DE1243423B - Verfahren zur Durchfuehrung von Antigen-Antikoerper-Reaktionen - Google Patents
Verfahren zur Durchfuehrung von Antigen-Antikoerper-ReaktionenInfo
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Description
DEUTSCHES
PATENTAMT
Int. Cl.:
GOln
DeutscheKl.: 421-3/54
Nummer: 1243 423
Aktenzeichen: H 47107IX b/421
Anmeldetag: 10. Oktober 1962
Auslegetag: 29. Juni 1967
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Durchführung von
immunologischen und ähnlichen Reaktionen, bei denen Proteine, Polysaccharide usw. in Lösung entweder
in Abwesenheit oder in Gegenwart von festem Material, wie z. B. Blutzellen oder Fragmenten derselben,
unter Bildung einer Fällung umgesetzt werden. Typische Reaktionen dieser Art sind die
Antigen-Antikörper-Reaktionen, die gemeinhin als Präzipitations- und Agglutinationsreaktionen bekannt
sind und deren Verlauf davon abhängt, ob festes Material in einer bzw. beiden Flüssigkeiten zugegen
ist oder nicht.
Die Erfindung besteht in einem Verfahren zur Durchführung von Antigen-Antikörper-Reaktionen
durch Ausstreichen der beiden zu testenden Flüssigkeiten auf einer nahezu ebenen Unterlage mit glatter
Oberfläche, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß dem Ausstrich ein feinverteilter Feststoff zugeteilt
wird, der gegenüber den Flüssigkeiten inert und darin unlöslich ist, daß der Ausstrich auf ein benetzbares
Blatt als Unterlage aufgebracht wird und daß Feststoff und Unterlage in ihrer Farbe so aufeinander abgestimmt
werden, daß ein möglichst deutlicher Farbkontrast zwischen ihnen auftritt.
Es ist ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber bekannten Verfahren, daß sich klare
und eindeutig positive oder negative Ergebnisse erzielen lassen.
Es ist, mindestens zum Zweck der Beschreibung der vorliegenden Erfindung notwendig, anzunehmen,
daß eine Agglutinationsreaktion eine Reaktion zwischen Substanzen in zwei mischbaren Flüssigkeiten
ist, wobei wenigstens einer der Reaktionsteilnehmer aus einem Feststoff wie z. B. Bakterien- oder Blutzellen
oder Fragmenten derselben besteht oder diese enthält, die dann als Ergebnis der Umsetzung agglomeriert
werden. Eine Präzipitationsumsetzung andererseits ist eine Umsetzung zwischen Substanzen in
zwei Flüssigkeiten, die beide frei von suspendierten Feststoffen sind. Eine Präzipitationsumsetzung führt
zur Fällung und Ausflockung von festen Materialien, jedoch sind die Ergebnisse dieser Umsetzungen
häufig schwierig festzustellen und auszuwerten.
Die Worte Antigen und Antikörper werden im vorliegenden in ihrer weiteren Bedeutung verwendet,
so daß alle Substanzen, z. B. Mikroorganismen, Viren und ihre biologischen Produkte, darunterfallen,
die in der Lage sind, immunologische Reaktionen, z. B. Präzipitations-, Agglutinations- oder
Ausflockungsreaktionen, einzugehen.
Bisher wurden die bei Präzipitationsreaktionen Verfahren zur Durchführung von
Antigen-Antikörper-Reaktionen
Antigen-Antikörper-Reaktionen
Anmelder:
Hynson, Westcott & Dunning,
Baltimore, Md. (V. St. A.)
Baltimore, Md. (V. St. A.)
Vertreter:
Dr. W. Beil, A. Hoeppener und Dr. H. J. Wolff,
Rechtsanwälte,
Rechtsanwälte,
Frankfurt/M.-Höchst, Adelonstr. 58
erhaltenen Ergebnisse durch das Suspendieren eines feinverteilten Feststoffs in einer oder der anderen
der beiden verwendeten Flüssigkeiten leichter feststellbar gemacht, wobei der supendierte Feststoff
durch Umsetzung zur Agglutination gebracht und dadurch die Umsetzung leichter beobachtbar gemacht
wird.
Es ist bekannt (s. USA.-Patentschrift 2 770 572), Agglutinationsreaktionen so durchzuführen, daß man
den Verdampfungsrückstand eines Antiserums, das getestet werden soll, auf einer tragenden Oberfläche
ablagert, die Ablagerung mit Blutflüssigkeit benetzt, die Blutzellen enthält, und die Ergebnisse beobachtet.
