DE3223837A1 - Verfahren und ausruestung zur bestimmung von glykosilierten proteinen in biologischen fluiden oder fluessigkeiten - Google Patents

Verfahren und ausruestung zur bestimmung von glykosilierten proteinen in biologischen fluiden oder fluessigkeiten

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DE3223837A1 DE19823223837 DE3223837A DE3223837A1 DE 3223837 A1 DE3223837 A1 DE 3223837A1 DE 19823223837 DE19823223837 DE 19823223837 DE 3223837 A DE3223837 A DE 3223837A DE 3223837 A1 DE3223837 A1 DE 3223837A1
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Paolo Siena Neri
Carlo Impruneta Paoli
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Description

Case 1404
ISTITÜTO SIEROTERAPICO E VACCINOGENO TOSCANO "SCLAVO" S.p.Α., Siena/Italien Verfahren und Ausrüstung zur Bestimmung von
glykosilierten Proteinen in biologischen Fluiden oder Flüssigkeiten
BESCHREIBUNG
Es ist äußerst wichtig, den Blutspiegel von Glykose bei Diabetes-Patienten unter genauer Kontrolle zu halten, welche bekanntlich eine Schwankung von Glykämie in einer Vielzahl von Fällen zeigen.
Da die Entwicklung von fortschreitenden sekundären Komplikationen von Diabetes mit der Intensität der Kontrollen des metabolischen Verhaltens des Patienten in Beziehung steht, wurde nach Parametern gesucht, welche in der Lage sind, Angaben zu liefern, die unabhängig von den schnellen Schwankungen von Glykämie, wie dies in der Literatur bekannt ist, sind, und die durch eine Anzahl von Variablen entstehen.
Ein Weg zur Ermittlung des Zustands der Glykämie-überwachung bei solchen Patienten besteht darin, die nicht enzymatisch glykosilierten Proteine zumessen (Yue, K. et al., Diabetes, 29: 296, 1980). Eine derartige Reaktion ist für eine Anzahl
von Proteinen gemeinsam und ist ein Glykose-blockierender Prozess (Day, J.F. et al/ J. Biol. Chem. 254; 595, 1979).
Das überwachen dieses Prozesses gibt deutliche Hinweise, um den Grad der metabolischen Kontrolle bzw. des metabolischen Hemmnisses bei Diabetes-Patienten festzustellen, da gezeigt wurde, daß ein Glykämie-Anstieg einen dauernden Anstieg des glykosilierten Betrages schafft. Die Messung des glykosilierten Hämoglobins (Hb A-.) kann als Langzeitkontrolle für Glykämie dienen, da das Leben eines solchen Proteins sehr lang ist (etwa 120 Tage). Andererseits kann diese Dosis-Messung von geringem Nutzen sein, wenn es gewünscht ist, das Fortschreiten einer1 therapeutischen Behandlung zu verfolgen. Zu letzterem Zweck kann es interessanter sein, den Grad der Glykosilierung von Albumin auszuwerten, da dessen Lebensdauer kürzer ist als diejenige von Hämoglobin. Glykosiliertes Hämoglobin wird aus dem Gesamthämoglobin durch Ionenaustausch-Chromatographie an schwach saurem Harz isoliert und wird dann kolorimetrisch gemessen.
Hb A1 kann auch bestimmt werden, indem durch Reaktionen mit Thiobarbitursäure (TBA) die Menge an 5-Hydroxymethylfurfural (HMF), welche durch saure Behandlung erzeugt wird, ausgewertet wird. Dieser Parameter wurde im Zusammenhang mit der Glykosilierung von Albumin mit Methoden ausgewertet, wobei diese zu dessen Isolierung durch chromatographische Affinität auf bestimmten besonderen Farbstoffen und anschließende kolorimetrische Bestimmung nach der Reaktion mit (TBA) vorgesehen sind oder alternativ durch Ionenaustausch-Chromatographie und anschließende Bestimmung, indem die optische Dichte der so erhaltenen Fraktionen abgelesen wird.
