DE1914081A1 - Verfahren zur Herstellung eines Antistreptolysin-Reagenzes - Google Patents

Description

• Verfahren zur Herstellung eines Antistreptolysin-Reagenzes Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines -ntistreptolysin-Reagenzes.
• Das Streptolysin O ist ein Stoffwechselprodukt der für den Menschen pathogenen Streptokokken. Bei Infektionen it diesen Keimen, z.B. bei Rheumatismus, werden im Organismus des Patienten antikörper - unter anderem gegen Streptolysin O - gebildet. Qnttkörper gegen Streptolysin 0 belzeichnet man als rntistreptolysin.
• Zum Nachweis einer Streptokokken-Infektion kann die Bestimmung dieses Antikörpers herangezogen werden.
• Bisher wurde Antistreptolysin im sogenannten Röhrchentest nachgewiesen, der darin besteht, daß man Patientenserum in Röhrchen fallender Verdünnung mit konstanten Mengen Strettolysin O reagieren lässt. Diese Reaktion wird durch die Haemolyse zugegebene Erythrozyten vorhanden sind, das heisst er ist somit an eine Tierhaltung gebunden.
• Versuche, diesen Test zu vereinfachen und Antistreptolysin mittels eines an Polystyrollatex adsorbierten Streptolysins O nachzuweisen, haben nicht zum Erfolg geführt, da die Adsorptionsverbindung Polystyrollatex und Streptolysin-O nicht haltbar ist.-Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung eines Antistreptolysin-Reagenzes gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, daS man treptolysin 0 mittels l-tminobenzol-b-3-hydroxyäthylsulfonschwefelsäureester an ein Polysaccharid kuppelt und diesen Komplex an Polystyrollatex adsorbiert, Das erfindungsgemäß herstellbare Präparat hat den Vorteil, daß mit ihm ein einfacher und billiger Test zum Nachweis von Antistreptolysin ausgeführt werden kann, der innerhalb weniger Minuten auf einem Glasplättchen ausgeführt werden kann. Mit dem Verfahrensprodukt verfügt der Arzt über ein Präparat, mit dem er ohne technische Hilfsmittel eine Streptokokkeninfektion diagnosti zieren kann.
• Das erfindungsgemäße Verfahren kann vorzugsweise folgendermaßen durchgeführt werden: Man löst zunächst das Polyseccharid in schwach alkalischer Lösung bei einem pR-Wert von etwa 8,5 bis 11, vorzugsweise 10 bis 10,5. Am besten eignet sich hierfür ein Phosphatpuffer; auch Natronlauge kann verwendet werden. Die erhaltene- Lösung wird dann mit einer Lösung von I-rrninobenzol-4-ß-hydroxyäthylsulfonschwefelsäureester zur Reaktion gebracht.
• Es können molare oder in geringem flberschuß angewandte ?4engen eingesetzt werden. Nach etwa einer Viertel-bis einer Stunde, vorzugsweise einer halben Stunde, wird mit einer mineralischen Säure, wie beispielswelse Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure auf einen pH-Wert von 2,5 bis 4, vorzugsweise 3 angesäuert, auf ca O bis 50C abgekühlt, mit einer Natriumnitritlösung versetzt, nech etwa 5 Minuten mit einer Lauge neutralisiert, eine Lösung von Streptolysin O zugegeben und anschließend etwa 12 bis 48, vorzugsweise 24 Stunden gegen vorzugsweise 0,1 molaren Glycin-natronlauge-Puffer vom pH-Wert 8,5-dlalysiert, dtr 1 Mol Natriumchlorid und 0,02 Mol Natriumazid enthält. Danach versetzt man unter Bohren die dialysierte Lösung mit einer vorzugsweise Uberschüssigen, instesondere 0,5 bis liegen, vorzugsweise Q,6S;iger.
• Polystyrollatex-Suspension, vorzugsweise in dem oben genannten Glycinpuffer. Das so gewonnene Präparat besitzt den weiteren Vorteil, daß es stabil und von guter Haltbarkeit ist.
• Fls erfindungsgemäß einsetzbare Polysaccharide kommen beispielsweise in Prage Dextrane, Stärke und deren Abbauprodukte, wie z.B. Dextrin, sowie Inulin und das synthetische Polysaccharid Fleoll (R).
• Der Antistreptolysintest kann in einer bevorzugten Ausführungsform folgendermaßen durchgeführt werden: Es werden 200 trotkenes Streptolysin 0 in 5 ml physiologischer KochsalzlöEung gelöst und davon 0,4 ml mit 0,1 ml des Patientenserums vermischt. Nach 15 Minuten verrührt man 0,05 ml des Gemisches auf einem Glasplättchenmit einem Tropfen des erfindungsgemäßen Präparates und bewegt das Glasplättchen 4 - 6 Minuten. Bei positiver Reaktion ballen sich die Latexpartiel zusammen und werden als weisse grobe Flocken sichtbar.
• Beispiel 2430 mg Dextran 500 (Pharmacia, Uppsala, Schweden) werden in 15 ml einer 0,5 molaren Natriumphosphat-Lösung, pH 10,3, die 13,75 ml 0,5 molare Dinatriumhydrogenphosphnt-Lösung, und 1,25 ml Trinatriumphosphat-' GSUng enthalt, gelöst. Dieser Lösung setzt man unter Rühren 3,75 ml einer 1 molaren Lösung von l-omlnobenzol-4-2-hydroxyethylsulfo-schwerels2'ureester zu.
• Nach 2 Stunden säuert man die Lösung mit 13,2 ml 2 molarer Salzsäure an und kühlt auf 00C..Zur Diazotierung der Aminogruppen wird die Lösung dann mit 4 ml einer ebenfalls auf 0°C vorgekühlten 1 molaren Natriumnitrit-Lösung versetzt und 5 Min bei OOC gehalten.
• Nach Neutralisation mit 13,5 ml 2 molarer Natronlauge rührt man 15 ml einer Lösung von 525 mg Streptolysin 0 mit 2600 E E'mg in den Diazotierungsansatz ein. Nach einsttndigem Rühren wird das Reaktionsgemisch während 24 Stunden gegen 3 x 2 Liter eines 0,1 molaren Glycln/liatronlaugepuffers, pH 8,6, mit einen Zusatz von 1 Mol Natriumchlorid und 0,02 Mol Natriumazid dinlysiert.
• Die dialysierte Lösung versetzt man nun unter Rühren mit 340 ml einer 0,6%igen Polystyrollatex-Suspension, die durch Verdünnen mit dem oben beschriebenen Glycinpuefer aus einer 30%igen coann-@@@ suspension (Polystyrene Latex der Firma The british Dru-Houses Ltd.) hergestellt worden ist.
• Das auf diese Weise erhaltene Präparat wurde bei 5, 20 und 370C aufbewaht und nach 8 Monaten mit einembisch gewonnenen Präparat verglichen. Mit beiden Präparaten wurden Übereinstimmende Test ergebnisse erzielt.

Claims (2)

Patentans prüche

1. Verfahren zur Herstellung eines Antistreptolysin-Reagenzes, dadurch gekennzeichnet, daß man Streptolysin 0 mittels i-Aminobenzol-4-ß-hydroxyäthylsulfonschwefelsäureester an ein Polysaccharid kuppelt und diesen Komplex an Polystyrollatex adsorbiert.

2. Antistreptolysin-Reagenz, gekennzeichnet durch einen Gehalt an gemäß Patentanspruch 1 hergestellter Vebindung.