Es wurde nun gefunden, daß Umsetzungen der vorstehend angegebenen Art dadurch leichter durchgeführt
und die Ergebnisse schärfer herausgearbeitet und leichter beobachtet werden können, daß man
einen feinverteilten Feststoff in einer Flüssigkeit suspendiert, eine Schicht der erhaltenen Suspension auf
einen geeigneten Träger streicht, der mit Bezug auf den Feststoff eine Kontrastfarbe hat, die Schicht
nacheinander mit den zu testenden Flüssigkeiten benetzt und die Ergebnisse feststellt. Bei den bevorzugten
Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die eine oder die andere der beiden
durch die Antigen-Antikörper-Reaktion zu testenden Flüssigkeiten als Suspensionsflüssigkeit für den feinverteilten
Feststoff und ferner für die nachfolgenden Verfahrensstufen verwendet, bei dem der anfängliche
Überzug der Suspension von feinverteilten Feststoffen auf dem Träger getrocknet und dann erneut mit der
anderen zu testenden Flüssigkeit benetzt oder vorzugsweise zuerst der getrocknete Überzug mit einer
indifferenten Flüssigkeit, wie Wasser oder Salzlösung, benetzt und dann die zweite zu untersuchende
Flüssigkeit aufgestrichen wird. Der Testbereich kann entweder vor, während oder nach der Feststellung
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der Ergebnisse getrocknet werden, nachdem die zweite Testflüssigkeit aufgebracht wurde, so daß die
Testergebnisse für nachfolgende Beobachtungen konserviert werden. Bei dem vollständigen Verfahren
kann auch das bei immunologischen Tests bekannte wiederholte Schaukeln oder Schütteln des Trägers
angewendet werden, was im allgemeinen dazu dient, die Testergebnisse zu verschärfen. Tatsächlich werden
durch die Gegenwart des feinverteilten Feststoffs Präzipitationsreaktionen zu Agglutinationsreaktionen
umgewandelt, und die Ergebnisse der Agglutinationsreaktionen werden leichter feststellbar gemacht. Es
wurde gefunden, daß es vorteilhaft ist, wenn die Suspension des feinverteilten Feststoffs auf der Trägeroberfiäche
getrocknet und dann, wie vorstehend beschrieben, erneut benetzt wird, um eine kleine Menge
eines Anfeuchtmittels wie Gyzerin in die Suspension einzuarbeiten.
Der Träger oder die Trägeroberfiäche, auf die die feinverteilten Feststoffe abgelagert werden, müssen ao
besonders glatt sein, d. h. so glatt wie die Oberfläche von gut satiniertem Papier oder satinierter Pappe,
so daß die Rauheit der Oberfläche die Testergebnisse nicht beeinträchtigt oder zu falschen Schlüssen Anlaß
gibt. Die Oberfläche kann hinsichtlich ihrer Glattheit zwischen satiniertem Papier oder satinierter
Pappe und Glas liegen. Die Oberfläche muß durch den flüssigen Träger der Suspension von feinverteilten
Feststoffen, der im allgemeinen aus Wasser besteht, leicht benetzbar sein, so daß die abgelagerte
Schicht glatt ist und ein gleichförmiges Aussehen hat. Der Träger kann mehr oder weniger absorbierend
wirken, wie im Fall von Pappe oder Papier, das so geleimt ist, daß mit wäßriger Tinte darauf geschrieben
werden kann. Eine beschränkte Absorptionsfähigkeit kann durchaus von Vorteil sein, da der
flüssige Träger dann schneller absorbiert wird und die Zeit verkürzt wird, die zur Erzielung der Testergebnisse
erforderlich ist. Träger mit höherer Absorptionsfähigkeit, wie z.B. Löschpapier, sind dagegen
nicht geeignet, weil ihre Oberfläche zu rauh ist und weil die Testflüssigkeit von dem Papier so
schnell aufgesogen wird, daß sich keine Oberflächenschicht bildet. In einigen Fällen, in denen das Reaktionsmittel
eine kleine Molekülgröße aufweist, ist sogar ein Material mit begrenzter Absorptionsfähigkeit,
wie geleimte oder satinierte Pappe, die mit wäßriger Tinte beschrieben werden kann, für das
vorliegende Testverfahren nicht geeignet, da die Reaktionsmittel von dem Grundmaterial zusammen
mit dem Träger aufgesogen werden und auf der Oberfläche keine Ablagerung bilden und keine Umsetzung
eingehen, die zur schnellen Feststellung der Ergebnisse führt. Im allgemeinen werden Trägeroberflächen,
die nur halbdurchlässig sind, das sind solche, die Flüssigkeiten, wie Wasser, jedoch nicht
Proteinmoleküle absorbieren, oder die undurchlässig sind, bevorzugt. Bei Verwendung eines undurchlässigen
Trägers muß der Testtropfen gänzlich durch Verdampfen ohne Absorption auftrocknen, so daß
der Trockenvorgang etwas länger dauert als bei Verwendung eines halbdurchlässigen Trägers. Ein
Beispiel für einen geeigneten absorbierenden Träger ist Pappe, wie sie für Lochkarten verwendet wird.
Ein Beispiel für einen geeigneten undurchlässigen Träger ist ein Blatt, dessen Rückseite aus Papier
oder Pappe besteht, mit einer gewalzten und/oder anderweitig damit verbundenen Oberflächenschicht
eines mit Wasser netzbaren, jedoch wasserundurchlässigen Beschichtungsmaterials, wie z. B. Polyäthylen.
