DE1222054B - Verfahren zur Herstellung von neuen delta 1,4-3-Oxo-androstadienverbindungen - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. Cl.:

C07c

Deutsche Kl.: 12 ο-25/04

Nummer: 1 222 054

Aktenzeichen: C 27963 IV b/12 ο

Anmeldetag: 19. September 1962

Auslegetag: 4. August 1966

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von neuen zl^-S-Oxo-androstadienverbindungen auf mikrobiologischem Wege durch Inkubation von Steroiden der Pregnan- oder Androstanreihe mit Pilzen der Art Fusarium solani oder daraus gewonnenen Enzymen unter aeroben Bedingungen.

In der deutschen Patentschrift 956 952 ist ein Verfahren zum biochemischen Abbau der Seitenkette von Pregnanverbindungen zu Androstan verbindungen ίο und gegebenenfalls Aufspaltung des Ringes D beschrieben, wobei gleichzeitig in 1(2)- und gegebenenfalls in 4(5)-Stellung eine Doppelbindung eingeführt wird; es ist dadurch gekennzeichnet, daß man in 3- und 20- bzw. 17-Stellung durch Sauerstoff-Funktionen substituierte Verbindungen der Pregnan- bzw. Androstanreihe, z. B. mit Pilzen der Arten Fusarium solani oder Fusarium caucasicum, inkubiert. So lassen sich z. B, Progesteron, J⁵-3jS-Oxy-20-oxopregnen, ll-Desoxy-corticosteron oder 3,20-Dioxoallopregnan in einer Verfahrensstufe in Δ^1Α-3,Π-Όϊ-oxo - androstadien bzw. 1,2 - Dehydrotestololacton überführen.

Es wurde nun gefunden, daß man zu neuen ^i.4_3_Oxo-androstadienverbindungen gelangt, wenn man Pilze der Art Fusarium solani oder daraus gewonnene Enzyme unter aeroben Bedingungen auf 18,11/9-Lactone von ll^-Hydroxy-18-säuren der Pregnan- oder Androstanreihe, welche in 3-Stellung eine freie oder veresterte Hydroxygruppe oder eine Oxogruppe, in 20-Stellung der Pregnanverbindungen eine Oxogruppe bzw. in 17-Stellung der Androstanverbindungen eine Oxogruppe oder eine freie oder veresterte Hydroxygruppe aufweisen, einwirken läßt und das erhaltene Oxydationsgemisch nach bekannten Methoden auftrennt.

Neben der Oxydation, die zum Abbau der Pregnanseitenkette zur Oxogruppe, zur Dehydrierung einer 3-ständigen Hydroxylgruppe und zur Einführung des 1,4-Dien-Systems im Ring A führt, findet eine Eliminierung der 18-Säuregruppe statt, wobei man zu Verbindungen der 18-Nor-Reihe gelangt. Doch können auch Verbindungen mit

O—CO

Verfahren zur Herstellung von neuen z(i.4-3-Oxo-androstadienverbindungen

Anmelder:

CIBA Aktiengesellschaft, Basel (Schweiz)

Vertreter:

Dr.-Ing. Dr. jur. F. Redies,

Dipl.-Chem. Dr. rer. nat. B. Redies und Dr. D. Türk, Patentanwälte, Opladen, Rennbaumstr. 27

Als Erfinder benannt:

Dr. Albert Wettstein, Riehen;

Dr. Ernst Vischer,

Dr. Jakob Urech, Basel (Schweiz)

Beanspruchte Priorität:

Schweiz vom 21. September 1961 (10 972)

intakter 18,11^-Lactongruppe, dem zl^- System im Ring A und einer Oxo- oder Hydroxylgruppe in 17-Stellung gefaßt werden. Die Bildung des einen oder des anderen dieser verschiedenen Reaktionsprodukte ist von der Dauer der Inkubation abhängig.

Die verfahrensmäßige Reaktion wird im folgenden Schema am Beispiel des 18,11^-Lactons der A⁴-3,20-Dioxo-1 lß-hydroxy-pregnen-18-säure gezeigt:

O—CO

CH₃

Ai

609608/438

Im Laufe der Reaktion entstehen anfänglich die Verbindungen vom Typus Ai, während bei längerer Inkubationszeit die Produkte vom Typus A2 bis A4 zu überwiegen beginnen.

Zur Kultur des Pilzes eignen sich die an sich hierfür bekannten Medien, z. B. solche mit Zuckern, wie Glukose oder Lactose, mit Peptonen, Maisquellwasser, Sojaprodukten u. dgl, sowie mit Mineralsalzen oder synthetische Nährlösungen. Man arbeitet unter aeroben Bedingungen, beispielsweise inSchüttelkultur oder bei submersen Kulturen unter Rühren und Luftzufuhr. Die verfahrensgemäße Reaktion findet in der beschriebenen Pilzkultur bzw. mit Hilfe der darin enthaltenen, gegebenenfalls angereicherten oder abgetrennten Enzyme statt, im einfachsten Fall also in einer Aufschwemmung des abgetrennten Pilzmycels, des homogenisierten Pilzmycels oder in Filtraten bzw. wasserhaltigen Extrakten davon.

