DE1770965A1

DE1770965A1 - Neue fuer die Herstellung von Peptiden vorteilhafte harzartige Verbindungen,Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung dieser Verbindungen zur Herstellung von Peptiden

Info

Publication number: DE1770965A1
Application number: DE19681770965
Authority: DE
Inventors: Tilak Manchar Anant; Hollinden Charles Stephen
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1967-07-24
Filing date: 1968-07-24
Publication date: 1972-02-03
Also published as: US3485810A; BE718459A; AT302654B; CH509981A; FR1584037A; SE355573B; GB1229994A; IL30409A; US3518240A; AT304870B; NL6810449A; DK126948B; DE1795714A1; IL30409A0

Description

Eli Lilly and Company, Indianapolis_v Indiana, V. St. A.

Neue für die Herstellung von Peptiden vorteilhafte harzartige

Verbindungen, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung dieser Verbindungen zur Herstellung von Peptiden

Die Erfindung betrifft neue Verbindungen, die zum Schutz der Carboxylgruppe von Aminosäuren bei Paptidsynthesen vorteilhaft sind, Verfahren zur Herstellung dieser Verbindungen und Verwendung dieser Verbindungen für Peptidsynthesen»

Peptide sind Stoffe von großer Bedeutung, und es ist üblich» diese Stoffe durch synthetische chemische Verfahren herzustellen. Das i'riizip dieser Verfahren besteht in der Kupplung von zwei oder mehr Aminosäuren unter Bildung einer Amidbindung zwischen den Molekülen :

C—

Il

II

10 98 86/U5 3

6AD ORIGlNAt.

Da Aminosäuren mindestens bifunktionell sind» ist es außerdem erforderlich, Tor dem Kupplungsschriti; alle funktioneilen Gruppen in einer Aminosäure, die nicht direkt an der Kupplung teilnehmen, zu inaktivieren. Yfenn noch reaktive funktionelle Gruppen vorhanden sind, werden infolge der Anwesenheit großer Mengen unerwünschter Nebenprodukte, die durch Reaktionen zwischen diesen funktionellen Gruppen bedingt sind, die Ausbeuten vermindert und die Reinigung erschwert» In der Chemie sind verschiedene Methoden zur Inaktivierung der funktionellen Gruppen von einfachen Aminosäuren mit Schutzgruppen bekannt, so daß nur die gewünschte funktionelle Gruppe reagieren kann, wenn die Amidbindung erzeugt wird. Die sogenannte "Schutzgruppe" muß sich mit der Aminosäure vor der Amidbildung leicht Terbinden und aus dem erhaltenen Peptid nach der Kupplung leicht entfernen lassen, ohne daß gleichzeitig die neu gebildete Amidbindung gespalten wird, Für Peptidsynthesen werden zwei Arten von Schutzgruppen benötigt: Die C-Schutzgruppen, die die Säurefunktion der Aminosäure inaktivieren, zum Beispiel Alkoholderivate, mit denen Ester entstehen, oder Aminderivate, mit denen Amide gebildet werden, und die N-Schutzgruppen, die die Reaktionsfähigkeit der /minogruppe beseitigen, s«um Beispiel Benzoxy carbonyl~„ Trityl- oder Allyloxygruppen« Die Erfindung be zieht sich auf C-ständige oder Carboxylschutzgruppen»

Mei'rlfield» ?r,Am,0hem> 303... 85_P 2149 (1963) hat ein Ver l'Vmreiri zur sogenünnten"so'i.id state" Peptidsynthese baschrie-

109886/ U53

BAD ORIGINAL

y bei dem eine Aminosäure, die die C- endständige Aminosäure des fertigen Peptide bilden soll, mit einem Chlormethylreßt umgesetzt wird, der an ein Styrol-Divinylbenaol-Copolymeres in Form eines festen Harzes gebunden ist. Durch diese Umsetzung wird die C-endständige Aminosäure an der Garbonsäurefunktion als inaktirer Ester, gebunden, und die Aminfunkt lon steht dann zur Bildung einer Peptidbindung frei zur Verfügung. Die Veresterung erfolgt durch Umsetzung des Triäthylammoniumsalzes der Aminosäure mit dem Benzylhalogenidhara in einem nichtreaktiven Lösungsmittel bei oder über Zimmertemperatur· Der erhaltene Aminosäure-Harzester kann dann in einem Zweiphasensystem (fest-flussig) mit einer Lösung der N~geschützten Aminosäure umgesetzt werden» die die zweite Einheit des Peptidmoleküls bilden soll, Diese Amidbildungsreaktion kann durch Aktivieren der Carbonsäurefunktion der zugesetzten Aminosäure_s beispielsweise durch Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid, durch Umwandlung in das Säurehalogenido Säureanhydrid oder gemischte Anhydrid oder ähnliche dem Fachmann bekannte Methoden herbeigeführt werden, Nach Auswaschen überschüssiger Reaktionsteilnehmer kann man die N-endsi;ändige Schutzgruppe entfernen und das Harz, das nun zwei Aminosäuren aufweist_s zur Herstellung eines Tripeptide anschließend mit einer anderen N-geschützten Aminosäure umsetzen., Durch wiederholte Entfernung der !^Schutzgruppe und Amidbildung können langkettige Peptide in bekannter V/eise aufgebaut v/erden ο /Js letzter Schritt kann das fertige Peptid ^on dem Harz getrennt werdene indem man dna Peptiö-Harz mi''; ';roniv^:; «serstr:ff in Eis aasig behände Lt.