Ein Film aus wasserdurchlässigem oder -undurchlässigem Material könnte auch allein ohne
Papier- oder Pappenrückseite verwendet werden, jedoch macht die Durchsichtigkeit solcher Filme die
Feststellung von Ergebnissen schwierig, sofern nicht der Film mit dem Testfleck über einer Unterlage in
einer Kontrastfarbe für den feinverteilten Feststoff, z. B. Weiß im Fall von schwarzen oder stark gefärbten
Feststoffen, beobachtet wird. In gleicher Weise kann der Film oder Überzug halbdurchlässig sein,
d. h. in der Lage sein, Wasser zu absorbieren, jedoch nicht Protein und derartige Moleküle aufzunehmen,
wie z. B. Zelluloseazetatfilme oder Uberzüge. Im Fall von normalerweise farblosen und durchsichtigen
Filmen kann dieser so gefärbt werden, daß die gewünschte Kontrastfarbe erhalten wird, z. B. Weiß
durch Einarbeitung eines Pigments in die Masse, aus der der Film besteht. Im Fall von durchlässigen und
halbdurchlässigen Trägern kommt es durch die Absorption der flüssigen Phase aus der Flüssigkeit, die
untersucht werden soll, zu einer Konzentration der Reagenzien an der Oberfläche des Trägers; jedoch
kommt es zu dieser Konzentration der Reaktionsmittel auch im Fall eines undurchlässigen Trägers
als Ergebnis der Verdampfung. Auf einem absorbierenden Träger wird die Feststellung der endgültigen
Ergebnisse des Tests beschleunigt. Es wurde gefunden, daß ein Film, der Wasser absorbiert, wie ein
Zelluloseazetatfilm der sich auf einem Träger, wie Pappe, befindet, in einigen Fällen versagt, da er nach
dem Benetzen und Trocknen leicht knittert und dadurch die Beobachtung der Antigen-Antikörper-Reaktion
beeinträchtigt.
Es kann eine große Zahl von feinverteilten Feststoffen verwendet werden. Wenn der feinverteilte
Feststoff mit der einen oder anderen der bei dem Test zur Herstellung einer Suspension verwendeten
Flüssigkeiten gemischt werden soll, wird die Verwendung eines festen Absorptionsmittels, wie aktiver
Holzkohle, bevorzugt, da diese außerordentlich adsorbierend wirkt und eine geeignete Farbe (Schwarz)
hat, so daß sie auf einem Träger, wie weißem Papier oder weißer Pappe, verwendet werden kann, und da
sie in geeigneter, feinverteilter Form verhältnismäßig leicht erhältlich ist. Jedoch können auch andere
feinverteilte Feststoffe, wie Farb- oder Druckfarbenpigmente, verwendet werden. In einigen Fällen, wie
bei Aktivkohle, findet eine wirkliche Adsorption des Reaktionsmittels durch den Feststoff statt, jedoch
kann bei anderen Pigmenten, die im allgemeinen nicht als adsorbierende Mittel angesehen werden,
eine geringfügige oder gar keine Adsorption stattfinden, und die Umsetzung, die stattfindet, kann
lediglich eine Mischagglutination sein, wobei die feinverteilten Feststoffe zusammen mit der Fällung
erhalten werden und als Sichtbarkeitsmittel dienen. Es wird jedoch angenommen, daß im Fall aller
getesteten, feinverteilten Feststoffe eine gewisse Adsorption stattfindet, d. h., es entsteht ein gewisser
Konzentrationsgrad der Moleküle des aktiven Mittels auf oder in der Nähe der Oberflächen der Feststoffteilchen.
Als feinverteilte Feststoffe die nicht aus Aktivkohle und Farb- und Druckfarbpigmenten der
vorstehenden Art bestehen, können Ionenaustauschharze und adsorbierende Kieselsäure, Tonerde und
Kaolin verwendet werden. Falls das aus feinverteilten
Feststoffen bestehende Adsorptionsmittel, das verwendet werden soll, nicht die gewünschte Kontrastfarbe
hat, kann es durch Behandlung mit einem geeigneten Farbstoff, wie z. B. Anilinfarbstoffen, umgefärbt
werden. Es kann auch unter ultraviolettem Licht durch Behandlung mit einem fluoreszierenden
Material, wie Fluoreszin, sichtbar gemacht werden. Ein Beispiel für ein geeignetes Ionenaustauschharz
ist das im Handel unter der Bezeichnung »Amberlite« C G. 50 geführte Harz. Dieses Material besitzt eine
solche Teilchengröße von 0,025 bis 0,04 cm; es ist ein synthetisches, schwach saures Kationenaustauschharz
vom Carbonsäuretyp, das in der Wasserstofform und in chromatographischem Reinheitsgrad vorliegt.
Vor Verwendung auf einem weißen Träger soll dieses Harz zu einer geeigneten dunklen Farbe, z. B.
