DE2036113C3

DE2036113C3 - Wäßriges Tetramisolpräparat

Info

Publication number: DE2036113C3
Application number: DE2036113A
Authority: DE
Inventors: Bruce Adam Croydon Forsyth; David Ernest Balwyn Pryor
Original assignee: ICI Australia Ltd
Current assignee: Orica Ltd
Priority date: 1969-07-21
Filing date: 1970-07-21
Publication date: 1979-09-06
Also published as: FR2059540B1; DE2036113A1; FR2059540A1; BE753711A; US3670085A; GB1287674A; DE2036113B2

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein wäßriges Tetramisolpräparat, das sich zur Injektion für die Bekämpfung der ί !elrninthiasiä bei Warmblütern, wie ;ii z. B. Rindern, Schweinen, Schafen oder Geflügel, eignet, das in den Ansprüchen im einzelnen gekennzeichnet ist

Aus der GB-PS 10 43 489 ist es bekannt, daß D,L-23Ä6-Tetrahydro-6-phenylimidazi)-(2,l-b-)-thiazol (welches in der Folge als D,L-Tetramisol abgekürzt r. wird) und seine therapeutisch brauchbaren Säureadditionssalze wirksame Antihelmintica sind. Es ist auch bekannt, daß linksdrehendes Tetramisol, welches in der Folge als !.-Tetramisol bezeichnet wird, als Antihelmintica nahezu zweimal so aktiv wie D,L-TetramisoI ist, das w heißt, daß L-Tetramisol für nahezu die gesamte oder den größten Teil der antihelmintischen Wirkung verantwortlich ist. In der DE-OS 17 95217 ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Tetramisol in hochreiner Form beschrieben. Da die bei Warmblütern r. zulässige Menge an rechtsdrehenden Tetramisol (in der Folge als D-Tetramisol bezeichnet) nahezu gleich der zulässigen Menge an L-Tetramisol ist, macht es die Herstellung von reinem L-Tetramisol möglich, das Risiko von toxischen Reaktionen beim behandelten Tier m beträchtlich zu verringern. Zwar besitzt das L,D-Tetramisol-Racemat bei den meisten Tierarten eine hohe Sicherheitsgrenze, aber die praktisch doppelte Sicherheitsgrenze des L-Isomers hat einen großen Wert, wenn dieses L-Iiomer draußen auf dem Lande unter einer π mehr oder weniger guten Kontrolle verabreicht wird, und zwar insbesondere unter den extremen Bedingungen der Schaf- und Rinderzucht im australischen Hinterland oder in den weiten Gebieten der USA, wo längere Dürreperioden die Widerstandsfähigkeit der -,o einzelnen Tiere in unvorhersehbarer Weise verringern können. Außerdem erleichtert die Herstellung von reinem L-Tetramisol die Verabreichung durch subkutane Injektion,da niedrigere Dosen erforderlich sind.

Zwar kann Tetramisol per os verabreicht werden, r, aber die Verabreichung durch Injektion wird bevorzugt. Rinder und insbesondere im Freien gezüchtete Rinder widersetzen sich einer Verabreichung von medizinischen Präparaten per os, weshalb komplizierte Gestelle und Geschirre erforderlich sind, um diese Verabrei- w> chung durchführen zu können. Die Verabreichung von medizinischen Präparaten an Rinder durch Injektion ist viel einfacher, erlaubt die Verabreichung an viel mehr Tiere je Zeiteinheit und beinhaltet weniger Risiko für Mensch und Tier. Auch bei Schafen, Schweinen und μ Geflügel wird zur Zeit die Injektion bevorzugt. Jedoch hat sich die Verabreichung von Tetramisollösungen durch Injektion als nicht ganz zufriedenstellend erwiesen. Die injizierte therapeutische Dosis ist dem Körpergewicht proportional und deshalb bei Rindern verhältnismäßig groß. Ein sehr kleiner Anteil der Tiere zeigt an der Injektionsstelle eine Empfindlichkeit und unter Umständen sogar unerwünschte pathologische Reaktionen, die von einer schwachen Reizung bis zur Bildung von Knoten reichen, welche einen Durchmesser von einigen mm bis mehrere cm aufweisen können.

