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Verfahren zur Herstellung von 4-N-p-Toluoyl-5-fluor-2'-desoxycytidin
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 4-N-p-Toluoyl-5-fluor-2'-desoxycytidin.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter
Weise 5-Fluorcytosin mit einem p-Toluoylierungsmittel behandelt, das erhaltene 4-N-p-Toluoyl-5-fluorcytosin
mit einem Quecksilber(II)-salz zum Monoquecksilbersalz umsetzt, dieses Monoquecksilbersalz
mit einem 3,5-Diaroyl-2-desoxy-D-ribofuranosylhalogenid umsetzt, das gebildete Gemisch
aus dem a-Anomeren und dem ß-Anomeren des 4-N-p-Toluoyl-1-(3',5'-di-O- aroyl - 2'-
desoxy - D - ribofuranosyl) - 5 -fluorcytosins durch Behandlung mit Kaliumjodidlösung
und Kristallisation voneinander trennt und schließlich die Aroylgruppen am Zuckerrest
des auskristallisierten ß-Anomeren durch Behandlung mit einem Alkalialkylat oder
mit methanolischem Ammoniak selektiv abbydrolysiert.
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In der ersten Verfahrensstufe wird das 5-Fluoreytosin zwecks Bildung
des entsprechenden 4-N-p-Toluoyl-5-fluorcytosins mit einem p-Toluoylierungsmittel,
besonders mit p-Toluoylchlorid,umgesetzt. Zur Durchführung der Umsetzung genügt
es, das 5-Fluorcytosin mit dem p-Toluoylierungsmittel zu vermischen, zweckmäßig
in Gegenwart eines inerten, organischen Lösungsmittels, bei einer Temperatur bis
zur Rückflußtemperatur des Reaktionsgemisches. Pyridin, Dimethylformamid u. dgl.
bewähren sich als Lösungsmittel. Die bei dieser Verfahrensstufe anzuwendende Menge
p-Toluoylierungsmittel kann variieren; es ist allerdings zweckmäßig, mindestens
1 Mol pro Mol 5-Fluorcytosin einzusetzen. Man kann jedoch auch mit einem geringen
Überschuß an p-Toluoylierungsmittel arbeiten.
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In der zweiten Verfahrensstufe wird das 4-N-p-Toluoyl-5-fluorcytosin
unter Bildung seines Monoquecksilbersalzes mit einem geeigneten Quecksilber(II)-Salz
umgesetzt, vorzugsweise in Gegenwart eines Lösungsmittels. Als Quecksilber(II)-salz
sind Mercurichlorid oder -acetat bevorzugt. Als Lösungsmittel kann jedes inerte,
organische Lösungsmittel verwendet werden, in dem sowohl das 4-N-p-Toluoyl-5-fluorcytosin
als auch das Quecksilbersalz löslich sind. In einer bevorzugten Ausführungsform
des Verfahrens wird Dimethylformamid verwendet. Im allgemeinen wird das gewünschte
Quecksilbersalz durch Vermischen der beiden Reaktionspartner bei Raumtemperatur
in Form eines Niederschlages gewonnen. Das ausgefallene Monoquecksilbersalz des
4-N-p-Toluoyl-5-fluorcytosins kann aus der Reaktionsmischung z. B. durch Filtern
oder durch Zentrifugieren abgetrennt werden. In der dritten Verfahrensstufe wird
das Quecksilbersalz des 4-N-p-Toluoyl-5-fiuorcytosins mit einer äquimolaren Menge
eines 3,5-Di-O-aroyl-2-desoxy-D-ribofuranosylhalogenides umgesetzt, z. B. mit 3,5-Di-O-p-toluoyl-
oder 3,5-Di-O-p-chlorbenzoyl-2-desoxy-D-ribofuranosylchlorid. Das Quecksilbersalz
des 4-N-p-Toluoyl-5-fluorcytosins wird hierbei in einem geeigneten, inerten, organischen
und mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel suspendiert, z. B. in Toluol, Tetrachlorkohlenstoff,
Xylol oder Benzol. Zu dieser Suspension setzt man das 3,5-Di-O-aroyl-2-desoxy-D-ribofuranosylhalogenid
zu und rührt die Reaktionsn-ischung bei Raumtemperatur. Das erhaltene, aus 4-N-p-Toluoyl-5-fluor-3',5'-di-O-äroyl-2'-desoxycytidin
und dem a-Anomeren dieser Verbindung bestehende Gemisch wird anschließend in die
Anomeren getrennt.
