DE1617643C - Verfahren zur Herstellung von Immun Lactoglobulinen - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Immun LactoglobulinenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Immun-Lactoglobulinen.
Es ist bereits bekannt, Rinderrassen, insbesondere Kühe, gegen Krankheiten, wie Tuberkulose, Keuchhusten
oder Pocken, zu immunisieren und die aus der Milch dieser Wiederkäuer erhaltenen Lactoglobuline
zur Immunisierung von Menschen oder Tieren zu verwenden.
Die Anwendung eines solchen Herstellungsverfahrens für immunisierende Lactoglobuline konnte
jedoch bisher nicht im industriellen Maßstab erfolgen, da die immunisierten Kühe einerseits während langer
Zeitspannen Milch produzieren sollen, die einen wesentlichen Anteil Antikörper enthält, andererseits
aber dabei vollständig gesund bleiben müssen. Diese beiden Bedingungen konnten jedoch bisher nicht
gleichzeitig verwirklicht werden.
Zwar führt die unmittelbare Injektion von Antigen unmittelbar in die Milchdrüsen nach dem einzigen
bisher angewendeten Verfahren zu einer wesentlichen Konzentration von Antikörpern in der Milch, jedoch
verursachen derartige Injektionen sehr häufig Entzündungen der Milchdrüsen. Außerdem wurde in
den meisten Fällen Eiter oder eine sehr große Leukocytenzahl in der nach diesem Verfahren erhaltenen
Milch festgestellt, die daher zum Verbrauch ungeeignet ist. Außerdem versiegt die Milchsekretion sehr
schnell, und der Antikörperspiegel sinkt merklich ab.
Andere Verfahren, die auf der subkutanen, intramuskulären oder intravenösen Injektion des Antigens
beruhen, ergeben einen für die Anwendung zu geringen Anteil von Antikörpern in der Milch.
Die vorliegende Erfindung betrifft nun ein Verfahren, mit dessen Hilfe bei Rinderrassen, insbesondere
bei Kühen, eine andauernde und starke Produktion von Antikörpern in der Milch bewirkt wird, ohne
daß diese Produktion sichtbar die Gesundheit des Tieres beeinträchtigt.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von immunisierenden Lactoglobulinen ist dadurch
gekennzeichnet, daß man zunächst ein Rind, insbesondere eine Kuh, durch Skarifikation oder Injektion
eines Antigens immunisiert, worauf man periodisch dasselbe Antigen in die rückwärtigen
Milchdrüsen injiziert und die Milch des Rindes gewinnt und daraus gegebenenfalls die Lactogobuline
isoliert. Hierdurch wird der Antikörperspiegel im Blut auf einem erhöhten Wert gehalten und nimmt
im Milchserum sehr stark zu. Zur Abtrennung des Milchserums läßt man gegebenenfalls die Milch
gerinnen und fällt in bekannter Weise, z. B. mit Ammoniumsulfat, die Lactoglobuline aus, die die
Antikörper enthalten, welche nach Dialyse und Abtrennen des Ammoniumsulfats in geeigneter Form
verabreicht werden können. Erfindungsgefaäß kann man die erste Immunisierung des Rindes durch einen
Schnitt (Skarifikation) vornehmen, worauf eine bestimmte Anzahl intramuskulärer Injektionen der
Antigene in Zeitabständen erfolgt.
Vorzugsweise, aber nicht notwendigerweise gewährt man der Kuh eine Ruhezeit^ die z. B, 2 Monate
betragen kann, und nimmt dann jede Woche eine weitere Injektion von Antikörpern in die rückwärtigen
Milchdrüsen vor.
Die rückwärtigen Milchdrüsen liegen auf der
hinteren Seite der rückwärtigen beiden Viertel des Euters und haben die Größe einer Mandarine. Sie
sind fühlbar und beweglich, so daß die Injektion
leicht vorgenommen werden kann. Vorzugsweise wird in der Mitte der Drüse mit Hilfe einer geeigneten
Injektionsnadel, z.B. von 12/10 mm, injiziert.
