DE1900798A1

DE1900798A1 - Reagens fuer den Rheumatoidagglutiniertest und Verfahren zu dessen Herstellung und Anwendung

Info

Publication number: DE1900798A1
Application number: DE19691900798
Authority: DE
Inventors: Yutaka Mizushima; Hidetaka Nagai
Original assignee: Kowa Co Ltd
Current assignee: Kowa Co Ltd
Priority date: 1969-01-08
Filing date: 1969-01-08
Publication date: 1970-08-27

Description

Reagens für den Rheumatoidagglutiniertest und Verfahren zu dessen Herstellung und Anwendung Die Erfindung betrifft ein Reagens für den Rheumatoidagglutiniertest, welches zur Peststellung des Rheumatoidfaktors im Gesamtblut als auch im Serum verwendet werden kann, ein Verfahren wie es bisher nicht möglich war, das ausgezeichnete Ergebnisse hinsichtlich Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit bei der Feststellung ergibt.
Das Feststellungsverfahren ist den üblichen Verfahren hinsichtlich der einfacheren Versuchsanordnung überlegen. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung des Mittels sowie ein diagnostisches Verfahren unter Anwendung desselben. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Reagens für den Rheumatoidagglutiniertest, das aus einer gepufferten Salzlösung mit einem pH-Wert von 7,5 + 1,5 besteht, worin eine geeignete Menge von mit y-Globulin überzogenen Harz teilchen, die durch Vereinigung eines Ionenaustauschharzes mit menschlichen y-Globulin in der Lösung gebildet wurden, und eine Klasse eines Hilfsmittels aus der Gruppe von hämolytischen Mitteln und Färbungsmittel, die das y-Globulin färben können, und weiterhin bevorzugt mindestens ein weiteres Hilfsmittel aus der Gruppe von Konservierungsmitteln und Stabilisatoren enthalten sind, sowie ein Verfahren zur Herstellung dieses Mittels und ein diagnostisches Verfahren unter Anwendung desselben0 Es ist bekannt, Rheumatismus serologisch durch Diagnose festzustellen, wobei mit y-Globulin überzogene Teilchen verwendet werden, die aus den roten Blutkörperchen der Schafe und einem Anti-Schafsantikörper der Kaninchen gebildet sind0 Wenn diese mit Globulin überzogenen Teilchen mit des von Menschen hergestellten Serum vermischt werden, findet eine Agglutinierung statt, wenn der Rheumatoidfaktor vorhanden ist, und es findet keine Agglutinierung in Abwesenheit dieses Faktors statt. Dieses Diagnoseverfahren wird als Waaler-Rose-Test bezeichnet und häufig einfach als Rose-Test bezeichnet. Als Modifizierung dieses Tests ist die Heller-Modifikation bekannt, wodurch die Ungenauigkeit der Bestimmung des Rose-Tests verbessert wurde.
Weiterhin ist auch ein Verfahren bekannt, bei denen als mit y-Globulin überzogene Teilchen solche verwendet werden, worin ein Polystyrollatex anstelle der, roten Blutkörperchen und natives oder aggregiertes menschliches -Globulin anstelle des vorstehenden Antikörpers verwendet wird (RiL-Test), und ein Verfahren bekannt, bei dem als mit y-Globulin überzogene Teilchen solche eingesetzt werden, worin Teilchen eines Absorbiermittels, wie Bentonit, Kaolin und roher Latex, anstelle des Polystyrollatex beim vorstehenden RA-Test,verwendet werden.
Das wesentlichste Merkmal der vorliegenden Erfindung liegt in der Anwendung eines Ionenaustauschharzes als Absorbiermittel.
