DE1805571A1

DE1805571A1 - Verfahren zur Herstellung einer waesserigen 6-Aminopenicillansaeureloesung

Info

Publication number: DE1805571A1
Application number: DE19681805571
Authority: DE
Inventors: Weiner Milton Hervey
Original assignee: Bristol Myers Co
Current assignee: Bristol Myers Co
Priority date: 1967-10-31
Filing date: 1968-10-28
Publication date: 1970-05-14
Also published as: SU409427A3; FR1604167A; IE32526B1; FI46628B; ES359709A1; SE357202B; IL30870A0; US3616223A; IE32526L; GB1251035A; NL140567B; BE723162A; BR6803595D0; CS153482B2; CH513919A; IL30870A; NO134912B; NL6815466A; DK129719C; NO134912C

Description

PATENTANWÄLTE .

PROF. DR, DR. J. REITST OTTER DR.-ING. WOLFRAM BUNTE

DR. KARL GEORG LÖSCH

D - BOOO MÜNCHEN 13. BAUERSTRABBE 22. FERNRUF(O811) 37 SS 83

Bristol-Myers Company
P 18 05 571.5-44 München, den

M/9449

Verfahren zur Herstellung einer wäßrigen 6-Aminopenicillansäurelösung.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur enzymatischen Spaltung von Penicillinen der 6-Aminopenicillansäure. Sie betrifft insbesondere ein Verfahren zur enzymatischen Spaltung von Penicillinen in Anwesenheit eines Hydrazide, wobei sich höhere Ausbeuten an 6-Aminopenicillansäure ergeben als bisher erreichbar waren.

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6-Aminopenicillansäure, die die nachfolgende Struktur besitzt

H₀N - CH CH C

I I I^xch₃

C N CH

ist ein außerordentlich wertvolles Ausgangsmaterial bei der Herstellung von halbsynthetischen Penicillinen. Die Verbindung wurde zuerst in J. Antibiotics, Reihe A, 6, 120, 184 (1953) und dann in J. Agric. Chem. Soc. Japan, 29, 400 bis 407, Juni 1955, beschrieben. Gemäß der letztgenannten Literaturstelle wird die Verbindung hergestellt, indem Penicillinamidase aus Penicillium chrysogenum Q Yj6 auf das Natriumsalz von Penicillin G einwirken gelassen wird. Bei dieser Reaktion wird Phenylessigsäure abgespalten. Der Stamm des Penicillium chrysogenum Q 176 wurde durch Vorbehandlung mit Sulfathiazol zur Penicillinamidaseabscheidung gebracht. Diese Arbeitsweise ist jedoch schwierig durchzuführen und ermöglicht nicht die Gewinnung von relativ großen Mengen an 6-Aminopenicillansäure.

Eine weitere Synthese zur Herstellung der 6-Aminopenicillansäure ist in der belgischen Patentschrift 569 728

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beschrieben, gemäß der Penicillium chrysogenum In den üblichen Medien unter herkömmlichen Bedingungen wachsen gelassen wird, mit der Ausnahme, daß der Vorläufer (wie Phenylessigsäure oder Phenoxyessigsäure) weggelassen wird. Es ist jedoch technisch sehr schwierig, das gewünschte Produkt abzutrennen und zu gewinnen, und'das Verfahren ist für technischen Betrieb ungeeignet.

Bis vor kurzem waren Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure schwierig durchzuführen, insbesondere in technisch durchführbarer Weise, bei der die wirtschaftliche Erzeugung von großen Mengen des Produkts erforderlich ist. Die synthetische Erzeugung von 6-Aminopenicillansäure In für die Praxis geeignetem technischen Maßstab muß noch erreicht werden.

Aus den USA-Patentschriften 3 014 845 und 3 014 846 ist die Verwendung von verschiedenen "Penicllllnamidasen", ,erhalten aus verschiedenen Bakterienkulturen, zum enzymatIschen Abbau von bestimmten Penicillinen zu 6-Amino-

penicillansäure bekannt. Eine am meisten bevorzugte Kultur ist ein Stamm von Streptomyces lavendulae. Die Verwendung von anderen Enzymen für diesen Zweck 1st aus den USA-Patentschriften 3 127 326, 3 164 6o4 und 3 260 653 bekannt.

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Durch die enzymatisehe Hydrolyse über die sogenannte "Penicillinamidase" (ein Enzym oder eine Enzymraischung, erhalten aus verschiedenen Bakterienkulturen) sind zwar große Portschritte in dem Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure erreicht worden, die Arbeitsweisen sind jedoch immer noch nicht so wirksam wie erwünscht wäre.

^ Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist somit die Schaffung eines verbesserten Verfahrens zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure durch enzymatischen Abbau von bestimmten Penicillinen. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist insbesondere die Schaffung eines Verfahrens zur Erhöhung der Ausbeute der 6-Aminopenicillansäure durch die bisher unbekannte Anwendung einer Hydrazidverbindung.

Es wurde nun gefunden, daß bestimmte Penicilline mit Hilfe eines Enzyms oder einer Mischung von Enzymen, die hier \ als "Penicillinamidase" bezeichnet wird, wirksamer in 6-Aminopenicillansäure umgewandelt werden können, wenn die enzymatische Hydrolyse in Gegenwart eines Hydrazide durchgeführt wird.

Wenn beispielsweise eine 2 #ige Lösung von Penicillin V mit aus Streptomyces lavendulae erhaltener Amidase behandelt wird, wird eine 6-Aminopenicillansäureausbeute von etwa 30 bis 40 # erhalten. Wenn andererseits eine 10 #ige

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Lösung von Penicillin V mit der gleichen Amidase unter ähnlichen Bedingungen behandelt wird, so wird eine Ausbeute von nur 5 % 6-Aminopenicillansäure erhalten,

Ziel der vorliegenden Erfindung ist somit die Entwicklung eines Verfahrens, um die Umsetzung in Richtung auf eine produktivere Ausbeute an 6-Aminopenicillansäure zu verschieben. Dies wird durch die Zugabe einer Hydrazidverbindung erreicht, die die ausgeprägte Wirkung hat, die Erzeugung der 6-Aminopenicillansäure zu erhöhen.