Die Erfindung ermöglicht die Herstellung von immunisierenden Lactoglobulinen, mit denen zahlreiche
Krankheiten bekämpft werden können. Die erhaltenen Antikörper hängen von der Art der Krankheit
ab, gegen die die Kuh immunisiert wurde.
Die erfindungsgemäß erhaltenen immunisierenden Lactoglobuline werden verabfolgt, indem entweder
die Milch, in der sie enthalten sind, zu trinken gegeben wird, oder indem aus dieser Milch der Anteil isoliert
wird, der die Antikörper enthält.
So kann das die Antikörper enthaltende Lactoglobulin oral oder rectal mit Hilfe geeigneter Exzipienten
verabreicht werden.
Zur Erläuterung der Erfindung werden in den nachstehenden Beispielen zwei Ausführungsformen
des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben.
Dieses Beispiel betrifft die Herstellung von gegen Kuhpocken wirksamem Lactoglobulin.
Eine Kuh wurde zu Beginn ihrer Lactationsperiode mit einem bekannten, zur Pockenschutzimpfung in
der Humanmedizin verwendeten Impfstoff, wie er in der »Pharmacopee Franpaise«, 1965, S. 1267 und
1268, beschrieben wird, geimpft.
Zunächst wurde ein erstes Mal geimpft, indem auf der rechten Flanke der Kuh eine Fläche von 40 χ 40 cm
eingeschnitten und 80 cm3 Impfstoff G 6 mit einem Titer von 1 · 106·7 aufgebracht wurde.
2 Wochen später wurden intramuskulär 10 cm3 Virus mit einem Titer von 1 · 106·7, vermischt mit
Glycerin der Konzentration 1/5 und unter Zusatz von Gelatine inokuliert. Eine weitere Woche später
wurden unter denselben Bedingungen in analoger Weise intramuskulär 20 cm3 desselben Virus injiziert.
1 und 2 Wochen später wurden unter denselben .Bedingungen intramuskulär und subkutan 50 bzw.
100 cm3 desselben Virus injiziert.
Nach Beendigung dieser Immunisierungsperiode
wurde die Kuh 2 Monate in Ruhe gelassen, ohne weitere Injektionen vorzunehmen.
Um die der Kuh verliehene Immunität aufrechtzuhalten, wurden ihr darauf jede Woche in das Zentrum
der beiden inneren Milchdrüsen 20 cm3 einer Suspension des zuvor beschriebenen Impfstoffvirus
injiziert.
Bei jeder Injektion während der Immunisierungsperiode und während der Periode der Aufrechterhaltung
der Immunität wurde der Gehalt an Lactoglobulinen einerseits im Milchserum und andererseits
im Blutserum bestimmt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt:
Tag der Skarifikation :
2 Wochen später (I. Injektion)
3 Wochen später (2. Injektion)
' 4 Wochen später (3. Injektion)
5 Wochen später (4. Injektion)
| Antikörpertiter | Blut |
| Milch- | serum |
| su rum | 0 |
| 0 | 1000 |
| 0 | 1000 |
| 16 | 3000 |
| 16 | 3000 |
| 32 |
| Produktionsperiode | Wochen | später (1. Injektion) | Antikörpertiter | Blut | |
| 14 | Wochen | später (2. Injektion) | Milch | serum | |
| 15 | Wochen | später (3. injektion) | serum | ||
| 16 | Wochen | später (4. Injektion) | '2000 | ||
| 17 | Wochen | später (5. Injektion) | 76 | 3000 | |
| 18 | Wochen | später (6. Injektion) | 200 | 3000 | |
| 19 | 500 | 3000 | |||
| 1000 | 3000 | ||||
| Fortsetzung | 1000 | 3000 | |||
| 1000 | |||||
Der Titer der Antikörper im Milchserum sowie in den Lactöglobulinen wurde durch Serumneutralisation
gemäß der Arbeitsweise nach Boulter in J. of Hygiene, 1957, S. 55 bis 502, bestimmt.
Gemäß dieser Arbeitsweise wurde eine 50%ige Verminderung der Pocken auf einer Chloroallantois-Membran
von 12 bis 14 Tage bebrüteten Eiern erzielt, die mit einer Pockenvirussuspension beimpft
worden waren.
