DE1900798C

DE1900798C - Reagens für den Rheumatoidagglutiniertest

Info

Publication number: DE1900798C
Application number: DE19691900798
Authority: DE
Inventors: Yutaka Tokio; Nagai Hidetaka Hachioji; Mizushima (Japan)
Original assignee: KowaCo., Ltd., Nagoya (Japan)
Filing date: 1969-01-08
Publication date: 1973-03-15

Description

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Die Erfindung betrifft ein Reagens für den Rheum.iloidagglutinierteM, welches zur Feststellung des Rheumatoidfaktors im (Jesamtblut als auch im Serum verwendet werden kann, ein Verfahren, wie ·;5 bisher nicht möglich war. das ausgezeichnete Ergebnisse hinsichtlich Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit bei der Feststellung ergibt. Das Feststellungsverfahren ist den üblichen Verfahren hinsichtlich der einfacheren Versuchsanordnung überlegen. Gemäß der Erfindung wird ein Reagens für den Rheumatoidagglutinienest gescha!T:n, das mit -'-Globulin überzogene Teilchen, die durch Kontaktieren eines Ionenaustauschharzes mit mensch! cher.i --Globulin in einer gepufferten Salzlösung gebildet wurden, und als Hilfsmittel ein hämolytisches Mittel und oder Färbungsmittel für ,-Globulin in einer gepufferten Salzlösung mit einem pH-Wert von 7,5 ± 1.5 enthält.

Dieses Reagens kann bevorzugt mindestens ein weiteres Hilfsmittel aus der Gruppe von Kon· Jivierungsmitteln und Stabilisatoren enthalten.

Es ist bekannt, Rheumatismus serologisch durch Diagnose festzustellen, wobei mit -/-Globulin überzogene /eilcr en verwendet werden, die aus den roten Blutkörperchen der Schafe und einem Anti-Schafsantikörper der Kaninchen gebildet sind. Wenn diese mit -/-Globulin überzogenen Teilchen mit dem von Menschen hergestellten Serum venriischt werden, findet eine Agglutinierung statt, wen- der RheumatoH-faktor vorhanden ist, und es findet keine Agglutinierung in Abwesenheit dieses Faktors statt. Dieses Diagnoseverfahren wird als Waaler-Rose-Test bezeichnet und häufig einfach als Rose-Test bezeichnet. Als Modifizierung dieses Tests ist die Heller-Modifikation bekannt, wodurch die Ungenauigkeit der Be-Stimmung des Rose-Tests verbessert wurde.

Weiterhin ist auch ein Verfahren bekannt, bei dem als mit -/-Globulin überzogene Teilchen solche verwendet werden, worin ein Polystyrollatex an Stelle der roten Blutkörperchen und natives oder aggregiertes menschliches y-Globulin an Stelle des vorstehenden Antikörpers verwendet wird (RA-Tes't), und ein Verfahren bekannt, bei dem als mit y-Globulin überzogene Teilchen solche eingesetzt werden, worin Teilchen eines Absorbiermittels, wie Bentonit, Kaolin und roher Latex, an Stelle des Polystyrollatex beim vorstehenden RA-Test, verwendet werden.

Das wesentlichste Merkmal der vorliegenden Erfindung liegt in der Anwendung eines Ionenaustauschharzes als Absorbiermittcl.

Wie vorstehend ausgeführt, wurde bei sämtlichen vorhergehend aufgeführten Verfahren Serum zur Bestimmung des Rheumatoidfaktors verwendet. Dadurch tritt der Nachteil auf, daß das Serum aus dem Gesamtblut, das abgenommen wurde, abgetrennt werden muß sowie das Serum verdünnt werden muß. Deshalb ist es in der Praxis nicht einfach durchführbar, da es notwendig ist, ein ziemlich gut ausgestattetes Laboratorium zur Verfügung zu haben.

Andererseits zeigt sich im Fall der vorstehend aufgeführten mit -/-Globulin überzogenen Teilchen, die aus Polystyrollatex und ·/·Globulin bestehen, obwohl dort der Vorteil auftritt, daß der Latex eine leicht mit genauer Reproduzierbarkeit nach einem einfachen Verfahren herstellbare Verbindung ist, der Nachteil, daß auf Grund solcher Faktoren, wie Modifizierung des /-Globulins und nicht spezifische Agglutinierung des Harzes, nicht nur die Stabilität schlecht ist, sondern auch die Genauigkeit der Feststellung unzureichend ist. μ) daß der Nachteil auftritt, daß bei der Abschätzung der Ergebnisse des Tests eine beträchtliche Erfahrung erforderlich ist.