Wie vorstehend ausgeführt, wurde bei sämtlichen vorhergehend aufgeführten Verfahren Serum zur Bestimmung des Rheumatoidfaktors verwendet. Dadurch tritt der Nachteil auf, daß das- Serum aus dem Gesamtblut, das abgenommen wurde, abgetrennt werden muß sowie das Serum verdünnt werden muß. Deshalb ist es in der Praxis nicht einfach durchführbar, da es notwendig ist, ein ziemlich gut ausgestattetes Laboratorium zur Verfügung zu hauben, Andererseits zeigt sich im Fall der vorstehend aufgeführten mit Globulin überzogenen Teilchen, die aus Polystyrollatex und Globulin bestehen, obwohl dort der Vorteil auftritt, daß der Latex eine leicht mit genauer Reproduzierbarkeit nach einem einfachen Verfahren herstellbare Verbindung ist, der Nachteil, daß aufgrund solcher Faktoren, wie Modifizierung des y-Globulins und nicht spezifische Agglutinierung des Harzes, nicht nur die Stabilität schlecht ist, sondern auch die Genauigkeit der Feststellung unzureichend ist, so daß der Nachteil auftritt, daß bei der Abschätzung der Ergebnisse des Tests eine beträchtliche Erfahrung erforderlich ist, Obwohl die Gründe für die vorstehenden Pehler nicht klar sind, dürfte anzunehmen sein, daß die Bindung zwischen den Teilchen des Polystyrollatex und des y-Globulins schwach ist und weiterhin, daß das y-Globulin in einem gegenüber den Versuchsbedingungen übermäßigen Ausmaß während der Konservierung des Reagens modifiziert wurde und dies die Hauptursachen für den Fehler darstellen, 4 Aufgrund umfangreicher Untersuchungen im Hinblick auf die Überwindung dieser zahlreichen Nachteile und Mängel wurde gefunden, daß als mit Globulin überzogene Teilchen solche, die aus einem Ionenaustauschharz und menschlichem y-Globulin bestehen, verwendet werden können, und daß durch Anwendung derartiger Teilchen der komplizierte Serumverdünnungsarbeitsgang vermieden werden kann, obwohl auch Serum für den Test verwendet werden kann. Es wurde weiterhin festgestellt, daß ein Diagnosereagens erhalten werden konnte, das auch zur Bestimmung des Gesamtblutes verwendet werden kann. Ausserdem wurde festgestellt, daß dieses Reagens nicht nur eine ausgezeichnete Feststellungsempfindlichkeit und Feststellungsgenauigkeit besitzt, sondern auch eine ausgezeichnete Stabilität zeigt, ganz gleich ob es zur Untersuchung von Serum oder von Gesamtblut verwendet wird. Es wurde auch festgestellt, daß das zur Herstellung dieser mit Globulin überzogenen Teilchen verwendete Ionenaustauschharz leicht zugänglich ist und daß der Arbeitsgang zur Herstellung dieser Teilchen einfach ist0 Eine Aufgabe der Erfindung besteht in einem Reagens für den Rheumatoidagglutiniertest, das eine ausgezeichnete Stabilität besitzt und eine überlegene Feststellungsempfindlichkeit sowie überlegene Genauigkeit der Feststellung zeigt. Eine weitere Aufgabe besteht in einem Verfahren zur Herstellung dieses Reagenses ç Eine weitere Aufgabe besteht in einem Verfahren zur Diagnose unter Anwendung dieses Reagens.
Andere Aufgaben und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung.
Die mit y-Globulin überzogenen Teilchen, die aufgrund ihrer Anwesenheit im erfindungsgemäßen Reagens für den Rheumatoidagglutiniertest Agglutinierungen durch Umsetzungen mit dem Rheumatoidfaktor ergeben, können durch Kontaktierung eines Ionenaustauschharzes mit menschlichem Globulin in einer gepufferten Salzlösung hergestellt werden.
hls gepufferte Salzlösungen sind wäßrige Salzlösungen verwendbar, deren pH-Wert auf 7,5 i 1,5, bevorzugt 6,5 bis 8,5, und besonders bevorzugt auf 7,5 bis 8,5, unter Anwendung eines sauren Bestandteils, beispielsweise Glycin, 'Lrishydroxyaminomethan, Kaliumdihydrogenphosphat, Borsäure und Salzsäure und eines basischen Bestandteils, beispielsweise eines Alkalihydroxyds, wie Natriumhydroxyd oder Kaliumhydroxyd, eines klkalicarbonats, wie Natriumcarbonat oder Kaliumcarbonat und anderen Verbindungen, wie Borax oder Dikaliumhydrogenphosphat, eingeregelt wurde. Besonders bevorzugt werden Pufferlösungen, bei denen Glycin und Natriumhydroxyd verwendet wurden.
Die gebildeten mit y-Globulin überzogenen Teilchen können aus der gepufferten Salzlösung, worin sie gebildet wurden, abgetrennt werden und in einer getrennt hergestellten gepufferten Salzlösung suspendiert werden, worauf entweder ein hämolytisches Mittel oder ein Pärbungsmittel, das das y-Globulin färben kann, zugesetzt werden können.
Andererseits können auch das hämolytische Mittel oder das Färbungsmittel zu der Pufferlösung zugegeben werden, worin die mit y-Globulin überzogenen Teilchen gebildet wurden, ohne daß die Teilchen hieraus abgetrennt wurden.
Deshalb muß der pH-Wert der gepufferten Salzlösung nicht notwendigerweise auf den zur Herstellung der vorstehenden Teilchen aufgefihrten pH-Wert eingeregelt werden und die Einstellung des pH-Wertes auf 7,5 i 1,5, bevorzugt 6,5 bis 8,5, und besonders bevorzugt auf 7,5 bis 8,5 braucht nur so durchgeführt werden, daß diese pH-Werte in dem Endprodukt erhalten werden.
Bei der Vereinigung des Ionenaustauschharzes mit dem menschlichen y-Globulin in der vorstehend aufgeführten gepufferten Salzlösung kann der Zusatz der beiden Bestandteile zu der Pufferlösung gleichzeitig erfolgen oder das Ionenaustauschharz kann zuerst zugesetzt werden und dann das menschliche Globulin zugesetzt werden oder die Zugabereihenfolge der beiden kann in umgekehrter Ordnung erfolgen, dohç Zusatz des menschlichen y-Globulins und anschliessender Zusatz des Ionenaustauschharzes.
