DE1642585A1 - Verfahren zur Gewinnung von stickstoffhaltigen Verbindungen aus Zellmaterial - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung von stickstoffhaltigen Verbindungen aus ZellmaterialInfo
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- DE1642585A1 DE1642585A1 DE1967B0092066 DEB0092066A DE1642585A1 DE 1642585 A1 DE1642585 A1 DE 1642585A1 DE 1967B0092066 DE1967B0092066 DE 1967B0092066 DE B0092066 A DEB0092066 A DE B0092066A DE 1642585 A1 DE1642585 A1 DE 1642585A1
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Description
I D if Ζ D Q
PATENTANWÄLTE
KÖLN 1, DEICHMANNHAUS
Köln, den 25. Mai 1970
Kl/En
Verfahren zur Gewinnung_von stickstoffhaltigenJVerbindungen
aus Zellmaterial
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewinnung von stickstoffhaltigem Material aus Mikroorganismen.
Verfahren zum Zerreißen der Zellwände von Mikroorganismen sind
bekannt. Bei diesen Verfahren werden die Zellwände zwar wirksam zerrissen, jedoch haben sie Nachteile, die ihren Wert als
Grundlage für die technische Gewinnung von stickstoffhaltigem Zytoplasma-Material aus Mikroorganismen verringern.
Es wurde bereits vorgeschlagen, die Zellwände mit Hilfe eines
Enzyms abzubauen, das die Kohlehydratkomponenten von in der Zellwand vorhandenen Verbindungen, die diese Komponenten enthalten,
zu zerreißen. Beispielsweise wurde die Verwendung einer ß-Glukanase vorgeschlagen, um die Cellulose und die Mannanstrukturen
in der Zellwand anzugreifen.
Zum Unterschied von diesem bereits vorgeschlagenen Verfahren ist die Erfindung auf ein Verfahren gerichtet, bei dem in
einer enzymatischen Anfangsstufe ein Mikroorganismus mit einem proteolytischen Enzym behandelt wird* wodurch Kohlehydrat-
Neue Unterlagen Wi^^
109819/0270 ßAO ORlGWAL
und Proteinverbindungen in der Zellwand angegriffen werden,
worauf die geschwächte Zellwand durch ein Enzym angegriffen wird, das eine Kohlehydratkomponente der Zellwand angreift,
wodurch die Zellwand weiter geschwächt oder abgebaut wird.
Das Verfahren gemäß der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet,
daß man ein Material, das aus Zellen eines Mikroorganismus besteht oder Zellen eines Mikroorganismus enthält, deren Wand
wenigstens teilweise aus wenigstens einer Verbindung aufgebaut ist, die eine Kohlehydratkomponente und eine Proteinkomponente
enthält, mit einem proteolytischen Enzym behandelt,
wodurch Degeneration der Proteinkomponente stattfindet und die Kohlehydratkomponente dem enzymatisehen Angriff zugänglich
wird, anschließend das in den Zellwänden vorhandene proteolytische
Enzym deaktiviert oder entfernt, danach das Material oder eine Fraktion, die den daraus gewonnenen ersten behandelten
Mikroorganismus enthält, einer weiteren Behandlung mit einem Enzym unterwirft, das ein in der Zellwand vorhandenes
Kohlehydrat anzugreifen vermag, wodurch Degeneration des Kohlehydrats stattfindet, und anschließend gegebenenfalls nach
einer Zwischenbehandlung zum weiteren Angriff auf die Zellwand oder zum Zerreißen derselben eine wäßrige Fraktion gewinnt,
die stickstoffhaltige Verbindungen in Lösung und/oder Suspension enthält.
Der Ausdruck "Mikroorganismus" im Rahmen der Beschreibung umfaßt auch Gemische von Mikroorganismen. Die erfindungsgemäß
behandelten Mikroorganismen können Hefen, Pilze oder Bakterien sein.
Die in dieser Beschreibung genannten Bakterien sind nach dem System eingestuft, das in "Bergey"s Manual of Determinative
Bacteriology" von R.S. Breed, E.G,D. Murray und N.R. Smith
(1957)* 7. Auflage, herausgegeben von Williams (Baltimore, USA), beschrieben ist. Die Hefen sind nach der Arbeit von
10 9 819 / 02 7 Π
8AD ORIGINAL
1b42H85 - 3 -
"The Yeasts - a Taxonomic Study" von Lodder und Kreger-van Rij
(I952), herausgegeben von North Holland Publishing Company
(Amsterdam), eingestuft.