Obwohl die Gründe für die vorstehenden Fehler nicht klar sind, durfte anzunehmen ein. daß die Bindung /wischen den Teilchen des Polvstvrollatex und des --Globulins schwach ist und weiterhin, daß das -/-Globulin in einem gegenüber den Versuchsbedingungen übermäßigen Ausmaß während der Konservierung des Reagens modifiziert wurde und die% die Hauptursachen für den Fehler darstellen.

Auf Grund umfangreicher Untersuchungen im Hinblick auf die Überwindung dieser /ahlreichen Nachteile und Mänge; wurde gefunden, daß als mit y-Globulin überzogene Teilchen solche, die aus einem Ionenaustauschharz und menschlichem --Globulin bestehen, verwendet werden können und daß durch Anwendung derartiger Teichen der komplizierte Seruiiiverdünnungsarbeitsgang vermieden werden kann, obwohl auch Serum für den Test verwendet werden kann. Es wurde weiterhin festgestellt, daß ein Diagnosereagens erhalten werden konnte, das auch zur Bestimmung aus dem Gesamtblut verwendet werden kanu. Außerdem wurde festgestellt, daß dieses Reagens nicht nur eine ausgezeichnete Feststellungsempfindlichkeit und Feststellungsgenauigkeit besitzt, sondern auch eine ausgezeichnete Stabilität zeigt, ganz gleich ob es zur Untersuchung von Serum oder von Gcsamtblut verwendet wird. Es wurde auch festgestellt, daß das zur Herstellung dieser mit y-Glubulin überzogenen Teilchen verwendete Ionenaustauschharz leicht zugänglich ist und daß der Arbeitsgang zur Herstellung dieser Teilchen einfach ist.

Eine Aufgabe der Erfindung besteht in einem Reagens für den Rheumatoidagglutinienest. das eine ausgezeichnete Stabilität besitzt und eine überlegene Feststellungsempfindlichkeit sowie überlegene Genauigkeit der Feststellung zeigt. Eine weitere Aufgabe besteht in einem Verfahren zur Herstellung dieses Reagens. Eine weitere Aufgabe besteht in einem Verfahren zur Diagnose i-nter Anwendung dieses Reagens.

Andere Aufgaben und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung.

Die mit -/-Globulin überzogenen Teilchen, die auf Grund ihrer Anwesenheit im erfindungsgemäßen Reagens für den Rheumatoidagglutiniertest Agglutinierungen durch Umsetzungen mit dem Rheumatoidfaktor ergeben, können durch Kontaktierung eines Ionenaustauschharzes mit menschlichem -/-Globulin in einer gepufferten Salzlösung hergestellt werden.

Als gepufferte Salzlösungen sind wäßrige Salzlösungen verwendbar, deren pH-Wert auf 7,5 ± 1.5,

jevoizugt 6,5 bis 8.5, und besonders bevorzugt auf 7 5 jis S.5. unter Anwendung eines sauren Bestandteil·; beispielsweise Glykokoll, Kaliumdihydrogenphosphat, Borsäure und Salzsäure und eines basischen Bestandteils, beispielsweis eines Alkalihydroxyds, wie Natriumiiydiüxyd oder Kaliumhydrcixyd, eines Alkalicarbonat, wie Natriumcarbonat oder Kaliumcarbonat und anderen Verbindungen, wie Borax oder Dikaliumhydrogenphosphat, Trishydroxyaminomeihan. eingeregeK wurde. Besonders bevorzugt werden Pufferlösunken, bei denen Glykokoll und Natriumhydroxyd verwendet wurden.

Die gebildeten mit y-Globulin überzogenen Teilchen können aus der gepufferten Salzlösung, worin sie gebildet wurden, abgetrennt werden und in einer getrennt hergestellten gepufferten Salzlösung suspendi··'·: werden, worauf entweder ein hämolytisches Mi.;.- oder ein 1 ärbungsmittel. das das --Globulin fiirv:i kann, zugesetzt werden können. Andererseits kr:, on .!UlIi das hämolytisehe Mittel oder das larb'JMjMnil.J /u der Pufferlösung zugegeben werden. W---<i die mit ---Globulin überzogenen Teilchen ge bi ; i wurden, ohne daß die Teilchen hieraus ahgeu.nni wurden. Deshalb muß der nH-Wert der gepul.rten Sal/iosung nicht notwendigerweise au! den /u· Herstellung der vorstehenden Teilchen aul'gef.!¹UCIi pH-Wert eingeregelt werden, und die Einstel-Iu:; des pH-Vv'ertes auf 7,5 ± 1.5. bevorzugt 6.5 bi x.5. und bt. onders bevorzugt auf 7.5 bis 8.5, b;. ucht nur so durchgeführt werden, daß diese -,o pH-Werte in dem Endprodukt erhalten werden.