Es ist auch möglich, die beiden Bestandteile getrennt zu zwei Pufferlösungen zuzugeben, die dann vermischt werden, Es besteht keine spezielle Begrenzung hinsichtlich der Temperatur der Umsetzung, bei der die mit Globulin überzogenen Teilchen gebildet werden und es ist möglich, diese Umsetzung unter Anwendung von Wärme oder Abkühlung durchzuführen. Beispielsweise kann die Umsetzung unter Kühlung mit einem Eis-Wasser-Bad durchgeführt werden oder sie kann unter Erwärmen ausgeführt werden0 Bevorzugt wird es jedoch üblicherweise, bei Temperaturen von 0 bis 10t zu arbeiten.
Beispiele von zur Bildung der mit y-Globulin überzogenen Teilchen verwendbare Ionenaustauschharze sind, solche, die aus der Gruppe von stark sauren Ionenaustauschharzen, stark basischen Ionenaustauschharzen und schwach basischen Ionenaustauschharzen gewählt wurden. Besonders bevorzugt sind die schwach basischen lonenaustauschharze, um eine zufriedenstellende Verbindung mit dem menschlichen Globulin zu erhalten.
Die Teilchengröße dieser Harze liegt bevorzugt bei einem Durchschnittsteilchendurchmesser von 0,5 bis 3 Mikron und vom Gesichtspunkt der Erzielung einer verbesserten Stabilität für das gebildete Reagens wird es bevorzugt, daß die Teilchen, die in den vorstehend aufgeführten Teilchendurchmesserbereich fallen, 75 Gew,-, bevorzugt 85 Gew.-%,und besonders bevorzugt 90 Gew,-der gesamten Teilchen ausmachen Als spezifische Beispiele für derartige Ionenaustauschharze seien die stark sauren Ionenaustauschharze, wie z.B. Amberlite IR-120 (Rohm & Haas Coç) Diaion SK-1 (Mitsubishi Chemical Co.), Dowex 50W (Dow Chemical Co.) und Duolite C-20 (Diamond Alkali Com), C-3, C-10, sowie stark basische Ionenaustauschharze, wie Amberlite IRA-400, 900, Diaion SA-10A, 20A, Dowex 1, 2 und Duolite A-101, A-40 und die schwach basischen Ionenaustauschharze, wie Amberlite IR-45, IR-4b, XE-168, IRA-68, IRA-93, Diolite A-2, A-30T, A-30B, A-4, A-41 und Dowex 4, 44, aufgeführt0 Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die mit y-Globulin überzogenen Teilchen, die aus dem vorstehenden Ionenaustauschharz und menschlichem Globulin bestehen, entweder ohne Abtrennung oder mit einer zunächst erfolgenden Abtrennung aus der gepufferten Salzlösung verwendet, worin sie gebildet wurden0 Im Fall ihrer Abtrennung werden sie dann zu einer ähnlichen gepufferten Salzlösung, wie sie beschrieben wurden, zugesetzt. In die dabei erhaltene, die mit y-Globulin überzogenen Teilchen enthaltende Pufferlösung werden dann als Hilfsmittel entweder ein hämolytisches Mittel oder ein Färbungsmittel, welches das Globulin färben kann, einverleibt0 Weiterhin bevorzugt kann noch mindestens ein weiteres Hilfsmittel aus der Gruppe von Konservierungsmitteln und Stabilisatoren einverleibt werden0 Es kann eine einzige Verbindung oder eine Mehrzahl von Verbindungen der hämolytischen Mittel, Färbungsmittel, Konservierungsmittel und Stabilisatoren einverleibt werden4 Es gibt keine Begrenzungen hinsichtlich der Reihenfolge, in der die Hilfsmittel zugesetzt werden4 Sie können in jeder beliebigen Reihenfolge zugegeben werden oder sie können sämtliche zusammen zugegeben werden.
Als hämolytische Mittel sind z.B. Saponine, Alkaloide, Salze der Gallensäure, Harnstoff, Alkylamine und oberflächenaktive Mittel verwendbar. Unter diesen oberflachenaktiven Mitteln sind die anionischen oberflächenaktiven Mittel, wie z0B4 Natriumoleat, Natriumlaurylsulfat, Natriumcetylsulfat, Natriumstearylsulfat, Natriumalkylbenzolsulfonat und Dialkylsulfosuccinat, kationische oberflächenaktive Mittel, wie z.B. Alkyltrimethylammoniumchloride, Benzyldimethylalkylammoniumbromide und Cetylpyridiniumchlorid, nichtionische oberflächenaktive Mittel, wie zeB. Polyoxyäthylensorbitanmonolaurat, Polyoxyäthylensorbitanmonooleat, Polyoxyäthylenstearat, Polyoxyäthylenlaurylalkohol und Polyglykoläther von Alkylphenolen, amphotere oberflächenaktive Mittel vom Miranol-Typ und Aktivatoren vom Polyäthylenglykol-Typ (200, 400, 600 und 800) verwendbar. Von diesen hämolytischen Mitteln sind besonders vorteilhaft die Saponine, Dodecylaminacetat, welches ein Alkylamin darstellt, oder Aktivatoren vom Miranol-Typ.