Bei Verwendung einer Hefe gehört diese vorzugsweise zur Familie Cryptococcaceae, insbesondere zur Unterfamilie Cryptococcoideae.
Gegebenenfalls können jedoch auch beispielsweise askosporogene Hefen der Unterfamilie Saccharomycoideae verwendet
werden. Bevorzugte Gattungen der Unterfamilie Cryptococcoideae sind Torulopsis (auch als Torula bekannt), Candida
und Mycoderma. Bevorzugte Hefespezies sind nachstehend aufgeführt.
Besonders bevorzugt ist die Verwendung der Stämme, deren Hinterlegungsnummter angegeben ist. Die mit "CBS" gekennzeichneten
Stämme sind beim Centraal Bureau vor Schimmelculture, Baarn, Holland, und die mit INRA gekennzeichneten Stämme
beim Institut National de la Recherche Agronomique, Paris, Prankreich, hinterlegt.
Candida lipolytica Candida pulcherrima
Candida utilis
Candida utilis, Variati major CBS 841
Candida tropicalis CBS 23I7 "
Candida arborea Torulopsis colliculosa Hansenula anomala Oidium lactis
Neurospora sitophila Mycoderma cancoillote
Von den vorstehend genannten Hefestämmen wird Candida lipolytica besonders bevorzugt.
CBS | 599 |
CBS | 610 |
CBS | 890 |
CBS | 841 |
CBS | 2317 |
CBS | 133 |
CBS | 110 |
INRA | : STV 11 |
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Gegebenenfalls können Pilze als Mikroorganismus eingesetzt
werden. Ein geeigneter Stamm ist Penicillium expansum.
Auch Bakterien kommen als Mikroorganismen in Frage. Diese Bakterien
gehören zweckmäßig zu den Ordnungen Pseudomonadales Eubacteriales und Actinomycetales.
Die verwendeten Bakterien gehören vorzugsweise zu den Familien Corynebacteriaceae, Micrococcaceae, Achromobacteraceae,
Actinomycetaceae, Rhizobiaceae, Bacillaceae und Pseudomonodaceae.
Bevorzugte Spezies sind Bacillus megaterium, Bacillus subtilis und Pseudomonas aeruginosa. Weitere geeignete Spezies
sind:
Bacillus amylobacter Pseudomonas natriegens Arthrobacter sp.
Micrococcus sp. Corynebacterium sp. Pseudomonas syringae
Xanthomonas begoniae Flavobacterium devorans Acetobacter sp.
Actinomyces sp.
Mocardia opaca
Zweckmäßig werden Mikroorganismen verwendet, die auf geradkettigen
paraffinischen Kohlenwasserstoffen zu wachsen vermögen. Vorzugsweise werden Mikroorganismen verwendet, die auf
einem Nährboden gezüchtet worden sind, der einen Kohlenwasserstoff enthält. Zu den geeigneten Substraten gehören Leuchtpetroleum, Gasöle und Schmieröle. Diese Einsatzmaterialien können
unraffiniert oder einer gewissen raffinierenden Behandlung unterworfen worden sein, müssen jedoch gewöhnlich einen Anteil
an geradkettigen Kohlenwasserstoffen enthalten, um für die Zwecke der Erfindung geeignet zu sein. Zweckmäßig wird eine
Erdölfraktion verwendet, die 3 bis 45 Gew.-% geradkettige Kohlenwasserstoffe
enthält.
Vorzugsweise wird eine Erdölfraktion gebraucht, die wenigstens teilweise aus geradkettigen Kohlenwasserstoffen besteht und
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t b 4 / ■ > Ί b
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ein mittleres Molekulargewicht hat, das wenigstens 10 Kohlenstoffatomen
pro Molekül entspricht.