Schwarz, durch Behandlung mit einer basischen Farbe gefärbt werden.
Scheinbar gibt es mit Bezug auf die Teilchengröße der feinverteilten (adsorbierenden) Materialien, die
verwendet werden, keine untere Grenze. Die Obergrenze der Teilchengröße kann nicht genau angegeben
werden. Sie hängt teilweise von der Fähigkeit der gebildeten Fällung, die Teilchen des feinverteilten
Feststoffs zu agglomerieren ab, und einige Fällungen haben offensichtlich eine stärkere agglomerierende
Wirkung als andere. Die angegebene Teilchengröße von 0,025 bis 0,04 cm und mehr liegt natürlich in
dem brauchbaren Bereich, jedoch kann dieser, allgemeiner ausgedrückt, als ein Bereich beschrieben
werden, der sich von submikroskopischen bis zu makroskopischen Teilchen erstreckt. Der brauchbare
Teilchengrößenbereich kann auch als ein Bereich beschrieben werden, bei dem ein Überzug einer
Suspension des feinverteilten Feststoffs auf einer glatten Oberfläche, wie Pappe, mit dem bloßen Auge
als glatt und gleichförmig, d. h. frei von sichtbaren einzelnen Teilchen, erscheint. Alle solchen Teilchen
sind zu einer sichtbaren Agglomeration in der Lage.
Aus der vorstehenden Beschreibung ist ersichtlich, daß der Träger eine glatte Oberfläche und mit dem
flüssigen Träger, der im allgemeinen aus Wasser besteht, der zu testenden Flüssigkeiten netzbar sein
muß und eine begrenzte Absorptionsfähigkeit hat oder halbdurchlässig oder undurchlässig sein kann,
wobei das letztere im allgemeinen bevorzugt wird. Der feinverteilte Feststoff kann adsorbierend oder
nicht adsorbierend sein, muß jedoch eine Kontrastfarbe mit Bezug auf den Träger haben und muß
ausreichend fein sein, um durch die durch die Antigen-Antikörper-Umsetzung gebildete Fällung agglomeriert
zu werden.
Die Erfindung ist besonders im Fall von Präzipitationsreaktionen von Wert, bei denen Lösungen der
Reaktionsteilnehmer, die frei von feinverteilten Feststoffen sind, umgesetzt werden, jedoch ist die Erfindung
gleichfalls zur Erzielung von Ergebnissen bei Agglutinationsreaktionen von Wert, bei denen die
eine oder die andere der Reaktionsmittelflüssigkeiten einen suspendierten, besser sichtbaren Feststoff enthält.
In diesem Fall verbindet sich der zugesetzte feine Feststoff, der eine Kontrastfarbe aufweist, mit
dem normalerweise in der Fällung anwesenden Feststoff, so daß die Ergebnisse der Fällung leichter
sichtbar werden.
Das bevorzugte erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, daß man einen geeigneten Träger mit
einer glatten, weißen, mit Wasser netzbaren, jedoch
im wesentlichen wasserundurchlässigen Oberfläche, z. B. einem 7,5 · 12,5 cm großen Stück eines Lochkartenkartons,
aussucht, der eine stark anhaftende Oberflächenschicht, wie Polyäthylen, hat und im
allgemeinen eine Stärke von 0,51 mm aufweist, (2) eine Suspension eines feinverteilten, vorzugsweise
adsorbierenden Feststoffs mit einer Kontrastfarbe mit Bezug auf den Träger, z. B. Aktivkohle in einer
wäßrigen Flüssigkeit, die das umzusetzende Antigen oder den Antikörper enthält, herstellt, (3) vorzugsweise
jedoch nicht notwendigerweise eine kleine Menge eines wasserlöslichen adhäsiven Mittels, wie
Methylzellulose oder gelöstes Kasein, in der Suspension löst, (4) einen Tropfen oder eine ähnliche Menge
der Suspension auf dem Träger ablagert, verteilt und trocknet, (5) vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise
den getrockneten verdampften Rückstand mit einer Lösung eines wasserlöslichen adhäsiven Materials,
wie Methylzellulose, oder gelöstem Kasein besprüht und getrocknet, (6) den Verdampfungsrückstand
mit einer geeigneten inerten Flüssigkeit, wie Wasser, einer Salz- oder Pufferlösung, benetzt, (7) die
auf die Antigen-Antikörper-Reaktion zu untersuchende Flüssigkeit auf den wieder benetzten Verdampfungsrückstand
aufbringt und darauf verteilt, (8) den Träger schüttelt oder schaukelt, wie es bei
der Durchführung von immunologischen Tests üblich ist und (9) die Oberfläche auf sichtbare Anzeichen
der Agglutination oder Agglomeration untersucht. Bei diesem bevorzugten Verfahren, bei dem die Suspension
der Feststoffe auf dem Träger getrocknet wird, ist es von Vorteil, d. h., es erleichtert das
Wiederbenetzen des getrockneten Uberzuges, eine kleine Menge eines Feuchtigkeitsmittels, wie Glyzerin,
in der Feststoffsuspension, die auf dem Träger aufgebracht wird, z. B. etwa 0,5 bis 1 Volumprozent
einzuarbeiten.
