DE1900798B

DE1900798B - Reagens fur den Rheumatoidagglutinier test

Info

Publication number: DE1900798B
Authority: DE
Inventors: Yutaka Tokio Nagai Hidetaka Hachioji Mizushima, (Japan)
Original assignee: Kowa Co, Ltd, Nagoya (Japan)

Description

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Die Erfindung betrifft ein Reagens für den Rheumatoidagglutiniertest, welches zur Feststellung des Rheumatoidfaktors im Gesamtblut als auch im Serum verwendet werden kann, ein Verfahren, wie es bisher nicht möglich war. das ausgezeichnete Ergebnisse hinsichtlich Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit bei der Feststellung ergibt. Das Feststellungsverfahren lsi den üblichen Verfahren hinsichtlich der einfacheren Versuchsanordnung überlegen. Gemäß der Erfindung wird ein Reagens für den Rheumatoidagglutiniertest geschaffen, das mit -/-Globulin überzogene Teilchen, die durch Kontaktieren eines Ionenaustauschharzes mit menschlichem -/-Globulin in einer gepufferten Salzlösung gebildet wurden, und als Hilfsmittel ein hämolytisches Mittel und, oder Färbungsmittel Tür -/-Globulin in einer gepufferten Salzlösung mit einem pH-Wert von 7.5 ± 1.5 enthält.

Dieses Reagens kann bevorzugt mindestens ein weiteres Hilfsmittel aus der Gruppe von Konservierungsmitteln und Stabilisatoren enthalten.

Es ist bekannt. Rheumatismus serologisch durch Diagnose festzustellen, wobei mit /-Globulin überzogene Teilchen verwendet werden, die aus den roten Blutkörperchen der Schafe und einem Anti-Schafsantikörper der Kaninchen gebildet sind. Wenn diese mit --Globulin überzogenen Teilchen mit dem von Menschen hergestellten Serum vermischt werden, findet eine Agglutinierung statt, wenn der Rheumatoidfaktor vorhanden ist, und es findet keine Agglutinierung in Abwesenheit dieses Faktors statt. Dieses Diagnoseverfahren wird als Waaler-Rose-Test bezeichnet und häufig einfach als Rose-Test bezeichnet. Als Modifizierung dieses Tests ist die Heller-Modifikation bekannt, wodurch die Ungenauigkeit der Be-Stimmung des Rose-Tests verbessert wurde.

Weiterhin ist auch ein Verfahren bekannt, bei dem als mit -/-Globulin überzogene Teilchen solche verwendet werden, worin ein Polystyrollatex an Stelle der roten Blutkörperchen und natives oder aggregiertes menschliches -/-Globulin an Stelle des vorstehenden Antikörpers verwendet wird (RA-Test>. und ein Verfahren bekannt, bei dem als mit y-Globulin überzogene Teilchen solche eingesetzt werden, worin Teilchen eines Absorbiermittels, wie Benlonit, Kaolin und roher ho Latex, an Stelle des Polystyrollatex beim vorstehenden RA-Test. verwendet werden.

Das wesentlichste Merkmal der vorliegenden Erfindung liegt in der Anwendung eines Ionenaustauschharzes als Absorbiermittel. 6s

Wie vorstehend ausgeführt, wurde bei sämtlichen vorhergehend aufgeführten Verfahren Serum zur Bestimmung des Rheumatoidfaklors verwendet. Dadurch tritt der Nachteil auf, daß das Serum aus dem Gesamtblut, das abgenommen wurde, abgetrennt werden muß sowie das Serum verdünnt werden muß. Deshalb ist es in der Praxis nicht einfach durchführbar, da es notwendig ist, ein ziemlich gut ausgestattetes Laboratorium zur Verfugung zu haben.

Andererseits zeigt sich im Fall der vorstehend aufgeführten mit y-Globulin überzogenen Teilchen, die aus Polystyrollatex und y-Globulin bestehen, obwohl dort der Vorteil auftritt, daß der Latex eine leicht mil genauer Reproduzierbarkeit nach einem einfachen Verfahren herstellbare Verbindung ist, der Nachteil, daß auf Grund solcher Faktoren, wie Modifizierung des y-Globulins und nicht spezifische Agglutinierung des Harzes, nicht nur die Stabilität schlecht ist, sondern auch die Genauigkeit der Feststellung unzureichend ist, so daß der Nachteil auftritt, daß bei der Abschätzung der Ergebnisse des Tests eine beträchtliche Erfahrung erforderlich ist.