In Gegenwart eines Hydrazide, wie Benzhydrazid, in der enzymatischen Spaltungsreaktion steigt die Ausbeute an 6-Aminopenicillansäure bei der Behandlung einer 2 #igen Penicillin V-Lösung auf über 90 %, verglichen mit JO bis 40 % ohne ein Hydrazid. Außerdem ist es möglich, die Ausbeute an 6-Aminopenicillansäure aus einer 10 #igen Penicillin V-Lösung in Gegenwart von Benzhydrazid auf etwa 6o % zu erhöhen, verglichen mit etwa 5 % in Abwesenheit von Benzhydrazid.

Erfindungsgemäß wird somit ein Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure und Salzen davon geschaffen, gemäß dem man ein natürliches Penicillin in Gegenwart eines Hydrazide mit einer Penicillinamidase behandelt, wobei das Penicillin der allgemeinen Formel

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R-C-NH-CH CH

O = C — N CHCOOH

entspricht, worin R Alkylgruppen mit 1 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen, Alkenylgruppen mit 3 bis einschließ-

u
lieh 10 Kohlenstoffatomen und R XCH₂ bedeutet, worin X

Sphwefel oder Sauerstoff und R Alkylgruppen mit 2 bis P einschließlich 6 Kohlenstoffatomen, Alkenylgruppen mit 3 bis einschließlich 6 Kohlenstoffatomen, Phenyl und monosubstituiertes Phenyl bedeuten, wobei der Substituent unter Chlor, Brom, Jod, Fluor, Nitro, Alkylgruppen mit 1 bis einschließlich 6 Kohlenstoffatomen, Alkenylgruppen mit 3 bis einschließlich 6 Kohlenstoffatomen und Alkoxygruppen, worin die Alkylgruppe 1 bis einschließlich 6 Kohlenstoffatome aufweist, ausgewählt ist. Derartige Penicilline gehören zu der Gruppe der hier als "natürliche "Penicilline bezeichneten Verbindungen, da sie beispielsweise durch Fermentation von F. chrysogenum in Anwesenheit von geeigneten Vorläufern erzeugt werden.

Zu den obigen Penicillinen, worin R Alkyl oder Alkenyl bedeutet, die als Ausgangsmaterialien beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, gehören eine Mischung der natürlichen Penicilline, die durch ein typisches Fermentationsverfahren erzeugt werden, bei dem kein Vorläu-

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fer verwendet wird. Eine derartige natürliche Mischung umfaßt n-Heptylpenicillin (Penicillin K), 2-Fentenylpenicillin (Penicillin P), n-Amylpenicillin (Dihydropenicillin P) und 5-Penicillin (Plavicin) sowie etwas Benzylpenicillin (Penicillin G) und p-Hydroxybenzylpeniclllin (Penicillin X). Jedes dieser Penicilline kann in Form aeiner Salze mit einem Kation verwendet werden, das die enzymatische Hydrolyse nicht stört. Die üblichsten derartigen Salze sind die Erdalkalimetall- und Alka-1!metallsalze, wie die Natrium, Kalzium- und Kaliumsalze.

Die obigen als Ausgangsmaterialien im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Penicilline, worin R die Bedeutung

it
R XCH₂ hat, schließen auch die Penicilline ein, die durch

ein Permentationsverfahren unter Verwendung eines Vorläufers hergestellt werden, wie es in den USA-Patentschriften 2 562 410, 2 479 295, 2 479 296 und 2 854 450 bezüglich der Herstellung von vielen biosynthetischen Penicillinen beschrieben ist. Zu derartigen Penicillinen gehören beispielsweise Phenoxyraethylpenicillin (Penicillin V) und monosubstitulerte Phenoxymethylpenicilline, wie p-Methoxyphenoxypenieillin, p-Nitrophenoxymethylpenicillin, Hydroxyphenoxymethylpenlcillin, p-Chlorphenoxymethylpenicillin, p- und m-Toloxyphenoxymethylpenicillin und dergleichen, Alkoxyraethy!penicilline, wie beispielsweise Äthoxymethy!penicillin, n-Butoxymethy!penicillin, Isoamyloxymethylpenicillin, Hexyloxymethylpenicillin-. J^lkßnylpxYmethylpenicilline, wie ' -8-

BAD ORIGINAL

Allyloxymethylpenicillin, 2-Methylallyloxymethylpenic111in und dergleichen und die schwefelhaltigen Penicilline, wie p-Tolylthiomethylpenicillin, ß-Naphthylthiomethylpenicillin, Äthylthiomethylpenicillin, n-Butylthiomethylpenieillin, Allylthiomethylpenlcillln und dergleichen. Jedes dieser Penicilline kann in Form seiner Salze mit einem Kation verwendet werden, das die enzymatische Hydrolyse nicht stört. Die üblichsten derartigen Salze sind die Alkalimetall- und Erdalkalimetallsalze, wie die Natrium-, Kalzium- und Kaliumsalze.

Eine Penicillinamidase, die beim er<findungsgemäßen Verfahren verwendet werden kann, ist ein bekanntes Enzym oder ,eine Mischung von Enzymen, deren Herstellung sowohl in Form eines Feststoffes als auch einer aktiven wäßrigen Lösung in J. Agr. Chem. Soc. Japan, 23, Seite 411 (1930) beschrieben ist. [Vergleiche auch CA. 45, II97 (1951) und die ausführliche Darstellung in J. Agr. Chem. Soc. Japan* 29, Seite 400 bis 407 (1955)* wovon auch eine englische Übersetzung von der Special Libraries Association, Translation Center, the John Crerar Library, Chicago, Illinois, erhältlich ist; vergleiche weiter CA. 51, 8160 g (1957)3 . Bei der Herstellung von Penicillinamidase gemäß den vorstehenden Literaturstellen wird Penicillium chrysogenum Q 176 verwendet, eine Kultur, die in der Penicillinindustrie in weitem Maß angewendet wird [vergleiche die Literaturstelle "Separation and

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BAD ORIGINAL

Identification of Penicillin Species in Commercial Penicillin (Q-I76 Culture)" vorgelegt von CJ. Salivar et al auf der "Conference on Antibiotic Research", Washington, D.C, Jl. Januar und 1. Februar 1947, sowie die USA-Patentschriften 2 479 296 und 2 562 407J. Eine bevorzugte Kultur, die in der USA-Patentschrift 3 014 als ein Stamm von Streptomyces lavendulae beschrieben ist und bei der Herstellung von Penicillinamidase verwendet wird, ist bei der American Type Culture Collection in Washington D.C, als A.T.C.C. No. 13664 hinterlegt. Eine weitere hinterlegte Kultur, A.T.C.C. No. 13665, erzeugt im allgemeinen weniger Pigment als A.T.C.C. No. 13664 und kann ebenfalls zur Erzeugung von Penicillinamidase verwendet werden.