Wenn ein adsorbierender feinverteilter Feststoff, wie Aktivkohle, verwendet wird, wird die Antigen-
oder Antikörperlösung vorzugsweise mit einer kleinen Menge, z. B. einigen Milligramm des adsorbierenden
Mittels, gemischt, das Gemisch wird lange genug gerührt, um die Adsorption zuzulassen, dann
wird das Gemisch zum Absetzen gebracht oder zur Konzentration des das adsorbierende Antigen oder
den adsorbierten Antikörper enthaltenden Adsorptionsmittels zentrifugiert, falls diese Materialien in
der Flüssigkeit zugegen sind, das konzentrierte adsorbierende Mittel kann dann gewünschtenfalls gewaschen
werden, dann wird das adsorbierende Mittel in einer inerten Flüssigkeit, z. B. etwa 5 ecm Wasser,
wieder suspendiert, gewünschtenfalls wird ein wasserlösliches Klebemittel, wie Methylzellulose, und einem
Feuchtigkeitsmittel, wie Glyzerin, in einer Konzentration von 0,5 bis 1 % zugegeben, und die erhaltene
Suspension wird auf dem Träger abgelagert und zu einer verhältnismäßig dünnen gleichmäßigen Schicht
aufgestrichen und getrocknet. Das wasserlösliche Klebemittel, falls es verwendet wird, dient zur Stabilisierung
der Suspension der feinverteilten Feststoffe, und ferner führt es zu einer dauerhafteren getrockneten
Schicht der Suspension auf dem Träger. Die getrocknete Schicht aus feinverteiltem Feststoff kann
dauerhafter gemacht werden, d. h., es kann durch Aufbringung eines Films aus einem wasserlöslichen
Klebstoff, wie Methylzellulose, oder löslichem Kasein auf die Schicht nach einem Verfahren, bei dem die
Schicht nicht beeinträchtigt wird, z. B. durch Auf-
sprühen, verhindert werden, daß sie abgerieben wird. Eine verdünnte Lösung des Klebematerials, z. B. 1%
oder weniger, kann verwendet werden.
Wie oben bereits gesagt wurde, kann entweder das Antigen oder der Antikörper adsorbiert und mit
einer Lösung des jeweilig anderen Materials behandelt werden, jedoch wird vorzugsweise das Antigen
adsorbiert und mit einer Lösung des Antikörpers behandelt. Beispielsweise kann das Verfahren zur
Identifizierung einer Krankheit verwendet werden. In diesem Fall werden Testbereiche aus einem adsorbierenden
Mittel gebildet, auf dem das Antigen der vermuteten Krankheit adsorbiert wird. Dieses
Antigen kann von ganzen oder geteilten Zellen des erkrankten Materials, in dem das Antigen oder
Toxin innerhalb der Zellen sich befindet, oder von der Flüssigkeit (Kulturmedium), in dem die Zellen
des kranken Materials gezüchtet wurden, und die die Stoffwechselprodukte (Exotoxin) des kranken Materials
(z. B. Diphtherie, Tetanus) enthalten, adsorbiert werden. Trockene Bereiche des verdampften Rückstands
einer Suspension des adsorbierenden Mittels, das das Antigen enthält, werden dann gebildet und
mit der Flüssigkeit, von der angenommen wird, daß sie das Antigen des in Frage kommenden kranken
Materials enthält, z. B. das Blutserum einer Person, von der angenommen wird, daß sie Typhusträger ist,
behandelt.
Im Fall von Syphilis und einigen anderen Krankheiten kann das Antigen etwas anders ausfallen als
das spezifische, auf die Krankheit ansprechende Mittel, jedoch ist bekannt, daß es zu einer Umsetzung
mit dem Antikörper der Krankheit führt.
Die Testbereiche des getrockneten Rückstands einer Suspension eines adsorbierenden Mittels der
vorstehend angeführten Art können jede gewünschte Größe oder Form haben, z. B. kreisförmig, wie in
F i g. 3, quadratisch usw., oder, wie in F i g. 1 und 2 der Zeichnung angegeben, die Form von fallenden
Tropfen haben. Hinsichtlich der Größe wird bei der Form eines fallenden Tropfens eine Hauptachse von
etwa 18 mm und eine kleinste Achse von etwa 12 mm bevorzugt, während bei einem kreisförmigen Bereich
der Durchmesser 18 mm und bei einem quadratischen Bereich eine Seite 18 mm beträgt. Die Schicht auf
dem Bereich kann dadurch gebildet werden, daß man etwa einen Tropfen (V20 ecm) der adsorbierenden
Suspension aufbringt und verteilt. Die Suspension muß natürlich hinsichtlich des adsorbierenden Mittels
ausreichend konzentriert sein, um einen leicht erkennbaren Überzug zu geben, z. B. Grau im Fall
von Aktivkohle auf weißer Pappe.