Das Färbungsmittel kann aus solchen bestehen, die zur Färbung von menschlichem Globulin geeignet sind. Hierzu gehören z.B. als rote Farbstoffe Ponceau R (C.I. 16150), Ponceau 3R (C,Ie 16155) und Rose Bengal (C.I. 45440), als grüne Farbstoffe Naphthal Green B und Brilliant Green (CoIX 42040) und als blaue Parbstoffe Evans Blue, Brilliant Blue FCF (C.I. 42090), Patent Blue (0.1. 42051) und Trypan Blue (C.I 23850).
Als Konservierungsmittel seien zçB erwähnt Natriumazid, die Phenole, wie Kresole, Chlorthymol, Thymol und iaraoxybenzosäureester und die Quecksilberphenyle, wie Quecksilberphenylacetat, Quecksilberphenylsulfat und quecksilberphenylborat, Weiterhin können auch Stabilisatoren zur weiteren Erhöhung der Stabilität des Endproduktes zugesetzt werden. Dies gilt besonders für den Fall eines Reagenses, welches die mit Globulin überzogenen Teilchen und ein hämolytisches Kittel enthält und das zur direkten Untersuchung des Gesamtblutes verwendet wird. Da in diesem Fall eine Eluierung von Hämoglobin und anderen Bestandteilen stattfindet, findet gelegentlich bei Anwendung des Mittels die Agglutinierung zwischen den mit Globulin überzogenen Teilchen und anderen Faktoren als dem Rheumatoidfaktor statt, so daß die Anwendung eines Stabilisators besonders zu empfehlen ist. Da die Stabilisatoren auch eine Neigung zur Erhöhung der Stabilität des y-Globulins zeigen, können sie auch im Fall eines Reagenses, welches die mit Globulin überzogenen Teilchen und ein Parbungsmittel enthält, das zur Untersuchung des Serums verwendet wird, eingesetzt werden.
Zu derartigen Stabilisatoren gehören die Serumalbumine, Peptone, Gelatine und Aminosäuren, wie z.B.
Acetyltryptophan, In dem erfindungsgemäßen Reagens können die Mengen, worin die mit Globulin überzogenen Teilchen, hämolyti scheß Mittel, Pärbungsmittel, Konservierungsmittel und Stabilisator in der gepufferten Salzlösung enthalten sind, in geeigneter Weise in Abhängigkeit von den Arten der Mittel und ihrer Kombination variiert werden Üblicherweise werden folgende Bereiche angewandt, bezogen auf das Reagens: 0,5 bis 2 Gew.-%, bevorzugt 1 bis 1,5 Gew,- der mit y-Globulin überzogenen Teilchen, 0,5 bis 2 ew,-, bevorzugt 0,1 bis 0,5 Gew.-0/a des hämolytischen Mittels, 0,005 bis 0,15 GewO-%, bevorzugt 0,01 bis 0,1 Gew,- des Färbungsmittels, 0,005 bis 0,5 Gew9-, bevorzugt 0,1 bis 0,2 Gew.-% des Konservierungsmittels, sowie 0,005 bis 1,0 Gew9-%, bevorzugt 0,01 bis 0,5 Gew.-% des Stabilisiermittels.
Bei der Diagnose von Rheumatismus unter Anwendung des erfindungsgemäßen Mittels wird, falls das verwendete Mittel eines mit einem pH-Wert von 7,5 # 1 ist, das die mit y-Globulin überzogenen Teilchen und ein Pärbungsmittel in einer gepufferten Salzlösung enthält, die weiterhin auch ein Konservierungsmittel und/oder ein Stabilisiermittel enthalten kann, das Serum von dem Gesamtblut abgetrennt und dieses Serum direkt dem Test unterworfen.
Das komplizierte Verfahren der Verdünnung des Serums, wie beim üblichen Verfahren, wird in diesem Fall unnötig.
Wenn andererseits das verwendete Reagens eines mit einem pH-Wert von 7,5 + 1 ist, das die mit Globulin überzogenen Teilchen und ein hämolytisches Mittel in einer gepufferten Salzlösung enthält, die auch ein Konservierungsmittel und/oder ein Stabilisiermittel enthalten kann, kann das Gesamtblut zur Bestimmung verwendet werden.
Der Test kann sehr einfach und schnell durchgeführt werden, wie im Fall der Bestimmung des Bluttyps. D.h., wenn frisches Blut vom Ohr oder Finger mit einem Tropfen des Reagens vermischt wird, zeigen sich die Eigenschaften der Rheumatoidagglutinierung, wie im Fall des üblichen Verfahrens, bei dem Serum verwendet wird. Weiterhin kann im Hinblick auf die Farbtönung der Hämoglobine die Bestimmung'genau erfolgen, ohne daß es notliendig ist, vorher mit einem Färbungsmittel zu färben.
