DE1493249B

DE1493249B - 2-Desoxy-2,3-dehydro-N-acyl-neuraminsäuren und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE1493249B
Authority: DE
Inventors: Peter Dr.; Tuppy Hans Dr.; Wien Meindl
Original assignee: Dr Karl Thomae GmbH
Current assignee: Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co KG

Description

nach Lucas & Pressmann (Ind. Eng. Chem. Anal. 10 [1938], S. 140), die UV-, IR- und NMR-Spektren mit der angegebenen Formel im Einklang. So zeigen die NMR-Spektren in D₂O-Lösung eindeutig ein olefinisches Wasserstoff atom, die UV-Spektren ein Absorbtionsmaximum bei 235 nm, das einer α,/3-ungesättigten Carbonyl-Verbindung entspricht.

Die Säuren können nach bekannten Methoden in ihre Salze mit anorganischen oder organischen Basen übergeführt werden, beispielsweise in ihre Alkali- oder Erdalkalisalze oder in Salze mit tertiären aliphatischen Aminen.

Die als Ausgangsstoffe verwendeten 2-Chlor- und 2-Brom-4,7,8,9-tetra-O-acyl-N-acetyl- oder -(O-acylglykolyl)-neuraminsäuren können durch Peracylierung der entsprechenden N-Acyl-neuraminsäure und anschließende Umsetzung mit wasserfreiem Chlorwasserstoff oder Bromwasserstoff erhalten werden. Da diese Verbindungen sich beim Stehen zersetzen, empfiehlt es sich, nur frisch hergestellte Ausgangsstoffe einzusetzen. Die erforderliche N-Acetyl-neuraminsäure kann aus Meconium (Kindspech) nach dem Verfahren von Zilliken u. a. (Biochem. Preparations, Bd. 7,1960, S. 1) erhalten werden, die N-Glykolyl-neuraminsäure aus Schweinesubmaxillarismucin nach dem Verfahren von G. B 1 i χ u. a. (Acta Soc. Med. Upsalien, Bd. 61, 1956, S. 1).

Die neuen 2-Desoxy-2,3-dehydro-N-acetyl- oder -neuraminsäuren besitzen interessante und wertvolle biologische Eigenschaften. So hemmen sie beispielsweise sowohl virale als auch bakterielle Neuraminidase schon in 1 bis 2 · 10-⁵molarer Konzentration zu 50 °/₀.

Als Hemmstoff für Neuraminidase wurde bisher nur N-Acetyl-D-neuraminsäure bekannt. E.Mohr (Z. Naturforsch., Bd. 15b, [1960], S. 575) hat die Hemmung der Vibrio cholerae Neuraminidase näher untersucht. Er erhielt eine Reduktion der ursprünglichen Enzymaktivität auf 50% mit 3 · 10-³molarer N-Acetyl-D-neuraminsäure. Vergleichsweise wurde eine 50%ige Aktivitätsverminderung des V. cholerae Enzyms schon mit 1 · 10-⁵molarer 2-Desoxy-2,3-dehydro-N-acetylneuraminsäure und 2-Desoxy-2,3-dehydro-N-glykolylneuraminsäure erzielt (vgl. Tabelle 1 und 2). Die erfindungsgemäß hergestellten Substanzen sind demnach wesentlich wirkungsvollere Neuraminidaseinhibitoren als N-Acetyl-D-neuraminsäure. Die Versuche wurden in folgender Weise durchgeführt:

Als Substrat für das Enzym wurde Neuraminyllactose in die Hemmversuche eingesetzt. Neuraminyllactose und Inhibitor wurden in einem Maleinsäure-Natronlauge-Puffer (0,1 m), pH 6,4, der 0,02molar an Ca-Ionen ist, in geeigneten Konzentrationen gelöst und in das Teströhrchen einpipettiert. Es wurde mit Puffer auf 0,70 ml aufgefüllt und 15 Minuten bei 37° C bebrütet. Nun wurden 0,30 ml einer standardisierten Enzymlösung zugesetzt und 1 Stunde bei 37° C bebrütet. Als Kontrollbestimmungen wurden gleichzeitig und unter denselben Bedingungen ein Spaltungsversuch mit Neuraminyllactose und eine Neuraminyllactose enthaltende Probe mitgeführt. Alle Versuche werden als Doppelbestimmung ausgeführt. Die aus dem Substrat enzymatisch freigesetzte N-Acetylneuraminsäure wurde mittels der von P. M e i η d 1 und H. T u ρ ρ y, Mh. Chem., Bd. 97 (1966), S. 990, beschriebenen Farbreaktion quantitativ bestimmt. Ihre Menge ist ein Maß für die Geschwindigkeit der enzymatischen Hydrolyse. Das Ausmaß der Enzymhemmung (vgl. Tabelle 1 und 2) ergab sich aus den Geschwindigkeiten der enzymatischen Hydrolyse des Substrats in Gegenwart (vl) und Abwesenheit (v₀) des Inhibitors:

°/o Hemmung =	= 100 · (1	- vJ/vo) .	Tabelle 1	1 · 10-³	Tabelle 2	2 · ΙΟ"³	9,1 · 10-"	1,8 · ΙΟ"³
		95	2-Desoxy-2,3-dehydro- N-glykolylneuraminsäure c in Mol/l	98	98	99
2-Desoxy-2,3-dehydro- N-acetyl-neuraminsäure c in Mol/l		95		73	96	88
		52	1 · 10-³	44	60	47
1 · 10-³		1 · 10-⁴
1 · 10-⁴		1 · 10-⁵	Enzymhemmung in % bei einer Konzentration von Neuraminyllactose (Mol/l)
1 · 10-⁵			6,1 ■ 10-"
			94
Enzymhemmung in °/₀ bei einer Konzentration von Neuraminyllactose (Mol/l)		89
5 · ΙΟ"⁴		49
100
90
45

Ferner wird das Wachstum von Influenzavirus, Stamm Melbourne, auf der aus Hühnereiern isolierten Chorioallantoismembran durch 2-Desoxy-2,3-dehydro-N-acetyl-neuraminsäure signifikant gehemmt. Mit »Flumidin« (N¹,N¹-Anhydrobis-(j3-oxyäthyl]-biguanidhydrochlorid), einer als Virusstatikum im Handel befindlichen Substanz, konnte im gleichen Testsystem keine meßbare Hemmung der Virusvermehrung erzielt werden. »Flumidin« wirkt jedoch deutlich cytotoxisch, was zum langsamen Absterben der Zellmembranen führt. 2-Desoxy-2,3-dehydro-N-acetyl-neuraminsäure zeigt diese unerwünschte Nebenwirkung nicht. Die Versuche wurden in der nachstehend beschriebenen Weise durchgeführt:

Aus 11 Tage lang bebrüteten Hühnereiern wurden Chorioallantoismembranen isoliert. Etwa 2 ecm große Stückchen dieser Membranen wurden 48 Stunden bei 37° C in 1 ml Earle's gepufferter physiologischer Kochsalzlösung in Gegenwart des Hemmstoffs (in geeigneter Konzentration) und des Influenza-Α-Virus (Stamm Melbourne; Virusverdünnung: 1:1000) bebrütet. Die Kontrollansätze enthielten keinen Hemmstoff. Nach beendeter Bebrütung wurden die Überstände mit frisch bereiteten Hühnererythrocyten titriert. Die Hämagglutinations-Titration erfolgt auf Salkschen Platten in der üblichen Weise. Die Ablesung des Hämagglutinations-Titers erfolgte in Mog-Einheiten. Die Hemmung des Viruswachstums wurde zunächst als die Differenz der Mog-Einheiten gegenüber den Kontrollansätzen ermittelt und sodann in Prozent-Hemmung umgerechnet.

Tabelle 3

Substanz

2-Desoxy-2,3-dehydro-N-acetyl-D-neur-

aminsäure

»Flumidin«

Hemmung der

ävermehrung in

einer Konzentration der

Substanz in Mol/l 1-10-³ I 1-10-* I 1-10-⁵

100
0

50 0

5 6

Die neuen Verbindungen verhindern außerdem die reagierende Eluat wird zuerst bei 40° C im Vakuum auf

Agglutination von Rh₀D-Erythrocyten durch ein spezi- ein kleines Volumen eingeengt und dann gefrierge-

fisch.es RhoD-Antiserum. trocknet. Man erhält in quantitativer Ausbeute die

Bei den nachstehenden Ausführungsbeispielen, die amorphe 2-Desoxy-2,3-dehydro-4,7,8,9-tetra-O-acetyl-

die Erfindung näher erläutern, wurden sämtliche 5 N-acetyl-neuraminsäure.