Die Versuche können durchgeführt werden, ohne daß geschüttelt oder erwärmt wird, jedoch wird die
Entwicklung der Ergebnisse der Agglutinationsreaktion durch Schütteln der Testblätter bei 20 bis
40° C bevorzugt. Das Schütteln wird vorzugsweise auf einer horizontalen Platte vorgenommen, die
929 cm2 groß ist und bei etwa 120 bis 180 Bewegungen pro Minute mit einer exzentrischen Bewegung
voii etwa 15 mm gedreht wird. Der Effekt des Schütteins bei verschiedenen Rotationsgeschwindigkeiten
wird in den Zeichnungen angegeben.
F i g. 1 ist eine Draufsicht auf eine Reihe von fünf Tests, bei denen die Karte bei einer langsamen
Geschwindigkeit, d. h. etwa 120 U/min oder weniger mit einer großen exzentrischen Bewegung gedreht
wurde;
F i g. 2 ist eine Draufsicht auf die gleichen Tests, die bei höherer Drehgeschwindigkeit und kleinerer
exzentrischer Bewegung gedreht wurden;
F i g. 3 und 4 sind Draufsichten auf die vorderen bzw. Rückseiten eines Testblatts.
Wie durch einen Vergleich der F i g. 1 und 2 festgestellt wird, sind die agglutinierten Teilchen in
F i g. 2 stärker konzentriert oder agglomeriert als in Fig. 1.
ίο Wie bereits gesagt wurde, können die Tests ohne Schütteln der Karten, z. B. einfach durch Schaukeln
der Karten hin und zurück oder sogar ohne diese Bewegung durchgeführt werden, und die Agglutination
wird, falls sie vorhanden ist, leicht sichtbar, jedoch wird das das Schütteln nach der beschriebenen
Art bevorzugt, um die Agglomeration zu beschleunigen und die Testergebnisse klarer und unmißverständlicher
sichtbar zu machen.
Die in den F i g. 1 und 2 erläuterten Tests waren Typhustests. Die Testbereichel bis 5 wurden mit
Aktivkohle beschichtet, die das Typhusantigen enthielt, und die Testbereiche 1, 3 und 5 wurden mit
dem Serum einer Person behandelt, die Typhusfieber hat, während die Bereiche 2 und 4 mit Serum von
Personen bestrichen wurden, die nicht unter Typhus litten.
Beispiel 1
Herstellung der Testblätter
Herstellung der Testblätter
Typhusorganismen wurden in einem geeigneten Medium kultiviert. Ein Extrakt der Organismen wird
dann durch Autobiolyse der Zellen erhalten, und einige Milligramm feinverteilte Aktivkohle werden
zu dem Extrakt zugegeben, und das Gemisch wird wenigstens einige Minuten gerührt. Dann wird das
Gemisch zentrifugiert, und die Kohleteilchen werden gesammelt und mit 5 ecm Wasser verdünnt. 1 %
Methylzellulose wird in der erhaltenen Suspension gelöst und die erhaltene flüssige Schicht auf einer
weißen Testkarte ausgestrichen, so daß die in den Zeichnungen angegebenen Testbereiche erhalten
werden, die dann getrocknet werden. Die Pappe wurde vor Bildung der Testbereiche mit einem stark
verdünnten Zelluloseazetatlösung bestrichen, um eine wasserdurchlässige, proteinundurchlässige Oberfläche
zu bilden. Hier wie in den meisten Fällen kann eine wasserundurchlässige Oberfläche wie Polyäthylen,
gleichfalls auf das Testblatt aufgebracht werden.
Verwendung des Testblatts
Einem Patienten, von dem angenommen wird, daß er Typhus hat, wird Blut entnommen, und das Serum
wird gesammelt. Die Bereiche auf dem Testblatt werden jeweils mit einem Tropfen Wasser benetzt,
und dann wird ein Tropfen des Serums des Patienten zu den Bereichen 1, 3 und 5 zugegeben, während die
Bereiche 2 und 4 mit Blutserum benetzt werden, von dem feststeht, daß es keine Typhusantikörper enthält.
Die Testkarten werden dann in eine Laboratoriumsschüttelmaschine gegeben und bei 120 U/min geschüttelt.
Das Schütteln kann fortgesetzt werden, und die Karte wird von Zeit zu Zeit untersucht, bis die
Bereiche trocken sind und/oder keine weitere Entwicklung der Agglomeration stattfindet, z. B. nach
etwa 5 Minuten. Nach dem vorstehend beschriebenen Testverfahren unter Verwendung von unterschiedlichen
Verdünnungen der Blutseren des Patienten
gewinnt man eine Vorstellung von dem Titer des Serums durch Beobachtung der Testbereiche.