Danach wurde gezeigt, daß eine sehr enge Beziehung zwischen der Menge des glykosilierten Albumins und der Menge der glykosilierten Serum-Proteine existiert, welche beide kolorimetrisch bestimmt wurden, wobei ein Verfahren zur Dosis-Messung des letzteren vorgeschlagen wurde, wodurch die
Isolierung des Albumins aus dem Serum übersprungen wurde mit dem beträchtlichen Vorteil sowohl vom Standpunkt der für den Test notwendigen Zeit als auch der Vereinfachung der Testverfahren.
Leider ist jedoch, wie später gezeigt wurde, bei einer derartigen Dosismessung die freie Glykose (und auch andere Kohlenhydrate) ein störender Faktor, und es ist absolut notwendig, davon abzugehen.
IM diesem Mangel abzuhelfen, haben Kennedy et al (Diabetes, 29: 413 (1980))eine 15-stündige Hydrolyse bei 4°C gegen eine geeignete Salzlösung vorgeschlagen. Gemäß diesem Verfahren ist die für die Analyse erforderliche Zeit beträchtlich ausgedehnt, und die analytische Methode wird schwieriger und komplizierter.
Zusammenfassend kann unter Berücksichtigung des Erfordernisses, daß die Serumglykose vor der Analyse beiseite getan wird, das von Kennedy et al (Diabetes 2_9: 413 (1980)) vorgeschlagene Verfahren folgendermaßen zusammengefaßt werden:
Reagentien
Test Blanko
Test
1,0 __
0,1 0,1
0,9 —
0,9
0,5 0,5
1,0 1/0
1,5 1,5
Arbeitsdetails
Serum
dialysiertes Serum physiol. Lösung (pH 7,4) physiol. Lösung + NaBH^ 1-molare Oxalsäure
Triehloressigsäure übers tehende s Thiobarbitürsäure (TBA)
0,5 0,5
15 Stunden Dialyse
Siedendes Dampfbad während 5 Stunden
Zentrifugieren
30 Min. bei 400C halten
Ablesen der optischen Dichte bei 443 nm (Mikron)
Die Gesamtzeit/ welche zur Analyse erforderlich ist, beträgt 21 bis 22 'Stunden (davon sind 15 für die Dialyse notwendig) , und die verschiedenen Arbeitsschritte stellen/ auch wenn sie nicht zu schwierig sind, wenigstens in gewissen Fällen Anforderungen, welche mit der. üblichen Routine nicht sehr übereinstimmen.
Es wurde in den vorhergehenden Ausführungen bis zu einem gewissen Grad ausgedrückt, daß die Bestimmung von nichtenzymatisch glykosilierten Proteinen analytischen Irrtümern ausgesetzt ist, welche durch xnterferierende störende Faktoren verursacht sind, und daß das einzige Korrektiv, welches bisher vorgeschlagen wurde, eine vorherige Dialyse der Probe ist. Die Erfindung schafft zwei Alternativen zu der oben erwähnten Methode, nämlich: Einerseits wird die Dialysestufe
durch einen enzymatischen Schritt, der die Kohlenhydrate, welche nicht an die Proteine gebunden sind, unterdrückt, und andererseits wird der Test in Gegenwart von freien Kohlehydraten- durchgeführt, jedoch unter solchen analytischen Bedingungen (wie gesteuerte Hydrolyse) , daß solche Kohlenhydrate nicht stören. In letzterem Fall wird die saure Hydrolyse innerhalb von Zeiten durchgeführt, welche zweieinhalb Stunden oder kürzer sind. Wenn die erste der beiden Alternativen gewählt wird, so ist eine vorherige Inkubation der zu testenden Probe darin vorgeschlagen oder angeregt.
Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung einer verbesserten Methode zur Bestimmung oder Dosierung der nicht-enzymatisch glykosilierten Proteine, welche in biologischen Flüssigkeiten vorhanden sind, in Blutserum unter anderem, wobei diese Methode eine Hydrolyse der zu testenden Probe in einer sauren Umgebung und bei einer Temperatur oberhalb 800C vorsieht, wobei vor dieser Hydrolyse gegebenenfalls eine vorherige Inkubation durchgeführt wird und die Entfernung der Kohlehydrat- und/oder der störenden Substanzen, die·anschließende Ausfällung des Proteins, die Abtrennung der flüssigen Phase und den Zusatz eines Reagens
zu letzterer/ das die Kohlehydrate und/oder ihre Derivate aufzufinden vermag, und schließlich das Ablesen der optischen Dichte von der Probe und der Leerprobe bzw. Blindprobe.