Bevorzugte Verfahren für die Züchtung der Mikroorganismen und
zur Gewinnung des Produkts sind in den britischen Patentschriften 914.567, 914.568, 1.017.584 und 1.017.585 und in
den folgenden deutschen Patentanmeldungen beschrieben:
B 74.85I IVa/6a B 85.074 IVa/6a
B 78„776 IVa/6a B 85.075 IVa/6a
B 79.32I IVa/6a B 87.7I3 IVa/6a
B 85.070 IVa/6a B 89.462 IVd/23b f
B 85.O7I IVa/6a - B 91.002 IVd/23b
B 85.072 IVd/23b B 9I.OO3 IVd/23b
B 85„073 IVd/23b
Als proteolytisches Enzym wird beim Verfahren gemäß der Erfindung
vorzugsweise ein Enzym verwendet, das nur eine Bindung zwischen zwei spezifischen Aminosäuren auflöst, die in
einer Proteinkomponente der Zellwand vorhanden sind, wodurch
das Ausmaß des Abbaues der Proteinkomponente stark begrenzt wird« Da ferner eine gewisse Durchdringung des Zytoplasmas
durch das proteolytische Enzym stattfinden kann, ist die Verwendung eines Enzyms mit dieser begrenzten Aktivität ebenfalls
erwünscht, da hieraus folgt, daß ein etwaiger Abbau des Pro- " teins des Zytoplasmas in ähnlicher Weise begrenzt wird. Zu den
geeigneten proteolytIschen Enzymen für die Zwecke der Erfindung
gehören Pepsin, Trypsin, Bromelin, Piein und Papain. Bevorzugt
wird Papain, das zweckmäßig in einer Menge von 0,2 bis 0,j5 lfo des Gewichts der trockenen Zellen verwendet wird.
Das proteolytLsche Enzym wird vorzugsweise unter solchen Bedingungen
verwendet, unter denen ein wesentlicher Anteil, der in den Zellen enthaltenen stickstoffhaltigen Komponente löslicht
gemacht wird. Vorzugsweise werden jedoch die Bedingungen, unter denen das proteolytische Enzym verwendet itfird, auch
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Ib 4
so gewählt, daß nur ein geringer Anteil des Zytoplasmaproteins abgebaut, d.h. In niedrigmolekulare Polypeptide oder in Aminosäuren
umgewandelt wird.
Es ist ein wesentliches Kennzeichen der Erfindung, daß das
proteolytische Enzym nach dem Gebrauch und vor der Behandlung
mit einem Enzym* das das Kohlehydrat der ZeILe angreift, deaktiviert
oder entfernt wird. Als Folge des Angriffs auf das Kohlehydrat wird das Protein des Zytoplasmas anfälliger für
den Angriff durch ein proteolytisches Enzym, und die Geschwindigkeit des Angriffs auf ein Protein dieses Typs wäre hoch.
Aus diesem Grunde ist die Deaktivierung oder Entfernung des proteolytischen Enzyms in der geeigneten Phase wichtig. Ferner
findet in der ersten Phase des enzymatischen Angriffs auf die Zellwand ein gewisser Angriff auf das Zytoplasmaprotein
statte Auch aus diesem Grunde muß die Dauer der Berührung der Zelle mit dem proteolytischen Enzym vor dessen Entfernung oder
Zerstörung auf die Zeit begrenzt werden, die notwendig ist, um den Angriff auf das Protein dar Zellwand vorzunehmen.
Die geeigneten Bedingungen für die Anwendung des proteolytischen Enzyms werden vorzugsweise wie folgt bestimmt:
Nach der Bestimmung des Gesamtstickstoffs der Zellen wird die
Probe der Mikroorganismen in einer Reihe von Versuchen mit steigenden Enzymmengen behandelt. Der insgesamt löslich gemachte
Stickstoff wird dann ermittelt und das folgende Verhältnis bereichnet:
insgesamt Löslich gernachter Stickstoff
GesamtstLckstoff der Zelle
Die verwendete Enzymkonzentration ist die Mindestkonzentratlon,
die dem Maximum dieses Verhältnisses entspricht.
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Das nach der Behandlung mit dem proteolytischen Enzym zurückbleibende
behandelte Material wird vorzugsweise der Phasentrennung unterworfen. Gegebenenfalls kann die hierbei gewonnene
wäßrige Phase mit oder ohne Zwischenbehandlung für die Behandlung weiterer Mengen des Mikroorganismus wiederverwendet
oder im Kreislauf geführt werden. Die Phasentrennung wird vorzugsweise durch Zentrifugieren vorgenommen. Nach der Phasentrennung
wird die den Mikroorganismus enthaltende Fraktion vorzugsweise mit einem wäßrigen Medium, zweckmäßig Wasser,
gewaschen, um das proteolytische Enzym zumindest so weit zu entfernen, wie das Enzym mit den Zellwänden assoziiert ist.
Der gewaschene Mikroorganismus kann einer weiteren Phasen- f trennung, die zweckmäßig durch Zentrifugieren erfolgt, unterworfen
werden.