Zwar ist die statistische Häufigkeit dieser Erscheinung äußerst gering, aber trotzdem hat sie die Verabreichung durch Injektion an vielen Orten verhindert Deshalb ist die Beseitigung dieser Erscheinung nach wie vor äußerst erwünscht Die in vielen Ländern weit verbreitete Verabreichung von Tetramisol erfolgt nahezu ausschließlich in Form seines Halogenid- und insbesondere Chloridsalzes in wäßrigen Präparaten, wobei häufig kleine Zugaben eines Phosphat- oder Citratpuffers erfolgen, und zwar gewöhnlich weniger als 0,03 Mol/l, um den pH etwas geringer zu uäken als der nümiaie pH des Hydrochlorids, der ungefähr 4 beträgt Diese pH-Einstellung erfolgte nur zu dem Zweck, die Lagerfähigkeit der Lösungen zu erhöhen, da Tetramisol einer basisch katalysierten Hydrolyse in ein inaktives Derivat unterliegt

Die phathologische Empfindlichkeit, die bei bestimmten Tieren nach der Injektion des Hydrochlorids und auch des Acetats beobachtet wurde, wurde bisher allergischen Reaktionen gegen das organische Tetramisolmolekül zugeschrieben, wie z. B. Reizwirkung oder Histaminabsonderung.

Aus diesem Grunde haben sich Überlegungen bezüglich der biologischen Verträglichkeit insbesondere der Verträglichkeit bei Injektionen, bisher auf die Wirkung des Tetramisolmoleküls oder von Analogen desselben konzentriert.

Es wurde nunmehr gefunden, daß die Erfordernisse für die therapeutische Verträglichkeit von Tetramisolsalzen für Injektionen sich von denjenigen für Verabreichung per os unterscheiden. Insbesondere wurde festgestellt, daß die Natur und die Konzentration weiterer in der Lösung anwesender Ionen das lebende Gewebe in verschiedenem Ausmaß beeinflussen. Es wird angenommen, daß osmotische und elektroosmotische Effekte bei gewissen empfindlichen Tieren die Triebkraft für Beschädigungen in den Zellwandungen sind und daß diese durch den Zusatz einer geeigneten Menge gewisser Zusätze beseitigt werden kann.

So wird also gemäß der Erfindung ein wäßriges Tetramisolpräparat, das zur Injektion für die Bekämpfung der Helminthiasis bei Warmblütern geeignet ist, vorgeschlagen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es Tetramisolacetat oder -hydrochlorid entsprechend mindestens 6% (G/V) der Tetramisolbase und zusätzlich 0,1 bis 0,5 Mol eines Natriumsalzes von Zitronen-, Weinoder Phosphorsäure pro Liter Lösung enthält.

In völlig überraschender Weise wurde gefunden, daß die erfindungsgemäße Auswahl der Salze eine Unterdrückung unerwünschter Begleitreaktionen beim Injizierenbewirkt.

Es hat sich gezeigt, daß ein Maß für die therapeutische Verträglichkeit von Injektionen aus wäßrigen Tetramisoladditionssalzlösungen durch einen einfachen Hämolysetest erhalten werden kann. Wenn eines der Tetramisolsalze, welches für subkutane Injektionen weniger geeignet ist, unter Standardbedingungen mit Rinderblut gemischt wird, dann erleidet ein Teil der roten Blutkörperchen eine I lämolyse und das Blutserum verfärbt sich in einem Ausmaß, das vom Hämolysegrad

abhängt Bei den erfindungsgemäßen Präparaten ist dagegen nur eiine geringe oder gar keine solche Hämolyse zu beobachten. Wenn die roten Blutkörperchen dann durch Zentrifugierung der Losung abgetrennt werden, dann ist die verbleibende Farbe des Blutserums ein quantitatives MaB für die Hämolyse. Es ist nicht bekannt, ob in vivo eine gewisse Hämolyse im Gewebe des Tieres auftreten kann oder ob die Hämolyse, welche das Blut im in vitro-Test zeigt, bloß eine Erscheinung ist, die mit der Schädigung des Gewebes in vivo zusammenhängt, aber es wurde gefunden, daß der Grad der Hämolyse weitgehend mit dem Auftreten einer Empfindlichkeit gegen Injektionen bei solchen lebenden Tieren zusammenhängt, die eine Empfindlichkeit gegenüber Tetramisolhydrochloridode'r Tetramisolacetatinjektionen zeigen.