Obwohl die Gründe für die vorstehenden Fehler nicht klar sind, dürfte anzunehmen sein, daß die Bindung zwischen den Teilchen des Polystyrollatex und des /-Globulins schwach tst und weiterhin, daß das j-Globulin in einem gegenüber den Versuchs bedingungen übermäßigen Ausmaß während der Konservierung des Reagens modifiziert wurde und dies die Hauptursachen für den Fehler darstellen.

Auf Grund umfangreicher Untersuchungen im Hinblick auf die Überwindung dieser zahlreichen Nachteile und Mangel wurde gefunden, daß als mit ■/-Globulin überzogene Teilchen solche, die aus einem Ionenaustauschharz und menschlichem -/-Globulin bestehen, verwendet werden können und daß durch Anwendung derartiger Teilchen der komplizierte Serumverdünnungsarbeitsgang vermieden werden kann, obwohl auch Serum für den Test verwendet werden kann. Es wurde weiterhin festgestellt, daß ein Diagnosereagens erhalten werden konnte, das auch zur Bestimmung aus dem Gesamtblut verwendet werden kann. Außerdem wurde festgestellt, daß dieses Reagens nicht nur eine ausgezeichnete Feststellungsempfindlichkeit und Feststellungsgenauigkeit besitzt, sondern auch eine ausgezeichnete Stabilität zeigt, ganz gleich ob es zur Untersuchung von Serum oder von Gesamtblut verwendet wird. Es wurde auch festgestellt, daß das zur Herstellung dieser mit /-Globulin überzogenen Teilchen verwendete Ionenaustauschharz leicht zuganglich ist und daß der Arbeitsgang zur Herstellung dieser Teilchen einfach ist.

Eine Aufgabe der Erfindung besteht in einem Reagens für den Rheumatoidagglutiniertest. das eine ausgezeichnete Stabilität besitzt und eine überlegene Feststellungsempfindlichkeit sowie überlegene Genauigkeit der Feststellung zeigt. Eine weitere Aufgabe besteht in einem Verfahren zur Herstellung dieses Reagens. Eine weitere Aufgabe besteht in einem Verfahren zur Diagnose unter Anwendung dieses Reagens.

Andere Aufgaben und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung.

Die mit /-Globulin überzogenen Teilchen, die auf Grund ihrer Anwesenheit im erfindungsgemäßen Reagens für den Rheumatoidagglutiniertest Agglutinierungen durch Umseizungen mit dem Rheumatoidfaktor ergeben, können durch Kontaktierung eines Ionenaustauschharzes mit menschlichem /-Globulin in einer gepufferten Salzlösung hergestellt werden.

Als gepufferte Salzlösungen sind wäßrige Salzlösungen verwendbar, deren pH-Wert auf 7.5 ± 1,5.

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bevorzugt 6,5 bis 8,5, und besonders bevorzugt auf 7,5 bis 8,5, unter Anwendung eines sauren Bestandteils, beispielsweise Glykokoll, Kaliumdihydrogenphosphat,' Borsäure und Salzsäure und eines basischen Bestandteils, beispielsweis eines Alkalihydroxyds, wie Natriumhydroxyd oder Kaliumhydroxyd, eines Alkalicarbonate, wie Natriumcarbonat oder Kaliumcarbonat und anderen Verbindungen, wie Borax oder Dikaliumhydrogenphosphat, Trishydroxyaminomethan, eingeregelt wurde. Besonders bevorzugt werden Pufferlösungen, bei denen Glykokoll und Natriumhydroxyd verwendet wurden.

Die gebildeten mit y-Globulin überzogenen Teilchen können aus der gepufferten Salzlösung, worin sie gebildet wurden, abgetrennt werden und in einer getrennt hergestellten gepufferten Salzlösung suspendiert werden, worauf entweder ein hämolytisches Mittel oder ein Färbungsmittel, das das y-Globulin farben kann, zugesetzt werden können. Andererseits können auch das hämolytische Mittel oder das Färbungsmittel zu der Pufferlösung zugegeben werden, worin die mit y-Globulin überzogenen Teilchen gebildet wurden, ohne daß die Teilchen hieraus abgetrennt wurden. Deshalb muß der pH-Wert der gepufferten Salzlösung nicht notwendigerweise auf den zur Herstellung der vorstehenden Teilchen aufgeführten pH-Wert eingeregelt werden, und die Einstellung des pH-Wertes auf 7.5 ± 1,5. bevorzugt 6.5 bis 8.5. und besonders bevorzugt auf 7.5 bis 8.5. braucht nur so durchgeführt werden, daß diese pH-Werte in dem Endprodukt erhalten werden.