Eine am meisten bevorzugte Kultur, die im vorliegenden Verfahren verwendet wird, ist unter der Nr. A.T.C.C. 21138 hinterlegt. Der Organismus ist eine Mutante eines Mutterstammes, der als Streptomyces lavendulae identifiziert ist.

Verbesserte Ausbeuten an 6-Aminopenicllansäure werden ebenso erhalten, wenn ein Hydrazid in Kombination mit anderen Penicillinamidasen verwendet wird, die aus einer Vielzahl von Penicillinamidase erzeugenden Mikroorganismen erhalten worden sind, beispielsweise von den Fungi Botrytia einerea und Penieilllum chrysogenum sowie be-

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- ίο -

stimmten anderen Fungi der Gattungen Alternaria, Aspergillus, Epicoccum, Fusarium, Mucor, Penicillium, Phoma und Trichoderma. Die Hefen Cryptococcus albldus und eine Trichosporonspezies und mehrere Actinomycetes der Gattung Streptomyces erzeugen Penicillinamidase. Ausbeuteverbesserungen werden auch festgestellt, wenn man Stämme von Bacterium proteus, Escherichia coil A.T.C.C. 96>7, Escherichia coil A.T.C.C. IIIO5 und aerobacter ^ Aerogenes in Gegenwart eines Hydrazide verwendet.

Penicillinamidase kann aus Penicillinamidase erzeugenden Mikroorganismen der Gattung Streptomyces nach der folgenden allgemeinen Arbeitsweise hergestellt werden, die durch die nachfolgend angegebene detaillierte spezielle Arbeitsweise veranschaulicht wird.

Ein geeignetes Enzympräparat für das erfindungsgemäße Verfahren kann gemäß der folgenden allgemeinen Arbeitsweise " erhalten werden. Schrägkulturen der ersten Generation auf Nähragar werden aus einem Bodenvorrat von Sporen eines Penicillinamidase-erzeugenden Mikroorganismus der Gattung Streptomyces hergestellt. Nachdem geeignetes Wachstum und Sporenbildung; stattfinden gelassen worden ist« bilden diese SchrägkUiltüren der ersten Generation dsas Inokulum f.ü"r die Schrägkulturen de*· zweiten Generation auf dem gleichen Kulturmedium. Ausreiehentl f kulturen der zweiten Generation weMe© m&%-

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ser gewaschen und die sich ergebende Suspension von Sporen wird aseptisch in den Zuchtbehälter Überführt, der Nährbrühe enthält. Wenn diese Fermentation 24 bis 48 Stunden lang abgelaufen ist, wird das Gebrau in eine größere Menge Nährbrühe überführt. Nach Rühren und Belüftung für eine Zeitspanne von 2 bis 4 Tagen wird das Mycel entfernt, wobei eine klare Fermentationsflüssigkeit zurückbleibt. In Abhängigkeit von dem speziellen verwendeten Organisnais wird die Penicillinamidase entweder in der Fermentationsflüssigkeit oder in der ganzen ZeI!masse gefunden. Bei dem erfindungsgeraaßen Organismus der Wahl wird die gewünschte Penicilllnamidase in der ganzen ZeIlraasse gefunden und wird als solche verwendet.

Eine bevorzugte Arbeitsweise zur Herstellung der Zellen von Streptomyces lavendulae A.T.C.C. No. 21138, die die Penicillinamidase enthalten, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, wird nachfolgend beschrieben.

Herateilung von Penicillinamidase

Eine Kultur von Streptoayces A.T.C.C. No. 21138 wird in SchUttelkolben, 10 Liter Fermentem und 90 Liter Feraentern gezogen, wobei ein Medium verwendet wird» das aus einer Brühe besteht, die auf eine Konzentration von 20 g pro Liter verdünnt ist und pH 7,3 bis 7,4 besitzt. Die Brühe hat die folgende Zusammensetzung:

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' Prozent

Flüssige Glucose 3*0

Sojabohnenmehl 2,5

Hefeextrakt (Difco) 0,5

Natriumchlorid 0,5

Kalziumcarbonat 0,2

Die ersten vier Bestandteile werden zusammengemischt, der pH wird auf 6,8 gestellt und das Kalziumcarbonat wird dann zugegeben. Eine Keimstufe wird angewendet, indem der Mikroorganismus in dem Medium j50 Stunden bei etwa 27°C unter Rühren und bei strömender Luft wie in einer Penicillinfermentation wachsen gelassen wird, und es werden etwa 7 Vol.-% dieses Wachstums verwendet, um die endgültige Fermentation zu inokulieren. Diese endgültige Fermentation wird 96 Stunden lang bei 26 bis 28°C unter Rühren und Belüftung ablaufen gelassen und das Mycel wird dann durch Filtration (oder, gewünschtenfalls durch Zentrifugieren) entfernt. Die gesammelten Mycelmaterialien werden gewaschen und in einem Volumen Wasser suspendiert, das dem 2-fachen des Volumens der ursprünglichen Brühe gleich ist. Das zu hydrolysieren e Penicillin wird der Mycelsuspension zusammen mit einem Anteil eines Hydrazide zugesetzt. Das Hydrazid wird gewöhnlich in einer Konzentration verwendet, die der Konzentration des Penicillinausgangsmaterial8 proportional 1st, insbeson-

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dere in einem Molverhältnis von etwa 0,5 bis 4,0 Mol Hydrazid pro Mol Penicillin. Der pH, bei dem die enzymatisehe Spaltung durchgeführt wird, wird gewöhnlich in dem pH-Bereich von etwa 6,0 bis etwa 11,0, vorzugsweise in dem Bereich von etwa 6,5 bis etwa 9*0, gehalten. Die Temperatur der Mischung wird im Bereich von etwa 10 bis 6O⁰C, vorzugsweise im Bereich von 20 bis 50⁰C und am meisten bevorzugt bei etwa 40° C gehalten.

Die Ausbeuten an 6-Aminopenicillansäure variieren natürlich mit den verwendeten Bedingungen. Kürzere oder längere Reaktionsspannen als die unten beschriebenen können verwendet werden, jedoch werden maximale Ausbeuten in 2 bis 24 Stunden und gewöhnlich in 2 bis 6 Stunden erhalten. Ein alternatives Fermentationsmedium setzt sich folgendermaßen zusammen:

Bestandteil g/Ltr.