Als Ausgangsstoffe für das neue Verfahren verwendet man gesättigte oder ungesättigte 18,llß-Lactone von lljS-Hydroxy-18-säuren der Pregnan-, AlIopregnan- oder Androstanreihe. Sie können Doppelbindungen enthalten, z. B. in 1-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8- oder 14-Stellung, oder zusätzliche Substituenten aufweisen, wie freie oder geschützte Oxy- oder Oxogruppen, ferner Epoxygruppen, Halogenatome, oder Alkyl-, besonders niedere Alkylgruppen, wie Methylgruppen, beispielsweise in 2-, 6-, 7-, 15-, 16- oder 21-Stellung. Die genannten Ausgangsstoffe umfassen auch solche der 19-Nor-Reihe. Eine geschützte Oxygruppe ist eine mit einer aliphatischen, aromatischen oder heterocyclischen Carbonsäure, beispielsweise Essigsäure, Propionsäure, Benzoesäure oder Furancarbonsäure, veresterte oder eine verätherte Oxygruppe, z. B. die Tetrahydropyranyloxy-, Benzyloxy- oder Triphenylmethoxygruppe. Eine geschützte Oxogruppe ist z. B. eine ketalisierte Oxogruppe, abgeleitet insbesondere von einem zweiwertigen Alkohol, wie die Äthylendioxygruppe. Spezifische Ausgangsstoffe sind z. B. 18,11^-Lactone der zl⁴-3,20-Dioxo-llß-hydroxy-pregnen-18-säure, zl⁴-3,20-Dioxo-ll/S,14-dihydroxy-pregnen-18-säure, A⁵- oder zl⁴-3,ll^-Dihydroxy-20 - oxo- pregnen -18 - säure, zl⁴ - 3,20 - DioxolljS,21-dihydroxy-pregnen-18-säure, zl⁴-3,17-Dioxoll,9-hydroxy-androsten-18-säure,. zl⁴-3-Oxo-ll,S,17-dihydroxy-androsten-18-säure, zl⁴-3,ll^-Dihydroxy-17 - 0x0 - androsten -18 - säure, D - zl¹·⁴ - 3,20 - Dioxo- ilß - hydroxy - pregnadien -18 - säure, 3,20 - Dioxo-11|S-hydroxy -pregnen-18 -säure, 3,11^-Dihydroxy-20-oxo-pregnan-18-säure, 3,17-Dioxo-ll^-hydroxyandrostan-18-säure, 3,20-Dioxo-11/9-hydroxy-allopregnan-18-säure, 3/S-Acetoxy-1 l^-hydroxy-20-oxoallo-pregnan-18-säure bzw- entsprechende Verbindungen mit geschützten Hydroxy- oder Oxogruppen.

Verfahrensgemäß kann man in den erhaltenen Verbindungen, die wegen der enzymatischen Hydrolyse zumeist keine veresterten Hydroxygruppen mehr enthalten, in an sich bekannter Weise freie Hydroxygruppen acylieren, die llß-standige Hydroxygruppe zu einer Oxogruppe oxydieren oder die 17-Ketogruppe, z. B. in den erhaltenen /!!•'^,n-Dioxo-lliS-hydroxy-18-nor-androstadienen bzw. den entsprechenden 13-Isoverbindungen, gegebenenfalls unter Einführung eines niederen aliphatischen Kohlenwasserstoffrestes, wie Äthinylrestes, zur 17/?-Hydroxygruppe reduzieren.

Die Einführung des erwähnten aliphatischen Kohlenwasserstoffrestes in 17a-Stellung, z. B. des Äthinylrestes, erfolgt durch Umsetzung mit der entsprechenden aliphatischen Metallverbindung, wie einem Alkalimetall-acetylid, z. B. Kaliumacetylid.

In den verfahrensgemäß erhältlichen Estern sind die Säurereste solche von gesättigten oder ungesättigten aliphatischen oder cycloaliphatischen, von aromatischen oder heterocyclischen Carbonsäuren, beispielsweise solche der Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, der Buttersäuren, Valeriansäuren, wie n-Valeriansäure oder Trimethylessigsäure, der Capronsäuren, wie /KTrimethylpropionsäure, der Oenanth-, Capryl-, Pelargon-, Caprin-, Undecylsäuren, z. B. der Undecylensäure, der Laurin-, Myristin-, Palmitin- oder Stearinsäuren, z. B. der ölsäure, der Cyclopentyl-, Cyclohexyl- oder Phenylessigsäuren oder -propionsäuren, der Benzoesäure, Phenoxyalkansäuren, wie Phenoxyessigsäure, p-Chlorphenoxyessigsäure, ■2,4-Dichlorphenoxyessigsäure, 4-tert.-Butylphenoxyessigsäure, 3 - Phenoxypropionsäure, 4 - Phenoxybuttersäure, der Furan - 2 - carbonsäure, S-tert.-Butylfuran^-carbonsäure, 5-Bromfuran-2-carbonsäure, der Nicotinsäuren, ferner von Dicarbonsäuren, wie Oxal-, Bernstein- oder Glutarsäuren, von substituierten Carbonsäuren, wie /S-Ketocarbonsäuren, z. B. der Acetessig-, Propionylessig-, Butyrylessig- oder Caprionylessigsäure, oder von Aminosäuren.

Die Verfahrensprodukte weisen progestative, anabole, androgene und Antialdosteronwirkung auf und können zur Herstellung von Medikamenten verwendet werden. Sie stellen jedoch auch Zwischenprodukte zur Herstellung von physiologisch interessanten Verbindungen dar.