Bei der Vereinigung des lonenaustauschharzes mit dem menschlichen y-Globulin in der vorstehend aufgeführten gepufferten Salzlösung kann der Zusatz der beiden Bestandteile zu der Pufferlösung gleichzeitig erfolgen, oder das Ionenaustauschharz kann zuerst zugesetzt werden und dann das menschliche ;-Globulin zugesetzt werden, oder die Zügabereihenfolge der beiden kann in umgekehrter Ordnung erfolgen, d. h. Zusatz des menschlichen ^-Globulins und anschließender Zusatz des lonenaustauschharzes. Es ist auch möglich, die beiden Bestandteile getrennt zu zwei Pufferlösungen zuzugeben, die dann vermischt werden.

Es besteht keine spezielle Begrenzung hinsichtlich der Temperatur der Umsetzung, bei der die mit y-Globulin überzogenen Teilchen gebildet werden, und es ist möglich, diese Umsetzung unter Anwendung von Wärme oder Abkühlung durchzuführen. Beispielsweise kann die Umsetzung unter Kühlung mit einem Eis-Wasser-Bad durchgeführt werden, oder sie kann unter Erwärmen ausgeführt werden. Bevorzugt wird es jedoch üblicherweise, bei Temperaturen von 0 bis 10" C zu arbeiten.

Beispiele von zur Bildung der mit y-Globulin überzogenen Teilchen verwendbaren Ionenaustauschharzen sind solche, die aus der Gruppe von stark sauren Ionenaustauschharzen, stark basischen Ionenaustauschharzen und schwach basischen Ionenaustauschharzen gewählt wurden. Besonders bevorzugt sind <>o die schwach basischen Ionenaustauschharz^ um eine zufriedenstellende Verbindung mit dem menschlichen y-Globulin zu erhalten.

Die Teilchengröße dieser Harze liegt bevorzugt bei einem Durchschniltstcilchcndurchmesser von 0,5 bis d.s 3 Mikron, und vom Gesichtspunkt der Erzielung einer verbesserten Stabilität für das gebildete Reagens wird es bevorzugt, daß die Teilchen, die in den vorstehend aufgeführten Teilchendurchmesserbereich fallen, 75 Gewichtsprozent, bevorzugt 85 Gewichtsprozent und besonders bevorzugt 90 Gewichtsprozent der gesamten Teilchen ausmachen.

Als spezifische Beispiele für derartige lonenaustauschharze seien die stark sauren lonenaustauschharze auf der Basis von sulfonierten» Polystyrolharz vom Na-Typ und vom Η-Typ, sulfoniertem PoIystyrolharz vorwiegend vom Η-Typ und zum Teil vom Na-Typ und Phenolsulfonsäureformaldehydharz sowie stark basische Ionenaustauschharze auf der Basis von chlormethylierten Styroldivinylbenzol-Mischpolymerisaten mit einem Gehalt an quarternären Ammoniumgruppen mit unterschiedlichen Mengen an eingeführten Chlormethylgruppen und unterschiedlicher Basizität und die schwach basischen Ionenaustauschharze auf der Basis von chlormethylierten Polystyroldivinylbenzol-Mischpolymerisaten mit eingeführtem Diäthylentriamin oder Dimethylamin. Phenolformaldehydharzen mit eingeführtem Polyalkylen, PoIyamin oder sekundärem Amin und Modifikationen h»e-von u a

jemäß der vorliegenden Erfindung werden die mit y-Globulin überzogenen Teilchen, die aus dem vorstehenden Ionenaustauschharz und menschlichem y-Globulin bestehen, entweder ohne Abtrennung oder mit einer zunächst erfolgenden Abtrennung aus der gepufferten Salzlösung verwendet, worin sie gebildet wurden. Im Fall ihrer Abtrennung werden sie dann zu einer ähnlichen gepufferten Salzlösung, wie sie beschrieben wurde, zugesetzt. In die dabei erhaltene, die mit -/-Globulin überzogenen Teilchen enthaltende Pufferlösung wird dann als Hilfsmittel entweder ein hämolytisches Mittel oder ein Färbungsmittel, welches das y-Globulin färben kann, einverleibt. Weiterhin bevorzugt kann noch mindestens ein weiteres Hilfsmittel aus der Gruppe von Konservierungsmitteln und Stabilisatoren einverleibt werden.