Sojabohnenmehrl 40

Mailmehl 40

" 1 ■

CaGO₅ 10

Dieses Fermentationsmedium ist bei der Erzeugung von Zellen von Streptomyces lavendulae ebenfalls brauchbar und kann anstelle des oben beschriebenen bei der vorliegenden Arbeitsweise verwendet worden. Dieses Medium wird vor der Autoklavenbehandlung vorzugsweise auf pH 7,2 bis

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7,4 gestellt* In Beispiel i ist ein weiteres zur Wahl stehendes Medium beschrieben.

Es wurde festgestellt, daß viele Hydrazide eine erhöhte Ausbeute an 6-Aminopenicillansäure in dem oben beschriebenen Verfahren fördern. Diese sind nachfolgend angegeben .

1) Aromatische Hydrazide mit der Formel

worin R , R und R^ gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, (Niedrig)-alkyl (vorzugsweise C.-Cp), (Niedrig)-alkoxy, Hydroxy, Amino, N-(Niedrig)-alkylamino oder N,N-Di-(niedrig)-alkylamino bedeuten« Beispiele dieser Verbindungen sind Benzhydrazid, Salicylhydrazid, 1-Aminobenzhydrazid, 4-Methylbenzhydrazid oder dergleichen, jedoch vorzugsweise Benzhydrazid.

2) Andere Hydrazide, die die Fähigkeit gezeigt haben, erhöhte" Ausbeuten von 6-Aminopenicillansäure zu fördern, sind Carbohydrazid, Phenylessigsäurehydrazld* Naphfchyl-

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essigsäurehydrazid, J-Indolcarbonsäurehydrazid, 2-Thiophencarbonsäurehydrazid, Bernsteinsäurehydrazid, Glycinhydrazid, Tyrosinhydrazid, Buttersäurehydrazid, t-Butylcarbazat, Cyclopentancarbonsäurehydrazid und dergleichen.

Die aromatischen Hydrazide rufen in Hinblick auf die Ausbeute an 6-Aminopenicillansäure Verbesserungen verschiedenen Grades hervor. Das aromatische Hydrazid der Wahl aus QrUnden der Wirksamkeit und des Preises ist Benzhydrazid. Carbohydrazid verbessert die 6-Aminopenicillansäureausbeute stark, neigt jedoch dazu, eine gewisse Menge der gebildeten 6-Aminopenicillansäure abzubauen, indem es einen höheren Prozentsatz Zerstörung des ß-Lactamringee katalysiert als Benzhydrazid. Andere Hydrazide sind für inaktiv befunden worden, so Oxalylhydrazid, Formylhydrazid, Semicarbazide Acetylhydrazid und Isonikotlnsäurehydrazid.

Die Analyse der Mutterlaugen im Anschluß an die Amidasehydrolyse' von Penicillin V (Phenoxyacetamidopenicillansäure) in Gegenwart von Benzhydrazid ergibt folgende Komponenten:

1. Penicillin V

2. 6-Aminopenicillansäure y. Phenoxyessigsäure

4. Benzhydrazid

5. Phenoxyacetylbenzhydrazid.

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Eine Reihe von kinetischen Untersuchungen ist durchgeführt worden, um die optimalen Bedingungen für die Durchführung der enzymatischen Hydrolyse in Gegenwart von ganzen Zellen von Streptomyces lavendulae A.T.C.C. 21158 zu bestimmen. Die untersuchten Parameter waren Penicillinkonzentration, Hydrazid und Hydrazidkonzentration. Temperatur, pH und Hydrolysegeschwindigkeit.

Ausgedehnte Versuche sind unter Verwendung von Penlcil-" lin G (Benzylpenicillin) und Penicillin V als Ausgangsmaterialien durchgeführt worden, das Ausgangsmaterial der Wahl ist Penicillin V.

• Unter den Bedingungen, die vor der erfindungsgemäßen Erhöhung der Ausbeute in Gegenwart eines Hydrazids angewendet worden sind, hat eine 2 #ige Lösung eines nichttoxischen Salzes von Penicillin V (Natrium-, Kaliumsalz und dergleichen) in Gegenwart von Zellen von Streptomyces lavendulae eine durchschnittliche Ausbeute an 6-Aminopenicillaneäure im Bereich von J>0 bis 40 % innerhalb einer Zeltspanne von 4 bis 12 Stunden erzeugt.

Es wurde nun gefunden, daß die Zugabe von 2 % Benzhydrazid zu der 2 Jilgen Penicillin V-Mischung die Ausbeute an 6-Aminopenicillansäure auf über 90 % in etwa 2 bis J5 Stunden erhöht.

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Ein Nachteil der enzymatischen Spaltung von Penicillinen war bisher der einschränkende Paktor der Penicillinkonzentration. Wenn man auf das Arbeiten mit 2 bis 3 i&igen Lösungen eines Penicillins beschränkt ist« ist es notwendig, riesige Reaktionsbehälter zu verwenden, um relativ kleine Mengen an 6-Aminopenicillansäure zu erhalten. Bei dem bisher durchgeführten Verfahren ohne Zusatz eines Hydrazids haben die Ausbeuten der erhaltenen 6-Aminopenicillansäure proportional zur Erhöhung der Penicillinkonzentration abgenommen.

Eine Penicillinkonzentration von 2 % ohne ein Hydrazid ergibt im Durchschnitt JO bis 40 % 6-Aminopenicillansäure. Eine Penicillinkonzentration von 5 # ergibt etwa 15 bis 20 % 6-Aminopenicillansäure. Eine Penicillin V-Konzentration von 10 % ergibt etwa 5 % 6-Aminopenicillansäure. In Gegenwart eines Hydrazids ist der Einfluß der Konzentration zwar nicht überwunden, jedoch etwas kontrolliert. Beispielsweise liefert eine Penicillin V-Konzentration von 2 % in Gegenwart von 2 % Benzhydrazid über 90 % 6-Amino-penicillansäure. Eine Penicillin V-Konzentratlon von 8 % erzeugt mit Benzhydrazid etwa 70 bis 80 % Ausbeute 6-Aminopenicillansäure. Eine Penicillin-» konzentration von 10 % mit Benzhydrazid erzeugt eine 60 bis 70 ^ige Ausbeute an 6-Aminopenicillansäure in etwa 4 bis 6 Stunden.