Die Auftrennung des Oxydationsgemisches und die Isolierung der Verfahrensprodukte läßt sich nach bekannten Methoden vornehmen. Die Trennung kann z. B. durch Extraktion des Reaktionsgemisches mit einem organischen Lösungsmittel, z. B. Methylenchlorid oder Essigester, erfolgen. Für die weitere Reinigung des so erhaltenen Extraktes eignen sich besonders die Chromatographie, z. B. an Aluminiumoxyd, Silicagel oder Cellulosepulver, oder die Anwendung von Verteilungsmethoden, z. B. des Gegenstromverfahrens, oder die Trennung mittels Girard-Reagenzien, wie Trimethylammonium- oder Pyridiniumessigsäurehydrazidchlorid. Anschließend an die Reinigung oder an ihrer Stelle wird schließlich vorzugsweise aus organischen oder wäßrig-organischen Lösungsmitteln umkristallisiert.
Die als Ausgangsstoffe zu verwendenden 18,11/S-Lactone von lljS-Hydroxy-18-säuren der Pregnan- oder Androstanreihe sind bekannt oder lassen sich nach bekannten Methoden herstellen. Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt auch jene Ausführungsformen, bei denen man die nach dem Verfahren erhältlichen zl¹'⁴-18,ll^-Lactone der Androstanreihe der Inkubation mit der erwähnten Pilzart unterwirft.

Die verfahrensgemäß erhältlichen Verbindungen können als Heilmittel in der Human- und Veterinärmedizin, z. B. in Form von Stoffmischungen verwendet werden, die die Verfahrensprodukte sowie einen festen oder flüssigen Arzneimittelträger enthalten. Als Trägermaterial kommen solche pharmazeutische, organische oder anorganische Stoffe in Frage, die für die parenterale, enterale oder topicale Applikation geeignet sind und die mit den neuen Verbindungen nicht reagieren, wie z. B. Wasser, pflanzliche Öle, Benzylalkohol Polyäthylenglykole,

Gelatine, Milchzucker, Stärke, Magnesiumstearat, Talk, Vaseline, Cholesterin oder andere Arzneimittelträger. Für die parenterale Verabreichung eignen sich vorzugsweise Lösungen, in erster Linie ölige oder wäßrige Lösungen, ferner Suspensionen, Emulsionen oder Implantate, für die enterale Applikation Tabletten oder Dragees, für die topicale Anwendung außerdem Salben oder Cremes, die gegebenenfalls jeweils sterilisiert oder mit Hilfsstoffen, wie Konservierungs-, Stabilisierungs-, Netz- oder Emulgierungsmitteln, Salzen zur Veränderung des osmotischen Druckes oder Puffern, versetzt werden und auch andere therapeutisch wirksame Verbindungen enthalten können.

Die folgenden Beispiele erläutern das Verfahren der Erfindung. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.

Beispiel 1

20

Man bereitet eine Nährlösung, welche pro Liter Leitungswasser 5 ml Maisquellwasser, 20 g Pepton und 50 mg Glukose enthält und mit Natronlauge auf pH 6,2 eingestellt ist. Zwei 10-1-Schüttelgefäße mit je 41 obiger Nährlösung werden 30 Minuten bei 1,1 atü sterilisiert und nach Abkühlen auf Raumtemperatur mit einer vegetativen Kultur von Fusarium solani (Mart.) App. et. Wr. (Ciba-Stamm Nr. 34), welche vorgängig in 500-ml-Erlenmeyerkolben mit je 100 ml derselben Nährlösung gezüchtet worden war, beimpft. Man schüttelt unter oberflächlicher Belüftung 26 Stunden bei 26 bis 28°, gibt dann unter sterilen Bedingungen zu den gut entwickelten Kulturen je 2 g 18,11/S-Lacton der zJ⁴-3,20-Dioxoll^-hydroxy-pregnen-18-säure, gelöst in 50 ml Aceton, und läßt unter gleichen Belüftungs- und Temperaturbedingungen weiterschütteln. Die Umsetzung des Substrats wird papierchromatographisch verfolgt. Zu diesem Zweck werden abgemessene Proben aus der Kultur entnommen, mit Essigester extrahiert und aliquote Teile im System Formamid—Benzol auf Papierstreifen chromatographiert. Nach A¹Jz Tagen läßt sich kein Ausgangsmaterial mehr feststellen. Statt dessen erkennt man mindestens drei UV-absorbierende Umwandlungsprodukte, welche sich im obigen Papierchromatographiesystem stärker polar verhalten als das Ausgangssteroid. Keines der drei reduziert Blautetrazoliumchlorid oder gibt die für zl⁴-3-Ketosteroide typische Fluoreszenz mit Natronlauge.

Nach 5 Tagen Inkubationszeit werden die Kulturen abgenutscht, das Mycel gründlich mit Essigester gewaschen und das Kulturfiltrat, welches ein pH von 9 aufweist, mit 50%iger wäßriger Essigsäure auf pH 6 gebracht, mit Natriumchlorid gesättigt und dreimal mit 41 Essigester Ausgeschüttelt. Die mit 10%iger Natriumchloridlösung gewaschenen und mit Natriumsulfat getrockneten Essigesterauszüge ergeben nach dem Verdampfen des Lösungsmittels im Vakuum 2,85 g rohen Steroidextrakt. Dieser wird an einer Säule von 120 g Silicagel (Davison Nr. 922), desaktiviert mit 2 Gewichtsprozent Wasser, aufgetrennt, und die einzelnen Fraktionen papierchromatographisch untersucht (System Formamid—Benzol):

Fr fclO M ¹ CM₂-Aceton (99 : 1)} ^{438 m}§ ^öliS^es' ™htsteroides Material Fr 11-13 1,81 CH₂Cl₂ — Aceton (98 : 2)

Fr 14-20 3,121 CH₂Cl₂ — Aceton (96
Fr 21 0,6 1 CH₂Cl₂ — Aceton (94

Fr 22 0,48 1 CH₂Cl₂ — Aceton (94
Fr 23-24 0,961 CH₂Cl₂ — Aceton (94
Fr 25-33 5,561 CH₂Cl₂ — Aceton (9

mg /l¹'⁴-3-Ketosteroid, schwächer polar als
das Ausgangssteroid

mg Substanz Ai, R/ 0,65

6) 70 mg Gemisch von Ai und A₂
6) 175 mg Substanz A₂, R/ 0,42

1) 923 mg Gemisch der Substanzen A₂, A3 und Aj
(Rf 0,42, 0,20 und 0,20)

Ai = 18,11-Lacton der J¹⁴-3.17-Dioxo-ll/i-hydroxy-androstadien-18-säure.