Es kann eine einzige Verbindung oder eine Mehrzahl von Verbindungen der hämolytischen Mittel. Färbungsmittel. Konservierungsmittel und Stabilisatoren einverleibt werden. Es gibt keine Begrenzungen hinsichtlich der Reihenfolge, in der die Hilfsmittel zugesetzt werden. Sie können in jeder beliebigen Reihenfolge zugegeben werden, oder sie können sämtlich zusammen zugegeben werden.

Als hämolytische Mittel sind z. B. Saponine. Alkaloide, Salze der Gallensäure, Harnstoff. Alkylamine und oberflächenaktive Mittel verwendbar. Unter diesen oberflächenaktiven Mitteln sind die anionischen oberflächenaktiven Mittel, wie z. B. Natriumoleat, Natriumlaurylsulfat, Natriumcety !sulfat, Natriumstearylsulfat, Natriumalkylbenzolsulfonat und Dialkylsulfosuccinat. kationische oberflächenaktive Mittel, wie z. B. Alkyltrimethylammoniumchloride, Benzyldimethylalkylammoniumbromide und Cetylpyridiniumchlorid, nichtionische oberflächenaktive Mittel, wie z. B. Polyoxyäthylensorbitanmonolaurat, Polyoxyäthylcnsorbitanmonooleat, Polyoxyälhylcnstearat, Polyoxyäthylcnlaurylalkohol und Polyglykoläthcr von Alkylphenolen, amphotere oberflächenaktive Mit-IeI vom Typ (A) der Alkyläthylcycloimidiso-l-hydroxy - 3 - älhylnatriumalkoholul - 2 - melhylnatriumcarboxylate und Aktivatoren vom Polväthylenglykol-Typ (200 400, 600 und 800) verwendbar. Von diesen hämolytischen Mitteln sind besonders vorteilhaft die Saponine, Dodecylaminacetat, welches ein Alkylamin darstellt, oder Aktivaloren vom Typ (A).

Das Färbungsmittel kann aus solchen bestehen, die zur Färbung von menschlichem y-Globulin geeignet sind. Hierzu gehören z. B. als rote Farbstoffe PonceauR (CI. 16150), Ponceau 3R (CI. 16155) und Rose Bengal (CI. 45440), als grüne Farbstoffe Naphthol Green B und Brillant Green (C. I. 42040) und als blaue Farbstoffe Evans Blue, Brillant Blue FCF (C. 1.42 090), Patent Blue (C 1.42 051) und Trypaa Blue (C. 1.23 850).

Als Konservierungsmittel seien z. B. erwähnt Natriumazid, die Phenole, wie Kresole, Chlorthyniol, Thymoi und Paraoxybenzoesäureester und die Quecksilberphenyle, wie Quecksilberphenylacetat, Quecksilberphenylsulfat und Quecksilberphenylborat.

Weiterhin können auch Stabilisatoren zur weiteren Erhöhung der Stabilität des Endproduktes zugesetzt werden. Dies gilt besonders für den Fall eines Reagens, welches die mit y-Globuiin überzogenen Teilchen und ein hämolytisches Mittel enthält und das zur direkten Untersuchung des Gesamtblutes verwendet wird. Da in diesem Fall eine Eluierung von Hämoglobin und anderen Bestandteilen stattfindet, findet gelegentlich bei Anwendung des Mittels die Agglutinierung zwischen den mit y-Globulin überzogenen Teilchen und anderen Faktoren als dem Rheumatoidfaktor statt, so daß die Anwendung eines Stabilisators besonders zu empfehlen ist. Da die Stabilisatoren auch eine Neigung zur Erhöhung der Stabilität des y-Globulins zeigen, können sie auch im Fall eines Reagens, welches die mit y-Globulin überzogenen Teilchen und ein Färbungsmittel enthält, das zur Untersuchung des Serums verwendet wird, eingesetzt werden.

Zu derartigen Stabilisatoren gehören die Serumalbuirine, Peptone, Gelatine und Aminosäuren, wie z. B. Acetyltryptophan.