!ki der Vereinigung des Ionen;·ustauschharzes mit Oc.11 menschlichen ;-Globulin in der vorstehend aufgefuiirten gepufferten Salzlösung kann der Zusatz der beiden Bestandteile zu der Pufferlösung gleichzeitig erlolüen. oder das Ionenaustauschharz kann zuerst zugesetzt werden und dann das menschliche y-Globulin zugesetzt werden, oder die Zugabereihenfolge der beiden kann in umgekehrter Ordnung erfolgen, d h. Zusatz^ des menschlichen ;,-Globulins und anschließender Zusatz des lonenaustauschharzes. Es ist auch möglich, die beiden Bestandteile getrennt zu zwei Pulferlösungen zuzugeben, die dann vermischt werden.

Es besteht keine spezielle Begrenzung hinsichtlich der Temperatur der Umsetzung, bei der die mit •/-Globulin überzogenen Teilchen gebildet werden, und es ist möglich, diese Umsetzung unter Anwerbung von Wärme oder Abkühlung durchzuführen. Beispielsweise kann die Umsetzung unter Kühlung mit einem Eis-Wasser-Bad durchgeführt werden, oder sie kann unter Erwärmen ausgeführt werden. Bevorzugt wird es jedoch üblicherweise, bei Temperaturen von 0 bis 10 C zu arbeiten.

Beispiele von zur Bildung der mit y-Globulin überzogenen Teilchen verwendbaren lonenaustauschharlen sind solche, die aus der Gruppe von stark sauren lonenaustauschharzen, stark basischen Ionenaustauschharzen und schwach basischen lonenaustauschharzen gewählt wurden. Besonders bevorzugt sind do die schwach basischen Ionenaustauschharz^, um eine zufriedenstellende Verbindung mit dem menschlichen -/-Globulin zu erhalten.

Die Teilchengröße dieser Harze liegt bevorzugt bei einem Durchschnittsteilchendurchmcsscr von 0.5 bis 3 Mikron, und vom Gesichtspunkt der Erzielung einer verbesserten Stabilität für das gebildete Reagens wird es bevorzugt, daß die Teilchen, die in den vorstehend aufgeführten Teilchendurchmesserbereich fallen, 75 Gewichtsprozent, bevorzugt 85 Gewichtsprozent und besonders bevorzugt 90 Gewichtsprozent der gesamten Teilchen ausmachen.

Als spezifische Beispiele für derartige Ionenaustauschharze seien die stark sauren Ionenaustauschharze auf der Basis von sulfoniertem Polystyrolharz vom Na-Typ und vom Η-Typ, sulfoniertem Polystyrolharz vorwiegend vorn Η-Typ und zum Teil vom Na-Typ und Phenolsulfonsäureformaldehydharz sowie sta !. basische Ionenaustauschharze auf der Basis von chlormethylierten Styroldivinylbenzol-Mischpolymerisaten mit einem Gehalt an quarternären Ammoniumgruppen mit unterschiedlichen Mengen an eingeführten Chlormethylgruppen unC unterschiedlicher Basizität und die schwach basischen Ionenaustauschharze auf der Basis von chlormethylierten Polystyroldivinvlbenzol-Mischpohmerisaten mit eingeführtem Diäthylentriamin oder Dimethylamin. Phenolformaldthydharzen mit eingeführtem Polyalkvlcn. PoIyamm oder sekundärem Amin unu Modifikationen hiervon u. a.

Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die mit -/-Globulin überzogenen Teilchen, die aus dem vorstehenden Ionenaustauschharz und mensc iU:hem y-Globulin bestehen, entweder ohne Abtrennung oder mit einer zunächst erfolgenden Abtrennung aus der gepufferten Salzlösung verwendet, worin sie gebildet wurden. Im Fall ihrer Abtrennung werden sie dann zu einer ähnlichen gepufferten Salzlösung, wie sie beschrieben wurde, zugesetzt. In die dabei erhaltene, die mit /-Globulin überzogenen Teilchen enthaltende Pufferlösung wird dann als Hilfsmittel entweder ein hämolytisches Mittel oder ein Färbungsmittel, welches das -/-Globulin färben kann, einverleibt. Weiterhin bevorzugt kann noch mindestens ein weiteres Hilfsmittel aus der Grupp von Konservierungsmnteln und Stabilisatoren einverleibt werden.