Schmelzpunkte auf einem Heiztischmikroskop nach _{Elementaranalyse:} (C₁₉H₂₅O₁₂N) 459,42.

^K^^fi^er _l^^eStl,^{Dmt;dieWertederElemeilt}^^ran^^Sen Berechnet ... C 49,68, H 5,49, N 3,05%;

sind das Mittel aus zwei Bestimmungen. Die Dunn- aefnnHen nn« w < ^s xr?x8o/

1 - -, 1 1 ο -rr · λ .. 1 ^ gClUIlUCIl ... K^ 4-y,JJ, Li J,DO, J.N Z,OO In.

schichtchromatogramme wurden auf Kieselsauregel G

nach Stahl (Merck) mit dem Laufmittel n-Buta- 10 Zur weiteren Charakterisierung kann auch der

nol zu n-Propanol zu 0,In-HCl, 1:2:1 (v/v/v), die 2 - Desoxy - 2,3 - dehydro - N - acetyl - neuraminsaure-

Papierchromatogramme auf Schleicher-&-Schüll-Pa- methylester dienen:

pier 2043 a in dem Laufmittel Äthylacetat zu Eisessig 442,5 mg 2-Desoxy-2,3-dehydro-N-acetyl-neuramin-

zu Wasser, 3:1:3 (v/v/v) ausgeführt. Entwickelt säure werden in 8,0 ecm absolutem Methanol gelöst

wurden die Dünnschichtchromatogramme mit kon- ₁₅ und mit einer Lösung von Diazomethan in Äther bis

zentrierter H₂SO₁ZWaSSeT, 1:1 (v/v), die Papier- zur bleibenden Gelbfärbung versetzt. Hierzu waren

chromatogramme mit Natriummetaperjodat und Ben- 220 ecm der ätherischen Diazomethanlösung erforder-

zidin- Die R/-Werte wurden auf den R/-Wert der lieh. Eine flockige Fällung, die sofort auftritt, wird

N-Acetyl-D-neuraminsäure gleich 1,00 bezogen. über »Hyflo-Supercell« abgetrennt. Das nun klare,

20 leicht gelbliche Filtrat wird mit 10 ecm absolutem

Beispiel 1 Äther versetzt und über Nacht im Eisschrank bei 4° C

2-Desoxy-2,3-dehydro-N-acetyl-neuraminsäure stehengelassen Der Methylester der 2-Desoxy-2,3-de-