In dem erfindungsgemäßen Reagens können die Mengen, worin die mit y-Globulin überzogenen Teilchen, hämolytisches Mittel, Färbungsmittel, Konservierungsmittel und Stabilisator in der gepufferten Salzlösung enthalten sind, in geeigneter Weise in Abhängigkeit von den Arten der Mittel und ihrer Kombination variiert werden, üblicherweise werden folgende Bereiche angewandt, bezogen auf das Reagens: 0,5 bis 2 Gewichtsprozent, bevorzugt 1 bis 1,5Ge wichtsprozent, der mit y-Globulin überzogenen Teilchen, 0,5 bis 2 Gewichtsprozent, bevorzugt 0,1 bis 0,5 Gewichtsprozent des hämolytischen Mittels, 0,005 bis 0,15 Gewichtsprozent, bevorzugt 0,01 bis 0,1 Gewichtsprozent des Färbungsmittels, 0,005 bis 0,5 Gewichtsprozent, bevorzugt 0,1 bis 0,2 Gewichtsprozent des Konservierungsmittels, sowie 0,005 bis 1,0 Gewichtsprozent, bevorzugt 0,01 bis 0,5 Gewichtsprozent des Stabilisiermittels.

Bei der Diagnose von Rheumatismus unter Anwendung des erfindungsgemäßen Mittels wird, falls das verwendete Mittel eines mit einem pH-Wert von 7,5 ± 1 ist, das die mit y-Globulin überzogenen Teilchen und ein Färbungsmittel in einer gepufferten Salzlösung enthält, die weiterhin auch ein Konservierungsmittel und/oder ein Stabilisiermittel enthalten kann, das Serum von dem Gesamtblut abgetrennt und dieses Serum direkt dem Test unterworfen. Das komplizierte Verfahren der Verdünnung des Serums, wie beim üblichen Verfahren, wird in diesem Fall unnötig. Wenn andererseits das verwendete Reagens eines mit einem pH-Wert von 7,5 ± 1 ist, das die mit y-Globulin überzogenen Teilchen und ein hämolytisches Mittel in einer gepufferten Salzlösung enthält, die auch ein Konservierungsmittel und/oder ein Stabilisiermittel enthalten kann, kann das Gesamtblut zur Bestimmung verwendet werden. DerTest kann sehr einfach und schnell durchgeführt werden, wie im Fall der Bestimmung des Bluttyps. Das heißt, wenn frisches Blut vom Ohr oder Finger mit einem Tropfen des Reagens vermischt wird, zeigen sich die Eigenschaften der Rheumatoidagglutinierung, wie im Fall des üblichen Verfahrens, bei dem Serum verwendet wird. Weiterhin kann im Hinblick auf die Farbtönung der Hämoglobine die Bestimmung genau erfolgen, ohne daß es notwendig ist, vorher mit einem Färbungsmittel zu färben.

Zwei typische Beispiele für bevorzugte Ansätze des Reagens für den Rheumatoidagglutiniertest gemäß der Erfindung werden nachfolgend gegeben.

1. Bestimmung im Gesamtblut

Mit Glykokoll gepufferte Salzlösung eines pH-Wertes von 8 bis 9 und folgendem Gehalt

Gramm je 100 ml Lösung

Mit y-Globulin überzogene Teilchen, die aus einem schwach basischen Ionenaustauschharz und menschlichem y-Globulin bestehen 1 bis 2,0

Saponin (hämolytisches Mittel) 0,3 bis 0,7

Natriumazid (Konservierungsmittel) 0,1 bis 0,15

Serumalbumin (Stabilisator) ... 0,27 bis 0,34 Acetyltryptophan (Stabilisator) 0,01 bis 0,015

Ein Beispiel für diese Art des Mittels wird folgend gegeben:

Gehalt (Gramm) je 100 ml glykokollgepulTerter Salzlösung

Mit y-Globulin überzogene Teil- · chen, bestehend aus menschlichem y-Globulin und einem
schwach basischen Ionenaustauschharz auf der Basis von
chlormethyliertem Polystyroldivinylbenzol-Mischpolymerisat
mit eingeführtem Diäthylentriamin (Durchschnittsteilchendurchmesser 2,1 μ, 90% mit
Teilchendurchmessern von
1 bis 3 μ) 1,50

Saponin 0,50

Natriumazid 0,10

Serumalbumin der Kuh 0,30

Acetyltryptophan 0,012

2. Untersuchung des Serums

Mit -/-Globulin überzogene Teilchen, bestehend aus einem
schwach basischen Ionenaustauschharz und menschlichem
y-Globulin 0,5 bis 1.0%

Natriumazid (Konservierungsmittel) 0.1 bis 0.15%

Serumalbumin (Stabilisator) 0.27 bis OM⁰'■

Trypan Blue (Färbungsmittel).... 0.01 bis 0.015%

7 ^J 8

Ein Beispiel einer derartigen Art ist folgendes: auf der Basis von Phenolformaldehydharz mit einge-

