DE1598833A1 - Diagnostikum zur Bestimmung von Pakreas-Enzymen in Koerperfluessigkeiten - Google Patents

Description

* Abi. April 1967

Neue Anschrift: 2 HAMBURG 52 Hew Address: Giesestr.8, Postfadi 520 580

Dr. H. Meys ^{TtbhB 892803}

Patentsnwältin · 5 Köln-Braunsfeld 2

' Aaohener Straße 663

Postfach iea

7. April 1967 Anmelder? Dr»Dr.Jürgen Meyer-Bertenrath Marburg, Medizinische Universitäts-Poliklinik Robert-Koch-Strasse "Ja.

meine Akte: 421

Diagnostikum zur Bestimmung von Pankreas-Enzymen in Körperflüssigkeiten

Die Erfindung bezieht sioh auf ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Pankreas-Enzymen, insbesondere der Lipase und des Ghymotrypsins in Körperflüssigkeiten, wie Duodenalsaft und Blut.

Die Pankreas-Enzyme haben entscheidenden Einfluß auf den Stoffwechsel; die Pankreas-Lipase beispielsweise ist das für die Fettverdauung wichtige Enzym, mit dem beim Verdauungsvorgang Pöttsäureester, insbesondere Triglyceride, in Alkohol- und Bäurekomponenten gespalten und damit in eine resorbierbare Form überführt werden. Die Diagnostik von Pankreaserkrankungen hat bisher auf zuverlässige, rasch und einfach durchführbare Bestimmungen der Pankreas-Enzym-Konzentrat Lonen im Duodenalsaft bzw. Blut verzichten müssen. Bei der bisher bekannten Methode zur Prüfung beispielsweise der Pankroas-Lipase-Aktivltät ist es notwendig, zunächst den zu prüfenden Duodenalsaft mittels einer vom Patienten zu

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schluckenden Sohlauchsoride zu entnehmen. ISrst der so gewonnenen Körperflüssigkeit konnte dann definiert ein Substrat., z.B. Triolein oder Tr-ibutyrat, zugesetzt und das Gemisch Inkubiert werden. Die dabei durch die ..ünzymwirfcung freigesetzten Fettsäuren wurden anschließend analytisch, beispielsweise titrimetrisch, bestimmt. Abgssehen davon, da.3 die Entnahme von Körperflüssigkeit mittels S :hlauchsonde unangenehm und aufwendig ist, enthält diese bekannte Methode zahlreiche Fehlerquellen, so daß die damit gewinnbaren Testwerte mit einem relativ hohen Uligenauigkeitsfaktor belastet sind.

In der theoretischen Forschung sind Fluoreszeinester mit Essig-, Propion-, Chlorpropion-, Butter-, Valerian- und 'oder Capronsäure zur Charakterisierung biochemisch interessierender thermodynamisch^!' und kinetischer iCrizymkonstanten eingesetzt worden, wobei die Aktivitäten verschiedener Enzyme, z.B. Steapsin, Schweinepankreaslipase, Weizenkeimlipase, Acylase und Chymotrypsin miteinander verglichen wurden. In diesen Versuchen wurden die gereinigten Enzyme in Pufferlösung'en, die als Substrat Fluoreszeinester enthielten, inkubiert, und die Hydrolyse des Esters wurde an der durch das freiwerdende- Fluoreszein hervorgerufenen Fluoreszenz analytisch erfaßt. In keinem Falle ist bei dieser bekannten Methodik mit Körperflüssigkeiten in nativer Zusammensetzung gearbeitet worden; vor allem sind keine Versuche bekannt, die eine Anwendung der Fluoreszeinester in der klinischen Diagnostik darlegen. Die bisherige Fragestellung bezog sich auf rein theoretische Aspekte.

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Es ist das Ziel der vorliegenden Erfindung, die bestehende Lücke in der Fankreasdiagnostik in sowohl zuverlässiger als auch einfacher Weise zu schließen.

Diese Aufgabe wird gelöst mittels des erfindungsgemäßen Diagnostikums zur Bestimmung von Pankreas-Enzym-Konzentrationen in Körperflüssigkeiten, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es aus einem Gemisch eines Fluoreszein-Diesters einer Fettsäure mit 8 bis 16 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise eines Diesters der Laurin- oder Myrisfcinsaure, mit einer Puff er subs tanz, wie Na₂HPO₂J/12 HgO und/oder NaH₂PO^ «HgO, in einer Menge von etwa 0,30 bis 0,40 m Mol des Fluoreszein-Diesters je 400 bis 450 mg der Puffersubstanz besteht.