nydro-N-acetyl-neurammsaure scheidet sich als farb-

331 mg frisch bereitete 4,7,8,9-Tetra-O-acetyl-N-ace- loses Kristallisat ab. Man saugt ihn ab und kristallityl-2-chlorneuraminsäure werden in 6 ecm absolutem 25 siert ihn aus siedendem absolutem Methanol um. Die Dioxan gelöst. Diese Lösung wird mit 300 mg Silber- Ausbeute beträgt 207,4 mg (44,8 % der Theorie) carbonat und 500mg wasserfreiem Calciumsulfat F. = 225 bis 227⁰C, bei 213°C beginnendes Sintern. (Drierit) versetzt. Es wird unter kräftigem Rühren „, _{TT n} „,
90 Minuten auf 80 bis 90⁰C erwärmt. Nachdem das Elementarenalyse: (C₁₂H₁₉O₈N)^305 29
Reaktionsgemisch abgekühlt ist, wird mit 10 ecm 30 Berechnet · ■ · C 47,21, H 6,27, N 4,59%;
Wasser versetzt und über handelsüblichem Kieselgur gefunden ... C 47,06, H 6,5/, JN 4,53 /₀.
(»Hyflo-Supercell«) filtriert. Das klare Filtrat wird mit . -19
5,0 ecm ln-Natronlauge versetzt und 15 Minuten bei B e 1 s ρ 1 e 1 2
4O⁰C verseift. Zur Entfernung der Kationen wird mit Wie im Beispiel 1 beschrieben, erhält man aus 170 mg überschüssigem Kationenaustauscher auf Polystyrol- 35 4,7,8,9 - Tetra - O - acetyl - N - acetyl - 2 - chlorneurgrundlage (»DOWEX 50 · 8«, H+-Form) versetzt und aminsäure und 200 mg Silberoxid in 3 ecm absolutem das stark sauer reagierende Filtrat auf eine geeignet di- Dioxan 91 mg 2-Desoxy-2,3-dehydro-N-acetyl-neurmensionierte, mit einem Anionenaustauscher auf Poly- aminsäure. Das entspricht einer Ausbeute von 91 % der styrolgrundlage (»DOWEX 1 · 8«, Formiat-Form) be- Theorie. Die erhaltene Säure ist mit der gemäß Beischickte Chromatographiesäule aufgebracht. Die 40 spiel 1 hergestellten identisch.
2-Desoxy-2,3-dehydro-N-acetyl-neuraminsäure wird an . . . *
das Austauscherharz gebunden. Man wäscht mit reich- Beispiel
lieh Wasser aus und eluiert dann die 2-Desoxy-2,3-de- 97 mg 4,7,8,9-Tetra-O-acetyl-N-acetyl-2-chlorneurhydro-N-acetyl-neuraminsäure mit 0,4 n-Ameisensäure. aminsäure werden in 1 ecm absolutem Dioxan gelöst Die ameisensauren Eluate werden vereinigt, bei 40° C 45 und mit 0,20 ecm wasserfreiem Pyridin versetzt. Man im Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt und erwärmt das Gemisch innerhalb von 25 Minuten von diese Lösung, sofern sie sich verfärbt hat, mit ein wenig 50 auf 85 ⁰C. Die Reaktionslösung färbt sich dunkel-Tierkohle behandelt. Die farblose klare Lösung wird braun. Nach beendeter Reaktion wird mit 9 ecm gefriergetrocknet. Die 2-Desoxy-2,3-dehydro-N-ace- Wasser verdünnt und nach dem Verseifen mit 2 ecm tyl-neuraminsäure fällt als amorphe, farblose Substanz 50 1 η-Natronlauge wie unter 1 a) beschrieben weiter aufan. Die Ausbeute beträgt 155,6 mg, entsprechend gearbeitet. Der gefriergetrocknete Rückstand (37 mg), 82,9% der Theorie, [<x]ff = +10,9° (c 13,4, Wassert. ein farbloses Harz, wird zur weiteren Reinigung auf Dünnschichtchromatogramm: Rna = 1,28. Whatman-3 mm-Papier mit dem Lösungsmittel Äthyl-Elementaranalyse: (C₁₁H₁₇O₈N) 291,3. acetal zu Pyridinzu Wasser, 3 :1: 3 (v/v/v) chromato-

Berechnet ... C 45,36, H 5,88, N 4,81 %; 55 graphiert. Nach dem Eluieren erhalt man 10 mg 2-Des-

gefunden ... C 44,53, H 6,37, N 4,47 %. oxy-2,3-dehydro-N-acetyl-neuraminsaure. Sie ist dünnschicht- und papierchromatographisch einheitlich und

Zur Charakterisierung wird noch die 2-Desoxy- mit der im Beispiel 1 erhaltenen 2-Desoxy-2,3-dehydro-

2,3 - dehydro - 4,7,8,9 - tetra - O - acetyl - N - acetyl- N-acetyl-neuraminsäure identisch,

neuraminsäure hergestellt: 60 .

100 mg 2-Desoxy-2,3-dehydro-N-acetyl-neuΓamin- B e 1 s ρ 1 e 1 4
säure werden mit 1,0 ecm absolutem Pyridin und 97 mg 4,7,8,9-Tetra-O-acetyl-N-acetyl-2-chlorneur-1,5 ecm Acetanhydrid versetzt und 48 Stunden bei aminsäure werden in 2 ecm absolutem Dioxan mit 4°C stehengelassen. Das überschüssige Acetanhydrid 0,15 ecm einer l,48molaren Natriummethylatlösung wird mit Eiswasser zersetzt und die klare Lösung durch 65 60 Minuten auf 80 bis 85° C erwärmt. Das Reaktionseine mit einem Kationenaustauscher auf Polystyrol- gemisch wird wie im Beispiel 3 beschrieben aufgebasis (»DOWEX 50-8«, H+-Form) beschickte Chro- arbeitet und 2-Desoxy-2,3-dehydro-N-acetyl-neuraminmatographiesäule filtriert. Das farblose, stark sauer säure isoliert.