G -haii (Gnmm) führtem Polyalkylenpolyamin vom OH-Typ ver-

jc loo ml glykokoii- wendet wurden, wurden jeweils 40 mg Laurylamin

gepufferter salzlösung (hämolytisches Mittel) und Albumin (Stabilisator)

Mit -/-Globulin überzogene Teilch^ ⁵ "nd weiterhin 0,8 mg Chlorthymol (Konservicrungs-

bcstehend aus menschlichem ;-Glo- ^miUel> ^zuS^{esetzl und das Produkl erhalten} (P^H = ⁸-²>'

bulin und schwach basischem Ionen- _R . . . .

austauschharz der vorstehend ge- Beispiel 4

nannten Art (Durchschnittsteilchen- Herstellung eines mit Gesamtblut zu verwendenden

durchmesser 2,1 μ, 90% mit Teilchen- ^l0 Reagens

durchmessern von 1 bis 3 μ) 1,50 ^- · · _π · · , , ■ „ _ο

Evans-blue 0 01 einer wie im Beispiel 1 hergestellten Suspension,

Natriumazid 0 10 wobei jedoch 2 g feinzerteiltes Ionenaustauschharz

Serumalbumin der Kuh ".'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'.'. 0,30 ?^{uf der Ba}?^is eines modifizkrtenPhenolformaldehyd-

Acetyltryptophan 0,012 ¹⁵ JS™⁸™^{1 ein}g^efi*^rtem Polyalkylenpolyamin vom

^{J v} Chlor-Typ verwendet wurden, wurden jeweils 40 mg

Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Er- Saponin (hämolytisches Mittel) und Albumin (Stabili-

läuterung der Erfindung und stellen einige Ausfüh- sator) und weiterhin 0,8 mg Quecksilberphenylsulfat

rungsformen der vorliegenden Erfindung dar. (Konservierungsmittel) zugesetzt und das Produkt

20 erhalten (pH = 8,2).
Beispiel 1

Herstellung eines mit Gesamtblut zu verwendenden e ι s ρ ι e

Reagens Herstellung eines mit Gesamtblut zu verwendenden

2 g des lonenaustauschharzes auf der Basis von Phe- 25 eagens

nolformaldehydharz vom OH-Typ wurden gebrochen Zu einer wie im Beispiel 1 hergestellten Suspension,

und zu einer einheitlichen Teilchengröße mit Durch- wobei jedoch feinzerteiltes Ionenaustauschharz auf

messern von 1 bis 2 μ geformt und in 14 ml einer mit der Basis von Phenolformaldehydharz vom H-Typ

Glykokoii gepufferten Salzlösung suspendiert (pH 8,2, verwendet wurde, wurden jeweils 40 mg eines ampho-

n/10 Glykokoii und n/20 Natriumhydroxyd). Ein im 30 teren grenzflächenaktiven Stoffes Typ (A) (hämolyti-

Handei erhältliches menschliches y-Globulin wurde sches Mittel) und Albumin (Stabilisator) sowie 0,8 mg

mit der vorstehenden wäßrigen Lösung zu einer Kon- Thiomersal (Konservierungsmittel) zugegeben und das

zentration von 2% verdünnt. Nachdem diese wäßrige Produkt (pH = 8,8) erhalten.
Lösung während 10 bis 15 Minuten auf 60 bis 65°C

erhitzt wurde, wurden 1,5ml hiervon zu 1,5ml der 35 Beispiel 6

vorstehenden Suspension zugesetzt, worauf die Um- ., .„ . . _ , ,

setzung während 2 Stunden in Eiswasser unter Rühren Herstellung eines mit Serum zu verwendenden

ausgeführt wurde. Dann wurde das Harz, das die mit Keagens

y-Globulin überzogenen Teilchen ergab, abzentrifu- 2 g des lonenaustauschharzes auf der Basis von

giert und abgesetzt, worauf gründlich gewaschen wurde 40 Phenolformaldehydharz vom OH-Typ, das zu ein-

und anschließend 8 ml der vorstehenden mit Glykokoii heitlich feinzerteilten Teilchen mit Durchmessern von

gepufferten Salzlösung zugesetzt wurden. Zu dieser 1 bis 2 μ verteilt worden war, wurden in 13 ml einer