Zwei typische Beispiele für bevorzugte Ansätze des Reagens für den Rheumatoidagglutiniertest gemäß der Erfindung werden nachfolgend gegebene (1) Bestimmung im Gesamtblut Mit Glycin gepufferte Salzlösung eines pH-Wertes von 8 bis 9 und folgendem Gehalt: Gramm je 100 ml Lösung Mit Globulin überzogene Teilchen, die aus einem schwach basischen Ionenaustauschharz und menschlichem Globulin bestehen 1-- 2,0 Saponin (hämolytisches Mittel) 0,3 - 0,7 Natriumazid (Konservierungsmittel) 0,1 - 0,15 Serumalbumin (Stabilisator) 0,27 - 0,34 Acetyltryptophan (Stabilisator) 0,01 - 0,015 Ein Beispiel für diese Art des Mittels wird folgend gegeben: Gehalt (Gramm) je 100 ml Glycin-gepufferter Salzlösung Mit y-Globulin überzogene Teilchen, bestehend aus menschlichem y-Globulin und einem schwach basischen Ionenaustauschharz Amberlite IR-45 (Durchschnittsteilchendurchmesser 2,1 µ , 90% mit Teilchendurchmesserii von 1 bis 3 µ ) 1,50 Saponin 0,50 Natriumazid 0,10 Serumalbumin der Kuh 0,30 Ace tyltryptophan r 0,012 (2) Untersuchung des Serums Mit y-Globulin überzogene Teilchen, bestehend aus einem schwach basischen Ionenaustauschharz und menschlichem y-Globulin 0,5 - 1,0 % Natriumazid (Konservierungsmittel) 0,1 - 0,15 % Serumalbumin (Stabilisator) 0,27 - 0,34 % Trypan Blue (Färbungsinittel) 0,01 - 0,015 % Ein Beispiel einer derartigen Art ist folgendes: Gehalt (Gramm) je 100 ml Glycin-gepufferter Salzlösung Mit y-Globulin überzogene Teilchen, bestehend aus menschlichem y-Globulin und schwach basischem Ionenaustauschharz Amberlite IR-45 (Durchschnittsteilchendurchmesser 2,1 µ , 90 % mit Teilchendurchmessern von bis 3 µ ) 1,50 dvans-blue 0,01 Vatriumazid 0,10 berumalbuMin der Kuh 0,30 Acetyltryptophan 0,012 Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung und stellen einige Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar.
Beispiel 1 Herstellung eines mit Gesamtblut zu verwendenden Reagens: 2 g des Ionenaustauschharzes Dowex 44 (OH-Typ, Produkt der Dow Chemical Co.) wurden gebrochen und zu einer einheitlichen Teilchengröße mit Durch'messern von 1 bis 2 geformt und in 14 ml einer mit Glycin gepufferten Salzlö-Lösung suspendiert (pH 8,2, n/10 Glycin und n/20 Na-triumhydroxyd). Ein im Handel erhältliches menschliches y-Globulin wurde mit der vorstehenden wäßrigen Lösung zu einer Konzentration von 2 % verdünnt, Nachdem diese wäßrige Lösung während 10 bis 15 Minuten auf 60 bis 65°C erhitzt wurde, wurden 1,5 ml hiervon zu 1,5 ml der vorstehenden Suspension zugesetzt, worauf die Umsetzung während 2 Stunden in Eiswasser unter Rühren ausgeführt wurde0 Dann wurde das Harz, das die mit Globulin überzogenen Teilchen ergab, abzentrifugiert und abgesetzt, worauf gründlich gewaschen wurde und anschliessend-8 ml der vorstehenden mit Glycin- gepuffarten Salzlösung zugesetzt wurden. Zu dieser Suspension wurden dann jeweils 400 mg eines nichionischen Polyoxyäthylenlauryläthers (hämolytisches Mittel) und Albumin (Stabilisator) und weiterhin 0,8 mg Thymerosal (Konservierungsmittel) zugesetzt und das Produkt erhalten (pH = 8,5). Dieses Mittel wurde bei 2 bis 10S aufbewahrt und vor Gebrauch gut geschüttelt.
Beispiel 2 Herstellung eines mit Gesamtblut zu verwendenden Reagens: Zu einer, wie in Beispiel 1, hergestellten Suspension, wobei jedoch 2 g feinzerteiltes Ionenaustauschharz Amberlite IR-45 (NH2-Typ, Produkt der Rohm & Haas Co,) verwendet wurden, wurden jeweils 40 mg Saponin (hämolytisches Mittel) und Albumin (Stabilisator) und weiterhin 10 mg Natriumazid (Konservierungsmittel) zugesetzt und das Produkt erhalten (pH = 8,5).