Die Entfernung der Kohlenhydrate und möglicher störender Substanzen verschiedener Natur wird insbesondere nach zwei Richtungen durchgeführt, die im Folgenden beschrieben sind.
Nach der ersten Versuchsweise können alle eine Rolle spielenden Proteine durch Zusatz bestimmter Fällungsmittel gefällt werden, welche aus einer Anzahl von Reagentien ausgewählt sind: Diese gehören zu der Klasse der organischen Verbindungen wie Alkohole, mehrwertige Alkohole, Carbony!verbindungen, organische Säuren oder Salze davon. Außerdem können Salze anorganischer Verbindungen auch verwendet werden.
Vor allem werden p-Toluolsulfonsäure, Trichloressigsäure, Perchlorsäure, Uranylacetat, Sulfosalicylsäure, Ammoniumsulfat und Natriumsulfat bevorzugt. Die Temperatur wird auf Werten gehalten, welche diejenigen der Umgebung oder niedriger sind. " . ,
Die Entfernung der Kohlenhydrate und/oder anderer störender oder interferierender Substanzen kann enzymatisch erfolgen, möglichst nachdem der pH-Wert des Blutmediums auf einen geeigneten Wert eingestellt wurde. In diesem Falle werden Enzyme zugesetzt (entweder getrennt zu verschiedenen Zeiten oder vermischt miteinander), welche geeignet ausgewählt wurden, so daß solche störenden Substanzen in Produkte umgewandelt werden, die nicht mehr störend sind.
Die Enzyme können als solche oder in geeigneter Weise immobilisiert eingeführt werden, beispielsweise eingeschlossen in Fasern oder gebunden (kovalent oder anderweitig) an natürliche (oder synthetische) polymere Substrate.
Wie oben ausgeführt/ kann den Arbeitsgängen im Zusammenhang mit der Entfernung der störenden Substanzen eine Inkubation der Probe vorausgehen mit dem Ziel, mögliche störende Faktoren z.u entfernen, welche bei der Freisetzung anschliessend während des Fortschreitens des analytischen Verfahrens stören könnten. Typische Beispiele sind die Vorbehandlung der Probe mit geeigneten Enzymen (wie Syalidase, Galactoxidase usw.) oder mit Säuren bei einer Temperatur im Bereich von 8O0C bis 1000C und während einer Zeit nicht langer als 30 Minuten.
pie zu verwendenden. Säuren sind Glieder, ausgewählt vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus Oxalsäure, Schwefelsäure, Salzsäure, Sulfosalicylsäure und p-Toluolsulfonsäure und Mischungen dieser Säuren untereinander und mit anderen Säuren.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird dann mit einem Hydrolysesehritt in saurer Umgebung während einer Zeit über zweieinhalb Stunden und bei einer Temperatur oberhalb 800C fortgesetzt. Anschließend werden die Proteine gefällt, und es können dieselben Fällmittel wie oben erwähnt verwendet werden. Diesem Schritt folgt die Trennung der festen Phase von der überstehenden Flüssigkeit, welche ihrerseits nicht in zwei Fraktionen zerfällt. Zu einem Teil der flüssigen Phase wird ein Kohlenhydrate nachweisendes Reagens gegeben (und./oder ein Reagens zum Auffinden von deren Derivaten, wie Thiobarbitursäure), während zu dem anderen Teil der flüssigen Phase Wasser zugesetzt wird, um eine Blindprobe zu erhalten, wenn kein NaBH4 verwendet wird.
Schließlich werden die optischen Dichten abgelesen (bei einer geeigneten Wellenlänge)sowohl von der Probe als auch von der Blindprobe. Die wie oben beschriebene Methode kann zur Bestimmung von glykosilierten Proteinen, welche in diesen biologischen Flüssigkeiten irgendwelcher Natur oder Herkunft enthalten sind, angewandt werden.
Es wurde gefunden, daß die Anwendung dieser Methode besonders vorteilhaft ist zur Bestimmung der glykosilierten Proteine, welche in Blutserumproben enthalten sind, und die folgenden Beispiele sind besonders auf diesen speziellen Fall gerichtet im Hinblick auf die Natur und außerordentliche Bedeutung einer derartigen Anwendung. Jedoch bietet die Anwendung der vorliegenden Methode auf Proben unterschiedlichen Ursprungs keinerlei Schwierigkeit, und die Ausdehnung der Methode auf andere als die in den Beispielen beschriebenen Ausführungsformen ist lediglich eine Routineangelegenheit, welche im Bereich der Erfindung liegt.