Man kann das erfindungsgemäße Diagnostikum in im wesentlichen * zwei grundsätzlich verschiedenen Arten anwenden. a) Das für Routineuntersuchungen am besten geeignete Verfahren besteht in der peroralen Applikation des erfindungsgemäßen Diagnostikums, das zu diesem Zweck vorteilhaft portionsweise in magen- oder dünndarmlöslichem Kapselmaterial eingekapselt eingesetzt wird. Da der im erfindungsgemäßen Diagnostikum enthaltene Fluoreszein-Diesfcer wasserunlöslich und als Ester nicht resorbierbar ist, hat dieser Bestandteil des erfindungsgemäßen Diagnosti kums in dieser Hinsicht die Eigenschaften der natürlichen Nahrungsfette und kann wie diese erst nach der Hydrolyse der Ssterbindungen durch die Pankreasenzyme in Form der

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Alkohol- und Säurokcmponenten resorbiert werden. Die alkoholische Komponente, die dabei aus Fluoreszein besteht wird na^ii ihrer Resorption irn Blut und 'oder Urin durch Messung der Absorption und/oder der Fluoreszenz nachgewiesen.

Vergleichende Untersuchungen haben erkennen lassen, c?a-· eine der Enzym-Konzentration proportionale Men_:~e an Fluoreszein freigesetzt wird u.id weder die Enzymwirkunc noch die Fluoreszeiribildung durch die übrigen in der Körperf lässig ce it iit.-ben den Pankreas-Enzymen vorhandenen Enzyme beeinträchtigt oder verfälscht wird. Dabei wurde gefunden, daß die Pankreasenzyiriempf indliehkeit der Fluoreszeinester in der Körperflüssigkeit bei Verabreichung vcrgJeiehoarer Mengen tuJt steinender Kc?tt.jnl'!n_;;;o der mit dem Fluoreszeinmolokül vei'estei'tv.n Fettsäuren ein Optimum durchlauft; bei Ivinsat;^ von Estern der Fettsäuren mit relativ niedriger Anzahl von 'vohlenstoi'fatomen, beispielsweise 3 ujid .IO C-Atomen, wire unter pjlk,iehe:i Un'i^?rsuchu:\^f_';sbedinr;un ;en die maxiniale Fluor^s"einuiidun;-; zwjlv nach relativ kurzer KiiiwirkuJigsdauer, etwa 1,'ί bus I. Stunden, erreicht, jedoch J-Je₁^b da ο Μαχίϋ,ιιΐιι ::ieht· ils haJi» so nicdi'ii" wie beisiM'.clswoiije ne i dem Piaster (ior Ixiuriiis"ure. Unif.'ekehrt findet mau ooi Liiitoi'suchui^en der Diester der Fettsäuren mit 1.^ iris Iu C-Atomen die opiimalt^ Fluüi'eszein-Frei setzuil·.; erst nach 1'i.ti/^ei'er V.rsuchsdaut-i·, etwa ('■> bis 7 Stunden, und das Maximum luv;t etwa ebenso nledi'lis wie das bei Verwendung der kUrzerketui^en Fettsäuren ermittelte. Je nachdem, welche Empfindlichkeit für einen speziellen Einzelfall für die Diagnostik er-

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wünscht ist, kann man die spezifisch dafür geeigneten

Fettsäureester einsetzen. Beispielsweise kann in der " M·

klinischen Diagnostik eine zu hohe Empfindlichkeit uner- -,^ <

wu.ischt sein, wenn es darum geht, kleine Unterschiede in ':.:'■■' "

dan Enzym-Konzentrat ionon zu ermitteln. Tn diesem Falle ^:\^:'"\ί

wird man vorteilhaft im erfindungsgem'v3en Diagnostikum ■■/.:.V'^

(!•^n Fluoroszein-di-riiyristirisäureoster einsetzen. Soll, ','■' ...