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Zieht man alle Paktoren des enzymatischen Spaltungssystems in Betracht, d.h. Hydrolysegeschwindigkeit, verwendetes Enzym, 6-Aminopenicillansäureausbeuten und Stabilität der erzeugten 6-Aminopenicillansäure, so wird festgestellt, daß Benzhydrazid im erfindungsgemäßen Verfahren das wirksamste Hydrazld ist.

Es sind Untersuchungen bei variierenden Konzentrationen an Benzhydrazid unter Verwendung von 8 # Penicillin V,
pH 7 und 4O⁰C durchgeführt worden.

% Benzhydrazid gebildete % 6-Amino- Material-

6-Aminopeni- penicillan- bilanz

cillansäure- säure im %

menge Gleichgewicht

2	8,4 mg/Std.	65	91
3	10,6 mg/Std.	70	87
4	12,7 mg/Std.	75	86

Die Untersuchung zeigt, daß die bevorzugteste Benzhydrazidkonzentration in einem Bereich von etwa 4 bis 4 % erhalten wird. Oberhalb dieses Bereiches findet zunehmende ß-Lactamzersetzung statt.

Ähnliche Untersuchungen unter Verwendung von 8 % Penicillin V und 2 % Benzhydrazid bei pH 7, 8 und 9 ergeben, daß die besten Ausbeuten an 6-Aminopenieillansäure unter diesen Bedingungen im Bereich von etwa pH 7 bis 8 er-

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halten werden. Bei einem pH wesentlich oberhalb 8 ist die Zersetzung des Penicillins und der 6-Aminopenicillansäure genügend schnell, um bedeutende Verluste zu verursachen (über 20 % ß-Lactamzersetzung).

Der optimale Temperaturbereich scheint etwa 35 bis etwa 45°C zu sein. Die wirksamste Temperatur scheint etwa 4Q⁰C zu sein. Bei Temperaturen beträchtlich oberhalb 40°C neigt das Enzym zur Denatorierung und zur Verminderung der 6-Aminopenicillansäureausbeute durch Erhöhung der Geschwindigkeit der ß-Lactamzersetzung. Die Reaktion läuft jedoch bei Tempeaturen im Bereich von etwa 10 bis etwa 60°C.ab.

Verschiedene andere Untersuchungen sind durchgeführt worden, um die bevorzugten Gesamtbedingungen der Hydrolyse zu bestimmen. Es wurde festgestellt, daü Konzentrationen über 15 # Penicillinsubstrat die Ausbeute an 6-Aminopenicillansäure nicht wesentlich erhöhen. Die Hydrolyse kann zwar auch bei höheren Konzentrationen durchgeführt werden, der bevorzugteste Konzentrationsbereich 1st jedoch etwa ? bis 10 %.

Kinetisch werden die besten Ergebnisse mit der maximalen Ausbeute an 6-Aminopenicillansäurequalität erhalten, wenn die folgenden Mengen an Bestandteilen und die folgenden Bedingungen angewendet werden:

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- 20 -

1) 70 bis 100. g/Ltr. Penicillin V.

2) 30 g/Ltr. Benzhydrazid.

3) Eine Menge an Streptomyces lavendulae-Zellen/Ltr., die der äquivalent 1st, die aus 600 ml lavendulae-Kultur erhalten wird, deren Herstellung oben unter "Herstellung von Penicillinamidase" oder in Beispiel 1 beschrieben ist.

4) Ein pH voh etwa 7,5 bis 8,5, vorzugsweise pH 8.

5) Eine Temperatur im Bereich von etwa 35 bis 45⁰C*

Die Hydrolyse erreicht das Gleichgewicht (das Maximum an 6-Aminopenicillansäure) in etwa 2 bis 24 Stunden, gewöhnlich Jedoch in etwa 2 bis 6 Stunden.

Nach der Vollständigkeit der enzymatischen Hydrolyse werden das unumgesetzte Penicillin, Hydrazid und gebildete Acylhydrazidverbindungen durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, beispielsweise Butylacetat, Methylisobutylketon und dergleichen, entfernt, nachdem die Mutterlauge bis pH 2 bis 2 angesäuert worden ist.

Weitere Reinigung kann bewirkt werden, indem die wäßrige Lösung neutralisiert und Verunreinigungen durch Zugabe eines Lösungsmittels, wie Aceton, Methanol oder Äthanol, ausgefällt und zur Entfernung der niedergeschlagenen Verunreinigungen anschließend zentrifugiert wird. Die geklärte Lösung wird, entweder mit oder ohne vorherige

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Konzentration, auf pH 6,5 bis 7 gestellt und zur Adsorption des Produkts über ein lonenaustauscherharz laufengelassen.

Vorzugsweise wird eine Säule mit einem hochbasischen Anionenaustauscherharz in der Chloridform vom Typ des vernetzten Polystyrols mit funktioneilen quaternären Ammoniumgruppen verwendet, beispielsweise Dowex I und DeAcedite PP, die beide im Handel erhältlich sind. Ein kationisches Austauscherharz auf der Basis von vernetztem Polystyrol mit funktioneilen Sulfonsäuregruppen, wie Amberlite IR 120, kann ebenfalls verwendet werden. In dem Absorptionsschritt werden vorzugsweise etwa 4 kg Harz pro 15 Ltr. Lösung, die 40 bis 60 g 6-Aminopenicillansäure enthalten, verwendet. Die Elution des Produkts von dem Harz wird durch Zugabe von verdünnter Chlorwasserstoff säure, beispielsweise 0,05n HCl, erreicht. Verfahren zur Gewinnung von 6-Aminopenicillansäure aus wäßrigen Lösungen sind auch in der belgischen Patentschrift 569 728 veranschaulicht.