Neben der Methode zur Dosierung bzw. Bestimmung der glykosilierten Proteine ist ein weiteres wichtiges Merkmal der Erfindung die Lieferung von Mitteln, welche zur Durchführung einer solchen Methode angewandt werden.. Diese Mittel sind eine Ausrüstung, welche allein in getrennten Behältern oder getrennt, jedoch in einem einzigen Behälter vereinigt, Reagentien enthält, ausgewählt aus der Gruppe, umfassend:
a) .ansäuernde Mittel mittlerer Stärke
b) Protein-Fällmittel
c) Keton-reduzierende Mittel
d) Nachweismittel für Kohlenhydrate und/oder ihre Derivate
Insbesondere ist die Ausrüstung der Diagnosereagentien gemäß der Erfindung im Einklang mit den vorn angegebenen Indikationen zusammengesetzt aus Oxalsäure oder Essigsäure, Trichloressigsäure (TCA), Natriumborhydrid und Thiobarbitursäure (TBA). Die obigen Ausführungen und andere operative Details werden anhand der folgenden Beispiele näher erläutert, welche jedoch keine Begrenzung der Erfindung darstellen sollen.
Ergänzungsblatt zur Offenlegungsschrift 32 23 Offenlegungstag: 13.01.1983
Int.Cl.3: G 01 N 33/68
- 12 -
Beispiel 1
Ein Serumanteil äquivalent 3,3 mg Proteine wird nach Zugabe von Spuren von Octylalkohol mit 1 ml Phosphatpuffer 0,01— molar, pH 7,4, enthaltend 0,15 molar NaCl (PBS) und 0,85-raolar Natriumborhydrid verdünnt. Die Probe wird bei Raumtemperatur 1 Stunde stehengelassen und dann während 18 Stunden bei 4eC. Dieses Verfahren ist zur Herstellung der Blindprobe vorgesehen.
Ein anderer Serumanteil, enthaltend dieselbe Menge an Proteinen, wird mit 1 ml des üblichen Phosphatpuffers pH 7 verdünnt, jedoqh ohne das reduzierende Mittel. Beide Proben werden mit 1 ml 40%-iger Trichloressigsäure (TCA) behandelt und nach 15-minütigem Stehen bei Raumtemperatur werden die Proben während 15 Minuten bei 2500 g (2500-fache Schwerkraft) zentrifugiert. Die Niederschläge, welche in 1,5 ml zwei-normaler Essigsäure wieder aufgeschlämmt werden, werden 24 Stunden auf 1000C gehalten. Nach dem Kühlen wird die Aufschlämmung mit 0,5 ml 40%-iger Trichloressigsäure behandelt und zentrifugiert, um die klare, überstehende Flüssigkeit zu gewinnen. Anteile von jeweils 1,5 mi der klaren Lösung werden mit 0,5 ml Thiobarbitürsäure (TBA) während 30 Minuten bei 400C zur Reaktion gebracht. Die Differenz zwischen den optischen Dichten (O.D.) bei 443'nm der Blindproben und der Proben wird auf ein geeignetes Diagramm aufgetragen (ein kalibriertes Diagramm mit 5-HMF (5-Hydroxymethylfurfural)), so daß die Millimole 5-HMF, die in der Probe enthalten sind, errechnet werden können. Die Methode kann folgendermaßen zusammengefaßt werden:
Reagentien
Blindprobe.
Proben
Arbeitsdetails
Serum
PBS
PBS + NaHBH,
0,05 ml
0,05 ml 1 ml
1 Stunde warten bei Raumtemperatur + 18 Stunden bei 40C
• 4 ····
Ergänzungsblatt zur Offcnlcgungsschrift
Offenlegungstag:
Int ClΛ
52 23 837 13.01.1983 G 01 N 33/68
Reagentien
- 13 -
Blind- Proben
probe
Arbeitsdetails
40%-ige"TCA
2-nor. Essigsäure
Überstehendes
1 ml 1 ml
1,5 ml 1 ,5 ml
0,5 ml 0,5 ml
1 ,5 ml 1 ,5 ml
0,5 ml 0,5 ml
Zentrifuge
24 Stunden bei 1000C halten
Zentrifuge
Ablesen bei 443 nm nach 30 Min. bei 400C
Beispiel 2
Es wird eine Arbeitsweise angewandt, wonach eine Vorbehandlung während 15 Minuten bet 1000C und die Ausfällung der Proteine mit TCA (40% Konz.) durchgeführt wird.