Es kann eine einzige Verbindung oder eine Mehrzahl von Verbindungen der hämolytischen Mittel, Färbungsmittel. Konservierungsmittel und Stabilisatoren ein verleib: werden. Es gibt keine Begrenzungen hinsichtlich der Reihenfolge, in der die Hilfsmittel zugesetzt werden. Sie können in jeder beliebigen Reihenfolge zugegeben werden, oder sie können sämtlich zusammen zugegeben werden.

Als hämolytisehe Mittel sind z. B. Saponine. Alkaloide, Salze der Gallensäure. I !a-nsluff, Arylamine und oberflächenaktive Mittel verwendbar. Unter diesen oberflächenaktiven Mitteln sind die anionischen oberflächenaktiven Mittel, wie z. B. Natriumoleat, Natriumlaurylsulfat, Natriumcetylsulfat. Natnumstearylsulfat, Natriumalkylbenzolsulfonat und Dialkylsulfosuccinat, kationische oberflächenaktive Mittel, wie z. B. Alkyltrimethylammoniumchloride, Benzyldimethylalkylammoniumbromide und Cetylpyridiniumchlorid, nichtionische oberflächenaktive Mittel, wie z. B. Polyoxyäthylensorbitanmonolaural. Polyoxyäthylensorbitanmonoolcat, Polyoxyäthylenstearut, Poiyoxyäthylenlaurylalkohol und Polyglykoläther von Alkylphenolcn, amphotcrc oberflächenaktive Mittel vom Typ (A) der Alkyläthylcycloimidiso-1-hydroxy - 3 - äthylnatriumalkoholat - 2 - methylnatriumcarboxylate und Akt.vatoren vom Polyäthylenglykol-Typ (200, 400, 600 und 800) verwendbar. Von diesen hämolylischcn Mitteln sind besonders vorteilhaft die Saponine, Dodceylaminacetat, welches ein Alkylamin darstellt, oder Aktivatoren vom Typ (A).

Das Färbungsmittel kann aus solchen bestehen, die zur Färbung von menschlichem y-Globulin geeignet sind. Hierzu gehören z. B. als rote Farbstoffe PonceauR (CI. 16 150), Ponceau3R (CI. 16 155) und Rose Bengal (CI. 45 440), als grüne Farbstoffe Naphthol Green B und Brillant Green (C. 1. 42040) und als blaue Farbstoffe Evans Blue, brillant Blue FCF (C 1.42 090), Patent Blue (C 1.42 051) und Trypan Blue (CI. 23 850).

Als Konservierungsmittel seien z. B. erwähnt Natriumazid, die Phenole, wie Kresole, Chlorthymol, Thymol und Paraoxybenzoesäureester und die Quecksilberphenyle, wie Quecksilberphenylacetat, Quecksilberphenylsulfat und Quecksilberphenylborat.

Weiterhin können auch Stabilisatoren zur weiteren Erhöhung der Stabilität des Endproduktes zugesetzt werden. Dies gilt besonders für den Fall eines Reagens, welches die mil -/-Globulin überzogenen Teilchen und ein hämolytisches Miitel enthält und das zur direkten Untersuchung des Gesaritblutcs verwendet wird. Da in diesem Fall eine Eluierung von Hämoglobin und anderen Bestandteilen stattfindet, findet gelegentlich bei Anwendung d;s Mittels die Agglutinierung zwischen den mit y-Glooulin überzogenen Teilchen und anderen Faktoren als dem Rheumatotdfaktor statt, so daß die Anwendung eines Stabilisators besonders zu empfehlen ist. Da die Stabilisatoren auch eine N^jung zur Erhöhung der Stabilität des /-Globulins zeigen, können sie auch im Fall eines Reagens, welches die mit y-Globulin überzogenen Teilchen und ein Färbungsmittel enthält, das zur Untersuchung des Serums verwendet wird, eingesetzt werden.

Zu derartigen Stabilisatoren gehören die Serumalbumine, Peptone, Gelatine und Aminosäuren, wie z. B. Acetyltryptophan.