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BAD ORJGiNAL

Herrifield, Bioahem., 3, 1385 (1964) verwendete die tertc-Butoxycarbony!schutzgruppe, bei der die N-Schutzgruppe mit 1n HCl in Essigsäure entfernt werden kann* Versuche, das Harz zu modofozoeren, zuifc Beispiel durch Nitrieren oder Broraierung um die Verwendung der Benzoyloxyearbonyl-H-Schutz· gruppe zu ermöglichen, hatten wenig Erfolg Merrifield ο J,Am,Chem„ Soc, 35? 2H9 (1963), Die N~Benzyloxycarbonylgruppe konnte nur durch Behandlung des geschlitzten Peptide mit Bromwasserstoff in Essigsäure entfernt werden. Bei dieser Methode wird aber auch die Esterbindung der C-endständigen Schutzgruppe gespaltene

Die neue Klasse von harza rtigen Stoffen nach dieser Erfindung Erfindung ermöglicht aufgrund ihrer besonderen Struktur ihre Verwendung in Verbindung mit der Benzyloxycarbonylchutzgruppe und weist einige andere ungewöhnliche und vorteilhafte Eigenschaften auf, wenn sie zur Peptidsynthese in fester Phase verwendet wird.

ßegenstand der Erfindung sind für die Peptidsynthese in fester Phase vorteilhafte Verbindungen der Formel

R¹-(^i₂)_ra/z~vCH₂)_n]_k Y (D

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BAD ORIGJNAi-

R den Rest eines Styrol-J&vinylbenzol-Copolymerharzes, dessen Verknüpfungsetelle sich an einem darin enthaltenen Phenylrdng befindet»

Y eine OH-Gruppe oder ein Halogenatom,

Z die Gruppe

O O

η η

-G- oder/N - C - R² -

ο
worin H einen niederen Alkylrest bedeutet ι

m 0 oder 1;

η eine Zahl von 2 bis 6j

Ie eine Zahl von 1 bis 4

mit der %ßgabe, daß m 0 und η eine Zahl von 3 bis bedeutet, wenn Z die Gruppe

9
-c-

darstellt und k eine Zahl von 1 bis 4, m die Zahl 1 und η eine Zahl von 2 bis 6 bedeutet, wenn Z die Gruppe

darstellt.

Eine besondere Ausführungsform der Erfindung sind Verbindungen der formel

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BAD ORIGINAL

1770985

R¹-CH₂

C=O

(Π) R²

worin

R den Phenylanteil eines Styrol-Divinylbenzol-Copolymerharsiea;

2

R einen niederen /llcylreat;

Y eine OH-Gruppe oder ein Halogenatom;

^m eine Zahl von 1 bis ♦ und

η eine Zahl von 2 bie 6 bedeuten.

Eine weitere AusfUhrungsform der Erfindung sind Verbindungen der Formel ₀

¹ _2n (III)

worin

R¹-C=(CH₂)_n Y

R ein Styrol Divinylbenzol-Copolymerhars, dessen Verknüpfungsstelle sich an einem darin enthaltenen Phenyl ring befindet;

η eine Zahl von 3 bis 6 und

γ eine 0H=Gruppe oder ein Halogenatom bedeuten.