Suspension wurden dann jeweils 400 mg eines nicht- mit Glykokoii gepufferten Salzlösung suspendiert

ionischen Polyoxyäthylenlaurylathers (hämolytisches (pH 8,2, n/10 Glykokoii, n/20 Ätznatron). Getrennt

Mittel) und Albumin (Stabilisator) und weiterhin 45 wurde ein handelsübliches menschliches y-Giobulin

0,8 mg Thiomersal (Konservierungsmittel) zugesetzt in der gleichen gepufferten Lösung zu einer Konzen-

und das Produkt erhalten (pH = 8,5). Dieses Mittel tration von 2% gelöst und während 10 bis 15 Minuten

wurde bei 2 bis 10⁰C aufbewahrt und vor Gebrauch auf 60 bis 65⁰C erhitzt. 1,5 ml dieser Lösung wurden

gut geschüttelt. B " " 1 2 zu 14 ml der vorstehenden Suspension zugesetzt,

^e *^s P *^e 50 worauf das Gemisch während 2 Stunden in Eiswasser

Herstellung eines mit Gesamtblut zu verwendenden unter Rühren umgesetzt wurde. Daran schloß sich der

Reagens Zusatz einer l%igen Brillant-Green-Lösung (Fär-

Zu einer wie im Beispiel 1 hergestellten Suspension, bungsmittel) an, und das gefärbte Harz wurde zentri-

wobei jedoch 2 g feinzerteiltes Ionenaustauschharz fugiert und abgesetzt (mit j>-Globulin überzogene

auf der Basis von chlormethyliertern Polystyroldi- 55 Teilchen), gründlich gewaschen und anschließend

vinylbenzol-Mischpolymerisat mit eingeführtem Di- 20 ml einer mit Glykokoii gepufferten Salzlösung zu-

äthylentriamin vom NH₂-Typ verwendet wurden, gesetzt, die 0,1% Natriumazid (Konservierungsmittel)

wurden jeweils 40 mg Saponin (hämolytisches Mittel) enthielt, und das Produkt (pH = 7,5) erhalten. Dieses

und Albumin (Stabilisator) und weiterbin 10 mg Mittel wurde bei 2 bis 10° C aufbewahrt und gründlich

Natriumazid (Konservierungsmittel) zugesetzt und 60 vor der Verwendung geschüttelt
das Produkt eroalten (pH = 8,5).

Beispiel 7

B e 1 s ρ 1 e Herstellung eines mit Serum zu verwendenden

Herstellung eines mit Gesamtblut zu verwendenden Reagens

Reagens ^ _{g e}j_nes Ja₀₂J₀IjQiIe_n lonenaustauschharzes auf

Zu einer wie im Beispiel 1 hergestellten Suspension, der Basis von sulfoniertem Porystyrolharz vom H-Typ

wobei jedoch 2 g feinzerteiltes Ionenaustauschharz wurden in 10 ml einer mit Glykokoii gepufferten SaIz-

lösung (pH 8,2), die 0,01% Thiomersal (Konservierungsmittel) enthielt, suspendiert. Zu dieser Suspension wurden 10 ml der gleichen im Beispiel 6 beschriebenen 2%igen Lösung von menschlichem /-Globulin zugegeben, worauf das Gemisch auf 55° C während 15 Minuten erhitzt wurde. Daran schloß sich die Zugabe von 0.1% Evans-Blue-Lösung (Färbungsmittelj zum Färben des Gemisches an, worauf der Zusatz von Quecksilberphenylacetat (Konservierungsmittel) und Verdünnung des Gemisches mit 80 ml der vor- ι ο stehenden mit Glykokoll gepufferten Salzlösung anschloß, so daß das Produkt (pH = 9,2) erhalten wurde.

Beispiel 8

Herstellung eines mit Serum zu verwendenden '⁵ Reagens

Gewichtsprozent

Mit y-Globulin überzogene Teilchen, die aus menschlichem y-Globulin und dem gleichen Ionenaustauschharz wie im Beispiel 7 bestanden 0,5 bis 1,0

Thiomersal 0,01 Trypan-Blau 0,01 Albumin 0,27 bis 0,34

Die Ausgangsmaterialien der vorstehenden Masse wurden eingesetzt und das Reagens wie im Beispiel 6 hergestellt, wobei die maximalen Konzentrationen der Bestandteile in der mit Glykokoll gepufferten Salzlösung (pH 6,6 bis 8,5) im vorstehenden Rahmen waren.