7 8

B e i s D i e 1 5 kühlung und kräftigem Rühren mit 20 ecm absolutem

Pyridin und 20 ecm Acetanhydrid versetzt. Man läßt

104 mg 4,7,8,9-Tetra-O-acetyl-N-acetyl-2-chlorneur- das Gemisch 48 bis 72 Stunden bei +4⁰C stehen. Die aminsäure werden in 2 ecm wasserfreiem Acetonitril Peracetylierung ist vollständig, wenn die N-Glykolylgelöst und mit 116 mg Quecksilber(II)-cyanid versetzt. 5 neuraminsäure gelöst ist. Nach beendeter Reaktion Diese Mischung wird etwa 100 Minuten unter Rück- wird das überschüssige Acetanhydrid mit Eiswasser fluß gekocht. Nach beendeter Reaktion wird das Ge- zersetzt und die Lösung zur Entfernung des Pyridins misch mit 6 ecm Wasser versetzt und nach Zugabe von mit überschüssigem »DOWEX 50 · 8« (H⁺-Form) be-2,5 ecm 1 n-Natronlauge 30 Minuten auf 40⁰C er- handelt. Filtrat und die Wa>chflüssigkeiten werden wärmt. Nun wird über »Hyflo-Supercell« filtriert und 10 vereinigt und bei 4O⁰C im Vakuum auf ein kleines das Filtrat wie unter 1 beschrieben weiter aufge- Volumen eingeengt. Nach dem Gefriertrocknen isoarbeitet. Man erhält 23,6 mg (40% der Theorie) der liert man 1900 mg 2,4,7,8,9-Penta-O-acetyl-N-(O-acegewünschten Verbindung, die mit der gemäß Beispiel 1 tyl-glykolyl)-D-neuraminsäure, das sind 97 % der erhaltenen identisch ist. Theorie, als farbloses Schaumharz.

B ^e i s ρ i e 1 6 ¹⁵ Elementaranalyse: (C₂₃H₃₁O₁₆N · IH₂O) 595,5.

Wird die Lösung von 165 mg 4,7,8,9-Tetra-O-acetyl- Berechnet ... C 46,39, H 5,59, N 2,35 %;

N-acetyl^-chlorneuraminsäure in 2,0 ecm wasser- gefunden ... C 46,11, H 5,55, N 2,07%.
freiem Dioxan mit 101 mg Triäthylamin versetzt, so

bildet sich augenblicklich eine weiße Fällung. Man 20 1805 mg peracetylierte N-Glykolyl-D-neuraminsäure läßt das Reaktionsgemisch weitere 2 Stunden bei werden in 190 ecm eines Gemisches, bestehend aus Eis-Zimmertemperatur stehen. Nun wird etwa mit dem Eisessig und Essigsäureanhydrid 3:1 (v/v) gelöst. In gleichen Volumen Wasser versetzt und mit 4,0 ecm diese Lösung wird Salzsäuregas bis zur Sättigung 1 η-Natronlauge bei 40⁰C verseift. Diese Lösung wird unter Kühlung eingeleitet. Nun werden im Vakuum wie unter 1 beschrieben mit Austauscherharzen be- 25 bei 40⁰C das Lösungsmittelgemisch und die Salzsäure handelt. Die2-Desoxy-2,3-dehydro-N-acetyl-neuramin- abdestilliert. Durch Lösen des öligen Rückstandes in säure fällt nach dem Gefriertrocknen in 88,7%iger 150 ecm Eisessig und Gefriertrocknung erhält man die Ausbeute an. Sie ist in allen Eigenschaften mit der im 4,7,8,9 - Tetra - O - acetyl - N - (O - acetyl - glykolyl)-Beispiel 1 erhaltenen Säure identisch. 2-chlor-D-neuraminsäure in quantitativer Ausbeute ... 30 als fast farbloses Schaumharz. Die Substanz ist sehr ^{B e} ¹ ^{s p} ^l ^e ^l ' zersetzlich und hygroskopisch.

