DE1252610B

DE1252610B - Verfahren zum Stabilisieren von Katalase

Info

Publication number: DE1252610B
Application number: DENDAT1252610D
Authority: DE
Inventors: Pans Dr med Pierre Marcel Theil
Original assignee: SINCOREP SA, Fnbourg (Schweiz)
Priority date: 1964-01-08
Publication date: 1967-10-26
Also published as: GB1056192A; BE657602A; FR1484614A; LU47683A1

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

CO-Ti'

Int. Cl.:

Deutsche Kl.:

f C 1 2 N 9 / O O O

\\61k

a-^2/C7

Nummer: 1252610

Aktenzeichen: S 94959IV a/6 a Anmeldetag: 8. Januar 1965 Auslegetag: 26. Oktober 1967

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Stabilisieren von Katalase.

Bekanntlich besteht die Gewinnung der Katalase für therapeutische Anwendungszwecke aus folgenden Arbeitsstufen:

1. Extraktion der Katalase aus einem tierischen Organ, wie Leber;

2. Reinigen der Rohkatalase;

3. Lösen der Katalase in Wasser und gegebenenfalls Lyophilisieren der Lösung zur Gewinnung einer lyophilisierten Katalase oder Auskristallisieren der Katalase aus dieser Lösung, um eine kristallisierte Katalase zu erhalten.

Die bei der therapeutischen Anwendung der Katalase auftretende größte Schwierigkeit besteht bekanntlich darin, daß sie in der gereinigten Form außerordentlich instabil und gegenüber Temperaturschwankungen sehr empfindlich ist sowie durch Hitzeeinwirkung zerstört wird. Sehr ungewöhnlich ist zudem, daß sie auch gegenüber tiefen Temperaturen empfindlich ist. Diese besonders bei etwa — 20⁰C deutlich feststellbare Temperaturempfindlichkeit der Katalase macht das Lyophilisieren, das als bestgeeignet zur Konservierung von Stoffen dieser Art gilt, sehr schwierig.

Die Katalase ist in gleicher Weise sehr empfindlich gegenüber der Einwirkung von Lichtstrahlen, wobei die violetten und ultravioletten Anteile des Spektrums besonders zerstörend wirken. Ebenfalls ist die Katalase gegenüber zahlreichen, selbst nur geringfügig angreifenden chemischen Mitteln empfindlich; so führt eine Berührung mit Glas und selbst neutralem Glas zu einer fortschreitenden Zerstörung der enzymatischen Wirksamkeit.

Zum Konservieren der Katalase gegen Temperaturschwankungen hat man sie im Temperaturbereich von +5 bis +10° C, gegen jegliches Licht geschützt, in silikonisierten Neutralglasflaschen unter dem Schutz eines neutralen Gases gehalten. Die Lichtempfindlichkeit erfordert ein Arbeiten im Dunklen oder mit sehr schwachem Rotlicht während aller Arbeitsgänge (Inlösungbringen, Abtrennen, Lyophilisieren, Einschließen, Einkapseln, Etikettieren und Abfüllen in Flaschen) somit besondere Arbeitsplätze zu benutzen, wo die Arbeit sehr sorgfältig ausgeführt werden muß und wo die Qualität der Arbeit auf Grund der Tatasache leiden muß, daß die Arbeitskräfte »blind« arbeiten müssen. Trotz dieser Maßnahmen erfährt das Enzym — sowohl in Lösung wie auch in trockener Form — einen allmählichen Abbau, der in Abhängigkeit von den Ansätzen in 45 bis 60 Tagen zu einem 50%igen Verlust der enzyme·

Verfahren zum Stabilisieren von Katalase

Anmelder.

SINCOREP S. A., Fribourg (Schweiz)

Vertreter:

Dipl.-Ing. K. A. Brose, Patentanwalt, München-Pullach, Wiener Str. 2 Als Erfinder benannt: Dr. med. Pierre Marcel Theil, Paris Beanspruchte Priorität: Frankreich vom 8. Januar 1964 (959 674)

tischen Wirksamkeit führt. Zudem verbietet die pharmakologische Gesetzgebung mancher Länder, Injektionsflüssigkeiten in lichtundurchlässigen Glas gefäßen in den Handel zu bringen, wodurch der Schutz der Katalase gegen Lichteinwirkung unmöglich gemacht wird.

Auf Grund dieser Sachlage hat man in der USA.-Patentschrift 2 689 203 beschrieben, Katalaselösun-

«5 gen durch Zusatz von Natriumeitrat und seinen Gemischen mit Glycerin und/oder Thymol zu stabilisieren; hierdurch wird aber, wie weiter unten nachgewiesen, eine befriedigende Stabilisierung der Katalase nicht erreicht.