..oiapiclsweis« be:" Routineuntersuchungen, das ,irgebnis \^:^[,,}'■■{

in möglichst -Lürzer ZeIL vorliegen, dann ist es vorteil- ^{: l!}-:^: ^

ii'iftj dar·; :irf inuun^s^em'"^ Diagnostikurn mit dem Diester - ;■',':'■ der Lau r ins nur ο zu vürvrjndon. Die relativ kurze Dauer dor

Prüf methode i,it beir;i ui'f Ltidunssgemu'ien Diagnostücura des- ■■,*■.'...; Vy·.

v!;^on möglich, v;eil, wiu ix-obachtet wurde, das durch die ' :·;ί

Pan-:reas-inzyme im Ducxlonalsaft fruigos.jtzte Fluoreszein '^:'; : ;:

offensichtlich in hohem Flaue harnpflichtig Ist und sehr ^:.<·'■■"'] ^!

S'jiinoll durch die lliore eliminiert wird. Die Tewtergeo- ■λ^'¹'·"'

:'.inse lassen sich durch ..Erhöhung dor T .'Stdosis und durch ■■^■■^^:'

kontrollierte Variation der Ausscheidungszeiten verändern, .^:/y·,:/^'*

so daß aucii solche- Ester in dom erfindungngetnäßen Diag- -'^νΡ^;ί;'ί

nostikum verwendbar sind, mit denen.man in geringeren ,:·„ f:b

i'l ;ngen und kurzer Testdauur keine optimalen Testorgebnis- _;;^;

so erzielt. Dies hat insbesondere den Vorteil, daß man \ i

das erfindungsgemüß·; Diagnostikum ßegebenenfalls einzel- -: vj-y'v

non Spezialfüllon angepaßt einstellen kann. z¹*^ i^

D'.-r erreichte technische· Fortschritt besteht weiterhin ^Jf"

darin, dai.i auf das zeitraubende und aufwendige Abziehen ^;"TFi!

von Duodena Isaf t mittels einer vom Patienten zu schlucken- -'W;^

ei ο'η Sclilauchsonde auf jedem Fall verzichtet werden kann. '-:.:'s$

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Da Resorptions- und Aussehwidungsstörungen die jirfassung der durch Pankreas-Enzyme freigesetzten Fluoresneinmengen beeinträchtigen können, kann 35 von Nutzen sein, durch eine zeitlich verschobene Verabreichung einer'der Testdosis an Pluoreszeiriester "quimolaren Menge uriveresterten Pluoreszeins den für den einzelnen Patienten zutreffenden individuellen 100;«-Wert festzulegen und die durch die ünzymwirkung erreichte Pluoreszeinfreisetzung darauf zu beziehen.

In der beiliegenden Zeichnung ist die Wirksamkeit des erflndungsgemäGen Diarjnostikums beispielsweise veranschaulicht. J.S zeijeri:

Fig. 1 Die Ausscheidung von Fluoreszein (Ordinate:

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10 mMol) nach oraler Verabreichung einer Ming von 0,005 mMol pro kg Körpergewicht des erfindungsgeinM-'en Diagnostikums in Abhängigkeit ion der Zeit (Abszisse), Parameter ist die Ketten 1"'^e der 7ettsäurekomponente in dem Diester,

Fig. 2 Verlauf der Ausscheidung von Fluoreszein (Ordinate) nach Verabreichung eines erfindungsgemäßen Diagnostikums, das Fluoreszein-di-laurinester enthält, In Abhängigkeit von der Zeit (Abszisse).

' I.ix eiiUJi¹ Huri ;υ von 0,00;i ί.ιί-ΊυΙ ..istor je ic;-;

KürpiH'guv/lcliU
Aus Piß. 1 erkennt man, daß das Maximum der Ext inlet ion bei

einer Wellenlänge von 492 ni/U bei Verwendu.ig von einem

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Fluoreszein-di-laurinsäureester enthaltenden erfindungs-Γ·; ο mäße η Diagnostikums mehr als doppelt so hoch liegt als bei Verwendung eines sowohl Cn-Fettsäure-Diester als auch Cjh-F-jttsüure-Diester enthaltenden Diagnostikums. Die integrale Fluoreszein-Fi-eiSetzung nach 6 bis 10 Stunden ist in der nachfolgenden Tabelle wiedergegeben. Dabei ist die Ausscheiduni; in Prozent von je 0,005 rnMol Ester je kg Körpergewicht, als 100 ,■■> berechnet, bezogen.