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BAD ORIGINAL

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein verbessertes Verfahren zur Peptidsynthese in fester Phase₀ das darin besteht, daß man durch Umsetzung einer Aminosäure, die die C~endständige Säure eines fertigen Pöptids bilden soll, mit einer Harzverbindung₉ wie sie durch Formel I₉ II oder III definiert ist, das Harz mit der Carbonsäurefunktion der Säure verbindet, und einen Rest mit einer freien Aminofunktion fiir die Bildung einer Peptidbindung erhält und daß man das Peptid durch anschließende Umsetzung mit Aminosäure aufbaut»

Die Erfindung umfaßt ferner ein Verfahren zur Herstellung von Verbindungen d'_;r Formel II_S das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Copolymeres der Formel R -CHp-X, worin R wie in Formel II definiert ist und X ein Halogenatom bedeutet, mit einem Aminoalkanol der Formel HpN-(CHp)_n-OH _p worin η wie in Formel (II) definiert ist, umsetzt und das sekundäre Stickstoffatom des so erhaltenen Produkts mit einem Acylierungsmittel, das wenigstens einen Rest der Formel R²~C:O~ aufweist, worin R² wie in Formel II definiert ist, zu einer Verbindung acyliert, worin Y von Formel II OH bedeutet und gegebenenfalls die so erhaltene Verbindung zu der entsprechenden Verbindung halogeniert, warin Y von Formel II ein Halogenatom bedeutet.

Gegenstand der Erfindung ist weiter ein Verfahren zur Her--

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stellung von Verbindungen der Formel III, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Styrol-Divinylbenzol-Copolymerharz mit einem iy-Halogenacylhalogenid der Formel Y-(CHg)_n-CrOY₉ worin Y ein Halogenatom bedeutet und η wie in Formel III definiert ist, in Gegenwart eines Friedel-Crafts-Katalysators zu einer Verbindung umsetzt, worin Y in Formel III ein Halogenatom bedeutet, und gegebenenfalls die erhaltene Ver~ bindung mit einer Carbonsäure in Gegenwart eines tertiären Amins umsetzt und das so erhaltene CMcyloxyacylharz zu einer Verbindung hydrolysiert, worin Y in Formel III OH bedeutet.

Der Begriff "niederes Alkyl", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Methyl, Äthyl, n-Propyl und Isopropyl«

Der Ausdruck "Halogen" bezeichnet Fluor, Chlor_s Brom oder Jod.

Zu Beispielen fUr die reaktiven Substituenten, die an das zugrundeliegende Styrol-Divinylbenzol-Copolymere, im folgenden kurz als "Harz" bezeichnet, gebunden sein können, gehörens

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C=O

-CH₂-N-CH₂-CH₂-OH

	C=O	-CH₂	-Cl
CH₂
	-N-CH₂-CH₂
	C₂H₅	-CH₂	-OH
CH₂	C=O 1
	-N-CH₂=	-CH₂
	C₂H₅		-Br
CH₂	C=O	"N-CH₉-CHp
	-N-CH₂- C₅-H.,	CH₅	-OH
CH₂	3 7 C=O	C=O
	-N-CH₂- C,H»7		-Cl
CH₂	3ⁿ7 0 C=O

-CH₀-N-CH₀-OH₀-CH₀-P

C. C. ά C

CII,

v Π C[I,, GH₀ CfI₀ OiL₅ F

BAD ORIGINAiL

- CHp-Br

CH, CH₉

CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-I

CH

C=O

CH₅-CH-CH₅

C«0

H-CH₂-CH₂-CH₂-

„ N-CH₂ CH₂ GH₂-CH₂ CE₂ OIL,-Cl

1!

BAD ORIGINAL

177036S

-C-CH₂-CH₂-OH₂-Br

It

.C-CH₀-CIi_nCH₀-CH₀-J¹

C.

tr

-C-CH₂-CH₂-CH₂-RH₂-CH₂-I

st

-C-CH₂-OH₂-OH₂ GH₂- OH₂-CHg-Br

.C-GH₂-CII₂ GH₂- OH₂ :'I

Il

-C-CH₂- CH₂- CH₂-CH₂- 1

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BAD ORIGINAL

Die θΐ-findungsgemäßen Verbindungen, in denen Z die Gruppe

st

^N C-R und Y eine OH-Gruppe bedeutet, können durch Umsetzung dee von Merrifield JoAmcChenuSoe*„ 85 _P 2149 (1963) beschriebenen Polymeren, in dem die Chlormethylgruppe an sin Styrol-Di^inylbenzol Copolymeres gebunden ist, mit einem Aminoalkanol und Acylierung des sekundären Stickstoffatoms zur ^ Bildung eines Amide hergestellt werden.

Diese neuen harzartigen Verbindungen können dann in einer Ieptidsynthese eingesetzt werden, in der sie mit, der N-ge schützten Aminosäure umgesetzt werden, die di« C-endständige Aminosäure des fertigen Peptide bilden soll, indem man die beiden Verbindungen in einem inerten Lösungsmittel bei oder etwa bei Zimmertemperatur in Gegenwart von Dieyolohexylcarbo-

bis-

diimid oder Carbonylimidazol oder dergleichen umsetzt oder indem man den Säureanteil der Aminosäure aktiviert, beispiels- w weise durch Überführung in ein Säurechlorid, Säureanhydrid oder gemischtes Anhydrid.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen, in denen Z die Gruppe

9 ₂
yN-C-R und Y ein Halogenatom bedeutet, werden durch Umsetzung der oben beschriebenen CJ -Hy d ro xy a cy la mid over b:! η« öungen mi" Antinionpe^afluorid, Phosphorpentachlorid, Phosphorpen^abronid oder dergleichen zu dem gewünschten CJ-Halogen- <?e:"■■ '^rs^J- hergestel"';...