Erfindungsgemäß wird somit ein Verfahren zur Herstellung einer wäßrigen Lösung von 6-Aminopenicillansäure geschaffen, gemäß dem man eine Lösung eines natürlichen Penicillins, vorzugsweise eines Penicillins mit der Formel

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R-C-NH-CH CH C ^

I ^XCH3 O » C · N — CH - COOH

worin R Alkylgruppen mit 1 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen, Alkenylgruppen mit J3 bis einschließlich 10 Kohlenstoffatomen und die Gruppe R¹XCH bedeutet, worin X Schwefel oder Sauerstoff ist und R' Alkylgruppen mit 2 bis einschließlich 6 Kohlenstoffatomen, Alkenylgruppen mit 5 bis einschließlich 6 Kohlenstoffatomen, Phenyl und monosubstituiertes Phenyl bedeuten, worin der Substituent ausgewählt ist unter Chlor, Brom, Jod, Fluor, Nitro, Alkylgruppen mit 1 bis einschließlich 6 Kohlenstoffatomen, Alkenylgruppen mit 5 bis einschließlich 6 Kohlenstoffatomen und Alkoxygruppen, worin die Alkylgifuppe 1 bis einschließlich 6 Kohlenstoffatome umfaßt, oder der Salze davon, und am meisten bevorzugt eine Lösung von Penicillin V oder Penicillin G und/oder den Salzenaäavon in einer Konzentration von 2 bis 15 %, vorzugsweise Mhis 12 %, mit den ganzen oder zerkleinerten Zellen von Penicillinamidase-erzeugenden Bakterien oder Fungi oder mit der daraus erhaltenen löslichen Penicillinamidase, jedoch vorzugsweise von einem Stamm der Gattung Strepto« myces lavendulae und am meisten bevorzugt von einem Stamm, der als Streptomyces lavendulae A.T.C.C. 21158 bekannt ist, in Gegenwart von mindestens ca. 0,5 Mol

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eines wirksamen Hydrazide pro Mol Penicillin, vorzugsweise von 0,5 bis 2,0 Mol eines Hydrazide pro Mol Penicillin und am meisten bevorzugt von 0,7 Mol bis 1,5 Mol Hydrazid pro Mol Penicillin inkubiert, wobei das Hydrazid unter den hier beschriebenen aktiven Hydraziden ausgewählt ist, vorzugsweise ein aromatisches Hydrazid und am meisten bevorzugt Benzhydrazid 1st, und die Reaktionsmischung bei einem pH im Bereich von etwa 6,0 bis 11,0, vorzugsweise im Bereich von etwa 6,5 bis 9,0 und am meisten bevorzugt im Bereich von etwa 7,5 bis 8,5« und bei einer Temperatur im Bereich von etwa 10 bis 60⁰C, vorzugsweise im Bereich von etwa 20 bis 50⁰C und am meisten bevorzugt im Bereich von etwa 35 bis 45°C gehalten wird, für eine Zeitspanne von etwa 2 bis 24 Stunden, vorzugsweise 2 bis 12 Stunden und am meisten bevorzugt 2 bis 6 Stunden.

Nachfolgend werden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung beschrieben. Die Beispiele sollen die Erfindung welter veranschaulichen, jedoch nicht beschränken.

Beispiel 1

Herstellung von Streptomyces lavendulae-Zellen für die Amidasehydrolyse

Eine Kultur von Streptomyces lavendulae A.T.C.C. 21138 wird in einem Behälter inokuliert, der folgendes Keimkult urmed ium enthält: au

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Saccharose	2,5 %
Pharmamedia	1,5 %
Maisquellprodukt	1,0 %
Ammon iumsulfat	0,5 %
Kalzlumcarbonat	0,2 %

Die Keimstufenkultur wird 24 bis 48 Stunden wachsen gelassen, wonach' das ganze Gebräu das Inokulum für die endgültige Streptomyces lavendulae Fermentierung wirkt.

1 Ltr. der obigen Keimkultur wird in 9 bis 10 Ltr. einer Brühe mit folgender Zusammensetzung inokuliert:

Nutrlsoy	5,0 %
Pharmamedia	0,5 %
Natriumchlorid	0,5 %
Kalziumcarbonat	0,3 %
Gerelose	5,0 %
Saccharose	2,0 %

Die Fermentation wird 4 bis 6 Tage inkubiert und das Mycel wird durch Filtrieren oder Zentrifugieren gewonnen. Das Mycel wird gewaschen und als solches für die enzyraatische Hydrolyse von Penicillin zu 6-Aminopenicillansäure verwendet.

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- 25 Beispiel 2

6-Aminopenicillansäure aus 2 % Penicillin V (1 # Benzhydrazid)

Eine gewaschene Mycelmasse, erhalten aus 600 ml der gemäß Beispiel 1 hergestellten Fermentierung, wird in 1 Ltr. destilliertem Wasser suspendiert.Der pH wird auf etwa 7 gestellt. 20 g Kaliumpenicillin V und 10 g Benzhydrazid werden zugegeben. Die Suspension wird bei 55⁰C und der pH durch Zugabe von Natriumhydroxyd bei etwa pH 7 gehalten. Periodisch werden Proben entnommen und chromatographisch bestimmt. Die maximale Ausbeute an 6-Aminopenicillansäure wird zwischen 2 bis .4 Stunden erhalten und beträgt über 90 % der Theorie.

Beispiel 3

6-Aminopenicillansäure aus 2 % Penicillin V (2 % Benzhydrazid)

Eine gewaschene Mycelmasse, erhalten aus 500 ml der gemäß Beispiel 1 hergestellten Fermentation, wird in 1 Ltr. destilliertem Wasser suspendiert. Der pH wird auf 8 gestellt. 20 g Kaliumpenicillin V, das C im Acylrest enthält, und 20 g Benzhydrazid werden zugegeben. Die Suspension wird bei 55⁰C gehalten. Proben werden periodisch entnommen und chromatographisch analysiert. Die maximale Ausbeute wird bei etwa 3 Stunden erhalten und beträgt

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über 90 % der Theorie. Die Hauptmenge der Radioaktivität wird in Material gefunden, das als Phenoxyacetylbenzhydrazid identifiziert wird, der Rest liegt in der Phenoxyessigsäure vor*

B e 1 s ρ i e 1 4

6-Aminopenicillansäure aus 8 % Penicillin V (3 % Benzhydrazid) .

Das gewaschene Mycel, erhalten aus 500 ml der in Beispiel 1 beschriebenen Kultur, wird in 1 Ltr. destilliertem Wasser suspendiert, der pH wird auf einen Bereich von 7,8 bis 8,2 gestellt. 80 g Kaliumpenicillin V und 30 g Benzhydrazid werden zugegeben. Die Suspension wird unter Rühren bei 40°C gehalten. Proben werden periodisch entnommen und chromatographisch und analytisch bestimmt. Die maximale Ausbeute an 6-Aminopenicillansäure wird in etwa 4 bis 6 Stunden erhalten und die Ausbeute beträgt

Dieses Experiment wird in Abwesenheit des Benzhydrazids wiederholt. Die Ausbeute an 6-Aminopenicillansäure beträgt etwa 5 % und diese wird erst kurz nach 12 Stunden erreicht.