Aa = 13-Iso-J¹⁴-3.17-dioxo41|8-hydroxy-18-nor-androstadien.

A₃ = /Ji-^.n-Dioxo-UjS-hydroxy-lS-nor-androstadien.

A4 = 18,11-Lacton der J¹⁴-3-Oxo41/117|SKlihydroxy-andrc>stadien-18-säure.

Fr 22 sowie Fr 25 bis 33 werden an 450 Blättern ungewaschenem Whatman-(Nr. 1)-Papier unter Verwendung des Systems Formamid—Benzol im Chromatoblock präparativ aufgetrennt und die beiden UV-absorbierenden Hauptzonen mit Ri 0,42 und Rf 0,20 eluiert. Die Elution erfolgt durch Behandlung der Zonenstreifen mit Methanol-Wasser-Gemisch (1 : 4) und mehrmalige Extraktion der entstehenden Pulpa mit Aceton. Die Extrakte werden im Vakuum von Aceton und Methanol befreit und die verbleibende wäßrige Suspension erschöpfend mit Methylenchlorid extrahiert. Nach Verdampfen des Lösungsmittels erhält man auf diese Weise

aus der Zone mit Rj 0,42:

4,2 g Roh-Eluat von D-Iso-zlW
ll/?-hydroxy-18-nor-androstadien,

55 aus der Zone mit Rt 0,20:

3,9 g Roh-Eluat von z|i.⁴-3,17-Dioxo-ll^-hydroxy-18-nor-androstadien und 18,11-Lacton der /l¹-⁴-3-Oxo-ll^,17^-dihydroxy-androstadien-18-säure.

Die 4,2 g rohes 13-Iso-zl¹'⁴-3,17-dioxo-ll^-hydroxy-18-nor-androstadien werden an der lOfachen Gewichtsmenge aktiviertem Silicagel gereinigt: Mit Methylenchlorid—Aceton (85 : 15) werden 275 mg zum Teil kristallines 13-Iso-/l¹.⁴-3,17-dioxo-ll^-hydroxy-18-nor-androstadien (A₂) elaiert, während sich die öligen Beimengungen in den Vorfraktionen mit Methylenchlorid und in den Nachfraktionen mit Methylenchlorid-Aceton-(4 : 1) und -(I : 1) befinden.

Die analoge Reinigung des Roh-Eluates aus der

Zone mit Rf 0,20 ergibt 268 mg teilweise kristalli-

sierendes Gemisch der Substanzen /1!^-3,1 ll/S-hydroxy-18-nor-androstadien (A3) und 18,11-Lacton der /J^-S-Oxo-ll&lT/S-dihydroxy-androstadien-18-säure (A4).

Die Fraktionen 14 bis 21 (enthaltend die Substanz Ai) werden aus Aceton—Äther umkristallisiert. Unter Aufarbeitung der Mutterlaugen erhält man 644 mg 18,11-Lacton der 4i.4-3,17-Dioxo-ll/S-hydroxy-androstadien-18-säure, F. 320 bis 322° (Zersetzung). Das UV Spektrum in Äthanol weist ein Maximum bei 240 πΐμ auf; ε = 15 400. Das IR.-Spektrum in Nujol zeigt Banden bei 5,66 μ (y-Lacton), 5,74 μ (5 - Ring - keton), 6,01, 6,14 und 6,21 μ

Papierchromatographisches Verhalten:

Bush BLi

Bush Bi

Formamid—Cyclohexan-Benzol (1:2)

Formamid—Benzol..

Propylenglykol—
Toluol

Tempe ratur	-Rr
°C
38	0,79
38	0,37 Ό
22	0,33
22	0,65
22	0,64

Rs

(S = Desoxycorticosteron)

0,84 0,48

0,44 0,77

0,80

Reaktion mit m-Dinitrobenzol (Zimmermann-Reaktion) .. Purpurviolett

Reaktion mit
Blautetrazoliumchlorid ... Negativ

Fluoreszenz mit Natronlauge Negativ

Die Fraktionen 23 und 24 sowie das vorgereinigte Eluatvonl3-Iso-zl¹'⁴-3₅17-dioxo-ll/?-hydroxy-18-norandrostadien aus der papierchromatographischen Auftrennung werden aus Aceton—Äther umkristallisiert, wobei insgesamt 340 mg 13-Iso-zl¹·⁴^, 17-dioxo-ll/S-hydroxy-18-nor-androstadien (A2) erhalten werden; F. 248 bis 251°. Das UV-Spektrum in Äthanol weist ein Maximum bei 244 m μ auf; ε = 15 300. Das IR-Spektrum in Nujol zeigt Banden bei 2,92 μ (Hydroxyl), 5,78 μ (5-Ring-Keton), 6,02, 6,15 und 6,25 μ (ζμ.⁴-3-Κείοη).