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8AO ORJQINAt.

Die Halogenverbindungen können dann in einer Peptidsyn^heae mit der N-geschützten Aminosäure, die schließlich die C-end ständige Aminosäure des fertigen Peptids MIden soll, umgesetzt werden» indem man die beiden Reaktionsteilnehmer in einem inerten Lösungsmittel 24 bis 72 Stunden in Gegenwart einer organischen tertiären Aminbase unter Rückfluß hält»

Zu Beispielen für inerte Lösungsmittels die für die oben beschriebenen Umsetzungen geeignet sind, gehören Methylen-Chlorid, Chloroform, Trichlorethylen, Äthanol, Aceton, Dioxan und Diisobutylätherr

Für die Umsetzung geeignete tertiäre Aminbasen sind beispielsweise Triethylamin, Tr!Diethylamin, Triethylendiamin, und N-Äthylpiperidin.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen, in denen Z die Gruppe ^C - O und Y ein Halogenatom bedeutet, werden durch Umsetzung eines Styrol-Divinylbenzol~Copolymeran (Hendelsprodukt der Bio-Rad Laboratories, Richmond, California) mit dem geeigneten Ul -Halogenacylhalogenid in Gegenwart eines Friedel·=· Crafts-Katalysators, zum Beispiel von Aluminiumchlorid, AIuminiumbromid, Zinkchlorid, Bortrifluorid oder Stannichlorid, hergestellt»

In einer Peptidsyntheue kann die Aminosäure mit dem erhaltenen Haltf<g<:niiuylhax'is umgesetzt werden, j.«idem man dis beiden Substanzen in einem 'nerven Lösungsmittel bei der Illiskfluß

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8AD ORIGINAL

temperatur der üeaktionsciischung reagieren läßt. Für äj;se Umsetzung geeignete Lösungsmittel sind beispielsweise Dioxan, Äthanol und Isopropanolo

Alts;rnativ kann man das Halogenacylfeara mit einer Mischung aus einem tertiären Amin und einer niedermolekularen Carbonsäure mehrere Stunden unter Bildung eines €i/-Aoylo3cyacy')haraes umsetzen ο Dieser Eater wird dann mit wässrigem Hatriumhydroxyd Kaliumhydroxyd oder dergleichen 2U dem 6/~Hydroxyacylha:rz verseift,

PUr diese Umsetzung geeignete tertiäre /mine sind beispielsweise Trimethylamin, Triäthylendiaain un'S' ¹N-X thy I- piperidin«,

Zu Beispielen für geeignete Carbonsäuren gehören Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Bernsteinsäure oder Malonsäure.

Zur Synthese »on Paptiden werden diese Verbindungen, in denen Y eine OH-Gruppe bedeutet, mit der !!-geschützten Aminosäure, die die C-endständige Aminosäure des fertigen Peptide bilden soll, umgesetzt, indem man die beiden Verbindungen in einem der oben genannten inerten Lösungsmittel bei oder etwa bei Zimmertemperatur in Gegenwart von Dinyclohexylcarbodiimid, Garb^r n;/lbi siraida? '^;. oder dergleichen rangieren läßt oder nach dem iPiiη den Säur^c-i P dec Aminosäure- beispielsweise durch

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SAD ORIGINAL

Überführung in ein f5äurechlorid, Säureanl^drid oder gemischtes Anhydrid, aktiviert hat.

Die Entfernung der N-Schutzgruppe und der Peptidaufhau wird in bekannter V/eise durchgeführt =

Beispielsweise kenn die EcnayloxycarbonyX-lI-Scbutsgruppe die in Verbindung mit den erfindungsgemäßen C-Sohuts;-gruppen verwendet werden kann, durch Bromwasserstoff in Essigsäure, Jodwasserstoff in Essigsäure,. Bromwasserstoff in Dioxan, Bromwasserstoff in Chloroform oder Srifluoressigsäure entfernt werden.