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Enthält das Reaktionsprodukt der dritten Verfahrensstufe beispielsweise
4-N,3',5'-tri-p-Toluoyl-5-fluor-2'-desoxycytidin, d. h. das ß-Anomere, sowie 1-(2'-Desoxy-3',
5'-di-O-toluoyl-oc-D-ribofuranosyl)-4-N-p-toluoyl-5-fluorcytosin, d. h. das a-Anomere,
so wird zur Trennung der Anomeren das Reaktionsprodukt der dritten Verfahrensstufe
mehrmals mit großen Mengen einer wäßrigen Kaliumjodidlösung gewaschen. Dabei kristallisiert
ein Teil des ß-Anomeren aus; diese Kristalle lassen sich z. B. durch Filtrieren
abtrennen. Das Filtrat wird sodann zu einem Sirup
eingeengt. Durch
Verdünnen dieses Sirups mit kochendem Methanol -kann man eine weitere Menge des
kristallisierten ß-Anomeren erhalten.
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In der vierten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens wird das 4-N-p-Toluoyl-5-fluor-3',5'-di-O-aroyl-2'-desoxycytidin
bei Raumtemperatur oder bei einer Temperatur unterhalb Raumtemperatur mit einem
Alkaliälkylat oder mit methanohschem Ammoniak behandelt, wobei unter milden Bedingungen
nur die Acylgruppen am Zuckerteil des Moleküls entfernt werden.
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Das erhaltene 4-N-p-Toluoyl-5-fluor-2'-desoxycytidin ist bis jetzt
in der Literatur noch nicht beschrieben. Es wird durch Säure leicht zu 5-Fluor-2'-desoxyuridin
hydrolysiert. 5-Fluor-2'-desoxyuridin ist ein bekanntes Mittel gegen Pilze und Bakterien.
Daraus folgt, daß diese' Verbindung -als in biologischen Systemen in 5-Fluor-2'-desoxyuridin
umwandelbar angesehen werden kann.
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Es wurde nun gefunden, daß das 4-N-p-Toluoyl-5-fluor-2'-desoxycytidin
dem erwähnten Uridinderivat wie auch dem als in gleicher Weise wirksam bekannten
5-Fluor-2'-desoxycytidin überlegen ist. Diese Überlegenheit zeigt sich z. B. darin,
daß bei Leukämie B 82 bei Mäusen der- gleiche wachstumshemmende Effekt bereits mit
der 5- bis 8fach geringeren molaren Menge 4-N-p-Toluoyl-5-fluor-2'-desoxycytidin
als mit den genannten Vergleichssubstanzen erreicht wird. Dieser Befund (vgl. Tabelle)
wurde bei der Prüfung der genannten Substanzen-nach der von J. H. Burchenäl und
Mitarbeitern in »Proc. Soc. Exper. Biol. & Med.«, Bd. 71, 1949, S. 381, beschriebenen
Methode erhalten.
| Tumorwachstumshemmung bei Leukämie B 82 |
| Gewichts- |
| veränderung- Tumor- Tolerierte Dosis |
| Wirksubstanz Tägliche Dosis der Mäuse gewibht kor- bei täglicher |
| (5mal) m g hemmung Verabreichung. |
| nach der während 7 Tagen |
| Behandlung [mg] |
| Blindwert [mm/kg] I [mg/kg] +2,6 903 [°/o] [mg/kg] |
| 2.'-Desoxy-5-fluoruridin . . . . . . . . . . : . . . . . .
0,2 49,2 -1,5 0,5 99 { 0,1 . 24,6 +0,4 61 93 } 50 |
| 2'-Desoxy-5-fluorcytidin . . . . . . . . . . . . .