Beispiel 3 Herstellung eines mit Gesamtblut zu verwendenden Reagens: Zu einer, wie in Beispiel 1, hergestellten Suspension, wobei jedoch 2 g feinzerteiltes Ionenaustauschharz Amberlite IR-4B (OH-Typ) verwendet wurden, wurden jeweils 40 mg Laurylamin (hämolytisches Mittel) und Albumin (Stabilisator) und weiterhin 0,8 mg Chlorthymol (Konservierungsmittel ) zugesetzt und das Produkt erhalten (pH = 8,2).
Beispiel 4 Herstellung eines mit Gesamtblut zu verwendenden Reagens: Zu einer, wie in Beispiel 1, hergestellten Suspension, wobei jedoch 2 g feinzerteiltes Ionenaustauschharz Amberlite IRA-411 (Chlor-Typ) verwendet wurden, wurden jeweils 40 mg Saponin (hämolytisches Mittel) und Albumin (Stabilisator) und weiterhin 0,8 mg Quecksilberphenylsulfat (Konservierungsmittel) zugesetzt und das Produkt erhalten (pH = 8,2).
Beispiel 5 Herstellung eines mit Gesamtblut zu verwendenden Reagens: Zu einer, wie in Beispiel 1, hergestellten Suspension, wobei Jedoch feinzerteiltes Ionenaustauschharz Amberlite IRC-50 (H-Typ) verwendet wurde, wurden jeweils 40 mg Niranol C2M (hämolytisches Mittel) und Albumin (Stabilisator) sowie 0,8 mg Thymerosal (Konservierungsmittel) zugegeben und das Produkt (pH = 8,8) erhalten9 Bei spiel 6 Herstellung eines mit Serum zu verwendenden Reagens: 2 g des Ionenaustauschharzes Dowex 44 (oder 3) (OH-Typ) das zu einheitlich feinzerteilten Teilchen mit Burchmessern von 1 bis 2 /u verteilt worden war, wurden in 13 ml einer mit Glycin gepufferten Salzlösung suspendiert (pH 8,2, n/10 Glycin, n/20 Ätznatron). Getrennt wurde ein handelsübliches menschliches Globulin in der gleichen gepufferten Lösung zu einer Konzentration von 2 % gel-öst und während 10 bis 15 Minuten auf 60 bis 65°C erhitzt, 1,5 ml dieser Lösung wurden zu 1,5 ml der vorstehenden Suspension zugesetzt, worauf das Gemisch während 2 Stunden in Eiswasser unter Rühren umgesetzt wurde. Daran schloß sich der Zusatz einer 1%igen Brilliant Green-Lösung (Färbungsmittel) an und das gefärbte Harz wurde zentrifugiert und abgesetzt (mit Globulin über zogene Teilchen ), gründlich gewaschen und anschliessend 20 ml einer mit Glycin gepufferten Salzlösung zugesetzt7 die 0,1 ffi Natriumazid (Konservierungsmittel) enthielt, und das Produkt (pH = 7,5) erhalten. Dieses Mittel wurde bei 2 bis 10°C aufbewahrt und gründlich vor der Verwendung geschüttelt.
Beispiel 7 Herstellung eines mit Serum zu verwendenden Reagens: 0,5 g eines feinzerteilten Ionenaustauschharzes Amberlite IR-120 (H-?ypw Produkt der Rohm & Haas Co.) wurden in 10 ml einer mit Glycin gepufferten Salzlösung (pH 8,2), die 0,01 % Thymerosal (Konservierungamittel) enthielt, suspendiert. Zu dieser Suspension wurden 10 ml der gleichen in Beispiel 6 beschriebenen 2%igen Lösung von menschlichem y-Globulin zugegeben, worauf das Gemisch auf 55°C während 15 Minuten erhitzt wurde. Daran schloß sich die Zugabe von 0,1 % Evans Blue-Lösung (Färbungemittel) zum Färben des Gemisches an, worauf der Zusatz von Quecksilberphenylacetat (Konservierungsmittel) und Verdünnung des Gemisches mit 80 ml der vorstehenden Glycin gepufferten Salzlösung anschloß, so daß das Produkt ( pH = 9,2) erhalten wurde.
Beispiel 8 Herstellung eines mit Serum zu verwendenden Reagens: Gew,-14it T-Globulin überzogene Teilchen, die aus menschlichem y-Globulin und dem gleichen Ionenaustauschharz, wie im Beispiel 7, bestanden, 0,5 - 1,0 Thymerosal 0,01 rypzan-Blau 0,01 Albumin 0,27 - 0,34 Die Ausgangsmaterialien der vorstehenden Masse wurden eingesetzt und das Reagens, wie in Beispiel 6, hergestellt, wobei die maximalen Konzentrationen der Bestandteile in der Glycin gepufferten Salzlösung (pH 6,6 bis 8,5) im vorstehenden Rahmen waren.
