrin dreidimensional vernetzten Polysaccharid, das z. B. unter dem geschützten Warennamen Sephadex G-150® im Handel erhältlich ist, unterworfen. Die Elution erfolgte mit einer fast neutralen Pufferlösung wie z. B. einer 0,05 M Phosphatpufferlösung (pH 6,8). Zunächst wurde dabei Protein und eine gefärbte Komponente eluiert, wonach die Elution des Urokinaseinhibitors (erkennbar an der Aktivität) erfolgte, der gesammelt wurde. Bei dieser Behandlung wird die über die Absorption bei 2800A kontrollierte spezifische Aktivität auf das Zwei- oder Mehrfache erhöht.

Für die Gelfiltration können auch Gelpulver der gleichen Zusammensetzung wie vorstehend angegeben mit einem Fraktionsbereich für Molgewichte von 1000 bis 100 000 oder 100 000 bis 200 000 oder auch ein Polyamidtypgel verwendet werden, die im Handel z. B. unter den geschützten Warennamen Sephadex G-100® und Sephadex G-200 ® oder Bio-Gel ® erhältlich sind.

Die durch Gelfiltration erhaltene Flüssigkeit wurde durch Filtrieren sterilisiert und das Filtrat als solches oder nach Gefriertrocknung konserviert. Es kann bei Fehlgeburten oder Operationen an der Lunge, Prostata od. dgl. verabreicht werden.

Die Ausbeute und Reinigungswirkung der beschriebenen Arbeitsweise erreicht im allgemeinen folgende Werte:

Die aus 200 Placentas extrahierte Urokinaseinhibitormenge beträgt 3 bis 4 · 10⁸ Einheiten, von denen nach Gelfiltration noch 4 bis 6 ■ 10⁷ Einheiten vorliegen, so daß bei der Reinigung eine Ausbeute von 10 bis 15 °/o erhalten wird.

Weiter wurde die Reinigungswirkung durch Absorptionsmessungen bei 2800 und 4100A geprüft und dabei eine Erhöhung der spezifischen Aktivität

bzw. Menge an Protein um das 40- bis 50fache und an gefärbter Komponente um das 150- bis 200fache festgestellt.

Bei intravenöser Injektion von 400 Einheiten des gereinigten Urokinaseinhibitors bei zehn Mäusen mit einem Körpergewicht von etwa 'iOg wurden keine Abweichungen vom normalen Verhalten und Gewicht und beim Sektionsbefund festgestellt. Danach sollten einem Erwachsenen mit Sicherheit etwa 1 Million Einheiten verabreicht werden können.

Da noch 5 bis 10% Urokinaseinhibitor in der e-trahierten Placenta enthaiten sind, ist eine nochmalige Extraktion und Reinigung in analoger Weise durchführbar, um auch diese Reste zu gewinnen.

Claims (1)

1. keine stärkeren Blutungen auf, während bei einer

   Patentanspruch: vorzeitigen Placentalösung oft akute Hämorrhagien

   auftreten, die auf eine unvollständige Bereitschaft die-

   Verfahren zur Gewinnung eines Urokinase- sesAbwehrmechanismus zuriickzufünren sein dürften. inhibitors, g e k e η η ζ e i c h η e t d u r c h wäßrige 5 Der Erfindung hegt die Erkenntnis zugrunde, daß Extraktion von frischer bzw. frisch gehaltener ein Urokinaseinhibitor in sehr großer Menge in der menschlicher Placenta; Ausfällung der Proteine nach der Geburt ausgestoßenen menschlichen PIamit Ammoniumsulfat bei einer Konzentration centa vorhanden ist. Dieser aus frischer bzw frisch von zumindest 30 «/. Sättigung, vorzugsweise nach gehaltener menschlicher Placenta isoherte Urokmaseeiner vorangehenden Ausfällung von Verunreini- io inhibitor besteht aus zwei bei pH d,0 bis 7,3 stabilen gungen durch Ansäuern auf pH 3 bis 4 und an- Proteinen mit einem Molekulargewicht von 4j 000 schließendes Neutralisieren; Behandlung der in bzw. 70 000, die hinsichtlich ihres elektrophoretischen Wasser wieder gelösten, entsalzten Proteine mit Verhaltens zu den a-Globulinen gehören und hineinem Kationenaustauscher bei pH 5,0 bis 7,5; sichtlich ihrer Löslichkeit in Wasser Pseudoglobuline und abschließende Gelfiltration mit einem Mol- 15 sind. Er wird durch Aufheizen über 50 L inaktiviert, gewicht Fraktionierungsbereich von 1000 bis und sein isoelektnscher Punkt liegt bei etwa pH 4,8 200 000 des eingeengten Filtrats der Kationen- bis 4,9. Dieser kann prinzipiell durch wäßrige Extrakaustauscherbehandlung tion aus der Placenta gewonnen werden. Da jedoch

   ein solcher Extrakt noch verschiedene Verunreini-10 gungen enthält, kann er in dieser Form nicht für klinische Zwecke angewendet werden. Gegenstand der Erfindung ist mithin ein Verfahren zur Gewinnung eines für klinische Zwecke verwendbaren Präparates durch Extraktion und Reinigung.
   25 Dieses Verfahren ist gekennzeichnet durch wäßrige Extraktion von frischer bzw. frisch gehaltener menschlicher Placenta; Ausfällung der Proteine mit Ammoniumsulfat bei einer Konzentration von zu-

   Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewin- mindest 3O°/o Sättigung, vorzugsweise nach einer nung eines Urokinaseinhibitors. 30 vorangehenden Ausfällung von Verunreinigungen

   Im menschlichen Blut und den Geweben sind durch Ansäuern auf pH 3 bis 4 und anschließendes Sowohl ein System zum Ausfäl.en von Fibrin Neutralisieren; Behandlung der in Wasser wieder (Koagulationssystem) als auch ein System zum Ab- gelösten, entsalzten Proteine mit einem Kationenbauen bzw. Auflösen des koaguliertcn Proteins austauscher bei pH 5,0 bis 7,5 und aoschließende (fibrinolytisches System) vorhanden, zwischen denen 35 Gelfiltration mit einem Molgewicht Fraktionierungs-Im Normalzustand ein Gleichgewicht besteht. Wird bereich von 1000 bis 200 000 des eingeengten Filtrats dieses gestört, so treten bei Überwiegen des Koagu- der Kationenaustauscherbehandlung,
   lationssystems Thrombosen od. dgl. auf, während es Die Herstellung des ersten wäßrigen Extraktes

   bei Vorherrschen des fibrinolytischen Systems zu erfolgt mit Wasser oder einer verdünnten wäßrigen Hämorrhagien kommen kann. 40 Salzlösung.

   Wenn im Blut vorhandenes Plasminogen zu Pias- Unter menschlicher Placenta soll hier Placenta

   min aktiviert wird, zersetzt letzteres das Fibrin oder verstanden werden, die unmittelbar nach der Abschließlich das Fibrinogen, so daß eine Fibrinolyse stoßung eingefroren wird und im gefrorenen Zustand auftritt. Urokinase, die bekanntlich im Urin vor- bis unmittelbar vor der Extraktion und Reinigung kommt, fördert die Umwandlung von Plasminogen 45 konserviert wird, da es praktisch unmöglich ist. eine in Plasmin, und es ist nachgewiesen worden, daß die größere Anzahl frischer Nachgeburten auf einmal zu Urokinase bei Thrombosefällen wirksam ist, bei erhalten.

   denen die fibrinolytische Aktivität relativ gering ist. Der erfindungsgemäß gewonnene Urokinaseinhi-

   !Hämorrhagien, die bei einer übermäßigen Erhöhung bitor unterdrückt bei vorheriger parenteraler Verabder fibrinolytischen Aktivität auftreten, werden oft 50 reichung Hämorrhagien, wie sie z. B. bei Fehlbei Fehlgeburten und Operationen an der Lunge, geburten und Operationen an der Lunge, Prostata Prostata u. dgl. beobachtet. u. dgl. auftreten.

   Es ist ferner bekannt, daß zusätzlich jeweils eine Die Urokinaseinhibitorwirkung wird nach folgenantagonistische Beziehung zwischen einer aktivieren- dem Verfahren gemessen: Bringt man auf eine Fibrinden und einer inhibierenden Wirkung besteht. So ist 55 platte, die durch Zusatz von Thrombin zu Fibrinogen z. B. bekannt, daß im fibrinolytischen System das gebildet wurde, einen Tropfen einer Urokinaselösung aktivierte Plasmin und das Antiplasmin, das das und »entwickelt« die geeignet abgedeckte Platte bei Plasmin inhibiert, in antagonistischer Beziehung zu- 37 C im Brutschrank, so werden aus der Platte einander stehen. kreisförmige Flächen herausgelöst, deren Abmes-

   Ein Faktor, der insbesondere die Urokinase inhi- 60 sungen von der Aktivität der verwendeten Urokinasebiert, ist im Blut, wenn auch nur in kleiner Menge, lösung abhängen. Das Produkt der beiden senkrecht vorhanden. Dieser Urokinaseinhibitor nimmt wäh- aufeinanderstellenden Durchmesser der aufgelösten rend einer normalen Schwangerschaft von ihrer Fläche wird als die Lysisfiäche definiert, und es exiletzten Phase bis zur Geburt deutlich zu, erreicht sein stiert für ein bestimmtes Volumen an Urokinase-Maximum unmittelbar vor der Geburt und kehrt 65 lösung und eine bestimmte Inkubationszeit bei 37 ¹C nach der Geburt sehr schnell auf seinen normalen eine bestimmte Beziehung zwischen der Urokinase-Wert zurück. Bei einer normalen Geburt nach Ab- aktivität der aufgebrachten Lösung und der Lysisstoßen der Placenta im Mutlerkörper treten daher fläche. Ist nun die Lysisfiäche, die durch gleiche