Der Erfindung liegt die Aufgabenstellung zugrunde, ein Stabilisierungsverfahren zu schaffen, das die Nachteile der bisherigen Stabilisierungsmethoden vermeidet und vermittels dessen die Katalase gegen eine Zerstörung der enzymatischen Aktivität weit gehend geschützt wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren zum Stabilisieren von Katalase ist nun dadurch gekennzeichnet, daß man der Katalase in einer beliebigen Arbeitsstufe ihrer Gewinnung 50 bis 500 mg, vorzugsweise 100

bis 200 mg, eines Hexite je Million Beer-Sizer-Einheiten Katalase zusetzt.

Nach einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens wird das Hexit der Katalase in Form einer wäßrigen Lösung zugesetzt. Unter den Hexiten sind beispielsweise Mannit, Dulcit, Sorbit, Inosit, Idit und Talit benutzbar; das nicht toxische Mannit ist wegen seiner starken stabilisierenden Wirkung vorzugsweise anwendbar.

Die erforderliche Hexitmenge schwankt in Abhängigkeit von dem angewandten Hexit im allgemeinen von 5 bis 50 g/l einer Katalaselösung mit 100 Millionen Beer-Sizer-Einheiten, dies entspricht ungefähr

709 679/186

50 bis 500 mg Hexit je Million Beer-Sizer-Einheiten Katalase. Ein Gehalt von 100 bis 200 mg Hexit je Million Beer-Sizer-Einheiten Katalase gibt im allgemeinen sehr zufriedenstellende Ergebnisse. Größere Mengen als angegeben bewirken keine wesentlich bessere Stabilisierung, führen dagegen in den toxischen Mengenbereich.

■ Zur Stabilisierung von Katalase in einer für die Jherapeutische Anwendung geeigneten Form kann 'man das Hexit während der Bereitung der wäßrigen "Lösung der gereinigten Katalase zugeben, wodurch eine ausreichende Stabilisierung entweder der Lösung für die direkte Anwendung oder der aus dieser das Hexit enthaltenden Lösung zubereiteten lyophilisierten oder kristallisierten Katalase erreicht wird.

Wie jedoch gefunden wurde, ist es vorteilhaft, das Hexit schon in einer vorhergehenden Arbeitsstufe während der Gewinnung der Katalase einzuführen, und zwar vorzugsweise während der ersten Extraktionsstufe der Katalase aus dem tierischen Gewebe. Wenn man die Extraktion mit einer ein Hexit enthaltenden wäßrigen Lösung durchführt, enthält man eine ungewöhnlich gute Ausbeute an Rohkatalase im Vergleich zu der üblichen Extraktion ohne Hexit, nämlich in bestimmten Fällen die doppelte Menge Katalase oder sogar mehr. Dies beruht wahrscheinlich darauf, daß die Stabilisierung die üblicherweise während der ersten Extraktionsstufe stattfindende Zerstörung eines großen Ehzymanteils verhindert.

Während der sich anschließenden Arbeitsstufen der Gewinnung der Katalase muß eine ausreichende Menge Hexit vorliegen, um so eine Stabilisierung der fertigen Katalase zu erreichen; es kann daher erforderlich sein, während der abschließenden Arbeitsstufe erneut Hexit zuzusetzen.

Die Erfindung wird im folgenden durch Ausführungsbeispiele erläutert.

Beispiel 1

Die in üblicher Weise z. B. nach der französischen Patentschrift 1091 M zubereiteten wäßrigen, gereinigten Katalaselösungen enthalten 200000 Beer-Sizer-Einheiten Katalase. Die eine Hälfte dieser Katalaselösung erhält keinen Zusatz, und zur anderen Hälfte dieser Katalaselösung wird 1 Gewichtsprozent Mannit zugesetzt. Zur Untersuchung der Stabilisierwirkung befinden sich die Lösungen in nichtsilikonisierten Fläschchen bei einer Temperatur von 5° C gegen Lichteinwirkung geschützt. Die Ergebnisse zeigt die Tabelle I.

Tabelle I

Laut Tabelle erfährt die Vergleichslösung (ohne Stabilisator) einen Wirkungsabfall von mehr als 50% in 48 Stunden, während die mit Mannit stabilisierte Lösung ihre Wirksamkeit innerhalb von 6 Tagen unverändert beibehält und erst dann eine geringfügig fortschreitende Verringerung der Wirksamkeit zeigt.

Bei einem weiteren Versuch werden die Lösungen

der Lufteinwirkung ausgesetzt, wodurch der Wir-

kungsabfall der Vergleichslösung schneller erfolgt,

dagegen derjenige der mannithaltigen Lösung nur in

einer der Tabelle I vergleichbaren Weise.