Tabelle

^C8 ^Cl0 ^C12 ^Cl4 ^Cl6 nach 6 Std. 11 ,J- 14,2 % 17,3 $ 7,0 % 1,3 yo

nach 10 Std. Ij5,2 ο YJ₃O £ 21,3 ,ν 3^,4 >& 1,5 ^:p

Aus ?ig. 2 erkennt man, da.3 di^ Fluoreszein-Konzentration im Urin.nach oraler Verabreicliung eines erfindungsgemä:3en Diagnostikums, das 0,005 mMol an ^luoreszein-di-laurinester je kg Körpergewicht enthielt, nach einor Wirkungsdauer von rund 2 Stunden den optimalen Wert erreicht, was dieses Diagnostikum besonders geeignet f^:ir Reihenuntersuchungen macht.

^ii.e weitere Methode, mit uer das erfindungsgemäße Diagnostikum vorteilhaft anwendbar ist, wird nachfolgend beschrieben:

b.) Da ein kleiner Anteil der Pankreasenzyme direkt von den Pankreaszellen in das Blut übertritt, was insbesondere bei einer pathologischen Erhöhung der Permeabilität der Zeil-

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illllli

membranen, ζ.3. bei Pankreatitiden, eier Fall 1st, -rönnen c.ie Paniereasenzyme im Blut durch Inkubation von Plasma oder Gerum mit einer zugesetzten Lösung des erfincun^o-Pjemäßen Diagnostikums, die vorzugsweise durch Aufschlämmen und Oder Lösen in VJasser, insbesondere in einer Menge von 10 ml, erhalten wird, an der spektrophotometriser und 'Oder fluorometrisch erfaßbaren Hcnr;e des freigesetzten Fluoreszeins erkannt und quantitativ bestimmt v/erden. Die Fluoreszein-Difettsäureester sind farblos und fluoreszeieren nicht.

!'•'lan kann das erfindungsgemiiße Dia^nosoikum, sofern dies gewünscht wird, auch mit üblichen Füllstoffen tu/olottierc oder als Dragee einsetzen, und es Jst ferner ohne vie.'.u^ros möglich, übliche Färb- und/oder Gesciin.acksstoffο zuzusetzen.

Als besonders vorteilhafte Puffursuostanz-Xoi.ibinat lon hut sicji eine J'üisohung aus 419 t'iß NapHPG,,' 12 Ιί-,0 und 9 W-JaH₀POu *H₀ö erwiesen. Wenn man das erf

ikUi!, mit dieser Mischung in Gemisch mit 0,">'λ mMol dos betreffe.iden Fluoreszein-Diesters einsetzt, dann ov-Ii'ilt man nach Zugabe von 10 ml Wasser das erfindunf^s.-jem".ia IJiacnostii.um m.i L dem im Duodenum vorherrschenden pH-Wert von 8,0.

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0 Q 9 8 U7_p 3 1 β

Claims (1)

1. Patentansprüche

   . y

   I. Diagnostikum zur Bestimmung von Pankreasenzymen, insuosondere der Lipase und des Chymotrypsins in Korperflüssifv-ceiten, dadurch gekennzeichnet, dai3 es aus einem Gemisch eines Fluoreszein-Diesters einer Fettsäure, vorzugsweise oi.ijs Diesters der Laurin- oder Myristinsäurc, mit einer Pufi'erauüstanzi wie Ha₂HPO₁^ 12 HgO und /oder NaH₂PO₂^ H₂O, in cinsr Men^e von 0,3?0 bis 0,4ü mMol des Fluoreszein-Di-

   esters je 400 bis 4^0 mg der Puff er substanz besteht.

   2. Diagnostikum nach Anspruch 1, dadurch gekenn-

   zeichnet, daß es in magen- und/oder dünndarmlöslichem Kapsel-.-natorial eingekapselt vorliegt.

   jj. Diagnostikurn nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es mit üblichen Füllstoffen tablettiert oder

   als Dragee vorliegt. ;

   4. Diagnostikurn nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es aufgeschlämmt und/oder gelöst in Wasser, Vorzugs-

   v/eise 10 ml Wasser, vorliegt.

   l,. Diagnostikum nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es übliche Färb- und /oder Geschrnacksstoffe

   enthält. · . Ji₁ ¹

   BADORIGiNAL "9" QQ9844/Q318 '" IJ