Der Hämolysetest

Der Test wird mit einem heparinierten vernösen Blut ausgeführt, das entweder von einzelnen Tieren oder vorzugsweise von mehreren Tieren, die später injiziert werden sollen, stammt.

Verfahren

In eine Reihe von Zentrifugengläschen mit einem Fassungsvermögen von mindestens 10 ml werden 2 ml der wäßrigen Lösung des zu prüfenden Tetramisolsalzes einpipettiert, worauf rasch unter Rühren 4 ml eines ganzen heparinierten venösen Bluts zugesetzt werden und das Zentrifugen.v'äschen 20 min in ein Wasserbad mit 38°C eingebracht wird. Hierauf wird unmittelbar mit mindestens der 1500/achen Erdbeschleunigung zentrifugiert, um die roten Blutkörperchen abzuscheiden, worauf die Farbe des überstehenden Plasmas mit einer Reihe von Standards verglichen wird, die wie folgt hergestellt werden:

Lösung I

Es wird eine Menge Rinderserum (vorzugsweise aus dem gleichen Blut) durch Zentrifugierung von nichthämolysiertem Blut wie oben beschrieben hergestellt.

Lösung 2

Es wird hämolysiertes Blut hergestellt, indem 4 Volumina Blut mit 2 Volumina 15%ige (G/V) Tetramisolhydrochloridlösung verdünnt werden und die Mischung 20 min auf 38° C gehalten w ird.

Hierauf werden Standards durch Mischung der Lösungen I und 2 in den in der Folge angegebenen Verhältnissen hergestellt.

Hämolyseeinstufung	nicht brauchbar	Mischung	ml Lösung 2
		ml Lösung 1	0 0,05
<. brauchbar ³ I		10 9,95	0,1
1		9,9	0,25
2		9,75	1,0
3	9,0	2,5
4	7,5	4,0 5,5
5 6	6,0 4.5	7,0
7	3,0	8,5
8	1,5	9,5
9	0,5	10
10	0

Die Einstufung O wird gegeben, wenn überhaupt keine Hämolyse auftritt Die Einstufung S zeigt einen vernachlässigbaren Effekt an. Diese Einstufungen charakterisieren die erfindungsgemäßen Präparate. Die Einstufungen von 1 bis 10 bezeichnen verschiedene Hämolysegrade bis zur vollständigen Hämolyse. Sie treten bei den bisher verwendeten Hydrochlorid- und Acetatsalzen auf.

Der Zusatz von Natriumdihydrogenphosphat wird

in besonders bevorzugt Gewöhnlich wird ein Mononatriumsalz verwendet obwohl vom Standpunkt der therapeutischen und biologischen Verträglichkeit die stärker alkalischen Salze nicht ungeeignet sind. Im Hinblick auf die Lagerungserfordernisse sind sie jedoch

π nicht praktisch, da Tetramisol hydrolytisch instabil ist Es können auch Gemische der erwähnten Salze verwendet werden.

Da L-Tetramisol therapeutisch wirksamer ist als das

Racemat, kann es in kleineren Mengen Injektionsflüs-

2r, sigkeit verabreicht werden. Das erfindungsgemäße Präparat enthält deshalb das Tetramisol vorzugsweise in der L-Form.

Wenn als Folge der Auswahl eines bestimmten Natriumsalzes der pH das Optimum von 4 überschreitet, r> dann kann der pH durch Zusatz einer Säure mit einem therapeutisch verträglichen Anion, beispielsweise Weinsäure, Zitronensäure oder vorzugsweise Phosphorsäure, eingestellt werden.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele w näh zv :rläutert, in denen alle Verhältnisse als Gewicht/ Volumen-Äquivalent zur freien Tetramisolbase angegeben sind, sofern nichts anderes erwähnt ist.

Beispiele 1 bis 3

Sterile wäßrige Lösungen, die sich für Injektion eigneten, wurden aus verschiedenen Tetramisolsalzlösungen mit verschiedenen Konzentrationen, wie sie in den Tabellen 1 und 2 angegeben sind, hergestellt.

4(i Zusätzlich zu diesen Salzen wurden die folgenden Verbindungen, die üblicherweise in Tetramisolpräparaten des Standes der Technik verwendet werden, zugesetzt: 2 g Natriummetabisulfit, 0,5 g Methyl-paraoxybenzoat und 0,05 g Propyl-para-oxybenzoat/1000 ml

4') Wasser.