Ein Anteil von Serum (0,4 ml) wird von 1:2 auf 1:20 (1:5 ist bevorzugt) mit 0,6-normaler Oxalsäure direkt in einer Teströhre mit einem Schraubstopfen verdünnt und wird unter Rühren während 15 Minuten bei 1000C gehalten. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur werden 2 ml 40%-ige Trichloressigsäure zugesetzt. Die Probe wird gerührt und 15 Minuten lang bei Raumtemperatur stehengelassen und dann bei 2500 g während 10 Minuten zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen, indem die umgedrehte Teströhre einige Minuten auf Löschpapier-Bäusche gestellt wird. Der Rest wird dann mit 2,8 ml 0,6-normaler Oxalsäure ergänzt und nach Verschließen der Teströhren werden diese auf einem siedenden Wasserbad während 5 Stunden gehalten, so daß die an die Proteine gebundene GIykose in 5-HydroxymethyIfurfural (5-HMF) überführt wird. Die verschiedenen Teströhrchen werden auf Raumtemperatur in einem Wasserbad während 10 Minuten gekühlt, und jeder Röhre wird 1 ml 40%-ige Trichloressigsäure zugesetzt. Nach 10 weiteren Minuten bei Raumtemperatur wird das Zentrifugieren bei 2500 g durchgeführt. Die klare, überstehende Lösung wird gesammelt und in zwei Teile von jeweils 1,5 ml geteilt. Ein Teil, der mit 0,05 molarer Thiobarbitursäure ergänzt wird, ist die Probe,
während der andere Teil, der nur mit Wasser ergänzt wird, die Blindprobe ist.
Die Bestimmung der Menge von 5-HMF, welche in der Probe enthalten ist, wird ausgeführt, indem die Differenz zwischen den betreffenden optischen Dichten bei 443 nm der Probe und der Blindprobe errechnet, und indem die so gefundene Differenz mit einem Kalibrierungsdiagramm, erhalten mit Standard-5-HMF, verglichen wird.
Die Methode dieses Beispiels kann folgendermaßen zusammengefaßt werden:
Reagentien
Arbeitsdetails
Serum 0,4 ml 15 Min. bei 1000C
0,6-nor. Oxalsäure 1,6 ml Zentrifuge
40%-ige TCA 2 ml 5 Stunden bei 1000C belassen
0,6-nor. Oxalsäure 2,8 ml Zentrifuge
40%-ige TCA 1 ,0 ml Blindprobe
Testprobe 1,5 ml
Überstehendes 1 ,5 ml
TBA 0,5 ml 0/5 ml Ablesen O.D. bei
Wasser _
443 nm nach 30 Min. bei 4O0C

Claims (13)

  1. Dr. F. Zumstein sen.,- br. E-. Ässniann -4Dr8IR. Koenigsberger Dipl.-Phys. R. Holzbauer - Dipl.-Ing. F. klingseisen - Dr. F. Zumstein jun.
    PATENTANWÄLTE
    BOOO München S · BräuhausstraBe 4 -Telefon Samrnel-Nr. 22 5341-· Telegramme Zumpat -Telex 529*979
    Case 1404
    ISTITUTO SIEROTERAPICO E VACCINOGENO TOSCANO "SCLAVO" S.ρ.Α., Siena/Italien
    PATENTANSPRÜCHE
    ί 1 .JVerfahren zur Bestimmung der glykosi Harten Proteina, welche in biologischen Fluiden oder Flüssigkeiten enthalten sind, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt
    die Behandlung der zu testenden Probe in einer sauren Umgebung bei einer Temperatur oberhalb 800C, wobei gegebenenfalls vorher eine vorherige Inkubation, kombiniert mit der Entfernung der Kohlenhydrate und/oder anderer störender Substanzen erfolgte,
    die anschließende Ausfällung der Proteine, die Abtrennung der flüssigen Phase,
    die Zugabe eines in Anwesenheit von Kohlenhydraten und/oder deren Derivaten nachweisenden Reagens,
    der Zusatz von Wasser oder einer geeigneten Lösung zu einem Teil der flüssigen Phase (Blindprobe), wenn kein NaBH4 reduzierendes Mittel verwendet wird, und
    die Endablesung der optischen Dichten der Probe und der Blindprobe .