Beispiel 9 Herstellung eines mit Serum zu verwendenden Reagens: 0,5 g eines feinzerteilten Ionenaustauschharzes Dowex 44 wurden in 10 ml einer mit Glycin gepufferten Salzlösung (pH æ 8,2) suspendiert. 10 ml einer getrennt hergestellten 2 %eigen Lösung von menschlichem y-Globulin, die vorhergehend auf 60 bis 65°C während 10 bis 15 Minuten erhitzt worden waren, wurden dann kalt mit der vorstehend den Suspension umgesetzt. Daran schloß sich der Zusatz von 0,1 % Evans-Blau-Lösung (Färbungsmittel) und Chlorthymol (Konservierungsmittel) und die gleiche Behandlung, wie in Beispiel 7, an, wobei das Produkt (pH = 8,2) erhalten wurde,

Claims

Patentansprüche 1. Reagens für den Pheumatoidagglutiniertest, bestehend aus einer gepfferten Salzlösung mit eineM pH-Wert von 7,5 + 1,5, das (a) mit 8-Gloputin uber zogene Teilchen, die durch Kontaktieren eines Tonenaustauschharzes mit menschlichem @-Globulin in einer gepufferten Salzlösung gebildet wurden, und (@) als Hilfsmittel ein hämolytisohes Mittel und/oder Farbungsmittel, das Globulin färbt, enthält.
2. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die mit Globulin überzogenen Teilchen qS solchen bestehen, in welchen das Ionenaustauschharz aus stark sauren Ionenaustauschharzen, stark basischen Ionenaustauschharzen oder schwach basischen Ionenaustauechharzen besteht,und das Mittel außer den mit g -Globulin tberzogenen Teilchen und dem hämolytischon Mittel wenigstens ein Konservierungsmittel und/oder Stabilisierungsmittel als Hilfsmittel enthält.
3. Reagens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch g kennzeichnet, daß das hämolytische Mittel aus Saponin Alkaloiden, Salsen der Gallensäure, Harnstoff, Alkyl aminen oder oberflächenaktiven Mitteln, das Konservierungsmittel aus Natriumazid, Kresolen, Chlorthymol, Thymol, p-Oxybenzoesäureestern, Thymerosal, Quecksilberphenylacetat, Quecksilberphenylaulfat oder Quecksilberphenylborat, und das Stabilisierungsmittel aus Aminosäuren, wie Acetyltryptophan, Serumalbuminenw retonen oder Gelatine bestehen.
4. Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die mit Globulin überzogenen Teilchen in dem Reagens in einer Menge im Bereich von 0,5 bis 2 Gew.% das hämolytische Mitte; in dem Reagens in einer Menge im Bereich von 0,05 bio 2 Gew.%, das Konservierungsmittel in dem Reagens in einer Menge im Bereich von 0,005 bis 0,5 Gew.% und das Stabilisierungsmittel in dem Reagens in einer Menge i: Bereich von o,oo5 bis l,o Gew.% enthalten sind.
5. Reagens nach einem der Ansprüche 1 bis 4, durch gekennzeichnet, daß das Ionenaustauschharz au einem schwach basischen Ionenaustauschharz besteht, dessen Teilchengröße durchschnittlich 0,5 bis 3 Mi- t Durchmesser beträgt, wobei die Teilchen innerhalb d@eses Bereichs des Durchmessers mindestens 75 Gew.% der Gesamtteilchen ausmachen.
6. Reagens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es (a) mit Globulin überzogene Teilchen, in welchen das Ionenaustauschharz aus stark sauren Ionenaustauschharzen, stark basischen Ionenaustauschharzen oder schwach basischen Ionenaustauschharzen oc;-steht, (b) das Färbemittel und (c) wenigstens ein K@@ -servierungsmittel und/oder Stabilisierungsmittel al Hilfsmittel enthält.
7. Reagens nach Anspruch 6, dadurch gekennzel net, daß das Färbemittel aus Ponceau R, Ponceau 3R, Rose Bengal, Naphthol Green B, Brilliant Green, Evans Blume, Brilliant Blue FCF, Patent Blue oder Trpan Siu, das Konservierungsmittel aus Natriumazid, Kresol, Chlc>rthymol, Thymol, p-Oxybenzoesäureestern, Thymerosal, Quecksilberphenylacetat, Quecksilberphenylsulfat oder Quecksilberphenylborat und der Stabilisator aus Aminosäuren, wie Acetyltryptophan, Serumalbuminen, Peptonen oder Gelatine bestehen.
8. Reagens nach Anspruch 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die mit Globulin überzogenen TeIlchen in dem Reagens in einer Menge von o,5 bis 2 Gew., das Färbemittel in dem Reagens In einer Menge von o,o5 bis 0,15 Gew.%, das Konservierungsmittel in dem Reagens in einer Menge von o,oo5 bis o,5 Gew.% und das Stabilisierungsmittel in einer Menge von o,oo5 bis l,o Gew.% enthalten sind.