Die Ergebnisse sind auf den Kubikzentimeter Milchserum bezogen und werden in Verdünnung
angegeben, d. h., je höher die für die Verdünnung angegebene Zahl ist, um so mehr Antikörper sind im
Milchserum enthalten. Die Ergebnisse für Lactoglobuline werden auf 1 g des Pulvers bezogen.
Die Ergebnisse der Immunisierung ergaben für das Milchserum eine Aktivität von etwa 1/1000 und
für die Lacto-immunoglobuline Aktivitäten von etwa 1/10000.
Aus der vorstehenden Tabelle ergibt sich, daß während der Impfperiode der Antikörperspiegel im
Blutserum bis zu einem Wert von 3000 und im Milchserum bis zu dem Wert 32 anstieg.
Nach der Ruhezeit war der Antikörperspiegel im Blutserum auf 2000 und im Milchserum auf 16
gefallen.
Während der Periode der Produktion von immunisierenden Lactöglobulinen, der charakteristischen
Phase des erfindungsgemäßen Verfahrens, stellte man fest, daß der Antikörperspiegel im Blutserum wieder
anstieg und bei 3000 konstant blieb, wahrend der Antikörperspiegel im Milchserum gleichmäßig bis
zu einem Wert von 1000 zunahm. Dies stellt ein merkliches Anwachsen, und zwar um das' 30fachc
des am Ende der Immunisierungsperiode erhaltenen Spiegels dar.
Wenn man in der Folgezeit einmal wöchentlich eine Injektion in die rückwärtigen Milchdrüsen unter
den oben angegebenen Bedingungen vornahm, wurde während etwa 8 Monaten Milchserum mit einem
Antikörperspiegel von etwa 1000 produziert. Zwischen dem 8. und 11. Monat sank der Spiegel leicht ab,
um schließlich etwa den Wert 500 zu erreichen.
Man sieht, daß das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht, während der gesamten Lactationsperiode
einen hohen Antikörperspiegel zu erzielen, ohne daß die geringste Störung des Gesundheitszustandes der
Kühe beobachtet wird.
Während dieses ganzen Zeitraumes erhielt man durch zweimaliges tägliches Melken am Morgen
und am Abend etwa 16 bis 17 1 Milch je Kuh, die
Milch wurde bei +4"C aufbewahrt und (lic Morgenmilch mit der Abendmilch vereinigt.
Hierauf wurde die Sahne mit Hilfe einer Milchschleuder bekannter Bauart abgetrennt.
Dann wurde aus der täglich gewonnenen Milchmenge das Kasein ausgefällt, indem die Milch z. B.
durch Zusatz von Lab gemäß der bei der Käseherstellung gebräuchlichen Verfahren koaguliert wurde.
Man kann das Kasein auch durch Zusatz von 10%iger Essigsäure ausfällen.
Zur Kontrolle wurde der Antikörperspiegel des Milchserums bestimmt.
Um die Lactoglobuline zu erhalten, wurden 300 g/l
pulverisiertes Ammoniumsulfat zugesetzt und der pH-Wert auf 5,8 bis 6 eingestellt, indem je nachdem
entweder verdünnte Sodalösung (1 :10) oder verdünnte Salzsäure (1:10) zugesetzt wurde.
Die Lactoglobuline flockten aus und wurden auf einer Filterpresse gesammelt und anschließend durch
Abpressen zwischen Filterpapier getrocknet und vom Ammoniumsulfat befreit. Hierauf wurde bei 4° C
gegen reines, fließendes Wasser unter Verwendung eines Dialysatorschlauchs dialysiert.
Nach 4- bis 5tägiger Dialyse war das Ammoniumsulfat abgetrennt, und die Paste wurde wieder flüssig.
Hierauf wurde die verbliebene Flüssigkeit zentrifugiert und zur Sterilisation über eine Cellulose-Asbest-Platte
filtriert.
Die Proteinkonzentration der so erhaltenen Flüssigkeit wurde auf 5 bis 10% eingestellt. Es wurden
5 g NaCl je 1000 und 20 g Glycokoll je 1000 zugesetzt und das Gemisch bei — 300C lyophilisiert.
