DE1915170A1

DE1915170A1 - Verfahren zum Nachweis der in der Elektrophorese vorkommenden Zonen und zur quantitativen Bestimmung der Stoffe darin

Info

Publication number: DE1915170A1
Application number: DE19691915170
Authority: DE
Inventors: Virtanen Rauno Erkki; Pekka Kivalo
Original assignee: VIRTANEN RAUNO ERKKI
Current assignee: VIRTANEN RAUNO ERKKI
Priority date: 1968-03-27
Filing date: 1969-03-25
Publication date: 1970-08-27
Also published as: FI41214B; US3649499A; DE1915170B2; SE347112B; GB1196887A; DE1915170C3

Description

P AY 2 W Ϊ ANWKLTl:

m ivSm ύ UUVw/üll

Dipl.-Chem.

Dipl.-Jng,

Dipl.-Chem.

8000 MÜNCHEN 2

TAL 33

TELEFON 0811 /22 68 94

TELEGRAMMADRESSE: THOPATENT

München 25- März 1969 case 724/JS/ht - ? 3o72

Rauno Erkki Virtanen

Otaniemi / Finnland und

Pekka Kivalo
Helsinki / Finnland

Verfahren zum Nachweis der in der Elektrophorese vorkommenden Zonen und zur qauntitativen Bestimmung der Stoffe darin

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Nachweis der in der Elektrophorese vorkommenden Zonen.und zu ihrer quantitativen Auswertung. Insbesondere bezieht sie sich auf ein Verfahren, bei dem die Änderungen, die sich durch Einfluß der Probe in dem vom Elektrophoresestrom hervorgerufenen Potentialgradienten ergeben, dazu herangezogen v/erden, die Wanderungsgeschwindigkeit der Probe und. auch die Menge der Probe anzugeben.

9835/1635

Die Verwendung der Elektrophorese in der Analytik gründet sich auf die verschieden· große Geschwindigkeit in Lösung befindlicher verschiedenartiger geladener Teilchen . im elektrischen Feld. Diesem Umstand zufolge trennen sich die verschiedenen Komponenten der untersuchten Probe voneinander, !«mach sie getrennt bestimmt werden können.

In der qualitativen Analyse muß man den Ort der Zonen der verschiedenen Komponenten in der Elektrophoresephase oder deren Wanderungsgeschwindigkeit sowie in der quantitativen Analyse fernerhin auch die Stoffmenge in jeder Zone angeben. Die am allgemeinsten benutzten Verfahren sind folgende ; '

1. Die Elektrophorese wird in einem Gefäß durchgeführt, durch welches man Licht hindurchschickt, mittels dessen der Brechungsindex der Flüssigkeitssäule an jeder betreffenden Stelle gemes.sen wird. Aus der Änderung der Brechungszahl kann man den Ort und die Stoffmenge der Zone bestimmen.

2. Die Zonen werden photometrisch gemessen. Die Messunr kann Punkt für Punkt über die Zonen hinweg erfolgen, oder man läßt das Papier oder die sonstige Phase automatisch.am Meßinstrument vorbeilaufen und die Absorbtion an jeder Stelle von der Apparatur aufzeichnen.

009835/1635'

3· Die Zonen in der stabilisierten Phase, wie z.B.. in Papier, die beispielsweise durch Färben gekennzeichnet worden sind, werden herausgeschnitten und die in ihnen befindliche untersuchte Substanz wird extrahiert. Die extrahierte Probe kann dem gewünschten Analyseverfahren unterzogen
werden.

4. Die Probe wird mit Radionukleiden gezeichnet. Von
den Zonen kann ein Autoradiogramm hergestellt werden, oder
sie können mit Hilfe eines Zählgeräts ebenso wie farbige
Zonen mit dem Densitometer ausgemessen werden.

5. Man hat die elektrische Leitfähigkeit in der Elektrophoresezelle als Funktion des Wegs oder der Zeit gemessen.
Hierbei hat man sich stets einer gesonderten Leitfähigkeitsmessbrücke bedient. Man hat in die Elektrophoresezelle Meßelektroden eingebracht, oder der Elektrolyt ist nach erfolgter Elektrophorese durch eine Leitfähigkeitszelle hindurchgeleitet worden.