880 mg 4,7,8,9-Tetra-O-acetyl-N-acetyl-2-brom- Erfindungsgemäß werden nun 1800 mg4,7,8,9-Tetra-

D-neuraminsäure werden in 20 ecm absolutem Dioxan O-acetyl-N-(O-acetyl-glykolyl)-2-chlor-D-neuramin-

gelöst und diese Lösung mit 0,85 ecm Triäthylamin säure in 20 ecm absolutem Dioxan gelöst und in diese

versetzt. Nach Zugabe der Base beobachtet man eine 35 Lösung 1,5 ecm Triäthylamin eingetragen. Es tritt so-

weiße Fällung, die allmählich stärker wird. Man läßt fort nach Zugabe der Base eine weiße Fällung auf. Man

die Mischung 1 Stunde bei Zimmertemperatur stehen. läßt das Gemisch 1 Stunde bei Zimmertemperatur

Zur Verseifung der O-Acetylgruppen versetzt man stehen und gibt nach beendeter HCl-Abspaltung

das Reaktionsgemisch mit 15 ecm In-NaOH und er- 50 ecm destilliertes Wasser zu. Die Verseifung der

wärmt 15 Minuten auf 4O⁰C. Dann wird die bräunliche 4° O-Acetylgruppen erfolgt mit 30 ecm In-NaOH bei

Lösung zur Entfernung der Na⁺-Ionen durch eine mit Zimmertemperatur. Nun wird die Lösung wie im Bei-

einem Kationenaustauscher auf Polystyrolgrundlage spiel 7 beschrieben mit Hilfe geeigneter Ionenaus-

(DOWEX 50 · 8 in der H⁺-Form [26 ecm]) beschickte tauscher-Harze behandelt. Nach dem Einengen und

Chromatographiesäule filtriert und aus dem Filtrat die Gefriertrocknen der ameisensauren Eluate erhält man

gebildete 2-Desoxy-2,3-dehydro-N-acetyl-D-neuramin- 45 693 mgrohe2-Desoxy-2,3-dehydro-N-glykolyl-D-neur-

säure an einem Anionenaustauscher auf Polystyrol- aminsäure (das sind 69% der Theorie) als farbloses

grundlage (DOWEX 1 · 8, Formiat-Form; 33 ecm) ad- Schaumharz.

sorbiert. Man wäscht zuerst mit 500 ecm destilliertem Papierchromatogramm: Rna = 1,14, die Säure ist

Wasser nach und eluiert dann die 2-Desoxy-2,3-dehy- durch eine etwas schneller wandernde Substanz gering-

dro-N-acetyl-D-neuraminsäure mit 0,4n-Ameisen- 50 fügig verunreinigt. Dünnschichtchromatogramm: Rna

säure. Die ameisensauren Eluate werden im Vakuum = 1,33.

bei 40⁰C auf ein kleines Volumen eingedampft. Man Zur Charakterisierung wird der Methylester in folerhält nach dem Gefriertrocknen insgesamt 475 mg gender Weise hergestellt:

rohe 2-Desoxy-2,3-dehydro-N-acetyl-D-neuraminsäure, 0,670 g 2-Desoxy-2,3-dehydro-N-glykolyl-D-neurdas sind 100 % der Theorie. Die Säure wurde über 55 aminsäure werden in 10 ecm absolutem Methanol geihren gut kristallisierenden Methylester (s. Beispiel 1) löst und mit einem Überschuß einer ätherischen Lösung

charakterisiert: von Diazomethan versetzt. Eine amorphe flockige

F. 225 bis 226⁰C unter Zersetzung, bei 204⁰C be- Fällung wird abfiltriert und absoluter Äther bis zur

ginnendes Sintern [«]?? + 41,8° (c = 8,4, H,O). bleibenden Trübung zugefügt (etwa 100 ecm). Man

Elementaranalyse: (C₁OH₁₉OsN) 305,29. " ^{6o läßt} das Gemisch im Eisschrank stehen. Die Kristalli-