Das erhaltene Pulver war das rohe Ausgangsmaterial. Die Ausbeute betrug etwa 1 bis 2 g lyophilisiertes
Pulver je Liter Milch.
Nachstehend werden zwei Varianten der Konditionierung dieses Ausgangsmaterials zur therapeutischen
Verwendung angegeben.
Gemäß der ersten Variante wurden 150 g Pulver mit 300 g Rohrzucker vermischt und in 100 Beutel
je 4,5 g abgefüllt. Die Beutel waren aus mehreren undurchlässigen Plastikfolien hergestellt, da die
Lacto olobuUne außerordentlich hygroskopisch
sind. k
' Gemäß der zweiten Variante wurden Suppositorien hergestellt, indem 0,4 g Lactoglobulin als trocknes
Pulver mit 0,60 g einer Suppositorienmasse auf der Basis eines gehärteten Öls in an sich bekannter Weise
zusammengeschmolzen und die Masse in Spezialformen
ausgegossen wurde.
Die tägliche Verabfolgung des Inhalts der zuvor genannten Säckchen an kleine Kinder während der
auf die Pockenschutzimpfung folgenden 15 Tage führte zu einer starken Verminderung der fieberhaften
Erscheinungen in der Umgebung der Impfstelle.
Außerdem wurden bei den 20 in dieser Weise behandelten Kindern keinerlei Komplikationen beobachtet,
während die zum Vergleich unbehandelten 20 anderen Kinder starke Fiebererscheinungen aufwiesen.
Mit den nach der genannten Verfahrensweise erhaltenen Suppositorien wurden Hasen vorbeugend
behandelt, und es wurde hinterher keinerlei Reaktion auf den Impfstoff beim Impfen durch Skarifikation
beobachtet.
Dieselben Suppositorien bewirkten, wenn sie Kindern verabfolgt wurden, eine starke Verminderung
der die Pockenimpfung begleitenden Fiebererschei-
Zur Durchführung von Vergleichsversuchen wurden drei Kühe mit einer Formolsuspension von Escherichia
coli immunisiert, wobei die Serotypen 0:78,
0:8, 0:9, 0:115, 0:117 und 0:35, eingestellt auf 300 · 109 Bakterien/cm3, verwendet wurden. Jede Kuh
erhielt intramuskuläre Injektionen in den nachstehend angegebenen Zeitabständen und Mengen:
IO
| • 1. Injektion | l.Tag | 5 cm3 |
| 2. Injektion | 5. Tag | 10 cm3 |
| 3. Injektion | 10. Tag | 15 cm3 |
| 4. Injektion | 15. Tag | 20 cm3 |
| 5. Injektion | 18. Tag | 25 cm3 |
| . 6. Injektion | 21. Tag | 30 cm3 |
| 7. Injektion | 25. Tag | 35 cm3 |
| 8. Injektion | 28. Tag | 40 cm3 |
| 9. Injektion | 31. Tag | 45 cm3 |
| 10. Injektion | 35. Tag | 50 cm3 |
| 11. Injektion | 40. Tag | 55 cm3 |
20
Am Ende dieser Immunisierungsperiode wurde die Periode der Produktion von Antikörpern eingeleitet,
indem der ersten Kuh alle 14 Tage in die rückwärtigen Milchdrüsen 10 cm3 der oben angegebenen
Bakteriensuspension injiziert. wurden. Die zweite Kuh erhielt wöchentlich eine subkutane Injektion
von je 35 cm3 derselben Suspension, und die dritte Kuh schließlich erhielt alle 14 Tage die Injektion
in die rückwärtigen Milchdrüsen und jede Woche die subkutane Injektion, wie sie der ersten und der
zweiten Kuh verabfolgt wurden.
Der Antikörperspiegel in den Sera und den Lactoglobulinen wurde bestimmt, indem die Schutzwirkung
zum Vergleich gegenüber dem Serunischutz an Mäusen . bestimmt wurde.
Die Serumverdünnungen wurden etwa 16 g schweren
Mäusen intraperitoneal injiziert und 1 Stunde später Suspensionen von Escherichia coli, deren
Stärke der 2fachen Mindeststerblichkeitsdosis entsprach, auf dieselbe Weise injiziert. Zum Vergleich
wurden anderen Mäusen normales Rinderserum oder Milchserum injiziert.
