DE1227414B - Verfahren zum Stabilisieren von Cytochrom c - Google Patents
Verfahren zum Stabilisieren von Cytochrom cInfo
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Description
DEUTSCHES
PATENTAMT
AUSLEGESCHRIFT
Int. CL:
C12d
Nummer: 1227 414
Aktenzeichen: S 78193IV a/6 a
Anmeldetag: 24. Februar 1962
Auslegetag: 27. Oktober 1966
Die Erfindung bezieht sich auf ein neues und nützliches Verfahren zum Stabilisieren von Cytochrom c,
insbesondere gegen die Zersetzung durch optische und thermische Einwirkungen.
Wie allgemein bekannt ist, ist Cytochrom c ein rotes Protein, welches Hämin enthält, das ein wesentlicher
Faktor für den Mechanismus der Zellatmung ist, der bei fast allen Lebewesen in der Natur im
Bereich der Tiere, Pflanzen und Mikroorganismen vorkommt. Biochemisch gesehen nimmt das Cytochrom
c eine wichtige Stelle in dem Atmungsenzymsystem der Organismen ein, und es spielt eine Rolle
als geschwindigkeitsbestimmender Faktor bei der Oxydation der Zellengewebe in den Organismen. In.
dieser Hinsicht sind Versuche durchgeführt worden, um das Cytochrom c therapeutisch bei Krankheiten
anzuwenden, die durch unzureichende Atmungsoxydation der Zellen hervorgerufen zu sein scheinen.
Cytochrom c ist in der Therapie nützlich angewendet worden bei Gas- und Arzneimittelvergiftungen, bei ao
Arteriosklerose, Angina pectoris, Atembeschwerden bei der Lungenentzündung, Herzanfällen, Apoplexie
und ähnlichen Erkrankungen.
Die bisher zur Verfügung stehenden Cytochrom-c-Präparate, sei es in flüssiger oder in trockener Form,
werden beim Stehen am Licht oder in der Wärme verfärbt von hellorangeroter Farbe der reduzierten
Form des Cytochroms c zur dunkelbraunroten Farbe der oxydierten Form. Außerdem wird ihre enzymatische
Wirksamkeit beim Lagern unter der Einwirkung von Licht und Wärme vermindert. Es ist daher notwendig
und erstrebenswert, vor allem in der medizinischen Anwendung, die sowohl hohe Reinheit als
auch Homogenität der Beschaffenheit erfordert, die Cytochrom-c-Präparate genügend zu stabilisieren, um
ihr Aussehen und ihre Wirksamkeit auch nach längerer Lagerung unverändert zu erhalten.
Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Stabilisieren von Cytochrom c, insbesondere gegen
Zersetzung durch optische und thermische Einwirkungen, zu finden, welches es ermöglicht, Cytochrom c
für lange Zeit ein unverändertes Aussehen und hohe Stabilität zu verleihen.
Erfindungsgemäß wird der vorerwähnte erstrebte Zweck dadurch erreicht, daß man einer wäßrigen
Lösung des Cytochroms c d-Glucose, d-Galactose, d-Fructose, d-Mannose, L-Sorbose, Saccharose,
Maltose, d-Sorbit, d-Mannit, Glycylglycin, Glycylglycylglycin, Alanylglycylglycin, Leucylglycylglycin,
Histidin oder Lysin als Stabilisierungsmittel zusetzt und die so erhaltene Lösung gefriertrocknet.