Diese Verfahren besitzen u.a. folgende Nachteile.
Erstens ist deren Genauigkeit nicht immer hinreichend.
Zweitens können sie mühsam-und zeitraubend sein, und einige der Messungen können erst im Anschluß an die Elektrophorese als gesonderte Maßnahme vorgenommen werden. Dies ist beson-

0 0 98 3-5/163.5

ders nachteilig' bei der Hochspannungs-Elektrophorese, bei- : welcher die Trennung selbst sogar in wenigen Minuten er.- ■· ., folgen kann. · -'-.''■

Die Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß im- Eielc- .'. trophoresesystem das elektrochemische Potential einer zwischen den Endelektroden an gegebener Stelle zwischen den Elektroden eingesetzten oder damit mittels einer Salzbrücke verbundenen Elektrode oder dessen Änderung in Bezug auf irgendeine Bezugselektrode als Punktion der Zeit gemessen . wird. ■ ■ . ■

Mittels der vorliegenden Erfindung können die· Wände- . rungsgeschwindigkeit der Zonen und die darin befindlichen ..-. Stoffmengen im Verlauf der Elektrophorese selbst angegeben werden.-Die Angabe erfolgt elektrisch mit Hilfe des Elektrophoresestroms und ihre Grundlage sind die von den. Zonen, hervorgerufenen Änderungen im Potentialgradienten.

Es sei. angenommen, die Verhältnisse im Elektrophoresesystem seien konstant, so daß in demselben keine anderen · Veränderungen als das Wandern der Zone stattfinden. Hierbei, ist der Widerstand der Elektrophoesephase in jedem Punkt konstant und der vom EJ ekt rqpho.ras.es t rom bewirkte -Potentialgradient ist ebenfalls konstant. Die Probesuhstanz ruft je- dpe.h,Änderungenvinder^Leit,fäMgli:ßä;te d^.. Ejkgjcftrophpreseüha^e

0ύ9835/16§|₀

BAD ORIGINAL

hervorj womit sich bei der Zone auch im Potentialgradienten eine Änderung ergibt. Also läßt -sich durch Messen des Potentialgradienten an einer gegebenen Stelle als Punktion der Zeit der Vorbeigang der Zone an dieser Stelle anzeigen. Der Betrag der Gradientenänderung wiederum gibt die Stoffmenge in der Zone an.

Das allgemeine Prinzip der Messung geht aus Fig. 1 hervor. Zwischen den Endelektroden wird das Potential in zwei Punkten E- und Ep gemessen. Wie später dargestellt werden wird, kann der eine Messpunkt die eine Endelektrode sein. Die Potentialdifferenz zwischen diesen hält sich konstant (U), bis die Zone Z zwischen den Messpunkten anlangt, wobei die Potentialdifferenz irgendeinen anderen Wert (U) annimmt. Durch Kompensieren der konstanten Spannung U läßt sich die Änderung AU = U- - U der' Potentialdifferenz allein messen, die also die Änderung des Potentialgradienten auf der Strecke 1 ausmacht.

Die Erfindung wird nachstehend anhand einiger Ausführungsformen unter Bezugnahme auf die Zeichnungen näher beschrieben.

Fig. 2 zeigt im Schnitt eine Vorrichtung nach der Erfindung;

Fig. 3 zeigt die Schaltzeichnung der Vorrichtung, zum

00 98 3 57.163 5

■ Teil als Blockdiagramm;

Pig. 4 zeigt ein zweites Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung nach der Erfindung, und

Pig. 5 zeigt einen Teilausschnitt dieser Ausführungsform in größerem Maßstab.

Die Erfindung wurde mit Vorrichtungen nach den Zeichnungen in der'Zonenelektrophorese ausgeführt. In der Vorrichtung nach Fig. 2 erfolgt die Elektrophorese in der Glaskapillare K mit o,45 mm Innendurchmesser und 7 mm Außendurchmesser. Die Elektrophoresekapillare K' und die Elektrodengefäße D werden mit dem Grundelektrolyten gefüllt. Durch Bedienen der Hähne C können mittels Sogs die Seitenrohre . gefüllt werden, in denen die Elektroden E und E¹ sitzen, die. z.B. aus Platindraht hergestellt sind. Die Probe kann mittels des Vierweghahns A in die Kapillare eingeführt werden. Die Elektroden B werden an den positiven oder negativen- Pol der Spannungsquelle gelegt, je nachdem man auf Kationen oder Anionen analysieren will. Das Potential der Elektroden E und. E' in Bezug auf das geerdete Elektrodengefäß ergibt sich aus den Spannungsabfällen in den Kapillaren über die Strekken 1 und I¹. der Apparat ist derart gebaut, daß diese Spannungsabfälle nahezu gleichgroß sind. Mit Hilfe des Potentiometerwiderstands P- kann der eventuelle Unterschied kompensiert oder der Unterschied-auf gewünschte Größe eingestellt werden. Bei konstanten Verhältnissen hält sich der Potential-