Beispiel 9

Stark basische Ionenaustauschharz!;

Amberlite
Typ

IRA-400 I
IRA-900 I

Ausnahmslos Ionen des CI-Typs. Diese Erzeugnisse können durch Chlormethylierung von Styrol-divinylbenzol-Copolymerisaten mit Harzen' die quarternares Amin als Austauschgruppe haben, und nachfolgender Umsetzung mit tertiärem Amin erhalten werden.

Diaion

SA-IOAI Typ I und Typ II hängen von den SA-20 AII unterschiedlichen Mengen an eingeführten Chlormethylgruppen und von dei Basizität ab.

1 I 211

Dowex

Typ I

-CH-CH₂-CH-CH,-

Herstellung eines mit Serum zu verwendenden Reagens

0,5 g eines feinzerteilten Ionenaustauschharzes auf der Basis von Phenolformaidehydharz wurden in 10 ml einer mit Glykokoll gepufferten Salzlösung (pH = 8,2) suspendiert. 10 ml einer getrennt hergestellten 2%igen Lösung von menschlichem y-Globulin, die vorhergehend auf 60 bis 65° C während 10 bis 15 Minuten erhitzt worden waren, wurden dann kalt mit der vorstehenden Suspension umgesetzt. Daran schloß sich der Zusatz von 0.1% Evans-Blau-Lösung (Färbungsmittel) und Chlorthymol (Konservierungsmittel) und die gleiche Behandlung wie im Beispiel 7 an, wobei das Produkt (pH = 8,2) erhalten wurde.

Liste der lonenaustauschharze Stark saure lonenaustauschharze

Amberlite IR-120 Suifoniertes Polystyrolharz

(Ionentyp: Na-Typ).

Diaion SK-I Sulfoniertes Polystyrolharz

Ionentyp zur Verwendung als Analyse: H-Typ.

Dowex 50 W Srffoniertes Polystyrolharz.

Die lonentypen sind vorwiegend vom Η-Typ, einige jedoch vom Na-Typ.

Duolite C-20 desgl.

Na-Ionen. C-3 Phenolsulfonsäureformalde-

hydharz. C-10 desgl.

CH — CH₂ — CH — CH,—

CH₂N⁺(CHj)₃

er

Duolite A-101 I A-40 II

-CH- CH₂ -CH — CH, —

„

CH₂

CH₂ — CH —CH₂—CH

(CH₃J₂N⁺(C₂H₄OH)
CT

CH₁

«5 I

(CH₃I₂N⁺(C₂H₄OE

Schwach basische Ionenaustauschharze

Amberüte
IR 45..

1R4B

XI168
IRA-68
IRA-93

Duolite

A-30T...

Chlormethyliertes Polystyroldivinylbenzol-Copolymerisat. Diäthylentriamin ist eingeführt.
Phenolformaldehydharz. Es ist PoIyalkylenpoiyamin eingeführt. Verbessertes Erzeugnis von IR 45. Unbekannt.

Chlormethyliertes Polystyroldivinylbenzol-Copolymerisat. Dimethylamin ist eingeführt.

Phenolformaldehydharz. Es ist sekundäres Amin eingeführt. Kondensation von Polyalkylenpolyamin und Äthylenbromid. Vorwiegend tertiäres Amin.

A-30B ..

Duolite A-4 .

A-41

Dowex 4 ...

Kondensation von Polyalkylenpolyamin und Äthylenbromid. Vorwiegend quarternäres Amin.

Phenolformaldehyd. Polyalkylenpolyamin ist eingeführt (Phenolformaldehydharz).

Chlormethyliertes Polystyroldivinylbenzol. Es ist Dimethylamin eingeführt (Chlormethyliertes Polystyroldivinylbenzol-Copolymerisat).

Kondensation von Epichlorhydrin unc Ammoniak (Als Grundlage wird kondensiertes Harz, das keine aromatischen Gruppen enthält, verwendet, und Aminogruppen sind eingeführt). Unbekannt

Claims

I 900798

Patentanspruch:

Reagens fur den Rheumatoidagglutiniertest, das (a) mit y-Qlobulin überzogene Teilchen, die durch Kontaktieren eines Ionenaustauschharzes mit menschlichem y-Globulin in einer gepufferten Salzlösung gebildet wurden, und (b) als Hilfsmittel ein hämolytisches Mittel und/oder Färbungsmittel für y-Globulin in einer gepufferten Salzlösung mit einem pH-Wert von 7,5 ± 1,5 enthält.