Das fertige Peptid kann von der (^endständigen Schutzgruppe ohne Spaltung der ^eptidbindung durch Behandlung mit 0,05 η bis 2 η Natriumhydroxyd, 0*05 η bis 2 η Kaliumhydroxyd, wässrigem Triäthylamin oder dergleichen in einem geeigneten Lösungsmittel oder einer Mischung von Lösungsmitteln, die eine ( Quellung des Harzes Terurs:;Chen₈ getrennt werden.,

Alternativ kann man das Peptid-Harz mit Ammonik umsetzen, um die C-endstandige Aminosäure zu amidieren, oder man kann es mit Hydrazin zu einem Hydrazid umsetzen, das weiter zu einem Azid umgesetzt werden kann, welches zur Herstellung weiterer Peptidbindungen an der C-endständigen Aminosäure geeignet ist.

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BAD ORIGINAL

Durch die folgenden Beispiele wird die allgemeine Arbeitsweise zur Herstellung und Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen weiter erläutert,

B e i s ρ IeI 1

Eine Mischung von 6 g Harz (Copolymeres aus 5 °/° Divinylbenzol in Styrol) und 3»216 g (24 mMol) wasserfreiem Aluminium«-
chlorid in 80 ml Nitrobenzol wurde in einem Eis-Salz-Bad auf 5 bis 10⁰C gekühlte Die Mischung wurde tropfenweise
mit 1,2 ml (12 mMol) {/-Chlorbutylchlorid versetzt und
1 1/2 Stunden lang gerührt, wobei sie sich auf Zimmertemperatur erwärmen konnte. Die Lösungsmittel wurden abfiltriert, und das Harz wurde nacheinander mit jeweils 100 ml Essigsäure, 6n Salzsäure» Dioxan₉ das trockenen Chlorwasserstoff in 6n

wässrigem
Konzentration enthielt, 95 $-igem/l)ioxan, Dioxan und Äther gewaschen

Elementaranalyse -— Gefunden: Chlor, 4,23;

Sauerstoff^ 2_e74.

Dieses Harz wurde in 100 ml Benzylalkohol, der 10 g Kalium acetat enthielt, unter Rühren 16 Stunden auf 130⁰C erwärmt ο Die Lösungsmittel wurden abfiltriert und das erhaltene
Harz wurde nacheinander mit jeweils 100 ml §5 #-igem wässri-

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BAD ORIGINAL

- 17 --

gem Dioxan, Dioxan und Äther gewaschen, Das erhaltene Hars würde als Acetoxybrimethylencarbonylharz identifiziert»

Dieses ^arz wurde in einer Lösung von 50 ral "Dioxan„ f50 ml Äthanol, 15 ml Wasser und 10 ml 2n liatriumhydrosiyd 5 Stunden bei Zimmertemperatur geschüttelt» Die Lösungsmittel vrarden abfiltriert, und der erhalten8 Feststoff wurde In der gleichen Weise wie oben beschrieben gamascheη a Als Produkt wurde Hydroxytyirnethylenoarboiiylharz erhalten,^

Elsmentaranalyse — Gefunden? Chlor_; 0.00;

Sauerstoff, 4₉34.

1p495 g (5 mMol) N-=Benzyloxycarbonyl~L~Phenylalanin wurden in 50 ml Methylenchlorid gelöst und unter RUhren bei Zimmertemperatur mit O985O g (5»25 mMol) Carbonyl-bisimidazol versetzt. Die erhaltene Mischung wurde 1/2 Stunde bei Zimmer«- temperatur gerührt und dann mit 5 g des vorstehend beschrie- j benen Harzes versetzt«. Die entstandene Mischung wurde 46 Stunden lang gerührt, filtriert und nacheinander mit jeweils 100 ml Methylenchlorid, Äthanol und Methylenchlorid gewaschen.

Aminosäureanalyse-—Gefunden; Phe» 0_o224/um/mg.

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BAD ORIGINAL

Die Benzylöxycarborjylgruppe wurde durch 30 Hinuten langes Suspendieren des Feststoffs in 30 ml einer Lösung von 30 f* Bromwasserstoff in Eisessig bei Zimmertemperatur, anschließendes Abdekantieren der Lösungsmittel und Waschen mit Jeweils 100 ml Essigsäure und Methylenchlorid entfernt, Alts dem erhaltenen L-Phenylalanin-Harz-Hydrobroraid wurde die freie Base durch Neutralisieren des Salzes rait Überschüssigem Triäthylamin in Methylenohlorid, Abfiltrieren und Waschen des erhaltenen Feststoffs mit 100 ml Methylenchlorid hergestellt.