009835/1635

BAD ORIGINAL

wert der Elektroden konstant. Das Wandern der Probenzone durch den Kapillarenabschnitt 1 hindurch in das geerdete Elektrodengefäß gibt sich nun-durch eine Änderung des Potentials der Elektrode E zu erkennen, die zugleich die Änderung der Potentialdifferenz zwischen den Elektroden E und E¹ ist. Diese Änderung wird mit Hilfe eines wenig Strom aufnehmenden Potentiometers P gemessen, woran ferner ein Schreiber G angeschlossen ist. In.dem in Pig. 3 dargestellten Schaltschema bezeichnen die Widerstände R, und R¹, die Widerstände der Kapillaren K bzw. K¹, und der Widerstand R_D stellt den Widerstand des geerdeten Elektrodengefäßes dar, der jedoch im Vergleich zum Widerstand- der. Kapillaren sehr gering ist. Für die Dauer der Messung wird der "Apparat in ein thermostatisch geregeltes Viasserbad getaucht, so-daß die Kapillaren unter Wasser liegen...

Eine nach dem gleichen Prinzip arbeitende, aber etwas verschieden gebaute Vorrichtung ist in. Pig. M -dargestellt>. ■ Auch hier erfolgt die Elektrophorese in der Kapillare K. Die-Probe--wird, mit einer Mikrospritze mit ".dünner Spit-ze. mit. Hilfe der-Leitkapillare A in die Elektrophoresekapillare .injiziert. Die Elektrode E befindet:sich in-einem an seinem Ende kapillar; ausgezogenen Rohr. .Der Kapillarabschnitt, wird mittels, einer -Einstellvorrichtung um. die Strecke. 1 in ..die ....... ElektrophoresekeLpiLlare^hineingeschoben, und zwar.-kann er mit

BAD ORIGINAL

Hilfe der Einstellvorrichtung in drei zueinander senkrechten Ebenen bewegt werden. Die Elektrodenkapillare wird mit dem gleichen Elektrolyten wie die übrige Vorrichtung gefüllt. Die Potentialdifferenz zwischen der Elektrode E und Erde ergibt sich praktisch gänzlich in der Kapillare auf der Strecke 1 (mit Ausnahme des Potentials der Endelektrode in Bezug auf die Lösung, das jedoch unter Anwendung einer reversiblen Elektrode konstant gemacht werden kann), denn die Querschnittsfläche des Elektrodengefäßes ist sehr groß im Vergleich zum Querschnitt der Kapillare. Das Potential zum Kompensieren wird vom Regelwiderstand R abgegriffen. Die Elektrophoresekapillare läuft vom einen Elektrodengefäß zum anderen durch den Raum B hindurch, irr welchem die Temperatur konstant gehalten werden kann.·

Ausgeführte Versuche haben ergeben, daß der Betrag der gemessenen Potentialänderung sowohl bei Kationen als auch bei Anionen zur Konzentration der Probelösung linear proportional ist. Es ist festgestellt worden, daß mit Hilfe der Vorrichtungen die Trennung verschiedener Ionenarten voneinander sowie die Messung ihrer Geschwindigkeiten reproduzierbar erzielt wird.

00 98 35/163 5

Claims

Patentansprüche

3 Verfahren zum Nachweis der bei der Elektrophorese ■

vorkommenden Zonen und zur quantitativen Bestimmung der Stoffe darin, dadurch gekennzeichnet, daß im Elektrophoresesystem das elektrochemische Potential einer an gegebener Stelle zwischen den Elektroden eingesetzten oder damit mittels einer Salzbrücke verbundenen Elektrode oder "dessen Änderung in Bezug auf irgendeine Bezugselektrode als Punktion der Zeit gemessen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bezugselektrode im gleichen Elektrophoresesystem angewendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bezugselektrode in einem zweiten zum Elektrophoresesystem parallel geschalteten Elektrophoresesystem angewendet wird, in welches keine Probe eingebracht wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Potential der Bezugselektrode von einem zum Elektrophoresesystem parallel geschalteten .Regelwiderstand abgegriffen wird.

009835/1635

JO

- 4ο- -
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche ₃ dadurch gekennzeichnet, daß die Elektrophorese in einer - Kapillare vorgenommen wird, in der das Potential an einer bestimmten Stelle mittels einer durch das Ende der Kapillare in dieselbe hineinschiebbaren Elektrode oder mit Hilfe einer an die Elektrode angeschlossenen Salzbrücke ger messen wird..

009835/1635

Leerseite