Beispiel 2

Zur Untersuchung der stabilisierenden Wirkung von Mannit auf lyophilisierte Katalase werden zwei Lösungen mit 100 000 Beer-Sizer-Einheiten je Milliliter Katalase lyophilisiert, wobei die eine 1 % Mannit, die andere kein Mannit enthält und die Lösungen

ao in Fläschchen mit je 0,25 ml Lösung gemäß Beispiel 1 untersucht werden; man erzielt die in Tabelle II gezeigten Ergebnisse.

Tabelle II

Untersuchungszeitpunkt nach dem

Lyophilisieren

Unmittelbar

1 Woche ...

2 Wochen ..

1 Monat ...

2 Monate ..
6 Monate ..
12 Monate .

Lyophilisierte Katalase ohne Zusatz I mit Mannit

21600

18200

17600

13400

11800

8200

6100

25 000
25 000
25 000
25 000
25 000
25 000
25 000

Beispiel 3

Man arbeitet gemäß Beispiel 2, hält die Fläschchen jedoch bei einer Raumtemperatur auf 18 bis 30° C, wobei ein geringfügig schnellerer Abfall der Wirksamkeit ohne Mannit erfolgt, während mit Mannit die Wirksamkeit entsprechend Tabelle II erhalten bleibt.

Beispiel 4

Untersuchungszeitpunkt nach

0 Stunden

12 Stunden
24 Stunden
48 Stunden
72 Stunden

4 Tagen .

5 Tagen .

6 Tagen .

7 Tagen .
9 Tagen .

11 Tagen .

13 Tagen .
15 Tagen .

Katalaselösung ohne Zusatz I mit Mannit

200000	200000
172 000	200000
126000	200000
96000	200000
82 000	200000
79 000	200 000
76000	200000
71000	200000
68 000	198 000
64 000	198 000
63 000	195 000
61000	193 000
57000	193 000

Es wird das Beispiel 2 wiederholt und die Wirkung des Tageslichtes auf die lyophilisierte Katalase untersucht. Die Fläschchen werden dem normalen So Tageslicht an einer gut belichteten Stelle an einem wolkenlosen Tag ausgesetzt, wobei mittels photoelektrischer Zellen gewährleistet wird, daß alle Fläschchen gleichermaßen belichtet werden. Die erzielten Ergebnisse zeigt die Tabelle III.

Tabelle III

Untersuchungszeitpunkt nach

0 Stunden

1 Stunde .

2 Stunden
4 Stunden

8 Stunden

Lyophilisierte Katalase ohne Zusatz I mit Mannit

21900
20600
18700
12200
8100

25 000
25 000
25 000
25000
25 000

Die vorstehenden Untersuchungsergebnisse der Tabellen I bis HI zeigen, daß erfindungsgemäß er-

stens eine vollständige Erhaltung der Katalasewirksamkeit mindestens 6 Tage lang bei Tageslicht in gleicher Weise wie bei Lichtausschluß erzielbar ist. Ohne Abfall der Wirksamkeit kann zweitens auch das Lyophilisieren bei üblichem Tageslicht ausgeführt werden. Drittens kann lyophilisierte Katalase mindestens 12 Monate lang ohne Abfall der Wirksamkeit aufbewahrt werden, während Fläschchen mit nicht stabilisierter lyophilisierter Katalase unter gleichen Bedingungen einen Abfall der Wirksamkeit von mehr als 70% zeigen. Schließlich kann man Fläschchen mit lyophilisierter Katalase mindestens 8 Stunden dem Tageslicht aussetzen, ohne daß sich ein Abfall der Wirksamkeit zeigt.

Das folgende Beispiel gibt eine Ausführungsform der Erfindung wieder, wobei alle Arbeitsgänge in Gegenwart von Mannit ausgeführt werden.

Beispiel 5

Zu einem Gemisch von 1 kg homogenisierter Rinderleber und einem Liter einer l%igen wäßrigen Mannitlösung werden 20 Volumprozent Aceton zugesetzt. Nach dem Filtrieren fällt man aus dem FiI-trat unter stetigem Rühren durch langsames Zusetzen von 25 Volumprozent Aceton die Rohkatalase aus. Die zentrifugierte und getrocknete mannithaltige Katalase enthält 103 Millionen Beer-Sizer-Einheiten.

Der unter den gleichen Bedingungen, doch in Abwesenheit von Mannit durchgeführte Arbeitsgang enthält dagegen lediglich 35 Millionen Katalaseeinheiten.