5 g des α- Chlormethylderivats eines Copolymeren bus 2 fo Diviny!benzol in Styrol (von den Bio-Rad Laboratories, Richmond, California erhältlich) wurden in 40 ml Dioxan aufgev schlämmt und bei Zimmertemperatur langsam mit 100 ml Äthanolamin versetzt. Die Mischung v/urde uater Rühren 5 1/2 Stunden auf 8O⁰O erwärmt. Das Lösungsmittel und Überschüssiges Äthanol amin v/urden abfiltriert, und das ß-Hydroxyäthylaminomethylharz wurde nacheinander mit Dioxan, Tetrachlorkohlenstoff, 95 tige wässrigem Dioxan, Dioxan und Äther gewaschen«

Elementaranalyse—Gefunden: Sauerstoff, 0,91;

Chlor, 0,00; Stickstoff, 2_;02.

4₉5 g des ß-Hydroxyäthylaminomethylharzes wurden in 30 ml Dioxan suspendiert und mit 15 ml Acetanhydrid versetzt. Die Mischung wurde 15 Stunden bei Zimmertemperatur gelinde ge

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SAD ORJQiNAL

π .

-chittelt v/orauf dir. Lb'sun^nj tto 1. abrlelrnntiert wurden. Das erhaltene Produkt wurde naalse-itiander nn ^:; ;]ev.^Tc-ils 100 ml Me ΐ hy .1 π :> amilorid und Äther gm-jaüchen-.

Elsraentaranal.yae

Oh'l.or,. 0,00; ü!. i.'-I^tnff ₉ 2^,07

Um durch cH e j\^e «r« ihydrir ■"c^l.tirsri tsnntamlene Estergruppen zu entfernen, wurdf: des erha-.'-u-y Jiar« ■?'·· «--!ner Hii?chung Ton 30 ml £5oxan, "50 nl A^hfinol, 0 ία3 Wasoe?' und 5 ml 2n Hatriumhydroxyr3 suspendiert. Die >ixs-;chung v/urde 3 ^lundcn bei Zimmer temperatur gelinde gesc-hüttelt. Dann wurden eUe Löcungsmittel abdekundiert, und daü erlmltPiie ϊϊ-Aoetyi-ß hydroxyäthylamino methylharz wurde nach eins"'.! or mit 95 '/' .iger? wässrigem Äthanol 95 /^-igera v/ässrißen "JJioxan_v XH.oxan und Äther gewaschen»

Elementaranal:/se Gefunden: oauerstüff, Γ)»29?

Stickstoff, 1-6R,

Eine Lösung τοη 1,495 g (5,OmMoI) N-Benssyloxycarbonyl-I-Phenylalanin in 50 ml Methylenchlorid wurde mit 0₉850 g (5,25 mMol) Carbonylbisimidazol versetzt₇ und die Mischung wurde 30 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt.. Dann wurde die Mischung anteilweise mit 5,0g des vorstehend beschriebenen N-Acetyl-S-hydroxyäthylaminomethylharzes versetzt, und die erhaltene Aufschlämmung wurde 1? Ständen "^j ZiMme tür gerührt«, Das 3josungsm.it bei vmiüe abdekantiert, und 6as

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BAD ORIGINAL

feste N-Ben^yloxycarbonyl-L-phenylalanin-Ii'-aaetyl-ß-'hydroxy äthyl-aminomethylesterharz. wurde nacheinander mit jeweils 100 ml Methylenchlorid, Äthanol, Wasser, Äthanol _f Dioxan und Methylenehlorid gewaschen.

Aminosäureanalyse—Gefunden? Phe, 0,248 li

Die Benzyloxyearbonylgruppe wurde durch Suspendieren des Fe ststoffs in 30 ml einer Lösung von 30 $ Bromv;ass erst off in Eisessig während 30 Minuten bei Zimmertemperatur, /bdekantieren des Lösungsmittels und Waschen mit jeweils 100 ml Essigsäure und ^ethylenchlürid entferntp wodurch L-Ph'enylalanin--Nⁱ- acetyl-ß-hydroxyäthylaminomethylesterhydrobromidharζ erhalten wurde ο Daraus wurde die freie Base durch Neutralisieren des Salzes mit überschüssigem Triäthylamin in Methylenchlorid und Waschen des erhaltene« Peststoffes mit 100 ml Methylenchlprid hergestellt.

Ein gemischtes Anhydrid, N-Benzyloxycarbonyl-L-alanylisobu-'äyloxyameisensäureanhydrid, wurde durch Umsetzung von 1,115 g (5*0 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-alanin, O₉695 ml (5,OmMoI) Triäthylamin und 0,679 ml (5,25 mMol) Isobutylchlorformiat in 50 ml Methylenchlorid bei -15°C während 15 Minuten hergestellt. Dieses gemischte Anhydrid wurde mit dem oben beschriebenen L-Phenylalanin-N'aeetyl-ß-hydroxy- . äthylaniino-methylharzester rersetztp und die erhaltene Aufschlämmung wurde 5 Stunden bei -15⁰O und 16 Stunden bei Zimmertemperatur gerUfcurfc, Die Lösungsmittel wurden abdekantier'c_s

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.,-.,-.-.;■■ BADORiQINAi.

der Feststoff wurde nacheinander mit jeweils 100 ml Methylenehlorid, Äthanol» Essigsäure und Methylenchlorid gewaschen.