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Beispiel 5

6-Aniinopenicillansäure aus Penicillin G (2 % Benzhydrazid)

Das gewaschene Mycel, erhalten aus 500 ml Kultur gemäß Beispiel 1, wird in 1 Ltr. destilliertem Wasser suspendiert. Der pH wird auf 7 gestellt» 20 g Penicillin Q und 20 g Benzhydrazid werden zugegeben. Die erhaltene Ausbeute an 6-Aminopenicillansäure beträgt etwa 32 % und diese wird in 2 bis 6 Stunden erhalten. Das Fhenoxyacetylbenzhydrazid wird isoliert und identifiziert.

Der gleiche Versuch liefert bei der Durchführung in Abwesenheit von Benzhydrazid eine 10 £ige Ausbeute an 6-Aminopenicillansäure.

B e 1 8 ρ le I

6-Aminopenicillansäure aus Penicillin G unter Verwendung von E. Coil und 1 % Benzhydrazid

500 al einer dichten Suspension von Escherichia coil ATCC 11105-Zellen in einer Phosphatpufferlösung von pH 7,5 werden mittels einer Natriumcarbonatlösung auf einen pH von 8,5 gestellt. Nach Zugabe von 1 rag % Lysozyme, 0,05 # Natriumdesoxycholat, 0,01 Mol Natriutnäthylendiamintetraacetat und 0,4 % Toluol wird diese Suspension 2 Stunden bei 37° C gehalten, um eine Lyse der

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Bakterienzellen zu bewirken. Danach wird der pH des Ansatzes mittels HCl wieder auf pH 7,5 gestellt und die durch die Lyse unbeeinflußten restlichen Zellen und andere unlösliche Rückstände werden durch Zentrifugieren abgetrennt. Der überstehende flüssige Extrakt wird mit destilliertem Wasser auf 1 Ltr..verdünnt, wobei 20 g Kaliumpenicillin V und 10 g Benzhydrazid zugegeben werden. Die Temperatur wird bei etwa 37°C gehalten. Die maximale Ausbeute von über 90 % 6-Aminopenicillansäure wird in etwa 1 bis 2 Stunden erhalten. Das Phenoxyacetylbenzhydrazid wird Isoliert und identifiziert.

Der gleiche Reaktionsansatz in Abwesenheit von Benz-' hydrazid liefert eine ähnliche Ausbeute über 90 %. Jedoch wird die maximale Ausbeute an 6-Aminopenicillansäure erst nach 6 Stunden erhalten.

Beispiel 7

6-Aminopenicillansäure aus Penicillin V unter Verwendung von Streptomyces lavendulae-löslieher Amidase und 1 % Benzhydrazid

Unter Verwendung einer Kultur von Streptomyces lavendulae A.T.C.C. 13664 wird eine Fermentierung dieses Organismus nach der in Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise durchgeführt. Ein 500 ml Anteil der Gesamtbrühe wird

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zur Entfernung des Mycels filtriert. Das klare FiItrat, von dem vorher festgestellt worden ist, daß es lösliche Penicillinamidase enthält, wird auf 1 Ltr. verdünnt. Der pH wird auf etwa pH 8 gestellt. 20 g Kaliumpenicillin V und 10 g Benzhydrazid werden zugesetzt. Das Verfahren erzeugt über 90 % 6-Aminopenicillansäure in etwa 2 bis 6 Stunden.

Wenn das Verfahren in Abwesenheit des Benzhydrazids durchgeführt wird, beträgt die Ausbeute an 6-Aminopenicillansäure etwa 50 bis 40 % und die maximale Ausbeute wird nicht früher als nach 10 Stunden erhalten.

B e i s ρ i el 8

6-Aminopenicillansäure aus Penicillin V und 2 4-Methylbenzhydrazid

Es wird die allgemeine Arbeitsweise von Beispiel 4 wiederholt, mit der Ausnahme, daß die dort verwendeten 30 g Benzhydrazid durch 20 g 4-Methylbenzhydrazid ersetzt werden. Auf diese Weise wird eine 51 #ige Ausbeute von 6-Aminopenicillansäure erzeugt.

Die allgemeine Arbeitsweise von Beispiel 4 wird wiederholt, mit der Ausnahme, daß die 80 g Penicillin V und die JiO g Benzhydrazid, die dort verwendet werden, durch

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- 50 -

120 g Penicillin V bzw. 20 g 4-Methylbenzhydrazid ersetzt werden. Es wird 6-Aminopenicillansäure in einer Ausbeute von 35 % gebildet.

Beispiel 9

6-Aminopenicillansäure aus Penicillin V und 2 % SaIicylhydrazid

Es wird die allgemeine Arbeitsweise von Beispiel 4 wiederholt, mit der Ausnahme, daß die 80 g Penicillin V und die 30 g Benzhydrazid, die dort verwendet werden, durch 120 g Penicillin V bzw. 2 % Salicylhydrazid ersetzt werden. Dadurch wird 6-Aminopenicillansäure in einer Ausbeute von 51 % erzeugt.

Beispiel 10

6-Aminopenicillansäure aus Penicillin V und 2 % Glycylhydrazid

Die Arbeitsweise von Beispiel 4 wird wiederholt, mit der Ausnahme, daß die JO g Benzhydrazid, die dort verwendet werden, durch 20 g Glycylhydrazid ersetzt werden. 6-Aminopenicillansäure wird dabei in einer Ausbeute von 80 β erzeugt.

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- 31 Beispiel 11

6-Aminopenicillansäure aus Penicillin V und 2 % Phenylacetylhydrazid

Die Arbeitsweise von Beispiel 4 wird wiederholt, mit der Ausnahme, daß die 80 g Penicillin V und die 30 g Benzhydrazid, die dort verwendet werden, durch 120 g ,Penicillin V und 20 g Phenylacetylhydrazid ersetzt werden. 6-Aminopenicillansäure wird dabei in einer Ausbeute von 39 % erzeugt.

Beispiel 12

6-Aminopenicillansäure aus Penicillin V und 2 % Thiophencarbonsäurehydrazid

Die Arbeitsweise von Beispiel 4 wird wiederholt, mit der Ausnahme, daß die 50 g Benzhydrazld, die dort verwendet werden, durch 20 g Thiophencarbonsäurehydrazid ersetzt werden. 6-Aminopenicillansäure wird dabei in 80 % Ausbeute erzeugt.