Die Rohkatalase wird in 1% Mannit enthaltendem Wasser erneut dergestalt gelöst, daß die Lösung 100 Millionen Beer-Sizer-Einheiten je Liter enthält. Nach Abtrennen des Unlöslichen wird in der darüberstehenden Flüssigkeit durch Dialyse ein Mannitgehalt von nicht unter 1% der Lösung festgestellt; erforderlichenfalls wird erneut Mannit zugesetzt. Nach 48 Stunden Dialyse fällt die Katalase aus, die man erneut in einer Lösung vom pH-Wert von 7,3 bei 4° C löst. Die Katalase fällt nach und nach in kristalliner Form aus. Die gereinigte Katalase wird sodann in einer wäßrigen lVoigen Mannitlösung zu einer Lösung mit 100 Millionen Beer-Sizer-Einheiten je Liter gelöst und diese lyophilisiert. Man erhält ein therapeutisch anwendbares, völlig stabilisiertes Pulver, mit welchem die in den Beispielen 2 bis 4 beschriebenen Ergebnisse erhalten werden.

Im folgenden Beispiel werden die erfindungs-

lp gemäß angewandten Stabilisatoren mit den oben angeführten bekannten Stabilisatoren verglichen.

Beispiel 6

Verglichen wurden sieben wäßrige Katalaselösungen mit je 15 000 internationalen Aktivitätseinheiten (I. E.) je Milliliter, von denen jede einen anderen Stabilisatorzusatz erhalten hatte:

A. gemäß USA.-Patentschrift 2 689 203:
_a0 (1) 1 Gewichtsprozent Natriumeitrat,

(2) 1 Gewichtsprozent Natriumeitrat,
4· 15 Gewichtsprozent Glycerin,

(3) 2 Gewichtsprozent Natriumeitrat,
4- 1 Gewichtsprozent Thymol,

S₅ (4) 2 Gewichtsprozent Natriumeitrat,
4- 1 Gewichtsprozent Thymol
4-15 Gewichtsprozent Glycerin;

B. erfindungsgemäß:

(5) 1 Gewichtsprozent Idit,
(6) 1 Gewichtsprozent Talit,
(7) 1 Gewichtsprozent Mannit.

Die mit den verschiedenen Stabilisatoren versetzten Lösungen wurden 4 Wochen stehengelassen, dann unter sterilen Bedingungen filtriert und in zupfropfbaren Glasnaschchen abgefüllt. Diese wurden längere Zeit bei Raumtemperatur dem Tageslicht ausgesetzt, und jeweils nach 1, 2, 3, 4 und 5 Monaten, gerechnet vom Tag des Stabilisatorzusatzes, wurde der Abfall der Katalasewirksamkeit der Lösungen gemessen.

	(1) Ι.Ε./ΙΪ11	(2) 1.EJmI	(3) I.E./nU	Lösung (4) I.E./ml	(5) I. EJnU	(6) I.E./ml	(7) 1.EVmI
Versuchsdauer 1 Monat	10000 5490 3 200 1500 0 100%	9700 6400 3 300 2 200 1000 93,3%	11100 6200 3 500 2100 1200 92%	10500 5 900 3 900 2 500 1150 92,3%	13 800 13 000 12100 12100 12 000 20%	14200 13 700 13 700 12900 12500 16,6%	14 850 14800 14 800 14800 14800 1,3%
2 Monate
3 Monate
4 Monate
5 Monate
Aktivitätsverlust nach 5 Monaten

Aus den in der Tabelle angeführten Meßergebnissen geht hervor:

a) Im Gegensatz zu den Angaben in der USA.-Patentschrift 2 689 203 verlieren die mit Citrat stabilisierten Katalaselösungen ihre Aktivität nach 5 Monaten entweder vollständig oder günstigenfalls zu 92%; etwa ein Drittel der ursprünglichen Aktivität ist bereits nach 1 Monat verlorengegangen. Derart mangelhaft stabilisierte Katalaselösungen sind naturgemäß für eine therapeutische Anwendung ungeeignet.

b) Demgegenüber verlieren die erfindungsgemäß mit Talit und Idit stabilisierten Lösungen ihre Aktivität nach 5 Monaten nur zu 16,6 bzw. 20%, während die mit Mannit stabilisierten Lösungen lediglich zu 1,3% weniger wirksam sind. Derartig stabilisierte Katalaselösungen, insbesondere die mit Mannit stabilisierten Lösungen sind demnach in der Humantherapeutik vorzüglich anwendbar.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Stabilisieren von Katalase, dadurch gekennzeichnet, daß man der Katalase in einer beliebigen Arbeitsstufe ihrer

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Gewinnung 50 bis 500 mg, vorzugsweise 100 bis 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch

200 mg, eines Hexits je Million Beer-Sizer-Ein- gekennzeichnet, daß man als Hexit Mannit ver-

heiten Katalase zusetzt. wendet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man den Hexit der Katalase in S In Betracht gezogene Druckschriften: Form einer wäßrigen Lösung zusetzt. USA.-Patentschrift Nr. 2 689 203.

709 679/186 10.67 ® Bundesdruckerei Berlin