/,minosäureanalyse—Gefundens AIa₉ O₉255 /im/rag

Phe₉ 0_P241 nm/mg.

Der erhaltene Feststoff H-Benayloxycarbonyl-L-alanyl-l-phenylanin,»F'acetyl-i=hyärOxyäthylaminomethyl-=harzester ,wurde in 25 ml Dioxan mit 25 ml einer lösung von 0,1 η NaOH in wasserfreiem Äthanol versetzt.■ Die Aufschlämmung wurde 4 Stunden bei Zimmertemperatur geschüttelt, worauf die flüssige Phase abgetrennt wurde₀ Das Harz wurde nacheinander mit jeweils 13 G ml "95 $~igem wässrigem Äthanol» 95 ?5-igem wässrigem Dioxan, Dioxan und Methylenchlorid gewaschen. Sämtliche !Flüssigkeiten wurden vereinigt und im Vakuum zur trockne eingedampfte Das erhaltene öl wurde in einem 2-=Phasengemisch aus 50 tigern wässrigem Ithylacetat gelöst und mit In Phosphorsäure ange-Säuert» Fach. Irennung der Schichten wurde die organische Schicht mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, bis sie neu= tral war» Das Äthylacetat wurde im Vakuum verdampft, und das erhaltene Öl wurde in Essigsäure gelöst und lyophilisierto Das feste Produkt N-Benzyloxycarbonylalanyl-L-phenylalanin wog 360 mg (-97»4 i° Gfesamtausbeute)«

JlmiKoslureanalyse—G-efunden: AIa, 235 >um/mg<»

Phe, 2 j 22 Ai m/mg c

f QmBGn 453

SADOR[QlNM.

350 rag des N-Benzyloxycarbonyl=L~alanyl~L-phenylalaitiös wurden in der oben beschriebenen Weise mit einer Lösung von 50 $> Bromwasserstoff in Bisessig von der Schutzgruppe befreit. Die ^eptidanalyse bestätigte, daß dieses Produkt aus dem gewünschten Dipeptid bestände

Beispiel 3

™ Die Arbeitsweise von Beispiel 1 wurde unter Verwendung von Aminohexanol anstelle von Aminoäthanol wiederholt, um das Grundharz für die Esterbildung herzustellen. Auf diese Weise wurde ii~Aeetyl~6~hydroxyhexylaminomethyl als reaktive Seitenkette in das Styrol-Divinylbenzol-Copolyraere eingeführt ,

Analyse: Ber.: Cl 0 $>₉ Gef.: Cl 0 $

Il 1,85 fo.

Beispiel 4

10 g des a-Chlorme thy !derivate des Copolymeren aus 2 $> ■ Divinylbenzol und Styrol (3₉3 ί> Chlor) wurden in 40 ml Dioxan auf geschlämmt und mit 10 g 6-Aminohexanol versetzt. Die Mischung wurde unter Rühren. 5 Stunden auf 85⁰C e rwärmt^ Das Lösungsmittel und Überschüssiges Aminohexatföl wurde abfiltriert_ς

BAD ORIGINAL

und das Harz wurde nacheinander mit Dioxan, !Tetrachlorkohlenstoff, 95 tigern wässrigem Dioxan, Dioxsn und Äther gewaschen.

Der erhaltene Feststoff wurde 16 Stunden bei 25°C mit einer lösung von 20 ml Thionylchlorid in Hethylenchlorid be« handeltoDie Lösungsmittel wurden abfiltriert_p und das erhaltene Harz wurde mit 50 ml Acetanhydrid in Dioxan 4 Stunden | bei 50⁰C acetyliert.

Analyse: Gef_a: Ν 0^68 ^.

