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Verfahren zur Herstellung von 1 la-Hydroxy-6a-halogensteroiden
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 11 a-Hydroxy-6a-halogensteroiden
derallgemeinen Formel I
in der R, und R2 Wasserstoffatome oder niedrigmolekulare Alkylgruppen, z. B. gerad-
oder verzweigtkettige aliphatische Kohlenwasserstoffgruppen, wie Methyl-, Athyl-,
Propyl-, Isopropyl-, Butyl-, Isobutylgruppen u. dgl. bedeuten und X ein Halogenatom,
vorzugsweise ein Chlor- oder Fluoratom ist.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man
eine Verbindung der allgemeinen Formel 11
in der Ri, R2 und X die vorstehende Bedeutung besitzen, mit Hilfe der Mikroorganisinen
des Stammes Colletotrichum, z. B. C. phomoides, C. pesi,
C. linicolae u. dgl., oder des Stammes Tricothecium, z. B. T. roseum, T.
flagrans, T. domesticum u. dgl., vorzugsweise mit Hilfe von Colletotrichum phomoides
oder Tricothecium roseum, nach an sich bekannten Methoden in 11 a-Stellung
hydroxyliert.
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Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird entweder das
Steroid der Formel 11
mit einer aeroben Kultur des Mikroorganismenstammes
in Berührung gebracht, oder es werden das Steroid, Luft und der Mikroorganismenstamm
in einem wäßrigen Medium zusammengebracht. Die Bedingungen zum Züchten der Mikroorganismen,
die für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzt werden, sind die gleichen (vom
Zusatz des umzuwandelnden Steroids abzusehen) wie beim Züchten anderer Pilze, z.
B. zur Herstellung von Antibiotica oder Riboflavin, d. h. der Mikroorganismenstamm
wird in Berührung mit (in oder auf) einem geeigneten Nährmedium unter aeroben Bedingungen
gezüchtet. Ein geeignetes Medium enthält im wesentlichen eine Stickstogquelle und
eine Quelle für Kohlenstoff und Energie. Letztere kann ein Kohlenhydrat, wie Rohrzucker,
Melasse, Glucose, Maltose, Stärke oder Dextrin, eine Fettsäur-e, ein Fett und/oder
das Steroid selbst sein. Vorzugsweise enthält jedoch das Medium neben dem Steroid
eine assimilierbare Quelle für Kohlenstoff und Energie. Die Stickstoff liefernden
Substanzen können organische Substanzen, z. B. Sojabohnenmehl, Maisquellwasser,
Fleischextrakt und/oder Destillationsrückstände, oder synthetische Substanzen sein,
z. B. einfache organische oder anorganische Verbindungen, wie Ammoniumsalze, Alkalinitrate,
Aminosäuren oder Harnstoff. Während der Gärung soll flir eine angemessene Zufuhr
von steriler Luft gesorgt werden, indem z. B. nach üblichen Verfahren eine große
Oberfläche des Mediums der Luft ausgesetzt oder eine belüftete Submerskultur verwendet
wird. Das Steroid kann dem Kulturinedium während der Inkubationszeit oder auch dem
Medium vor dem Sterilisieren oder Animpfen zugesetzt werden. Der vorzugsweise verwendete
Konzentrationsbereich des Steroids in dem Kulturmedium liegt zwischen etwa
0,01 und 0,10 Gewichtsprozent. Die Brutzeit kann sehr verschieden
sein
und z. B. zwischen etwa 6 und 96 Stunden betragen.
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Die vorstehend beschriebene Ila-Hydroxylierung wird vorzugsweise mit
einem Acetonid der Formel II, d. h. mit einer Verbindung der Formel, in der
R, und R2 je eine Methylgruppe bedeuten, durchgeführt.