Beispiel 13

6-Arainopenicillansäure aus Penicillin V und 2 % Buttersäurehydrazid

Die Arbeitsweise von Beispiel 4 wird wiederholt, mit der

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Ausnahme, daß die dort verwendeten 30 g Benzhydrazid durch 20 g Buttersäurehydrazid ersetzt werden. 6-Aminopenicillansäure wird dabei in 48 % Ausbeute erzeugt.

Beispiel 14

6-Amlnopenicillansäure aus Penicillin V und 2 t-Butylcarbazat

Die Arbeitsweise von Beispiel 4 wird wiederholt, mit der Ausnahme, daß die dort verwendeten jJO g Benzhydrazid durch 20 g t-Butylcarbazat ersetzt werden. Auf diese Weise wird 6-Aminopenicillansäure in 4-7 % Ausbeute erzeugt.

Beispiel 15

6-Aminopenicillansäure aus Penicillin V und löslicher . Penicillinamidase extrahiert aus Streptomyces lavendulae

Das gewaschene Mycel aus 2 Ltr. gemäß Beispiel 1 hergestellter Kultur wird in einem Medium mit folgender Zusammensetzung suspendiert:

Harnstoff 36O g

Natriumdesoxycholat 7 g destilliertes Wasser 1000 g

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Der pH wird mit 0,05 molarem Trishydroxymethylaminomethanpuffer-HCl auf 8,5 gestellt.

Die Mischung wird 12 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt und dann durch Dialyse gegen zirkulierendes destilliertes Wasser 48 Stunden lang extrahiert, um den Harnstoff und andere unerwünschte Materialien zu entfernen. Der in dem Dialysebeutel verbleibende Inhalt wird zur Entfernung etwaiger Niederschläge filtriert. Das auf diese Weise erzeugte klare Filtrat enthält die lösliche Amidase.

Penicillin V (1,6 g) und Benzhydrazid (600 mg) werden zu 20 ml dieses Piltrats gegeben und der pH wird auf pH 8 gestellt und dabei bei 40°C gehalten.

Nach 4 Stunden wird festgestellt, daß 6l % des Penicillins V in 6-Aminopenicillansäure umgewandelt sind.

Dieser Versuch wird in Abwesenheit von Benzhydrazid wiederholt, die Umwandlung beträgt dann nur 9 % 6-Aminopenic illansäure.

Für den Fachmann liegen aufgrund der vorstehenden detaillierten Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen zahlreiche Abwandlungen und Modifikationen auf der Hand, ohne daß dabei der Rahmen der Erfindung verlassen wird. -

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Claims

- 34 Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung einer wäßrigen Lösung von 6-Aminopenicillansäure, dadurch gekennzeichnet , daß man eine wäßrige Lösung eines natürlichen Penicillins oder eines Salzes davon mit den ganzen oder zerkleinerten Zellen eines Penicillinamidase erzeugenden Bakteriums oder Fungus oder

™ mit der daraus erhaltenen löslichen Penicillinamidase

in Gegenwart von mindestens etwa 0,5 Mol eines aktiven Hydrazids pro Mol Penicillin bei einem pH von etwa 6,0 bis 11,0 und bei einer Temperatur im Bereich von etwa 10 bis 60° C inkubiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß man das Penicillin oder das Salz davon mit den ganzen oder zerkleinerten Zellen eines Penicillinamidase erzeugenden Stammes von

Streptomyces lavendulae oder mit der daraus erhaltenen löslichen Amidase in Gegenwart von etwa 0,5 bis 2,0 Mol Hydrazid pro Mol Penicillin bei einer Temperatur von 20 bis 5O⁰C für eine Zeitspanne von etwa 2 bis 24 Stunden inkubiert, wobei das Hydrazid ausgewählt ist unter Carbohydrazid, Phenylessigsäurehydräzid, Naphthylessigsäurehydrazid, 3-Indolcarbonsäurehydrazid, Thiophenearbonsäurehydrazld, Bern-

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steinsäurehydrazid, Glycinhydrazid, Tyrosinhydrazid, Buttersäurehydrazid, 6-Butylcarbazat, Cyclopentancarbonsäurehydrazid und Hydraziden der allgemeinen Formel

worin R¹, R² und F? jeweils Wasserstoff, (Niedrig) alkyl, (Niedrig)-alkoxy, Hydroxy, Amino, N-(Niedrig)-

alkylamino und/oder N,N-Di-(niedrig)-alkylamino bedeuten.

Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß das Penicillin die allgemeine Formel

R-C-NH-CH CH

O = C — N CH - COOH

besitzt, worin R Alkylgruppen mit 1 bis einschließ lich 10 Kohlenstoffatomen, Alkenylgruppen mit 3 einschließlich 10 Kohlenstoffatomen und die Gruppe R XCH₂ bedeutet, worin X Schwefel oder Sauerstoff

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und R Alkylgruppen mit 2 bis einschließlich 6 Kohlens to ff atomen, Alkenylgruppen mit 3 bis einschließlich 6 Kohlenstoffatomen, Phenyl und monosubstituiertes Phenyl bedeuten, worin der Substltuent ausgewählt ist unter Chlor, Brom, Jod, Fluor, Nitro, Alkylgruppen mit 1 bis einschließlich 6 Kohlenstoffatomen, Alkenylgruppen mit 3 bis einschließlich 6 Kohlenstoffatomen und Alkoxygruppen mit 1 bis einschließlich 6 Kohlenstoffatomen.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß man das Penicillin oder das Salz davon mit ganzen Zellen von Streptomyces lavendulae A.T.C. No. 21138 in Gegenwart von etwa 0,5 bis 1,5 Mol des Hydrazide pro Mol Penicillin bei einem pH von etwa 6,5 bis 9,0 inkubiert.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch g e k e η η -zeichnet, daß das Penicillin eine 2 bis 15 #>ige wäßrige Lösung von Penicillin V oder Penicillin G oder einem Salz davon und das Hydrazid Carbohydrazid oder ein aromatisches Hydrazid der Formel

R¹

/K ·

\ y— C-NH- NH₂

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sind, worin R die in Anspruch 2 angegebenen Bedeutungen besitzt, und daß die Inkubationsdauer etwa 2 bis 12 Stunden beträgt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , daß das Hydrazid Benzhydrazid ist und die Inkubation bei einer Temperatur von 35 bis 45⁰C durchgeführt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß das Penicillin eine 2 bis 12 #ige wäßrige Lösung von Penicillin V oder einem Salz davon ist und daß die Inkubation bei einem pH von 7,5 bis 8,5 durchgeführt wird.

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