9. Reagens nach einem der Ansprüche 6 bis 8 dadurch gekennzeichnet, daß das Ionenaustauschharz aus einem schwach basischen Ionenaustauschharz mit einer Teilchengröße von durchschnittlich 0,5 bis 3 Mikron Durchmesser, wobei die Teilchen, die innerhalb dieses Durchmesserbe,reiches fallen, wenigstens 75 Gew.% der Gesamtteilchen ausmachen, besteht.
lo. Verfahren zur Herstellung eines Reagens für den Rheumatoidagglutiniertest nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Ionenaustauschharz mit menschlichem Globulin in einer epufferten Salzlösung zur Bildung von mit Globulin überzogenen Teilchen in Berührung bringt und anschl@essend diese Teilchen in einer gepufferten, auf einen pH-Wert von 7,5 + 1 eingestellten Salzlösung mit einem hämolytischen Mittel und/oder einem Färbemittel, das Globulin färben kann, vereinigt.
11. Verfahren nach Anspruch lo, dadurch gekennzeichnet, daß man als #-Globulin-überzogene Teilchen solche verwendet, in welchen das Ionenaustauschharz aus stark sauren Ionenaustauschharzen, stark basischen Ionenaustauschharzen oder schwach basischen Ionenaustauschharzen besteht, und daß man die Teilchen mit einem hämolytischen Mittel und wenigstens einem gonservierungsmittel und/oder Stabilisierungsmittel als Hilfsmittel vereinigt.
12. Verfahren nach Anspruch lo oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als hämolytisches Mittel Saponin, Alkaloide, Salze der Gallensäure, Harnstoff, Alkyiamine oder oberflächenaktive Mittel, als Konservierungs mittel Natriumazid, Kresol, Chlorthymol, Thymol, p-Oxybenzossäureester, Thymerosal, Quecksilberphenylacetat,.

Quecksilberphenylsulfat oder Quecksilberphenylborat und als Stabilisierungsmittel Aminosäuren, wie Acetyltryptophan, Serumalbumine, Peptone oder Gelatine,verwendet.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche lo bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß man die mit Globulin überzogenen Teilchen dem Reagens in einer Menge im Bereich von 0,5 bis 2 Gew.%, das hämolytische Kittel dem Reagens in einer Menge im Bereich vcn o,o5 bis 2 Gew.%, das Konservierungsmittel dem Reagens in einer Menge im Bereich von o,oo5 bis o,5 Gew.% und das Stabilisierungsmittel dem Reagens in einer Menge im Bereich von o,oo5 bis 1,o Gew.% einverleibt.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche l bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als Ionenaustauschharz ein schwach basisches Ionenaustauschharz mit einer durchschnittlichen Teilchengröße von o,5 bis 3 Mikron Durchmesser verwendet, wobei die innerhalb dieses Durchmesserbereiches fallenden Teilchen wenigstens 75 Gew.% der gesamten Teilchen ausmachen.
15. Verfahren nach Anspruch lo, dadurch gekennzeichnet, daß man die mit Globulin überzogenen Teilchen, in welchen das Ionenaustauschharz aus einem stark sauren Ionenaustauschharz, einem stark basischen Ionenaustauschharz oder einem schwach basischen Ionenaustauschharz besteht, mit dem Färbungsmittel und ausserdem lit wenigstens einem Hilfsmittel, bestehend aus einem Konservierungsmittel und/oder Stabilisierungsmittel, vereinigt.
16. Verfähren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man als Färbemittel Ponceau R, Ponceau 3R, Rose Bengal, Naphthol Green B, Brilliant Green, Evans Blus, Brilliant Blue FCF, Patent Blue oder Trypan Blue, als Konservierungsmittel Natriumazid, Kresol, thlorthynol, Thymol, p-Oxybenzoesäureester, Thymerosal, Quecksilberphenylacet, Quecksilberphenylsulfat oder Quecksilberphenylborat und als Stabilisierungsmittel Aminosäuren, wie Acetyltryptophan, Seruualbumine, Peptone oder Gelatine verwendet.
17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß man die mit Globulin überzogenen Teilchen dem Reagens in einer Menge im Bereich von 0,5 bis 2 Gew.0/a, das Färbungsmittel dem Reagens in einer Menge im Bereich von o,oo5 bis 0,15 Gew.£/o, das Konservierungsmittel dem Reagens in einer Menge im Bereich von 0,005 bis 0,5 Gew.% und das Stabilisierungsmittel dem Reagens in einer Menge im Bereich von 0,005 bis l,o Gew. einverleibt.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet; daß man als lonenaustauschharz ein schwach basisches Ionenaustauschharz mit einer durchschnittlichen Teilchengröße von o,5 bis 3 Mikron verwendet, wobei die innerhalb des angegebenen Durchmesserbereichs fallenden Deilchen wenigstens 75 Gew. der gesamten Teilchen ausmachen.
19. Verwendung des Reagens für den Rheumatoidagglutiniertest nach einem der Ansprüche 1 bis 5, zur Bestimmung des Vorhandenseins des Rheumatoidfaktors aufgrund der Bildung von Agglutinierungen durch Vermischen mit menschlichem Gesamtblut.
20. Verwendung des Reagens für den Rheumatoidagglutiniertest nach einem der Ansprüche 1, und 6 bis 9,, zur Bestimmung des Rheumatoidfaktors aufgrund der Bildung von Agglutinierungen durch Vermischen mit menschlichem Serum.