Aus verschiedenen großen Herden wurden Rinder ausgewählt, welche während früherer Versuche eine Empfindlichkeit gegen Tetramisolhydrochloridinjektionen zeigten. Diese Auswahl war nötig, da der größte

Vi Teil der Tiere keinerlei ungünstige Reaktion gegen die Injektion von Tetramisol zeigt und die Häufigkeit einer Empfindlichkeit unter normalen Rindern so extrem gering ist, daß eine sehr große Anzahl von Rindern behandelt werden müßte, bevor irgendeine wesentliche

v> Neigung für eine Reizung beobachtet werden kann. Es ist bekannt, daß die Empfindlichkeit gegen Injektionen irgendwelcher Medikamente zwischen verschiedenen Tieren verschieden ist und daß sie sogar bei einem einzigen Tier von Injektionsstelle zu Injektionsstelle

wi sich ändert. Um diese Nebeneffekte zu beseitigen oder gering zu halten, wurden verschiedene Behandlungen willkürlich an verschiedenen Stellen, wie auch an verschiedenen Tieren vorgenommen, wobei soweit wie möglich Paare von identischen linken und rechten

hi Stellen ausgewählt wurden. Die sterilen Präparate wurden subcutan injiziert, nachdem an der Injektionsstelle die Haare abrasiert worden waren, um die Beobachtung zu erleichtern.

Eine Überprüfung der Gewebereaktion an der Injektionsstelle wurde in regelmäßigen Abständen während 14 Tage durchgeführt Die Art der Reaktion an jeder Stelle wurde wie folgt eingestuft:

■5

0 keine Reaktion,

1 schwache Hautverdickung und leichte Schwellung des subcütanen Gewebes, unterste Grenze, die nur durch Palpation feststellbar ist,

2 ähnlich wie Einstufung 1, aber etwas ausgeprägter, 4 Schwellung bis zu ungefähr 25 mm Durchmesser sichtbar, leichte Erhebung über die Körperoberfläche,

8 starke Schwellung bis zu 10 cm Durchmesser mit einer Erhebung von ungefähr 6 bis 25 mm von der Körperoberfläche,
16 größere Schwellung als bei 8.

Die exponentiell Zunahme der Einstufungswerte stellt das zunehmende Ausmaß der Reizung iii Rechnung.

Die Einstufungen 0 bis 4 wären ohne Ab^rasieren der Haare in der Praxis überhaupt nicht zu bemerken, aber Einstufungen von 8 und darüber sind merklich und unerwünscht; die Einstufung 16 ist unannehmbar.

Da eine große Anzahl von Behandlungen nicht gleichzeitig in zufriedenstellender Weise paarweise und mit einer ausreichenden Anzahl Tieren statistisch durchgeführt werden kann, und um einen Hinweis auf die statistischen Veränderungen auf Grund des Klimas, der Biologie (Alter, physischer Zustand, Geschlecht) und andere zufällige Faktoren zu erhalten, wurden verschiedene Gruppen von Versuchen ausgeführt, und ihre Ergebnisse wurden in gesonderten Tabellen festgehalten. Die Summe der Einstufungen der Tiere in einer jeden Gruppe (gesamte Einstufung), dividiert durch die Anzahl der Tiere ergab den Parameter Einstufung/Tier, der ein umgekehrt proportionaler Ausdruck für die Verträglichkeit des injizierten Präparats ist. Einstufun-

Tabelle I

20 gen untPr4,0 sind zufriedenstellend, unter 2,0 sind sie gut und unter 1,5 sind sie vorzüglich. Alle in den Tabellen angegebenen Zahlen sind statistisch beim 1 in 100-Wert oder noch höher bedeutsam.