  2. 2. Verfahren zur Bestimmung der in biologischen Flüssigkeiten oder Fluiden enthaltenen glykosilierten Proteine gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die saure Behandlung der Probe der erste Arbeitsgang ist und während einer Zeit/ die niemals zweieinhalb Stunden übersteigt, durchgeführt wird.
  3. 3. Verfahren zur Bestimmung der in biologischen Flüssigkeiten enthaltenen glykosilierten Proteine gemäß Anspruch 1, umfassend die folgenden Schritte:
    a) Vorinkubation der Probe
    b) Entfernung der Kohlenhydrate und/oder störender Substanzen
    c) Saure Behandlung des Rückstandes vom vorherigen Arbeitsgang während einer Zeit länger als zweieinhalb Stunden?
    d) Ausfällung der Proteine
    e) Abtrennung der flüssigen Phase von dem Niederschlag
    f) Zusatz eines Reagens, das Kohlenhydrate und/oder deren Derivate nachweist zu einem Teil der flüssigen Phase
    g) Zusatz von Wasser oder einer geeigneten Lösung zu einem Teil der flüssigen Phase in den Mengenverhältnissen wie beim vorherigen Schritt, und
    h) Ablesen der optischen Dichte der Probe und der Blindprobe.
  4. 4. Verfahren zur Bestimmung der glykosilierten Proteine gemäß den vorhergehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, daß die Stufe b) durchgeführt wird, indem die in der Probe enthaltenen Proteine ausgefällt werden.
  5. 5. Verfahren gemäß dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausfällung durchgeführt wird, indem zu der Probe ein Fällmittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus organischen Verbindungen, wie Alkoholen, mehrwertigen Alkoholen, Säuren, Salzen organischer Säuren, Carbony!verbindungen, zugesetzt wird.
  6. 6. Verfahren gemäß dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Ausfällung durch Zusatz anorganischer Salze zu der Probe bewirkt wird.
  7. 7. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt b) bewirkt wird, indem die spezifischen Enzyme der zu entfernenden ,Kohlerhydrate entweder jeweils individuell allein oder im Gemisch und/oder zu verschiedenen Zeiten zugesetzt werden.
  8. 8. Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt b) durch Verwendung immobilisierter Enzyme durchgeführt wird.
  9. 9. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der vorherige Inkubationsschritt bei einer Temperatur zwischen 80 und 1000C durchgeführt wird.
  10. 10. Verfahren gemäß dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Inkubation in Gegenwart einer Säure, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Oxalsäure, Essigsäure, Schwefelsäure, Salzsäure, Sulfosalicylsäure, p-Toluolsulfonsäure und Mischungen davon,durchgeführt wird.
  11. 11. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Arbeitsgang der Proteinausfällung von Schritt d) durchgeführt wird, indem eines der in den Ansprüchen 5 und 6 beanspruchten Fällmittel zugesetzt wird.
  12. 12. Ausrüstung diagnostischer Reagentien zur Bestimmung von glykosilierten Proteinen in biologischen Fluiden oder Flüssigkeiten, umfassend allein in getrennten Behältern oder getrennt, jedoch in einem einzigen Behälter vereinigt, Reagentien, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
    a) ansäuernde Mittel mittlerer Stärke
    b) Protein-Fällmittel
    c) Reagentien zum Auffinden oder Nachweisen von Kohlenhydraten und/oder Derivaten davon.
  13. 13. Ausrüstung gemäß dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagentien Oxalsäure, Trichloressigsäure und Thiobarbitursäure sind.
DE19823223837 1981-06-26 1982-06-25 Verfahren und ausruestung zur bestimmung von glykosilierten proteinen in biologischen fluiden oder fluessigkeiten Ceased DE3223837A1 (de)

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