Man kann die Lösung mit dem Stabilisierungs-Verfahren
zum Stabilisieren von Cytochrom c
Anmelder:
Sankyo Company Limited, Tokio
Vertreter:
Dipl.-Ing. K. Kiekeben, Patentanwalt,
Berlin 19, Kaiserdamm 28
Als Erfinder benannt:
Kazuo Nakanishi,
Hiroshi Mizushima,
Hamako Katano, Tokio
Kazuo Nakanishi,
Hiroshi Mizushima,
Hamako Katano, Tokio
Beanspruchte Priorität:
Japan vom 28. Februar 1961 (36-6140)
mittel vor der Gefriertrocknung sterilisieren. Weiter ist es zweckmäßig, vor der Hinzufügung des Stabilisierungsmittels
zu einer wäßrigen Lösung des Cytochroms c Ascorbinsäure zuzusetzen, um in bekannter
Weise die oxydierte Form des Cytochroms c, die möglicherweise teilweise oder völlig vorliegt, in die
reduzierte Form des Cytochroms c umzuwandeln, obwohl auch die gemischte Form des Cytochroms c
durch Hinzufügen des Stabilisators ebenfalls stabilisiert wird. Die angemessene Menge der zuzusetzenden
Ascorbinsäure beträgt wenigstens 0,1 % des Gewichts des Cytochroms c, sie beträgt aber zweckmäßig von
etwa 0,1 bis etwa 5,0 % des Gewichts des Cytochroms c. Die Zugabe der Ascorbinsäure in einer 5% des
Gewichts des Cytochroms e übersteigenden Menge ist zulässig, aber sie bringt keine besseren Ergebnisse.
Das Stabilisierungsmittel kann der Cytochrom-c-Lösung in Pulverform zugesetzt werden, es ist aber
zweckmäßig, das Stabilisierungsmittel in Form einer wäßrigen Lösung zuzusetzen, die zuvor durch Lösen
desselben in Wasser hergestellt wurde.
Die hohe Stabilisierungswirkung der Stabilisierungsmittel auf Cytochrom c gemäß der Erfindung ergibt
sich aus den Daten der folgenden Tabellen. Die Ergebnisse sind solche, die durch die unten beschriebenen
experimentellen Verfahren erhalten wurden.
Zu einer Lösung von Cytochrom c, die durch Zusetzen von Ascorbinsäure in einer Menge von 0,1 °/o
des Gewichts des Cytochroms c in die reduzierte Form umgewandelt wurde, wird ein Stabilisierungs-
609 708/56
mittel in Gewichtsmengen von 20, 50 und 100 % der Menge des Cytochrorns c hinzugefügt. Die erhaltene
Lösung wird gefriergetrocknet bei einer niedrigen" Temperatur und anschließend bei einer
Temperatur von 37° C 30 Tage lang stehengelassen. Das so gealterte gefriergetrocknete Cytochrom-c-Präparat
wird dann, in Wasser gelöst,.und von der wäßrigen Lösung wird das Absorptionsspektrum gemessen
bei einer Wellenlänge von 550 ηιμ (sichtbares
Licht) mit Hilfe eines Spektralphotometers.. Bei .derselben
Wellenlänge wie oben werden die Absorption von wäßrigen Lösungen koinzidierend gemessen,
von denen die eine einer beschleunigten Reduktion mit Hydrosulfit und die andere einer beschleunigten
Oxydation mit Ferricyanat unterworfen wurde, um die verbleibende. Menge in Prozent der reduzierten
Form des Cytochroms c zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt.
Der obenerwähnte Versuch wird wiederholt, mit der Ausnahme, daß die wäßrige Lösung des gefriergetrockneten
Cytochroms c in der oben beschriebenen Weise gemessen wird, jedoch ohne daß die wäßrige
Lösung des gefriergetrockneten Cytochroms c 30 Tage bei 37° C stehengelassen wurde. Die Menge der
reduzierten Form des Cytochroms c in der wäßrigen Lösung ist 100 %■ Diese Lösung wird also als Bezugslösung für die anderen Messungen verwendet.
Die in der folgenden Tabelle 1 waagerecht .neben den Stabilisierungsmitteln bzw. den Kontrollmessungen
angegebenen Zahlenwerte sind Prozentzahlen, die die Menge der reduzierten Form des Cytochroms c
angeben, bezogen auf die vorstehend beschriebene Bezugslösung.
■: '■■'-" ■-- TabeUe'l1 -" !zi: '-■-■"-"
Stabilisierung von Hefe-Cytochrom c
'Stabilisierungsmittel
d-Glucqse ,...,.. 60 68 73
d-Galactose Il 85 85
d-Fructose,... .· ,65 70 75
L-Sorbose 57 68 73
Sucrose 70 85 88
d-Sorbit 58 70 75
Histidin. , 40 : 50 55
Lysin 45 65 70
Glycylglycin 58 .83 82
Glycylglycylglycin ........... 60 85 85
Alanylglycylglycin 60 85 85.