Berechnet ... C 47,21, H 6,27, N 4,59%; ^{satlon des} 2-Desoxy-2,3-dehydro-N-glykolyl-D-neur-

gefunden ... C 46,98, H 6,50, N 4,53%. aminsaure-methylesters setzt erst nach einigen Tagen

zögernd ein und ist in der Regel nach 1 bis 2 Wochen

Beispiel 8 beendet. Man erhält ein Rohkristallisat (253 mg) das

2-Desoxy-2,3-dehydro-N-gl_ykolyl-neuraminsäure ^{65 aus} ?/^^!^^ T^n ί f

reinem Methylester (F. 169 bis 172° C Zersetzung) be-

Das Ausgangsmaterial wird wie folgt hergestellt: trägt 169,4 mg, das sind 24% der Theorie (bezogen 1069 mg N-Glykolylneuraminsäure werden unter Eis- auf Rohsäure), [α]?? + 35,9° (c = 3,9, H₂O).

:iementaranalyse: (C₁₂H₁₉O₉N) 321,3.
Berechnet ... C 44,86, H 5,96, N 4,36 °/₀;
gefunden ... C 44,87, H 6,03, N 4,38%.

Beispiel 9

11,1 g 4,7,8,9-Tetra-O-acetyl-N-acetyl-2-chlor-D-neuraminsäure werden in 70 ml absolutem Dioxan gelöst. Diese Lösung wird mit 9,6 ml Triäthylamin veretzt. Man läßt die Mischung 1 Stunde bei Zimmeremperatur stehen.

Zur Verseifung der O-Acetylgruppen versetzt man las Reaktionsgemisch mit 85 ml 2n-Natronlauge und ;rwärmt es 15 Minuten auf 40⁰C. Dann wird die lösung zur Entfernung der Na+-Ionen durch eine mit einem Ionenaustauscher in der H+-Form (180 ml) bexhickte Chromatographiesäule filtriert und aus dem

ίο

Filtrat die gebildete 2-Desoxy-2,3-dehydro-N-acetyl-D-neuraminsäure an einem Anionenaustauscher (Formiat-Form; 640 ml) adsorbiert. Man wäscht zuerst mit 5 1 destilliertem Wasser nach und eluiert dann 5 die 2-Desoxy-2,3-dehydro-N-acetyl-D-neuraminsäure mit 0,4 n-Ameisensäure. Die ameisensauren Eluate werden im. Vakuum "'bei 40° C eingedampft. Der Eindampfrückstand (etwa-⁷ 6,5 g) wird aus Methanol (80 ml), Wasser (8 ml)-und Äther (400 ml) zur Kristallo lisation gebracht. '

Ausbeute: 3,99 g, das sind 61% der Theorie, F. bis 142° C.

[«]? = +47,3° (c = 1,5, H₂O).

Elementaranalyse: (C₁₁H₁₇O₈N) 291,3. Berechnet ... C 45,36, H 5,88, N 4,81%; gefunden ... C 45,50, H 5,94, N 4,83%.

Claims

Patentansprüche:

1. 2-Desoxy-2,3-dehydro-N-acyl-neuraminsäuren der Formel

COOH

O-

CH

CHOH

RHNCH

-CH

(CHOH)₂

CH₂OH

in der R einen Acetyl- oder Glykolylrest bedeutet, und ihre Salze mit anorganischen oder organischen Basen.

2. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen gemäß Anspruch 1 und deren Salzen, dadurch gekennzeichnet, daß eine 2-Chlor- oder 2-Brom-4,7,8,9-tetra-O-acyl-N-acetyl- oder -N-(O-acylglykolyl)-neuraminsäure in an sich bekannter Weise in Gegenwart eines inerten organischen Lösungsmittels bei Zimmertemperatur oder erhöhten Temperaturen mit einem halogenwasserstoffbindenden Mittel behandelt wird, aus der erhaltenen 2-Desoxy^S-dehydro^J^^-tetra-O-acyl-N-acetyl-oder -N-(O-acylglykolyl)-neuraminsäure die O-Acylgruppen in an sich bekannter Weise mittels verdünnter wäßriger Alkalien abgespalten werden, und die erhaltene freie Säure gegebenenfalls in ihre Salze mit anorganischen oder organischen Basen übergeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als halogenwasserstoffbindendes Mittel Silbercarbonat oder Silberoxid oder eine tertiäre organische Base, wie Pyridin oder Triäthylamin, verwendet wird.