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Die Ausgangsverbindungen der Formel 11 können aus J5,16-Pregnadien-3ß,21-diol-20-on-21-acetat
nach dem in J. Am. Chem. Soc. 81, 1264 (1959) und
J. Am. Chem. Soc. 82, 3399 (1960) beschriebenen Verfahren durch aufeinanderfolgende
Behandlung mit Kaliumpermanganat und einem Keton oder Aldehyd in Gegenwart von Perchlorsätire
hergestellt werden, wobei das -15-Pregnen-3fl,16a,17a,21-tetrol-20-on-16,17-ketal
oder -16,17-acetal erhalten wird. Der Acetal-oder Ketalrest entspricht dabei dem
bei der Umsetzung verwendeten Keton oder Aldehyd der allgemeinen Formel
in der Rl und R2 die oben angegebene Bedeutung haben. Bei der Behandlung des Ketals
oder Acetals mit Monoperphthalsäure wird das 5a,6a-Epoxyd erhalten. Durch Spaltung
des Epoxyds mit Bortrifluorid oder Bortrichlorid in Äther-Benzol wird die entsprechende
5a-Hydroxy-6fl-fluor- oder 5a-Hydroxy-6ß-chlorverbindung erhalten, die dann durch
Oxydation mit Chromtrioxyd und anschließende Behandlung mit wasserfreiem Chlorwasserstoff
in Aceton in das 6a-Fluor- oder 6a-Chlor- 1 6a-hydroxycortexolon-16,17-ketal-21-acetat
bzw. das entsprechende Acetal umgewandelt wird. Die zuletzt genannte Verbindung
kann dann durch Verseifen mit verdünntem Alkali, wie Kaliumcarbonat oder Kaliumhydroxyd,
in Abwesenheit von Sauerstoff entacyliert werden, wobei das gewünschte Ausgangsmaterial
erhalten wird. Für die Herstellung der Ausgangsstoffe wird im Rahmen der vorliegenden
Erfindung-kein Schutz begehrt.
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Die Verbindungen der Formel I haben ähnlich wie Cortison und Hydrocortison
entzündungshemmende Eigenschaften und können daher in der Human- und Veterinännedizin
z. B. zur Behandlung von rheumatischer Arthritis und Nebennierdenrindenhormon-Insuflizienz
verwendet werden, wobei sie an Stelle von Cortison und Hydrocortison in der gleichen
Weise wie diese verabreicht werden können und die Dosierung von der Wirksamkeit
des einzelnen Steroids abhängt.
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Es ist bekannt, daß die Enzymsysteme von Mikroorganismen und anderen
Quellen zu vielfältigen Umsetzungen bei Steroiden befähigt sind. Typisch ist dabei
die hohe Spezifität dieser Umsetzung. So wurden -1-1-3-Ketosteroide mit einer Ketolseitenkette,
wie 6a-Fluorcortexolon-Derivate, durch Inkubation mit Nebennierenpräparaten in der
11-Stellung hydroxyliert; J. Am. Chem. Soc. 80, 6110 (1958). Mit Aspergillus
niger und anderen Mikroorganismen gelang es, Cortexolon in Cortisol umzuwandeln.
In einer Veröffentlichung von E. Vischer und A.Wettstein in »Advances in
Enzymology«, Vol. 20, 1958, S. 249, wird über die Eignung von Tricotheeium
roseum zur 17a-Hydroxylierung von Steroiden berichtet. Auf S. 252 wird erwähnt,
daß die Inkubation von Corticosteron mit dem 17a-hydroxylierenden Organismus Tricothecium
roseum neben Hydrocortison (Cortisol) noch Cortison ergibt. In diesem Fall kann
also der genannte Mikroorganismus die 1 Iß-Hydroxylgruppe dehydrieren. Es
ist daher überraschend, daß die verfahrensgemäß verwendeten Mikroorganismen des
Stammes Tricothecium und Colletotrichum im erfindungsgemäßen Verfahren A4-3-Ketosteroide
mit Ketolseitenkette, einer Halogenfunktion in 6a-Stellung und einer Acetal- bzw.
Ketalgruppierung in der ]6a-17a-Stellung selektiv in der 11 a-Stellung hydroxylieren.
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Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren.
Beispiel 1
6a-Fluor-1 6a-hydroxyepihvdrocortison-16a, 1 7a-acetonid
Oberflächenwachstum einer Kultur von Tricothecium roseum, das auf »Gould«-Agar der
folgenden Zusammensetzung: Agar ........................ 20 g
Glucose
..................... lOg Hefeextrakt .................. 2,5 g
Kaliumphosphat
.............. 1 g
destilliertes Wasser auf ........ 1 1
20 Minuten
sterilisiert bei ..... 1,05 kg/CM2 gehalten wurde, wird in 5 ccm einer
0,01 %igen Natriumlaurylsulfatlösung suspendiert. Anteile von 1 ccm dieser
Suspensionen werden zum Animpfen von acht Erlenmeyerkolben mit einem Fassungsvermögen
von 250 ccm verwendet, die je 50 ccm eines Nährmediums der folgenden
Zusammensetzung enthalten: Maisquellwasser .............. 6 gil NH4H2P04
.................. 3 91
CaC03 ...................... 2,5 g/1
Sojabohnenöl
................ 2,2 g/1
Steroid destilliertes Wasser auf
........ 11
Hefeextrakt .................. 2,5 g
Glucose .....................