Kontrollmessung (ohne Stabi·
lisierungsmittel) ·..'..:...,
lisierungsmittel) ·..'..:...,
Stabilisierung von Rinderherz-Cytochrom c
Zugesetzte Meng | 50 |
20 | 68 |
60 | 85 |
71 | 70 |
65 | 68 · |
57 | 85 |
70 | 70 |
58 | 50 |
40 | 65 |
45 | .83 |
58 | 85 |
60 | 85 |
60 | 30 |
Stabilisierungsmittel
d-Mannose : . .....
Maltose
d-Mannit .
Lysin '.'."
Glycylglycin
Leucylglycylglyciü
KontroUmessung (ohne Stabilisierungsmittel) .......
Zugesetzte Menge (%) 20 ' 50 100
60
72 55 65 75 74
72 85 61 76 87 85
50
A-. Die in; den oben beschriebenen Versuchen her^
gestellten gefriergetrockneten Cytochrom-c-Präparate wurden 30 Tage lang bei 45° C aufbewahrt,
und die erhaltenen Cytochrom-c-Präparate wurden in Wasser gelöst.
B. Die gleichen gefriergetrockneten Cytochrom-c-Präparate
wurden in Wasser gelöst, ohne stehen-. gelassen zu werden. Die so hergestellte Lösung B
dient als Bezugslösung. Ihre enzymatische Wirksamkeit wird gleich 100 % gesetzt.
Die verbleibenden enzymatischen Wirksamkeiten der wäßrigen Lösung von A werden gemessen und
verghchen mit denen der wäßrigen Lösung von B mit Hilfe eines Warburg-Manometers mit Keilin-Hartree-Präparat
aus Rinderherzmuskulatur als Cytochrom-Oxydase und Ascorbinsäure als Substrat. Die Ergebnisse
sind in TabeUe 2 zusammengestellt." AUe in der TabeUe 2 waagerecht neben den Stabilisierungsmitteln
ao bzw. den Kontrollmessungen angegebenen Zahlenwerte sind nach A hergestellten Lösungen zuzuordnen
und beziehen sich auf die gleich 100 gesetzte enzymatische Wirksamkeit der Lösung B.
TabeUe 2
StabiUsierung von Hefe-Cytochrom c
Stabilisierungsmittel
- d-Glucose
d-Galactose
d-Fructose ...
L-Sorbose .......
Sucrose
"- d-Sorbit .'
Histidin
Glycylglycin ....
Glycylglycylglycin
- Alanylglycylglycin
KontroUmessung (ohne Stabilisierungsmittel)
Zugesetzte Meng | 50 |
20 | 66 |
65 | 88 |
85 | 80- - |
75 | 64 |
60 | 88 |
85 | 65 |
60 | 80 |
75 | 73 |
70 | 90 |
90 | 90 |
90 | 89 . |
89 | 50 ■ |
Stabilisierung von Rinderherz-Cytochrom e
Stabilisierungsmittel
d-Mannose ..,
Maltose
d-Mannit
Lysin >
Glycylglycin
Leucylglycylglycin
KontroUmessung (ohne Stabilisierungsmittel)
Zugesetzte Menge (%), 20 I 50 I 100 ■
80 90 72 83 90 91
82 90 75 86 90 91
70
■ Beispiell
Zu 100 ml einer wäßrigen Lösung von Hefe-Cytochrom c in. einer Konzentration von 20 mg/mlj
wobei der. Gehalt an Cytochroni c mit optischen Methoden gemessen wurde, wird hinzugefügt eine
Lösung von 400 mg Glycylglycin in destiUierterii
Wasser, so daß sich ein Gesamtvolumen von 200 ml ergibt.. Die entstehende Lösung wird auf einem
Chamberland-Filter filtriert, und das Filtrat wird aseptisch in 1-ml-Lösungen aufgeteilt, die ohne Anwendung
von Wärme gefriergetrocknet werden.