Die Erfindung betrifft neue 2-Desoxy-2,3-dehydro-N-acyl-neuraminsäuren der allgemeinen Formel

O-

COOH
-C
CH
CHOH

RHNCH
CH

(CHOH)₂
CH₂OH

in der R den Acetyl- oder den Glykolylrest bedeutet, und ihre Salze mit anorganischen und organischen Basen sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß eine 2-Chlor- oder 2-Brom-4,7, 8,9-tetra-O-acyl-N-acetyl- oder -(O-acylglykolyl)-neuraminsäure in an sich bekannter Weise in Gegenwart eines inerten organischen Lösungsmittels bei Zimmertemperatur oder erhöhten Temperaturen mit einem

ίο halogenwasserstoffbindenden Mittel behandelt wird, aus der erhaltenen 2-Desoxy-2,3-dehydro-4,7,8,9-tetra-O-acyl-N-acetyl- oder -(O-acylglykolyl)-neuraminsäure die O-Acylgruppen in an sich bekannter Weise mittels verdünnter wäßriger Alkalien abgespalten werden und die erhaltene freie Säure gegebenenfalls in ihre Salze mit anorganischen oder organischen Basen übergeführt wird. Die Reaktionstemperatur ist von der Art des halogenwasserstoffbindenden Mittels abhängig. Als inerte Lösungsmittel können beispielsweise Dioxan, Aceton und Tetrahydrofuran verwendet werden, es können aber auch wasserfreie Alkohole eingesetzt werden.

Als halogenwasserstoffbmdende Mittel können z. B. tertiäre organische Basen, wie Triäthylamin oder Pyridin, Schwermetallverbindungen, wie Silberoxid, Silbercarbonat oder Quecksilber(II)-cyanid, oder Alkalialkoholate verwendet werden. Die besten Ausbeuten erhält man mit Silberoxid oder Silbercarbonat oder mit einer aliphatischen tertiären Base; bei Verwendung organischer tertiärer Basen, insbesondere der aliphatischen Reihe, erfolgt die Halogenwasserstoffabspaltung bereits bei Zimmertemperatur, während bei Verwendung von Silberoxid und Silbercarbonat oder eines anderen der genannten halogenwasserstoff bindenden Mittel erhöhte Temperaturen, vorzugsweise Temperaturen zwischen 80 und 90⁰C₅ erforderlich sind. Bei Verwendung eines Alkalialkoholats entsteht ebenso wie bei Verwendung eines wasserfreien Alkohols als Lösungsmittel eine beträchtliche Menge eines a-Ketosids.

Nach beendeter Halogenwasserstoffabspaltung, die, je nach dem verwendeten halogenwasserstoffbindenden Mittel, 5 bis 60 Minuten benötigt, wird das Reaktionsgemisch zweckmäßig ohne Isolierung der gebildeten 2-Desoxy-2,3-dehydro-4,7,8,9-tetra-O-acyl-N-acetyl- oder -(O-acylglykolyl)-neuraminsäure mit wäßrigen Alkalien behandelt, wobei die O-Acylreste abgespalten werden; die Temperatur kann hierbei gegebenenfalls mäßig erhöht werden, beispielsweise auf 40 bis 50° C.

Anschließend werden mit Hilfe eines Ionenaustauschers die Ionen entfernt und die resultierenden wäßrigen Lösungen nach üblichen Methoden, vorzugsweise mittels Gefriertrocknung, vom Wasser befreit. Die Ausbeuten betragen in den besten Fällen 80 bis 90%; in manchen Fällen, insbesondere wenn oc-Ketoside der entsprechenden N-Acyl-neuraminsäure in beträchtlichen Mengen als Nebenprodukte entstehen, ist eine weitere chromatographische Reinigung nach üblichen Methoden erforderlich; die Ausbeuten liegen dann niedriger.

Die erhaltenen neuen Verbindungen konnten nur zum Teil kristallin erhalten werden. Zu ihrer Charakterisierung wurden vorzugsweise, wie in den Ausführungsbeispielen beschrieben, die Peracetyl-Verbindungen sowie die gut kristallisierten Methylester hergestellt. Die katalytische Semimikrohydrierung der Methylester ergab genau die erwartete Wasserstoffaufnahme, ebenso stehen die Doppelbindungszahlen