In der. erfindungsgemäßen Reagens können die Mengen, worin die mit y-Globulin überzogenen Teilchen, hämolytisches Mittel, Färbungsmittel, Konservierungsmittel und Stabilisator in der gepufferten Salzlösung enthalten sind, in geeigneter Weise in Abhängigkeit von den Arten der Mittel und ihrer Kombination variiert werden, üblicherweise werden folgende Bereiche angewandt, bezogen auf das Reagens: 0,5 bis 2 Gewichtsprozent, bevorzugt 1 bis 1,5Gewichtsprozent, der mit y-Globulin überzogenen Teilchen. 0,5 bis 2 Gewichtsprozent, bevorzugt 0,1 bis 0,5 Gewichtsprozent des hämolytischen Mittels, 0,005 bis 0,15 Gewichtsprozent, bevorzugt 0,01 bis 0,1 Gewichtsprozent des Färbungsmittels, 0,005 bis 0,5 Gewichtsprozent, bevorzugt 0,1 bis 0,2 Gewichtsprozent des Konservierungsmittels, sowie 0,005 bis 1,0 Gewichtsprozent, bevorzugt 0,01 bis 0,5 Gewichtsprozent des Stabilisiermittels.

Bei der Diagnose von Rheumatismus unter Anwendung des erfindungsgemäßen Mittels wird, falls das verwendete Mittel eines mit einem pH-Wert von 7,5 ± 1 ist, das die mit y-Globulin überzogenen Teilchen und ein Färbungsmittel in einer gepufferten Salzlösung enthält, die weiterhin auch ein Konservierungsmittcl und/oder ein Stabilisiermittel enthalten kann, das Serum von dem Gesamtblut abgetrennt und dieses Serum direkt dem Test unterworfen. Das komplizierte Verfahren der Verdünnung des Serums, wie beim üblichen Verfahren, wird in diesem Fall ■unnötig. Wenn andererseits das verwendete Reagens eines mit einem pH-Wert von 7,5 ± 1 ist, das die mit y-Globulin überzogenen Teilchen und ein hämolytisches Mittel in einer gepufferten Salzlösung enthält, die auch ein Konservierungsmittel und/oder ein Stabilisiermittel enthalten kann, kann das Gesamtblut zur Bestimmung verwendet werden. Der Test kann sehr einfach und schnell durchgeführt werden, wie im Fall der Bestimmung des Bluttyps. Das heißt, wenn frisches Blut vom Ohr oder Finger mit einem Tropfen des Reagens vermischt wird, zeigen sich die Eigenschaften der Rheumatoidagglutinierung, wie im Fall des üblichen Verfahrens, bei dem Serum verwendet wird. Weiterhin kann im Hinblick auf die Farbtönung der Hämoglobine die Bestimmung genau erfolgen, ohne daß es notwendig ist, vorher mit einem Färbungsmittel zu färben.

Zwei typische Beispiele für bevorzugte Ansätze des Reagens für den Rheumatcidagglutiniertest gemäß der Erfindung werden nachfolgend gegeben.

1. Bestimmung ir Gesamtblut

Mit Glykokoll gepufferte Salzlösung eines pH-Wertes von S bis 9 und folgendem Gehalt

Gramm je i<iü ml Lösung

Mit y-Globulin überzogene Teilchen, die aus einem schwach basischen Ionenaustauschharz und menschlichem /-Globulin bestehen 1 bis 2,0

Sanonin (hämolytisches Mittel) 0,3 bis 0,7

Natriumazid (Konservierungsmittel) 0,1 bis 0,15

Serumalbumin (Stabilisator) ... 0,27 bis 0,34 Acetyltryptophan (Stabilisator) 0,01 bis 0,015

Ein Beispiel für diese Art des Mittels wird folgend gegeben:

Gehalt (Gramm) je 100 ml glykokollgepufferter Salzlösung

Mit -/-Globulin überzogene Teil- · chen, bestehend aus menschlichem -/-Globulin und einem
schwach basischen Ionenaustauschharz auf der Basis von
chlormethyliertem Polystyroldivinylbenzol-Mischpolymerisat mit eingeführtem Diäthylentriamin (Durchschnittsteilchendurchmesser 2,1 μ, 90% mit
Teilchendurchmesserii von
1 bis 3 μ) 1,50

Saponin 0,50

Natriumazid 0,10

Serumalbumin der Kuh 0,30

Acetyltryptophan ,, 0,012

2. Untersuchung des Scums

Mit y-Globulin überzogene Teilchen, bestehend aus einem
schwach basischen Ionenaustauschharz und menschlichem y-Globulin 0,5 bis 1,0%