Papierchromatographisches Verhalten:

Bush BLi

Bush Bi

Formamid—Cyclo-' hexan-Benzol (1:2)

Formamid—Benzol.,

Propylenglykol—

Toluol

Bush B₃

38
38

22
22

22
38

Rr

0,74 0,37

0,23 0,42

0,34 0,17

Rs

(S = Desoxycorticosteron)

0,79 0,48

0,30 0,55

0,43 0,34

Reaktion mit

Blautetrazoliumchlorid ... Negativ Fluoreszenz mit Natronlauge Negativ Reaktion mit

m-Dinitrobenzol ......... Purpurviolett

228 mg des vorgereinigten Gemisches von Α^1Λ-3, 17-Dioxo-ll/S-hydroxy-18 -nor-androstadien (A₃) und 18,11-Lacton der z^⁴-3-Oxo-llß-17/?-dihydroxyandrostadien-18-säure (A4) aus dem Papierchromatogramm-Roh-Eluat werden aus Aceton—Äther fraktioniert kristallisiert. Aus den ersten Kristallisaten erhält man insgesamt 63 mg 18,11-Lacton der did

F. 310 bis 314°. Das UV-Spektrum in Äthanol besitzt ein Maximum bei 242 ηΐμ, ε = 16 000. Das IR-Spektrum in Nujol zeigt Banden bei 2,88 μ (Hydroxyl), 5,64 μ (y-Lacton), 5,99, 6,15 und 6,24 μ (A¹^S-Keton).

Aus den Mutterlaugen lassen sich durch wiederholte Kristallisation aus Aceton—Äther 95 mg Α¹·'^ί-3,η-Όϊοχο- 11/J-hydroxy-18-nor-androstadien, F. 199 bis 202°, isolieren. Das UV-Spektrum in Äthanol weist ein Maximum bei 243 πΐμ auf; e = 14 800. Das IR-Spektrum zeigt Banden bei 2,96 μ (Hydroxyl), 5,75 μ (5-Ring-Keton), 6,02, 6,19 und 6,25 μ (zlL^-Keton).

Die zwei Steroide zeigen folgendes papierchromatographisches Verhalten:

Propylenglykol—Toluol
Formamid—Benzol

Formamid—Benzol-Chloroform (1:1)..

Bush C

Bush B₅

Bush Bi

Bush BLi

Bush B₃

22 22

22 38 38 38 38 38

0,11 0,20

0,51 0,68 0,78 0,23 0,47 0,07

RrA₁

0,51 0,64 0,78 0,23 0,47

Reaktion mit

Blautetrazoliumchlorid ... Negativ Negativ Fluoreszenz mit

Natronlauge Negativ Negativ

Reaktion mit

m-Dinitrobenzol Purpurviolett Negativ

A3 = J¹-⁴-3.17-Dioxo-ll/?-hydroxy-18-nor-androstadien. A₄ = 18.11-Lacton der J¹-⁴-3-Oxo-ll/S.17/?-dihydroxy-andiOstadien-18-säure.

Beispiel 2

40 mg des nach Beispiel 1 erhaltenen 18,11-Lactons der zl¹·⁴ - 3 - Oxo -11/3,17/9 - dihydroxy - androstadien-18-säure (A4) werden in 1,9 ml absolutem Pyridin gelöst und mit 0,5 ml Essigsäureanhydrid 16 Stunden bei Raumtemperatur belassen. Die Reaktionslösung wird dann im Hochvakuum zur Trockene eingedampft, der verbleibende Rückstand in Methylenchlorid aufgenommen und mit eiskalter n-Salzsäure, eiskalter 2%iger Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser neutralgewaschen. Die mit Natriumsulfat getrocknete Methylenchloridlösung wird im Vakuum zur Trockene eingedampft und das erhaltene 18,11-Lacton der zl^-S-Oxo-llß-hydroxy-nß-acetoxy-androstadien-18-säure aus einem Aceton-Äther-Gemisch umkristallisiert, Schmp. 187 bis 189°. Das IR-Spektrum in Methylenchlorid zeigt unter anderem

Banden bei 5,63 μ (18,11-Lacton), 5,77 μ (Acetat-Carbonyl), 6,01, 6,16 und 6,23 μ (zl^^-Keton) und 8,15 μ (Acetat). Im Papierchromatogramm weist die Substanz folgende Rf- und Rs-Werte auf:

System	Tempe ratur 0C	Rj	Rs (S = Desoxy- corticosteron)
Bush B3 Formamid—Cyclo- hexan-Benzol (1:1) Formamid—Benzol..	38 22 22	0,28 0,36 0,80	0,53 0,66 ~1

20

Beispiel 3

63 g des nach Beispiel 1 erhaltenen 18,11-Lactons der Δ¹·⁴ -3 - Oxo -11/5,17/3 - dihydroxy- androstadien-18-säure (A4) in 3 ml absolutem Pyridin werden mit 0,8 ml Propionsäureanhydrid bei 22° stehengelassen. Die Veresterung wird papierchromatographisch verfolgt. Nach 14 Stunden wird das 18,11-Lacton der A¹^OxO-I ljä-hydroxy-n^-propionoxy-androstadien-18-säure analog dem Acetat (vgl. Beispiel 2) aufgearbeitet. Er weist im IR-Spektrum Banden auf, unter anderem bei 5,64 μ (18,11-Lacton), 5,77 μ (Ester), 6,00, 6,16 und 6,22 μ (JL^-Keton) und 8,16 μ (Ester).