Wie in dem vorangehenden Beispiel wird eine wäßrige Lösung von 100 mg Ascorbinsäure hinzugefügt
zu 100 ml einer wäßrigen Lösung von Hefe-Cytochrom c in einer Konzentration von 20 mg/ml.
Anschließend wird hinzugefügt eine wäßrige Lösung von 2000 mg Lysin, so daß sich ein Gesamtvolumen
von 200 ml ergibt. Die erhaltene Lösung wird in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 behandelt.
15 Beispiel 3
Zu 50 ml einer wäßrigen Lösung von Hefe-Cytochrom c in einer Konzentration von 20 mg/ml, wobei
der Gehalt an Cytochrom c durch die gleiche Methode wie im vorangehenden Beispiel gemessen
wurde, wird eine Lösung von 500 mg Glycylglycylglycin in destilliertem Wasser hinzugefügt, so daß
sich ein Gesamtvolumen von 100 ml ergibt. Die erhaltene Lösung wird in der gleichen Weise wie im
Beispiel 1 behandelt.
Zu 50 ml einer wäßrigen Lösung von Hefe-Cytochrom c in einer Konzentration von 40 mg/ml, wobei
der Gehalt an Cytochrom c durch optische Methoden gemessen wurde, wird eine Lösung von 2000 mg
d-Fructose in destilliertem Wasser hinzugefügt, so daß sich ein Gesamtvolumen von 100 ml ergibt. Die erhaltene
Lösung wird in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 behandelt.
Die durch die Beispiele 1 bis 4 erhaltenen gefriergetrockneten Cytochrom-c-Präparate wurden 30 Tage
bei 37 0C stehengelassen. Die so gealterten gefriergetrockneten
Cytochrom-c-Präparate wurden in Wasser gelöst, und der verbleibende Betrag (%) der reduzierten
Form des Cytochroms c in einer jeden der Lösungen wurde in der oben beschriebenen Weise mit Hilfe
eines Spektrophotometers gemessen (vgl. Erläuterungen zu Tabelle 1).
Die durch die Beispiele 1 bis 4 erhaltenen gefriergetrockneten Cytochrom-c-Präparate wurden 30 Tage
bei 45 0C stehengelassen. Die erhaltenen Cytochrom-c-Präparate
wurden in Wasser gelöst, und die verbleibende enzymatische Aktivität in einer jeden der
Lösungen wurde in der oben beschriebenen Weise mit Hilfe eines Warburg-Manometers gemessen (vgl.
Erläuterungen zu Tabelle 2). Die Ergebnisse sind aus Tabelle 3 zu ersehen.
Verbleibende Menge | Verbleibende | |
der reduzierten Form | enzymatische | |
I f A« flMf aI | des Cytochroms | Aktivität |
Jüeispiei | nach 30 Tagen | nach 30 Tagen |
bei 37°C | bei 45° C | |
(7a) | (°/„) | |
1 | 58 | 90 |
2 | 70 | 80 |
3 | 85 | 90 |
4 | 75 | 80 |
Claims (1)
- Patentanspruch:Verfahren zum Stabilisieren von Cytochrom c, insbesondere gegen Zersetzung durch optische und thermische Einwirkungen, dadurch gekennzeichnet, daß man einer wäßrigen Lösung des Cytochroms c d-Glucose, d-Galactose, d-Fructose, d-Mannose, L-Sorbose, Saccharose, Maltose, d-Sorbit, d-Mannit, Glycylglycin, Glycylglycylglycin, Alanylglycylglycin, Leucylglycylglycin, Histidin oder als Stabilisierungsmittel Lysin zusetzt und die so erhaltene Lösung gefriertrocknet.In Betracht gezogene Druckschriften:
O. Hoffmann-Ostenhof; »Enzymologie«, 1954, S. 548.609 708/55 10.66 © Bundesdruckerei Berlin
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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JP614061 | 1961-02-28 |
Publications (1)
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