Natriumazid (Konservierungsmittel) 0,1 bis 0,15%

Serumalbumin (Stabilisator) 0,27 bis 0,34%

Trypan Blue (Färbungsmittel) 0,01 bis 0,015%

7 8v

Ein Beispiel einer derartigen Art ist folgendes: auf der Basis von, Phenolformaldehydharz mit einge-

Gchait (Gramm) führtem Polyalkylcnpolyamin vom OH-Typ vcr-

jc loo ml glykokoii- wendet wurden, wurden jeweils 40 mg Laurylamin

EcputTcrtcr Salzlösung (hämolytisches Mittel) und Albumin (Stabilisator)

Mit ,-Globulin überzogene Ten^nT ^{5 und} weiterhin 0,8 mg Chlorthymol (Konservierungs-

bestehcnd aus menschlichem y-Glo- ^mitlel> ^zu8^{esetzt und das Produkt erhaltcn} <P^H = ⁸'²)·

bulin und schwach basischem Ionen- _ . · \ λ

austauschharz der vorstehend ge- B e ι s ρ ι e 1 4

nannten Art (Durchschnittsteilchen- Herstellung eines mit Gesamtblut zu verwendenden

durchmesser 2,1 μ, 90% mit Teilchen- ^I0 Reagens

durchmessern von 1 bis 3 μ) 1,50 _ . . _ . . . , , „. „

Evans-blue 001 einer wie im Beispiel 1 hergestellten Suspension,

Natriumazid 0 10 wobei jedoch 2 g feinzerteiltes Ionenaustauschharz

Serumalbumin der Kuh '.'.".'.'.".".".'.'.'.".". o',3O ^{auf der Basis} eines modifizierten Phenolformaldehyd-

Acetyltryptophan 0,012 '⁵ ^™⁸™¹¹ eingerührtem Polyalkylenpolyamin vom

Chlor-Typ verwendet wurden, wurden jeweils 40 mg

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Er- Saponin (hämolytisches Mittel) und Albumin (Stabili-

läuterung der Erfindung und stellen einige Ausfüh- sator) und weiterhin 0,8 mg Quecksilberphenylsulfat

rungsformen der vorliegenden Erfindung dar. (Konservierungsmittel) zugesetzt und das Produkt

20 erhalten (pH = 8,2).
Beispiel 1

Herstellung eines mit Gesamtblut zu verwendenden Beispiel

Reagens Herstellung eines mit Gesamtblut zu verwendenden

2 g des Ionenaustauschharzes auf der Basis von Phe- 25 Reagens

nolformaldehydharz vom OH-Typ wurden gebrochen Zu einer wie im Beispiel 1 hergestellten Suspension,

und zu einer einheitlichen Teilchengröße mit Durch- wobei jedoch feinzerteiltes Ionenaustauschharz auf

messern von 1 bis 2 μ geformt und in 14 ml einer mit der Basis von Phenolforma'dehydharz vom H-Typ

Glykokoii gepufferten Salzlösung suspendiert (pH 8,2, verwendet wurde, wurden jeweils 40 mg eines amnho-

n/10 Glykokoii und n/20 Natriumhydroxyd). Ein im 30 teren grenzflächenaktiven Stoffes Typ (A) (hämölyti-

Handel erhältliches menschliches -/-Globulin wurde sches Mittel) und Albumin (Stabilisator) sowie 0,8 mg

mit der vorstehenden wäßrigen Lösung zu einer Kon- Thiomersal (Konservierungsmittel) zugegeben und das

zentration von 2% verdünnt. Nachdem diese wäßrige Produkt (pH = 8,8) erhalten.
Lösung während 10 bis 15 Minuten auf 60 bis 65" C

erhitzt wurde, wurden 1,5ml hiervon zu 1,5ml der 35 Beispiel 6

vorstehenden Suspension zugesetzt, worauf die Um- . ,

setzung während 2 Stunden in Eiswasser unter Rühren Herstellung eines mit Serum zu verwendenden

ausgeführt wurde. Dann wurde das Harz, das die mit Reagens

-/-Globulin überzogenen Teilchen ergab, abzentrifu- 2 g des Ionenaustauschharzes auf der Basis von

giert und abgesetzt, worauf gründlich gewaschen wurde 40 Phenolformaldehydharz vom OH-Typ, das zu ein-

und anschließend 8 ml der vorstehenden mit Glykokoii heitlich feinzerteilten Teilchen mit Durchmessern von

gepufferten Salzlösung zugesetzt wurden. Zu dieser 1 bis 2 μ verteilt worden war, wurden in 13 ml einer