Beispiel 4

Zu dem aus 84 mg Chromöäureanhydrid und 0,4 ml absolutem Pyridin gebildeten, in Pyridin schwerlöslichen Komplex gibt man die Lösung von 120 mg des nach Beispiel 1 erhaltenen /1^-3,17-Dioxo-ll/S-hydroxy-18-nor-androstadiens (A3) in 1,5 ml absolutem Pyridin und schüttelt das Reaktionsgemisch während 15 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend wird es mit 65 ml Methylenchlorid und 35 ml 5%iger Natriumsulfitlösung versetzt und mit η-Salzsäure auf pH 4 angesäuert. Nach gründlichem Durchschütteln wird die wäßrige Phase abgetrennt und zweimal mit 30 ml Methylenchlorid rückextrahiert. Die drei organischen Phasen werden mit Wasser neutralgewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand, ein Gemisch der 11-Ketoverbindung mit wenig Ausgangsmaterial, wird an 60-Bogen-Whatman-(Nr. 1)-Papier im System Formamid—Benzol präparativ aufgetrennt. Die UV-absorbierende Zone des schwächer polaren 11-Ketosteroids wird unter Verwendung von Tetrahydrofuran - Wasser - Gemisch-(1 : 4) und -(I : 1) und von reinem Tetrahydrofuran aus dem Papier eluiert. Die Eluate werden im Vakuum eingedampft, bis sie frei von Tetrahydrofuran sind. Aus der wäßrigen Suspension läßt sich das A¹^M, 17-Trioxo-18-nor-androstadieri mit Methylenchlorid rückextrahieren. Es schmilzt nach Umkristallisation aus Aceton—Äther bei 162,5 bis 163,5°. Im IR-Spektrum in Methylenchlorid weist es Banden auf, unter anderem bei 5,7ι μ (17-Keton), 5,82 μ (il-Keton), 5,99, 6,13 und 6,21 μ (zlL^K)

Papierchromatographisches Verhalten:

System

Formamid-Bush B₃ ..
Bush BLi.

-Benzol.

Temperatur
⁰C

22 38 38

IO Reaktion mit m-Dinitrobenzol
Beispiel 5

0,68
0.25
0,78
Bräunlich

120 mg des nach Beispiel 1 erhaltenen 13-Iso- ^'^,n-dioxo-lljS-hydroxy-lS-nor-androstadiens (A2) in 5,8 ml absolutem Pyridin werden mit dem Komplex aus 84 mg Chromsäureanhydrid und 0,4 ml absolutem Pyridin 17 Stunden bei Raumtemperatur geschüttelt und die 11-Ketoverbindung analog Beispiel 4 isoliert. Man erhält dabei das 13-Iso-zl¹·⁴^,!!, 17-trioxo-18-nor-androstadien, welches, aus Aceton— Äther umkristallisiert, bei 245 bis 247° schmilzt. Das IR-Spektrum in Methylenchlorid zeigt Banden unter anderem bei 5,75 μ (17-Keton), 5,85 μ (11-Keton), 6,02, 6,15 und 6,23 μ (zlL^K)

Papierchromatographisches	Verhalten:	Rf
System	Temperatur 0C	0,45 0,59 0,85
Formamid—Cyclohexan- Benzol (1:4) Formamid—Benzol Formamid—Benzol- Chloroform (2:1)	CN CN CN CN CN CN

Reaktion mit m-Dinitrobenzol .. Bräunlich
Beispiel 6

25 mg des nach Beispiel 1 erhaltenen Ji'⁴-3,17-Dioxo-ll/S-hydroxy-18-nor-androstadiens (A₃) werden mit 0,25 ml Essigsäureanhydrid in 2,25 ml absolutem Pyridin 48 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Pyridin und überschüssiges Essigsäureanhydrid werden dann im Hochvakuum bei Raumtemperatur entfernt. Man nimmt den öligen Rückstand in 15 ml Methylenchlorid auf, wäscht die Lösung mit eiskalter η-Salzsäure, eiskalter 2%iger Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser neutral, trocknet sie mit Natriumsulfat und entfernt das Lösungsmittel im Vakuum. Der Rückstand wird aus Aceton—Petroläther (Sdp. 50 bis 70°) umkristallisiert. Das <d¹'⁴-3,17-Dioxo-llj8-acetoxy-18-nor^andrG-stadien schmilzt bei 209 bis 211°. UV-Spektrum in Äthanol: A_WOx 241 πΐμ (ε = 15 600). Typische Banden des IR-Spektrums in Nujol liegen unter anderem bei 5,78 μ (17 - Keton), 6,02, 6,18 und 6,24 μ ), 8,12 μ (Acetat.

Ri

Papierchromatographisches Verhalten:

System

Bush B₃

Formamid—Cyelohexan-

Benzol (1:1)

Formamid—Benzol

Temperatur

38

.22 22

0,29

0,41
0,79

Reaktion mit m-Dinitrobenzol ... Purpurviolett

609 608/438

Beispiel· 7

17,4 mg des nach Beispiel 1 erhaltenen 13-Isozf^-S.-n-dioxo-UjS-hydroxy-lS-nor-androstadiens (A2) werden mit 0,25 ml Essigsäureanhydrid und 0,5 ml absolutem Pyridin 26 Stunden bei 70° C acetyliert. Das dabei entstehende 13-Iso-zl¹'⁴-3,i7-dioxo-Tlß-acetoxy-18-nor-androstadien wird analog zu Beispiele aufgearbeitet und fällt als hochviskoses farbloses £31 an. Es verhält sich im Papierchromatogram'm Rf-mäßig gleich wie das A^1A-3,n-Oioxollß-acetoxy-18-nor-androstadien.