Der Mikroorganismus, der der Behandlung zur Entfernung oder Zerstörung des mit der Zellwand verbundenen proteolytischen
Enzyms unterworfen worden ist, muß mit einem Enzym, das die Kohlehydrate anzugreifen vermag, in der nächsten Behandlungsphase ohne übermäßige Verzögerung und auf jeden Fall zu einem
Zeitpunkt, bevor die Zellwände durch Autolyse zerstört werden, behandelt werden.
•Bei dieser weiteren Behandlungsphase wird zumindest ein Teil j
der Kohlehydratkomponenten der Zellwand, z.B. Cellulose und Mannan, angegriffen. Da die verwendeten Enzyme nicht proteolytisch
sind, ist es möglich, unter scharfen Bedingungen ohne wesentlichen Abbau des Proteins des Zytoplasmas zu arbeiten.
Gegebenenfalls kann gleichzeitig oder anschließend eine Lipase verwendet werden, um eine weitere oder schnellere Schwächung
der Zellwand zu bewirken.
Nach der Behandlung mit Enzymen zum Abbau der Kohlehydrate der Zellwand und gegebenenfalls zum Abbau der Lipide enthält
die wäßrige Phase einen wesentlichen Anteil des Proteins des v
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Zytoplasmas in Lösung oder Suspension. Die wäßrige Phase rait
dem darin kolloidal suspendierten Protein kann beispielsweise durch Zentrifugieren abgetrennt werden. Gegebenenfalls kann
diese wäßrige Phase dann eingedampft werden, um ein festes stickstoffhaltiges Produkt zu gewinnen.
Durch Zusatz einer 2n-Natriumhydroxydlösung wurden 25 kg einer wäßrigen Hefecreme,. die 15 Gew.-% der Hefe Candida tropicalis
enthielt und auf einem Gasöl gezüchtet worden war, auf pH 7*6 eingestellt und dann mit einem nicht ionogenen Detergens
gewaschen. Dann wurden 270 g Dinatriumphosphat (POhHNa2'12H2O) und 5*3^· Citronensäure (Citronensäuremonohydrat)
zugesetzt. Die Temperatur des Reaktionsgemisches wurde auf 70 C gebracht. Nach Erreichen dieser Temperatur wurden
15 g Papain (SCHWARTZ) und 15 g Cysteinhydrochlorid zugesetzt. Die Temperatur wurde 1 Stunde bei 700C gehalten. Das Material
wurde dann zentrifugiert, wobei ein Rückstand und ein flüssiges Produkt erhalten wurden. Dieser Rückstand wurde mit 8 1
destilliertem Wasser gewaschen und dann erneut zentrifugiert.
Der erhaltene Rückstand wurde in 15 1 destilliertem Wasser
säure aufgenommen. Der pH-Wert wurde durch Zusatz einer 2n-Salz/Lösung
auf 5 eingestellt, worauf I38 g Dinatriumphosphat (PO^HNa212H2O) und 38,1 g Citronensäure (Citronensäuremonohydrat)
zugesetzt wurden. Dieses neue Gemisch wurde erhitzt und 2 Stunden in Gegenwart von 25 g Cellulose (B,-o* Hersteller
SEAB) und 25 g Lipase B (Rohm and Haas) bei 40°C gehalten. Das Produkt wurde zentrifugiert und das erhaltene Flüssigprodukt
zu den vorher durch Zentrifugieren erhaltenen Flüssigprodukten gegeben. Das Gemisch der Flüssigkeiten wurde durch
Versprühen getrocknet. Hierbei wurden 2,25 kg trockenes Produkt erhalten, das 11 Gew.-% Stickstoff enthielt»
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Durch Zusatz einer 2n-Natriumhydroxydlösung wurden 10 kg einer
wäßrigen Backhefesuspension, die 15 % Trockenstoff (Saccharomyces cerevisiae) enthielt, auf pH 7*6 gebracht.
Dann wurden 3 1 eines Puffers (390 ml einer 0,2 n-Mononatriumphosphatlösung
und 2610 ml einer 0,2 n-Dinatriumphosphatlösung) bei pH 7*6 zugesetzt. Die Temperatur der Suspension
wurde auf 70 C gebracht. Nach Erreichen dieser Temperatur
wurden 6 g Ficin (SCHWARTZ) und 3 g Cysteinhydrochlorid zugesetzt.