Beispiel 2
Test auf Syphilis
Test auf Syphilis
Es werden die üblichen VBRL-Alkohol- und Pufferlösungen verwendet. Nach Zugabe von 0,5 cm3
der Alkohollösung zu 0,4 cm3 der Pufferlösung auf übliche Weise werden 2,05 cm3 des Puffermaterials
zugegeben und nach bekannten Verfahren geschüttelt. Zu dieser Antigenlösung werden 1,5 mg Holzkohle
zugegeben und gründlich geschüttelt. Die erhaltene Holzkohlesuspension in Antigenlösung wird in einen
Kühlschrank gegeben und 24 Stunden abgestellt, die wahrscheinliche maximale Empfindlichkeit wird
jedoch nicht vor 36 bis 48 Stunden erreicht. Falls das Abstellen im Kühlschrank vorgenommen wird,
wird diese Empfindlichkeit wenigstens 3 bis 4 Tage aufrechterhalten. Wird die Antigenlösung-Holzkohlesuspension
bei einem Netztest verwendet, so wird ein Tropfen derselben mit einem Tropfen des Serums
auf einem Testblatt gemischt und 4 Minuten bei 160 bis 180 U/min auf einem klinischen Fisher-Rotator
gedreht. Im allgemeinen können die Ergebnisse, sobald die Karte getrocknet ist, abgelesen werden.
Um den Test auf einer Karte durchzuführen, auf der die Antigenlösung-Holzkohlesuspension getrocknet
wurde, müssen besondere Maßnahmen eingehalten werden, die nicht für alle Fälle angegeben werden Z°
können. Es wurde beim Experimentieren mit verschiedenen Materialien auf der Karte festgestellt, daß
etwas unterschiedliche Bedingungen für jeden Fall erforderlich sind. Im allgemeinen werden zwei- bis
dreimal soviel der holzkohlehaltigen Antigenlösung, wie sie bei dem Netztest verwendet wurde, auf der
Karte in Gegenwart von verschiedenen Mengen an Glyzerin und/oder Methylzellulose im Vakuum getrocknet.
Um den Test durchzuführen, wird gewöhnlich ein Tropfen Wasser zu dem getrockneten Bereich
zugegeben, und dann wird das zu testende Serum ausgestrichen. Nach gründlichem Mischen wird die
Karte bei etwa 130 bis 180 U/min in Abhängigkeit von dem auf der Karte befindlichen Material gedreht.
Die Ergebnisse werden vorzugsweise festgestellt, bevor die Karte trocken ist.
Mehrere Bedingungen, die für den Trockentest ausgearbeitet wurden, werden nachfolgend beschrieben.
Der Bereich, der zu trocknen ist, besteht aus einem Tropfen 2,5%igen Glyzerin und drei Tropfen einer
aus Antigen und Holzkohle bestehenden Suspension entsprechend der vorstehenden Beschreibung. Der
Bereich wird gemischt und gleichmäßig so ausgestrichen, daß der Testbereich bedeckt ist, und die
Karte wird im Vakuum bei Raumtemperatur 1 bis 2 Stunden getrocknet. Sie ist nun fertig, wobei lediglich
zu beachten ist, daß die Kontrollen während 1 bis 2 Tagen manchmal nicht so gut sind wie in
den Fällen, wo die Karte längere Zeit abgestellt wurde. Diese Karten werden bei Raumtemperatur
gelagert und gegen Feuchtigkeit geschützt.
Um den Test bei einer trockenen Karte vorzunehmen, wird ein Tropfen destilliertes Wasser zu
jedem Bereich zugegeben und dann ein Tropfen der Seren, die getestet werden sollen, aufgebracht. Jeder
Bereich wird gemischt, ausgestrichen und die Karte bei 160 bis 180 U/min während 4 Minuten gedreht.
Es wird darauf hingewiesen, daß die verwendeten Flüssigkeitsmengen sehr wichtig sind.
Eine Holzkohlesuspension in Wasser oder in einer verdünnten Lösung eines Klebemittels, wie Methylzellulose,
mit oder ohne Zugabe eines Feuchtigkeitsmittels, wie Glyzerin, wird in einzelnen Bereichen
auf eine Karte gebracht, die eine geeignete glatte weiße Oberfläche hat, und dann getrocknet. Dann
werden die Bereiche nacheinander mit den Antigen- und Antikörperlösungen benetzt oder zuerst mit
Wasser und dann nacheinander mit den wahrscheinlichen Antigen- und Antikörperlösungen benetzt,
durch Rühren gemischt, geschaukelt oder geschüttelt, während die Bereiche getrocknet werden und das
Auftreten der Agglomeration der Holzkohleteilchen beobachtet.
Im nachfolgenden wird ein Verfahren beschrieben, das von Vorteil ist, wenn eine große Anzahl von
Tests vorgenommen werden soll.
Aktivkohle wird in einer Antigenlösung suspendiert, und die Suspension wird in ein kleines Gefäß
eingeführt, verdampft und dann getrocknet, und die Flasche wird geschlossen, so daß sie gelagert und
später wiederverwendet werden kann. Die Holzkohlesuspension in der Antigenlösung kann auch zur
Trockne anderswo eingedampft werden, und der erhaltene Rückstand in eine verschlossene Flasche
zur späteren Verwendung eingeführt werden. Wenn das Material in der Flasche verwendet werden soll,
wird die Flasche geöffnet, eine kleine Menge, z. B. 2,5 ecm eines Verdünnungsmittels, wie Wasser, wird
zugegeben, und die Flasche wird erneut verschlossen und geschüttelt, um die Aktivkohle zu suspendieren.