Beispiel8

Zu einer eisgekühlten Lösung von 236 mg des nach Beispiel 1 erhaltenen zl¹'⁴-3,17-Dioxo-ll/S-hydrqxy-18-nor-androstadiens (A3) in 14 ml Tetrahydrofuran ..gibt man eine ebenfalls eiskalte Lösung von 41 mg Natriumborhydrid in 2 ml Tetrahydrofuran—Wasser (2 : 1) und beläßt sie 2 Stunden bei 0°. Das Reaktionsgemisch wird hierauf ohne ä,ußere Erwärmung auf etwa 6 ml eingedampft .und mit 90 ml Eiswasser und 1,2 ml Eisessig versetzt. Die Extraktion der wäßrigen Suspension mit drei Portionen von 180,.90.-und 9O.ml Methylenchlorid ergibt 219 mg Reduktioiisprbdukt, welches an einer Säule von 7 g entaktiviertem · Silicagel (enthaltend 15 Gewichtsprozent Wasser) gereinigt wird. Mit Methylenchlorid und Methylenchlorid - Aceton - Gemisch (95 : 5) werden schwach polare Verunreinigungen eluiert. Mit (9 : 1)-Gemisch läßt sich das Δ^-Ί,-Οχο-ll^,17/S-dihydroxy-18-nor-androstadien, 171 mg, eluieren. Dieses wird aus Aceton—Äther—Petroläther umkristallisiert und schmilzt bei 181 bis 183°. UV-Spektrum in Äthanol: A_mi^244 πΐμ (ε = 17 000). IR-Spektrum in Methylenchlorid: Banden bei 2,77 und 2,90 μ (OH), 6,00, 6,14 und 6,22 () trichter, sättigt das Nährmedium mit Natriurciehlorid und schüttelt mit zwei Portionen von 4,3 ύπαϊ 21 Äthylacetat aus. Die Auszüge werden mit Natriumsulfat getrocknet und durch 20 g entaktiviertes: Silicagel (mit 15 Gewichtsprozent Wassergehalt) filtriert. Das im Vakuum eingedampfte Filtrat, 1,50 gy gibt nach dem Umkristallisieren aus Aceton-¹—Äther 1,31 g 18,11-Lacton der zli^-S^O-Dioxo-ll^-hydröxypregnadien-18-säure, Schmp. 194 bis 195°·. UV-Spektrum in Äthanol: l_max 241 πΐμ (e = 18 000). IR-Spektrum in Methylenchlorid: Banden bei 5,66 μ (18,11-Lacton), 5,82 μ (20-Keton), 5,99, 6,13 und 6,21 μ (/H-⁴-3-Keton).

Papierchromatographisches Verhalten:

System	Tempe ratur 0C	Rt	Rs (S = Desoxy- corticosteron)
Formamid-Cyclohexan- Benzol (1 : 1) Formamid—Benzol ... Propylenglykol—Toluol Bush Bi	U) OJ NJ NJ NJ OO OO NJ NJ NJ	0,13 0,58 0,53 0,34 0,72	0,23 0,71. 0,72 0,46
Bush BIi

Beispiel 9

2 g 18,11-Lacton der zl^-S^O-Dioxo-ll/S-hydroxypregnadien-18-säure werfen analog Beispiel 1 mit einer Kultur von Fus.arium solani, welche in 41 der dort beschriebenen Nährlösung gezüchtet worden ist, 4^x/2 Tage inkubiert. Das Gemisch der Umsetzungsprodukte wird papierchromatographisch unter Ver- Wendung der Systeme Formamid—Benzol und Propylenglykol--Toluol untersucht. Es setzt sich ebenfalls aus den vier Abbauprpdukten 18,11-Lacton der zl¹'⁴ - 3,17 - Dioxo - U/S - hydroxy - androstadien-18-säure, 13-Iso-zI¹'⁴-3,17-dioxO'-ll/S-hydroxy-18-norandrostadien, Δ^χ'⁴-3,n-Dioxo-ll/S-hydroxy-lS-norandrostadien und 18,11-Lacton der. Z)¹^-S-OxO-ll/S,17/?-dihydroxy-androstadien-l8-säure zusammen und wird, wie im Beispiel 1 angegeben, aufgetrennt.

Zur Herstellung der Ausgangsverbindung gibt man zu 20 Stunden alten ,Kulturen von Arthrobacter simplex (Jensen) Lochhead, ATCC 6946, welche in fünfzig 500-ml-Erlenmeyer-Kolben zu 100 ml Nährlösung gezüchtet worden sind,'unter sterilen Bedingungen und unter gleichmäßiger Verteilung die Lösung von 1,75 g 18,11-Lacton der zl⁴-3,20-Dioxoll/?-hydroxy-pregnen-18-säure in 75 ml Aceton und bringt die Kulturen 19 Stunden auf die Schüttelmaschine (Temperatur 26 bis 27°). 11 Nährlösung enthält 1 g Difco-Hefeextrakt» 4,4 g primäres Kaliumphosphat und 8,8 g sekundäres Natriumphosphat und ist auf pH 7,1 eingestellt. Zur Aufarbeitung vereinigt man alle-Kulturlösungen.in einem Scheide-B e i s ρ i e 1 10