... 0,1 24,5 -0,2 23,3 97 { 005 12,25 +1,1 181 80 '- } 50 |
| 4-N-p-Toluoyl-5-fluor-2'-desoxycytidin . 0,012 4,4 -0,9 56
94 50 |
| 0,007 I 2,6 -I-0,4 150 84 |
Das nachfolgende Beispiel veranschaulicht das erfindungsgemäße Verfahren: A. 4-N-p-Toluoyl-5-$uorcytosin
12,9 g (0,1 Mol). 5-Fluorcytosin werden in 100 ml Pyridin suspendiert. Diese Suspension
wird mit 17,0 g (14 ml; 0,11 Mol) p-Toluoylchlorid versetzt. Nach dem Mischen. steigt
die Temperatur der Reaktionsmischung von selbst auf etwa 45°C. Man erhitzt etwa
5 Stunden unter Rückffuß und läßt sodann bei Raumtemperatur über Nacht stehen. Es
tritt Kristallisation von 4-N-p-Toluoyl-5-fluorcytosin ein. Das überschüssige p-Toluoylchlorid
wird durch Zusatz von 50 ml Äthanol und unter Rühren während etwa 20 Minuten entfernt.
-Man scheidet das- kristallisierte 4-N-p-Toluoyl-5-fluorcytosin durch-Siltrieren
ab und wäscht mit Äthanol und anschließend mit Äther. Sodann werden die Kristalle
im Vakuum bei einer Temperatur von etwa 60°C getrocknet. Man erhält 18,35 g 4-N-p-Toluoyl-5-fluorcytosin
vom Schmelzpunkt 250 bis
251'C
(Zersetzung). Durch Eindampfen der Mutterlauge
zur Trockne, Verreiben des* Rückstandes mit Äthanol, Entfernung des Äthanols durch
Verdampfen und schließlich Suspensiön* des Rückstandes in 20 ml Äther und 20 ml
Wasser erhält man zusätzlich 1,56 g Reaktionsprodukt in Form von.Kristallen.
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Die Gesamtausbeute an 4-N-p-Toluoyl-5-fluorcytosin beträgt 19,91 g
bzw. 80,5 °/o. Eine Probe dieses Produktes wird aus etwa 300 Raumteilen 90°/oigen
Äthanols umkristallisiert und liefert die folgende Analyse Schmelzpunkt 257 bis
258'C (Zersetzung) ; Am"" (Äthanol) 265, 325 mp@ (e = 12700, 17000); (Äthanol) 235,
290 m#t (8 = 8000, 9400).
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Analyse für C"H1aFN30z: -Berechnet ... C 58,30, H 4,08, N 17,00,
F 7;68; gefunden ... C 58,43, H 4,41, N 17,10, F 7,51. B. Monoquecksilberverbindung
von 4-N-p-Toluoyl-5-fluorcytosin Eine Lösung von 8,97 g (0,0281 Mol) Mercuriacetat
in 75 ml siedendem Äthanol wird zur Lösung von 6,95 g 4-N-p-Toluoyl-5-fluorcytosin
zugesetzt, das durch Erhitzen auf eine Temperatur von etwa 100°C in 75 ml Dimethylformamid
gelöst worden ist. Nach Vermischen dieser Lösungen scheidet sich ein Niederschlag
aus. Um völlige Ausscheidung zu gewährleisten, versetzt man die Reaktionsmischung
mit 800 ml Äther. Durch Zentrifugieren, Waschen mit Äther und Trocknen bei einer
Temperatur von -etwa 35°C im Vakuum erhält man 11,80 g (94,4 °/ö). des Monoquecksilbersalzes
von 4-N-p-Toluoyl-6-Nfluorcytosin.
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Die erhaltene Verbindung liefert die- folgende Analyse C12HsFN302Hg,
Berechnet ... F 4,26, N 9,43; gefunden ... F 4,07, N 9,13. _ .
C.
4-N,3',5'-Tri-p-toluoyl-5-fluor-2'-desoxycytidin Eine Suspension von 11,75 g (0,0264
Mol) der Monoquecksilberverbindung von 4-N-p-Toluoyl-5-fluorcytosin in 350 ml Toluol
wird durch Abdestillieren von etwa 40 ml Toluol entwässert. Die Suspension wird
hierauf auf Raumtemperatur abgekühlt und unter Rühren mit 22,3 g (0,0528 Mol) 2-Desoxy-3,5-di-O-p-toluoyl-ribofuranosylchlorid
versetzt. Die Temperatur der Reaktionsmischung steigt dabei leicht an, und innerhalb
etwa 5 Minuten bildet sich eine klare Lösung. Nach 35 Minuten beginnt ein kristallisiertes
Produkt auszufallen. In diesem Zeitpunkt läßt man 100 ml einer 15°/oigen wäßrigen
Kaliumjodidlösung in die Reaktionsmischung eintropfen und rührt diese etwa 20 Minuten.