Die Verdünnung des Milchserums und des Serums, mit dem 50% der Mäuse geschützt wurden, ist in
der nachfolgenden Tabelle angegeben.
Diese Versuche ergeben, daß die Injektion von Antigenen iri die rückwärtigen Milchdrüsen in keiner
Weise die Milchproduktion beeinträchtigt, während durch die Injektion in den Zitzenkanal die Produktion
stark verringert wird.
Aus -den Ergebnissen in der Tabelle ergibt sich weiter, daß durch die der ersten Kuh verabfolgten
Injektionen von Antigenen in die rückwärtigen Milchdrüsen der Antikörperspiegcl im Milchserum erhöht
und auf dem erhöhten Stand gehalten wird, während die der zweiten Kuh verabfolgten subkutanen Injektionen
den Antikörperspiegel im Milchserum weder erhöhen noch ihn aufrechterhalten und daß schließlich
der Antikörperspiegel im Milchserum der dritten Kuh nicht höher ist als der der ersten Kuh.
Hyperimmunisationsperiode
15
Tag
21
21
25 .15
Periode der Aufrcchlerhaltung der
Immunisation
55
65
Tag
90
90
105
120
Erste Kuh
Serum
Serum
Milchserum
Zweite Kuh
Serum ....:
Serum ....:
Milchserum
Dritte Kuh
Serum
Milchserum
1/2
0
0
1/4
0
0
1/2
0
0
1/2
1/4
1/4
1/4
1/4
1/4
1/2
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1/4
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1/16
1/16
1/4
1/16
1/16
1/2
1/16
1/16
1/2
1/32
1/32
1/4 1/32
1/2 1/32 1/8
1/256
1/256
1/8
1/256
1/256
1/8
t/256
t/256
1/8
1/512
1/512
1/8
1/256
1/256
1/8
1/512
1/512
1/32
1/512
1/512
1/64
1/256
1/256
1/128
1/512
1/512
1/32
1/1024
1/1024
1/32 1/1024
1/32 1/1024*
(Injektion in die rückwärtigen Milchdrüsen)
1/64
1/256
1/256
1/64' 1/256
1/128 1/128
(subkutane Injektion)
1/128 1/1024
1/128 1/1024
1/128 1/1024
Die angegebene Zeit ist von der ersten vorgenommenen Injektion an gerechnet.
(subkutane Injektion und Injektion in die rückwärtigen Milchdrüsen)
Hieraus folgt, daß durch die Kombination der beiden Injektionsweisen für das Antigen, d.h. der
subkutanen Injektion und der Injektion in die rückwärtigen Milchdrüsen, die Ausbeute der Antikörperproduktion
nicht verbessert wird.
Die nach der letztgenannten Verfahrensweise erhaltenen Lactoglobulinc können gemäß der Arbeitsweise
von Beispiel 1 abgetrennt werden. Wenn sie in einer Menge von 20 cm3 einer 5%igen sterilen Lösung
jungen Kälbern parenteral verabfolgt werden, bewirken sie einen wirksamen Schutz gegen die Hautinfektionen
dieser Tiere, die, wie man.weiß, häufig tödlich
, verlaufen und daher starke Verluste des Viehbestandes bedingen.
Claims (3)
1. Verfahren zur Herstellung von immunisierenden Lactoglobulinen, dadurch gekennzeichnet,
daß man zunächst ein Rind, insbesondere eine Kuh, durch Skarifikation öder
Injektion eines Antigens immunisiert, worauf man periodisch dasselbe Antigen in die rückwärtigen
Milchdrüsen injiziert und die Milch des Rindes gewinnt und daraus gegebenenfalls die Lactoglobuline
isoliert.
2, Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man dem Rind eine Ruhepause von etwa 2 Monaten zwischen der Immunisierungsperiode und der Periode der Produktion der
Läctoglobuline gewährt.
3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man während der
Periode der Produktion der Läctoglobuline wöchentlich einmal eine Injektion des Antigens
in die rückwärtigen Milchdrüsen vornimmt.
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