In einem Gemisch von 5 ml tertiärem Butylalkohol und 2,5 ml absolutem Benzol werden 0,40 g KaliÜmschnitzel aufgelöst. Durch diese Lösung wird trökkenes Acetylen geleitet bis zur Sättigung. Die resultierende Kaliumacetylidlösung wird unter Feuchtigkeitsausschluß und Rühren bei Raumtemperatur zu 0,32 g des nach Beispiel 1 erhaltenen /1^-3,17-Dk)Xo-HjS-hydroxy-18-nor-androstadiens (A3) in 30ml Dioxan-Tetrahydrofuran-Gemisch (1 : 1) getropft. Anschließend leitet man, immer unter Rühren, 2V2 Stunden Acetylen durch das Reaktionsgemisch. Zur Aufarbeitung gibt man 100 ml 2%ige wäßrige; Essigsäure zu und extrahiert mehrmals mit Methylenchlorid. Die Methylenchloridauszüge werden mit. Wasser · neutralgewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Man erhält 0,37g rohes z1¹'⁴-3-Oxo-ll/3,17/3-dihydroxy-17a-äthinyl-18-nor.-androstadien, welches aus Methylenchlorid—Hexan umkristallisiert wird. . . .

Beispiel 11

Werden an Stelle der in den Beispielen 1 und 9 verwendeten Ausgangsstoffe das 18,ll.-Lacton der. zl⁵ - 3,11/3 - Dihydroxy - 20 - oxo - pregnensäure, der zl⁴-3,20-Dioxo-ll/?-,21-dihydroxy-pregnen-18-säure, der 3,20-Dioxo-ll/S-hydroxy-pregnan-18-säure, der 3,11)3 - Dihydroxy - 20 - oxo - pregnan -18 -säure, der 3,20- Dioxo-1 1/S-hydroxy- allopregnan-18 - säure, der Sß-Acetoxy-lljS-hydroxy^O-oxo-allopregnan-lS-säure, der ζ!¹-⁴ - 3,17 - Dioxo -11/3 - hydroxy - androstadien-18-säure, der zl⁴-3,17-Dioxo-ll/3-hydroxy-androsten-18-säure oder der zi^-Oxo-ll/^n-dihydroxy-androsten-18-säure nach den in diesem Beispielen angegebenen Methoden inkubiert, so erhält man ein Reaktionsgemisch, dessen Hauptbestandteile ebenfalls das 18,11-Lacton der zi^^ droxy-androstadien-18-säure und der ίίβ,Πβ - dihydroxy - androstadien - 18 - säure, das 13-Iso-zI^]-⁴-3,17-dioxo-ll/3-hydroxy-18-nor-androsta-

dien und das \4¹'⁴-3,17-Dioxo-ll_;ö-hydroxy-18-norandrostadien darstellen, die, wie im Beispiel 1 angegeben, voneinander getrennt werden.

Claims (5)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von neuen zli^-S-Oxo-androstadienverbindungen auf mikrobiologischem Wege durch Inkubation von Steroiden der Pregnan- oder Androstanreihe mit Pilzen der Art Fusarium solani oder daraus gewonnenen Enzymen unter aeroben Bedingungen, dadurch gekennzeichnet, daß man das 18,11-Lacton einer HjÖ-Hydroxy-18-säure der Pregnan- oder Androstanreihe, welches in 3-Stellung eine freie oder veresterte Hydroxylgruppe oder eine Oxogruppe, in 20-Stellung eine Oxogruppe bzw. in 17-Stellung eine Oxogruppe oder eine freie oder veresterte Hydroxygruppe aufweist, als Ausgangsstoff verwendet, das erhaltene Oxydationsgemisch nach bekannten Methoden auftrennt und gegebenenfalls in den erhaltenen Verbindungen in an sich bekannter, Weise freie Hydroxygruppen acyliert, die llß-Hydroxygruppe zur Ketogruppe oxydiert oder die 17-Ketogruppe, gegebenenfalls unter gleichzeitiger Einführung eines niederen aliphatischen Kohlenwasserstoffrestes, zur 17/J-Hydroxygruppe reduziert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Inkubation während etwa 5 Tagen vornimmt und das erhaltene Oxydationsgemisch durch Verteilungsmethoden oder

Chromatographie bzw. Papierchromatographie auftrennt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man von einem verfahrensgemäß erhältlichen /I¹^-IS₅IIjS-LaCtOn der Androstanreihe ausgeht und dieses mit den im Anspruch 1 genannten Pilzen inkubiert.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das 18,11-Lacton der zl⁴-3,20-Dioxo-ll/S-hydroxy-pregnen-18-säure, der A ⁵ - 3,11 β - Dihydroxy - 20 - oxo - pregnen - säure, der A⁴ - 3,20 - Dioxo -11/3,21 - dihydroxy - pregnen-18-säure, der zl⁴-3,17-Dioxo-llß-hydroxy-androsten-18-säure, der /J⁴-3-Oxo-lli3,17-dihydroxyandrosten-18-säure, der 3,20-Dioxo-llß-hydroxypregnan-18-säure, der 3,ll/3-Dihydroxy-20-oxopregnan-18-säure, der 3,20-Dioxo-lljS-hydroxyallopregnan -18 - säure, der 3β - Acetoxy -1 iß - hydroxy - 20 - oxo - allopregnan -18 - säure oder der d - zl¹·⁴ - 3,20 - Dioxo -11/3 - hydroxy - pregnadien-18-säure als Ausgangsstoffe verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man erhaltene A^l-⁴-lS-nor-Androstadien-17-one, insbesondere A ¹^⁴0,17-Di-0x0 -11/3 - hydroxy - 18 - nor - androstadien mit einer Metallverbindung eines niederen aliphatischen Kohlenwasserstoffs, insbesondere mit Kaliumacetylid, umsetzt.

In Betracht gezogene Druckschriften:
Experientia, JBd. 9 (1953), S. 371.