Es bildet sich ein dichter kristallisierter Niederschlag, der abgetrennt und mit
Wasser und Äther gewaschen wird. Sodann werden die Kristalle im Vakuum bei einer
Temperatur von etwa 60°C getrocknet. Nach Verreiben dieser Kristalle mit 75 ml siedendem
Äthanol erhält man 5,36 g 4-N,3',5'-Tri-p-toluoyl-5-fluor-2'-desoxycytidin vom Schmelzpunkt
217°C. Durch Umkristallisieren des Produktes aus 400 ml Butylacetat erhält man 4,25
g von Nadelbüscheln vom Schmelzpunkt 234 bis 235°C.
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Am." (Methylenchlorid) 243, 232 mp. (s = 37 500, 26500); Ampn (Methylenchlorid)
290 m#L (s = 8490). [a]ä5 = -f-5,5° (c = 1,0 in Dimethylformarnid).
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Weiteres kristallisiertes Reaktionsprodukt erhält man durch Eindampfen
der Toluol-, Athanol- und Butylacetatmutterlaugen. Die Gesamtausbeute an 4-N,3',5'-Tri-p-toluoyl-5-fluor-2'-desoxycytidin
beträgt 5,90 g (400/,). Die Verbindung liefert die folgende Analyse für C"H3oFN307:
Berechnet ... C 66,10, H 5,04, F 3,17, N 7,01; gefunden ... C 66,16,
H 5,03, F 3,01, N 6,73, 6,90.
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D. 4-N-p-Toluoyl-5-fluor-2'-desoxycytidin 1,12 g (0,002 Mol) 4-N,3',5'-Tri-p-toluoyl-5-fluor-2'-desoxycytidin
werden in 30 ml Methanol suspendiert, das einige Tropfen Phenolphthalein enthält.
Zu dieser Suspension setzt man 2 ml ln-Natronlauge zu. Die Mischung wird 20 Minuten
geschüttelt und hierauf mit weiteren 2 inl ln-Natronlauge versetzt. Sodann läßt
man bei etwa 3'C 16 Stunden lang stehen. Durch anschließende Neutralisation mit
methanolischer Salzsäure (0,0026 Mol Chlorwasserstoff) und Eindampfen erhält man
einen Sirup, der durch Verreiben mit 50 ml Äther Kristalle bildet. Das kristallisierte
Produkt wird durch Zentrifugieren abgetrennt, mit Äther gewaschen und sodann in
15 ml Wasser aufgenommen. Nach dem Stehen scheiden sich Kristalle ab, die durch
Filtration abgetrennt und mit Wasser und Äthanol gewaschen werden. Das Filtrat liefert
nach Neutralisieren mit 0,7 ml In-Salzsäure weiteres kristallisiertes Reaktionsprodukt.
Die Gesamtausbeute beträgt 0,41 g (56,5 °/o). Das Produkt erweicht bei 188 bis 189°C,
verfestigt sich wieder und schmilzt abermals bei 217 bis 218°C.
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Durch Umkristallisieren von 0,3 g des Produktes aus 15 ml Wasser und
5 ml Äthanol erhält man 0,27 g 4-N-p-Toluoyl-5-fluor-2'-desoxycytidin in Form von
langen Nadeln, die bei 218 bis 219'C schmelzen. 2max (Äthylalkohol) 265,
329 mp@ (a = 16800, 17900). Amin (Äthylalkohol) 236, 294 m#L (a = 8 600, 8 700).
,Zmax (0,1n-Natronlauge) 245, 320 m#L (e=11440, 22380). Amin (0,1n-Natronlauge)
235, 260 m#t (s = 11160, 8410). [a]ö5 = -f-90,3° (c = 0,4 in Dimethylformamid).
Analyse des Produktes für Cl7Hj8FN30s: Berechnet ... C 56,19, H 4,99, F 5,23,
N 11,57; gefunden ... C 56,66, H 5,10, F 5,18, N 11,52.