Das Schütteln während eines kurzen Zeitraums, z. B. 10 Sekunden, ist im allgemeinen ausreichend. Die
alte Suspension kann unmittelbar verwendet werden, jedoch wird es im allgemeinen vorgezogen, sie für
eine kurze Zeit, etwa 15 Minuten, vor der Verwendung abzustellen. Die Menge der suspendierenden
Flüssigkeit, die zu der Flasche zugegeben wird, hängt natürlich von der Größe der Flasche und der Menge
der lyophilisierten Antigen-Holzkohle ab, die in ihr enthalten ist. Die oben angegebene Zahl von 2,5 ecm
ist für eine lyophilisierte Ablagerung von wenigen Milligramm geeignet. Das wieder suspendierte Gemisch
von Antigen und Holzkohle wird auf eine Testkarte in Bereichen ausgestrichen, etwa ein Tropfen
pro Bereich, und dann wird ein Tropfen des zu testenden Serums zu jedem Bereich zugegeben. Die
Bereiche werden gemischt, z. B. durch Rühren mit einem Zahnstocher, die Karte wird dann bei
160 U/min 4 Minuten geschüttelt, und die Ergebnisse werden abgelesen, während die Testbereiche noch
feucht sind.
Das vorstehende Verfahren ist von Vorteil, wenn eine große Anzahl von Tests vorgenommen werden
soll. Das Verfahren führt zu genauen Ergebnissen, die mit den Seren von positiven und negativen Patienten
getestet wurden, und die Ergebnisse wurden mit den Ergebnissen verglichen, die durch Verwendung
von frisch hergestelltem Antigen erhalten wurden. Das Verfahren hat den Vorteil, daß, falls eine große
Anzahl von Tests vorgenommen werden muß, es die
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Claims (2)
1. Verfahren zur Durchführung von Antigen-Antikörper-Reaktionen durch Ausstreichen der
beiden zu testenden Flüssigkeiten auf einer nahezu ebenen Unterlage mit glatter Oberfläche,
dadurch gekennzeichnet, daß dem Ausstrich ein feinverteilter Feststoff zugeteilt
wird, der gegenüber den Flüssigkeiten inert und darin unlöslich ist, daß der Ausstrich auf ein
benetzbares Blatt als Unterlage aufgebracht wird
und daß Feststoff und Unterlage in ihrer Farbe so aufeinander abgestimmt werden, daß ein möglichst
deutlicher Farbkontrast zwischen ihnen auftritt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Suspension dieses
feinverteilten Feststoffs in der einen Flüssigkeit auf der Unterlage ablagert und die andere Flüssigkeit
mit dieser Suspension mischt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als feinverteilten Feststoff
ein adsorbierendes Mittel verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als feinverteilten Feststoff
Aktivkohle verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die abgelagerte Suspension
vor dem Mischen mit der zweiten Flüssigkeit trocknet.
6. Testkarte zur Durchführung von Antigen-Antikörper-Reaktionen gemäß einem der Ansprüche
1 bis 5, bestehend aus einem festen Blatt mit einer glatten, benetzbaren Oberfläche, einem
darauf abgelagerten feinverteilten Feststoff, welcher eine Kontrastfarbe in bezug auf die Kartenoberfläche
hat, und einem Antigen oder Antikörper.
In Betracht gezogene Druckschriften:
H. Schmidt, »Fortschritte der Serologie«, 2. Auflage, 1955, S. 374;
H. Schmidt, »Fortschritte der Serologie«, 2. Auflage, 1955, S. 374;
L. Hallmann, »Bakteriologie und Serologie«, 1950, S. 411.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
709 608/195 6. 67 © Biindesdruckerei Berlin
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1962H0047107 DE1243423B (de) | 1961-06-22 | 1962-10-10 | Verfahren zur Durchfuehrung von Antigen-Antikoerper-Reaktionen |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US118824A US3074853A (en) | 1961-06-22 | 1961-06-22 | Serological test card with color solid as visualizing agent |
DE1962H0047107 DE1243423B (de) | 1961-06-22 | 1962-10-10 | Verfahren zur Durchfuehrung von Antigen-Antikoerper-Reaktionen |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE1243423B true DE1243423B (de) | 1967-06-29 |
Family
ID=25979949
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE1962H0047107 Withdrawn DE1243423B (de) | 1961-06-22 | 1962-10-10 | Verfahren zur Durchfuehrung von Antigen-Antikoerper-Reaktionen |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE1243423B (de) |
-
1962
- 1962-10-10 DE DE1962H0047107 patent/DE1243423B/de not_active Withdrawn
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
None * |
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