Suspension wurden dann jeweils 400 mg eines nicht- mit Glykokoii gepufferten Salzlösung suspendiert

ionischen Polyoxyäthylenlaury'äthers (hämolytisches (pH 8,2, n/10 Glykokoii, n/20 Ätznatron). Getrennt

Mittel) und Albumin (Stabilisator) und weiterhin 45 wurde ein handelsübliches menschliches y-Globulin

0,8 mg Thiomersal (Konservierungsmittel) zugesetzt in der gleichen gepufferten Lösung zu είητ Konzen-

und das Produkt erhalten (pH = 8,5). Dieses Mittel tration von 2% gelöst und während 10 bis 15 Minuten

wurde bei 2 bis 10⁰C aufbewahrt und vor Gebrauch auf 60 bis 65° C erhitzt. 1,5 ml dieser Lösung wurden

gut geschüttelt. B 'sDiel 2 zu 1,5ml der vorstehenden Suspension zugesetzt,

50 worauf das Gemisch während 2 Stunden in Eiswasser

Herstellung eines mit Gesamtblut zu verwendenden unter Rühren umgesetzt wurde. Daran schloß sich der

Reagens Zusatz einer l%igen Brillant-Green-Lösung (Fär-

Zu einer wie im Beispiel 1 hergestellten Suspension, bungsmittel) an, und das gefärbte Harz wurde zentri-

wobei jedoch 2 g feinzerteiltes Ionenaustauschharz fugiert und abgesetzt (mit y-Globulin überzogene

auf der Basis von chlormethyliertem Polystyroldi- 55 Teilchen), gründlich gewaschen und anschließend

vinylbenzol-Mischpolymerisat mit eingeführtem Di- 20 ml einer mit Glykokoii gepufferten Salzlösung zu-

äthylentriamin vom NH₂-Typ verwendet wurden, gesetzt, die 0,1% Natriumazid (Konservierungsmittel

wurden jeweils 40 mg Saponin (hämolytisches Mittel) enthielt, und das Produkt (pH = 7,5) erhalten. Diese;

und Albumin (Stabilisator) und weiterhin 10 mg Mittel wurde bei 2 bis 10⁰C aufbewahrt und gründlicl

Natriumazid (Konservierungsmittel) zugesetzt und 60 vor der Verwendung geschüttelt,
das Produkt erhalten (pH = 8,5).

Beispiel 7

^e ^λ ^s P^{! e} Herstellung eines mit Serum zu verwendenden

Herstellung eines mit Gesamtblut zu verwendenden Reagens

^ea^^ens 0,5 g eines feinzerteilten Ionenaustauschharzes ai

Zu einer wie im Beispiel 1 hergestellten Suspension, der Basis von sulfonierten! Polystyrolharz vom H-Ty

wobei, jedoch 2g feinzerteiltes Ionenaustauschharz wurden in 10 ml enier mit Glykokoii gepufferten SaI;

■?»

lösung (pH 8,2), die 0,01% Thiomersal iKonservierungsmittel) enthielt, suspendiert. Zu dieser Suspension wurden IO ml der gleichen im Beispiel 6 beschnebenen 2%igeTi Lösung von menschlichem -Globulin zugegeben, worauf das Gemisch auf 55 C während 15 \ inuten erhitzt wurde. Daran schloß sich die Zueabe von 0,1% Evans-Blue-Lösung IFärbungsmittel| zum Färben des Gemisches an. worauf der Zusatz Stark basische lonenaustausehharze

Ambtvlite

Ausnahmslos Ionen des CI-Typs. D₁CSi Erzeugnisse können durch Chlorraethy- >'^e™"^{g von} Styrol-divinylbenzol-Co-

und Verdünnung des Gemisches mit 80 ml der vorstehenden mit Glykokoll gepufferten Salzlösung anschloß, so daß das Produkt (pH = 9.2) erhalten wurde.

Beispiel 8

Herstellung eines mit Serum zu verwendenden
Reagens

Gewichtsprozent

Mit -/-Globulin überzogene Teilchen,
die aus menschlichem /-Globulin
und dem gleichen Ionenaustauschharz wie im Beispiel 7 bestanden 0.5 bis 1.0

Thiomersal 0.01

Trypan-Blau 0,01

Albumin 0.27 bis 0,34

Die Ausgangsmaterialien der vorstehenden Masse wurden eingesetzt und das Reagens wie im Beispiel 6 he.gestellt, wobei die maximalen Konzentrationen der Bestandteile in der mit Glykokoil gepufferten Salzlösung (pH 6,6 bis 8,5) im vorstehenden Rahmen waren.