Nach einstündigem Stehen und Zentrifugieren wurden ein flüssiges Produkt und ein Rückstand erhalten. Dieser
Rückstand wurde mit 3 1 destilliertem Wasser gewaschen und
erneut zentrifugiert. Der erhaltene Rückstand wurde in 3*3 Wasser aufgenommen und mit einer 2n-Salzsäurelösung auf pH
gebracht. Diese Suspension wurde mit 3*3 1 Phosphatpuffer-Citronensäure
gemischt, wodurch der pH-Wert auf 5 eingestellt wurde. Die Temperatur wurde in Gegenwart von 15 g Cellulase
(SEAB) und 15 g Lipase B (Rohm and Haas) 2 Stunden bei 40°C gehalten. Das Produkt wurde zentrifugiert und die erhaltene
Flüssigkeit zu den vorher durch Zentrifugieren erhaltenen Flüssigkeiten gegeben. Das Flüssigkeitsgemisch wurde durch
Zerstäubung getrocknet. Etwa 700 g trockenes Produkt, das
10 Gew.-^ Stickstoff enthielt, wurden erhalten.
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Claims (12)
1) Verfahren zur Gewinnung von stickstoffhaltigen Verbindungen aus Zellmaterial, dadurch gekennzeichnet, daß ein aus
Mikroorganismenzellen bestehendes oder solche Zellen enthaltendes Material, deren Zellwände mindestens teilweise
aus mindestens einer eine Kohlenhydrat- und eine Protein-Komponente aufweisenden Verbindung aufgebaut sind, mit einem
proteolytischen Enzym behandelt wird, wobei ein Abbau der Proteinkomponente stattfindet und die Kohlenhydrat-Komponente
einem enzymatischen Angriff zugänglich wird, dann das in den Zellwänden vorliegende proteolytische Enzym
deaktiviert oder entfernt wird, darauf das so vorbehandelte Material oder eine Fraktion des Materials mit einem
die Kohlenhydrat-Komponente der Zellwände angreifenden Enzym behandelt wird, wobei ein Abbau des Kohlenhydrats
stattfindet, und dann, gegebenenfalls nach einem weiteren Angriff auf die Zellwände oder einem Zerreißen derselben,
eine wäßrige, stickstoffhaltige Verbindungen in Lösung und/oder in Suspension enthaltende Fraktion gewonnen wird.
2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als proteolytisches Enzym ein Enzym mit einer spezifischen Aktivität
verwendet wird, das nur eine Bindung zwischen zwei bestimmten Aminosäuren löst, die in der Protein-Komponente
der Zellwände vorhanden sind.
J>) Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet,
daß als proteolytisches Enzym Pepsin, Trypsin, Bromelin, Ficin oder Papain verwendet wird.
4) Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichriet, daß Papain
in einer Menge von 0,2 bis 0,5 %, bezogen auf das
Trockengewicht der Mikroorganismenzellen, eingesetzt tvird.
Unterlagen (Art. 7 § I Abs. 2 Nr. t Satz 3 d«s ÄndarunflUfles. v.4,9.1
109819/02*0
ORIGINAL INSPECTED
I b 4 2 b $ 5
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5) Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß das proteolytische Enzym untör solchen
Bedingungen zur Anwendung gebracht wird, unter denen ein wesentlicher Anteil der stickstoffhaltigen Komponente der
Zellwände in Lösung gebracht, dabei aber, wenn überhaupt, nur ein geringer Teil des Cytoplasmaproteins abgebaut wird.
6) Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das nach der Behandlung mit dem proteolytischen
Enzym verbliebene Material einer Phasentrennung unterworfen wird.
7) Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die den Mikroorganismus enthaltende Fraktion nach der Phasentrennung
mit einem wäßrigen Medium gewaschen wird.
8) Verfahren nach einein der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß für den Angriff auf das Kohlenhydrat der Zellwände eine Cellulase verwendet wird.
9) Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß zusammen
mit der Cellulase eine Lipase eingesetzt wird.
10) Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus eine Hefe, insbe- '
sondere eine geradkettige, paraffinische Kohlenwasserstoffe enthaltende Hefe verwendet wird.
11) Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß eine Hefe der Gattung Candida, insbesondere aus der Spezies
Candida lipolytica oder Candida tropicalis, verwendet wird.
12) Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet,
daß als Mikroorganismus Bakterien eingesetzt v/erden. v
109819/0270 ΒΑ0 ORIGINAL
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus eingesetzt wird* der durch Kultivieren auf* einem kohlenwasserstoff haltigen
Substrat erhalten wurde«
109819/0270
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