In den Versuchen I bis 3 wurden 3 Präparate aus einem L-Tetramisolsalz des Standes der Technik, nämlich L-Tetramisolhydrochlorid, hergestellt und durch Injektion in die ausgewählten Testtiere geprüft. Da das Auftreten einer Reizung bei den üblicherweise verwendeten Konzentrationen (6,38% [G/V], ausgedrückt als freie Base) sogar bei ausgewählten empfindlichen Testtieren so selten ist, daß sie nur bei sehr groß angelegten Versuchen demonstriert werden kann, wurde die Konzentration des L-Tetramisolhydrochlorids um 30%, nämlich auf 8,5% (G/V) freie Base erhöht, um die Empfindlichkeit zu steigern. Diese Lösung A wurde als Vergleich (Stand der Technik) verwendet. Eine Natriumdihydrogencitratmenge (0,072 Mol), ent sprechend mehr als dem Doppe!..--ti der üblicherweise ais Puffer verwendeten Menge, wuide ais Puffer in der Lösung B zugesetzt (als Vergleich gemäß dem Stand der Technik). Diese Menge ist größer als das Maximum, das man normalerweise für eine Pufferwirkung verwendet. Schließlich wurde auch noch eine Lösung gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt, indem eine große Menge, nämlich 0,290 Mol, Mononatriumdihydrogencitrat zugesetzt wurde. Diese 3 Präparate wurden in 24 Tiere injiziert (jeweils mit 2 identischen Injektionsstelien rechts und links), und zwar entsprechend einem statistischen Schema, wobei die 3 Behandlungen auf Gruppen von 8 Tieren in Paaren über identische rechte und linke Stellen an einem jeden Tier verteilt waren, so daß 16 Injektionen für jede Behandlung verwendet wurden. Auf diese Weise wurden Zufallseffekte klein gehalten, indem identische Stellen wilikürlich und in Paaren verwendet wurden. Die Resultate sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.

Die Unterschiede zwischen den Einstufung/Tier-Werte waren statistisch beim 1 in 10C-Wert bedeutsam.

Bsp. Nr.	Präparat	Einstufung 10 8	4	2	1	0	2	Anzahl der Tiere	Zusatz	Gesamte Ein stufung	Ein stufung/ Tier	Relative Lin- stu fung
I	Lösung A	2	7	5	0	6	16	54	3,4	6,8
2	Lösung B	2	3	3	2	10	16	36	2,3	4,6
3	Lösung C			I	6		16	8	0,5	1
Lösung	L-Tetramisolsalz

A L-Tetramisolhydrochlorid

B L-Tetramisoihydrochlorid

C L-Tetramisolhydrochlorid

8,5% (G/V), bezogen auf freie Base = 0,415 Mol 8,5% (G/V), berechnet als freie Base = 0,415MoI

8,5% (G/V), berechnet als freie Base = 0.415MoI nichts

plus 1,55% (G/V) Mononatriur-

dihydrogencitrat

(= 0,0725MoI)

plus 6,2% (G/V) Monona'rium-

dihydrogencitrat

(= 0,290MoI)

3eispiele 4 bis 6

Die Versuche 1 b^:r 3 wurden mit einer kleineren Gruppe von Rindern (21) wiederholt, wobei ein ähnliches statistisches Schema verwendet wurde (14 Behandlungen je Lösung). Zusätzlich zu den obigen wurden Hämolyseversuche mit den Lösungen A, B und C ausgeführt, um den Zusammenhang mit der Verträglichkeit der Lösungen zu bestimmen. Die Resultat»; sind in Tabelle 2 angesehen.

Tabelle 2

Versuch Präparat

Einstufung 16 8

4	Lösung Λ	2	6	6	0
5	Lösung B	I	I	6	4
6	Lösung C			!	3

Anzahl Gesamt- Ein- Hämoly

der einstufung stufung/ setest-

Tiere Tier einstufung

14	104	7.4	9 bis	10
14	57	4.!	4
14	14	I	U

Eine statistische Auswertung der Resultate der Tabelle I, 2 und 3 ergab, daß die Hämolysetesteinstufungen Resultate ergaben, die mit den Einstufungen übereinstimmten, die bei tatsächlichen Tierversuchen auf der Basis dieser Serie gefunden wurden.

Claims

Patentansprüche:

1. Wässeriges Tetramisolpräparat, das zur Injektion für die Bekämpfung der Helminthiasis bei Warmblütern geeignet ist, dadurch gekennzeichnet, daß es Tetramisolacetat oder -hydrochlorid entsprechend mindestens 6% (G/V) der Tetramisolbase und zusätzlich 0,1 bis 0,5 Mol eines Natriumsalzes von Zitronen-, Wein- oder Phosphorsäure pro I Lösung enthält. in

2. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der pH durch Zusatz von Weinsäure, Zitronensäure oder Phosphorsäure auf einen Wert von 2 bis 4 eingestellt worden ist.