Dieses Harz wurde in 40 ml Dioxan aufgeschiämmt und mit 10 g 6-Aminohexanol versetzt. Die Mischung wurde 16 Stunden auf 85⁰C erwärmt und dann abgekühlt«, Die Lösungsmittel wurden abfiltriert, und das erhaltene Harz wurde wie Torher aoetyliert, wodurch NpN'-Diacetylhydroxyhexylaminohexylamino» methyl-harz erhalten wurde. (

Analyse: Gefunden N 1_Ρ67 $>*

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Claims

1770985

- 24 Pa t e η t a η 8 ρ r ü ο h e

Verbindungen für Peptidsynthesen in fester Phase., gekenn·= !zeichnet durch die Formel

worin

R den Rest eines Styrol-Divinylbenzol-Copolymerharzes, der ausgehend von einem darin enthaltenen Phenylring ge« bunden ist;

Y eine OH-Gruppe oder ein Halogenatom;

9 o

Z die Gruppe -C- oder >N- q - R² _p worin R² einen niederen Alkylrest bedeutet;

m 0 oder 1;

η eine Zahl von 2 bis 6 und

k eine Zahl von 1 bis 4

bedeuten_p mit der Maßgabe_p daß k 1_? m O und η eine Zahl

Il

von 3 bis 6 bedeuten, wenn Z die Gruppe -C- darstellt, und k eine Zahl von 1 bis 4 , m 1 und η eine Zahl von 2 bis

10 9 886/145

we nn Z ■ _ 2-5 =* • o
!1 1 770965 6 bedeuten, die Gruppe ^ -2 dar- stellte

Verbindungen nach Anspruch 1, gekennzeichnet dureh die Formel

C=O

R den Phenylanteil eines Styrol^Divinylbenzol·= Copolymerharzes;

ο
R einen niederen Alkylrest;

Y eine 0H~Gruppe oder ein Halogenatom;

m eine Zahl von 1 bis 4 und η eine Zahl von 2 bis 6

bedeutet.

Verbindungen nach Anspruch 1 oder 2, nämlich N-=-Acetyl·= ß-hyäroxyäthylaminomethyl-=harz, N=ACetylhydroxyhexylamino= methyl-harz oder N,If'-Diaeetylhydroxyhexylaminohexyl" aminomethyl~harz.

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Verbindungen nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Formel

O
η

worin

R ein Styrol-Divinylbenzol-Gopolymerharz, das

an einem darin enthaltenen Phenylring gebunden ist;

η eine Zahl von 3 bis 6 und

Y eine OHMJruppe oder ein Halogenatom bedeutet.

5.' Verbindung nach Anspruch 1 oder 4, nämlich 0-Chlorfcutyrylharz.

6. Verfahren zur Peptidsynthese in fester Phase durch Umsetzung einer Aminosäure, die die G-endständige Aminosäure eines fertigen Paptids bilden soll, mit einem festen Harz unter Verbindung des Harzes mit der Carbonsäurefunktion der Aminosäure und Bildung eines -Rests mit einer freien Amino« funktion für die Bildung einer ^eptidbindung und Aufbau des Peptide durch schrittweise Umsetzung mit Aminosäure^ dadurch gekennzeichnet, daß man als festes Harz eine wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 definierte Verbindung verwendet»

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ο Verfahren aur Herstellung von Verbindungen "nach. Anspruch 2, dadurch gekennaeiahneij daß man ein Copolyraeres der For-Kiel R^--OH₂-X₇ worin Ii v/its in Anspruch 2 definiert ist, und 1 ein Halögenatooi bedeutet, mit einem /minoalkanol der Formel H₀Ji-(GHn)-OH , wa-pin η wie io Anspruch 2 definiert ist, ums-e'tzt und das sekundäre Stickstoffatom das erhaltenen ■ ?ro-dulcts mit einern. Aöylierungsmittel, das

ρ
\\^fenisten3 sincn Best der Formal R"-Os-O- aufv/elst, worin R² wie in -Anspruch 2 definiert ist., unter JJilöung einer Ver~ | bindung aoyliert, worin Y in der ΡοητκίΊ you Anspruch 2, eine QH-Gruppe bedeutet, und gegebenenfalls durch Halogenierung des erhaltenen ^irodukts eine Verbindung herstellt, woKFin

Y in der Formel von Anspruch 2 ein Hslcgenstom bedeutet_P

8„ Verfahrensur Herstellung von Verbindungen nach Ansprueh A₉ dadurch gekennzeichnet, daß man ein Otyrol=-Divinylbenzol«Co=> polynierharz mit einem O "Haiügenaaylhalogenid der Formel Y=-(CHg)-C:OY_f. worin IC ein Halogenatom bedeutet und η wie in Ansprueh 4 definiert ist, in Gegenwart eines Friedel« Orafts^-iiatalysatars zu einer Verbisidung iimsetzt, worin

Y in der Poroel τοη Anspruch 4 ein H;.logenatom bedeutet, und gegebenenfalls die erhaltene Verbindung ta-.lt; einer Carbonsäure in Gegenwart eines tertiären Amins umsetzt und das erhaltene Cj Aeyloxyacylharss t,u einer V-ojrbindung hydrolysiert, wo=- rin Y Iß dar- Formel τοπ Anspruch 4 eine 0H-6ruppe bedeutete

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SAD ORIGlNAi.