Beispiel 9

Herstellung eines mit Serum zu verwendenden
Reagens

0,5 g eines feinzerteilten lonenaustauschharzes auf der Basis von Phenolformaldehydharz wurden in 10 ml einer mit Glykokoll gepufferten Salzlösung (pH = 8.2) suspendiert. 10 ml einer getrennt hergestellten 2%igen Lösung von menschlichein -/-Globulin, die vorhergehend auf 60 bis 65''C während 10 bis 15 Minuten erhitzt worden waren, wurden dann kalt mit der vorstehenden Suspension umgesetzt. Daran schloß sich der Zusatz von 0,1% Evans-Blau-Lösung (Färbungsmittel) und Chlorthymol (Konservierungsmittel) und die gleiche Behandlung wie im Beispiel 7 an, wobei das Produkt (pH = 8,2) erhalten wurde.

Liste der lonenaustausehharze
Stark saure lonenaustausehharze

Ambeilite IR-120 Sulfoniertes Polystyrolharz

(Ionentyp: Na-Typ).

Diaion SK-I Sulfoniertes Polystyrolharz

Ionentyp zur Verwendung
als Analyse: H-Typ.

Dowex 50 W Sulfoniertes Polystyrolharz.

Die Ionentypen sind vorwiegend vom Η-Typ, einige
jedoch vom Na-Typ.

üuolite

C-20 desgl.

Na-Ionen.

C-3 Phenolsulfonsäureformalde-

hydharz.

C-10 desgl.

Diaion
SA-IOAI
SA-20A II

_{tiärem Amin erha]ten werd}

Typ I und Typ II hängen von den unterschiedlichen Mengen an eingeführ· ^l _o ^en .Chlormethylgruppen und von dei Basizitat ab.

ov-ex

■/

ί Ο '

CH — CH₂ — CH—CH_; —

CH-N-(CH₃I₃
λ,-

,—\

N'lCH,), j Cl

Duolite
A-101 1
A-40 II

-CH — CH, — CK — CH₂ —

CH₁ -CH-CH₂-CH

(CH₃J₂N⁺(C₂H₄OH)

cr

(CHj)₂N⁺(C₂H₄OH)

er

11

Schwach basische Ionenaustauschharze Amberlite IR 45.

IR4B

ΧΠ68 IRA-68 IRA-93

Duolite

Chlormethyliertes Polystyroldivinylbenzol-Copolymerisat. Diäthylentri- _s amin ist eingeführt. Phenolformaldehydharz. Es ist PoIyalkylenpolyamin eingeführt. Verbessertes Erzeugnis von IR

Unbekannt. '°

Chlormethyliertes Polystyroldivinylbenzol-Copolymerisat. Dimethylamin ist eingeführt.

A-30T ..,

Duolite A-4

Dowex

PhenHformaldehydharz. Es ist sekundäres Amin eingeführt. Kondensation von Polyalkylenpolyamin und Äthylenbromid. Vorwiegend tertiäres Amin.

Kondensation von Polyalkylenpolyamin und Äthylenbromid. Vorwiegend quarternäres Amin.

Phenolformaldehyd. Polyalkylenpolyamin ist eingeführt (Phenolformaldehydharz).

Chlormethyliertes Polystyroldivinylbenzol. Ls. isl Dimethylamin eingeführt (Chlormethyliertes Polystyroldivinylbenzol-Copolymerisat).

Kondensation von Epichlorhydrin und Ammoniak (Als Grundlage wird kondensiertes Harz, das keine aromatischen Gruppen enthält, verwendet, und Aminogruppen sind eingeführt). Unbekannt.

Claims

Patentanspruch:

Reagens Tür den Rheumatoidagglutiniertest, das (a) mit y-Globuiin überzogene Teilchen, die durch Kontaktieren eines Ionenaustauschharzes mit menschlichem -/-Globulin in einer gepufferten Salzlösung gebildet wurden, und (b) als Hilfsmittel ein llämolytiscbes Mittel und/oder Färbungsmittel fcir y-Globulin in einer gepufferten Salzlösung mit einem pH-Wert von 7,5 ± 1,5 enthält.