lOg Die Kolben werden dann bei 25'C auf einer Drehschüttelmaschine mit
280 U/min (Radius etwa 5 cm) 72 Stunden bebrütet, worauf
10 Volumprozent des Inhalts der Kolben aufje sieben Erlenmeyerkolben mit
einem Fassungsvermögen von 2 1 übertragen werden, die je 500 ccm des
vorgenannten Nährmediums enthalten. Gleichzeitig werden jedem Kolben 2,5
ccm einer Lösung von 6a-Fluor-]6a-hydroxycortexolon-16a,17a-acetonid in N,N-Dimethylformamid
zugesetzt, die 60 mg des Steroids je ccm enthält. Die Kolben, deren
Inhalt eine Steroidkonzentration von 300 7,1ccm aufweist, werden dann auf
einer Drehschüttelmaschine mit 280 U/min (Radius etwa 5
cm) geschüttelt.
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In Abständen von 24 Stunden nach der Zugabe des Steroids werden von
der gesamten Gärmaische Proben abgenommen. Je 8 ccm der Probe werden mit
1 ccm Methylisobutylketon extrahiert, worauf die Methylisobutylketonextrakte
in Mengen von 0,1
und 0,2 ccm auf »Whatrnan«-Papier Nr. 1 aufgetragen
und 3 Stunden mit einem Toluoi-Propylenglykol-Gemisch chromatographiert werden.
Die Chromatogramme werden dann im ultravioletten Licht auf die Gegenwart des Steroidsubstrats
untersucht.
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4Tage nach der Zugabe des Steroids wird die Gärmaische ausiedem der
Kolben durch ein Büchner-
Seitz-Klärfilter vakuumfiltriert. Die
vereinigten Filtrate werden dann dreimal mit je 1300 ccm Chloroform extrahiert.
Die Chloroformextrakte werden vereinigt, zweimal mit 1500 ccm Wasser gewaschen
und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand (etwa 930 mg) wird aus
Aceton-Hexan umkristallisiert, wobei etwa 284 mg 6a-Fluor-16a-hydroxyepihydrocortison-16a,
17a-acetonid erhalten werden. Fp. 264 bis 266'C; [aj YO = + 102' (Chloro-),Alk
ANujol form), Max 237 mti», e # 13 100, =286 592,
Max 6,04 und
6,17 u. C24H3,306F (436,50)
Berechnet ..... C 66,04, H
7,62, F 4,35; gefunden ..... C 66,17, H 7,36, F 3,7 1.
Beispiel
2 6a-Fluor-16a-hydroxyepihydrocortison-16a, 17a-acetonid Oberflächenwachstum einer
Kultur von Colletotrichum phomoides, das auf »Gould«-Agar der folgenden Zusammensetzung:
Agar ........................ 20 g
Glucose .....................
10 g
Hefeextrakt .................. 2,59
Kaliumphosphat ..............
1 g
destilliertes Wasser auf ........ 11
20 Minuten sterilisiert bei
..... 1,05 kg(cm2 gehalten worden war, wird in 5 cem einer 0,01 %igen
Natriumlaurylsulfatlösung suspendiert. Anteile von 1 ccm dieser Suspension
werden zum Animpfen von acht Erlenmeyerkolben mit einem Fassungsvermögen von
250 ccm verwendet, die je 50 ccm eines Nährmediums der folgenden Zusammensetzung
enthalten: Stärke ....................... 20 g
gemälzter Getreideextraktsirup
lOg Pepton ...................... 20 g
Glucose .....................
44 g
NaN03 ...................... 3 g
KH2P0,1 .....................
1 g
KCI ......................... 0,59
MgS04 7H20 ................
0,5 g
FeS0,i ..... 0,01 g
Leitungswasser auf ........... 11
20
Minuten sterilisiert bei ..... 1,05 kg(cm2 Die Kolben wurden dann bei einer
Temperatur von 25'C auf eine Drehschüttelmaschine mit 280 U/min (Radius etwa
5 cm) 72 Stunden bebrütet, worauf je 10 Volumprozent des Inhalts
dieser Kolben auf je sechs Erlenmeyerkolben mit einem Fassungsvermögen von
2 1 übertragen werden, die je 500 ccm eines Nährmediums der folgenden
Zusammensetzung enthalten: NaN03 ...................... 3 g
Glucose
..................... 40 g
KH2P04 ..................... 1 g
Agar
........................ 1 g
Leitungswasser auf ............. 11
20
Minuten sterilisiert bei ..... 1,05 kg/cm2 Gleichzeitig werden jedem Kolben
2,5 ccm einer Lösung von 6a - Fluor - 16a - hydroxycortexolon-16a,17a-acetonid
in N,N-Dimethylformamid zugesetzt, die 60 mg des Steroids je ccm enthält.
Die Kolben, deren Inhalt eine Steroidkonzentration von 300 -y/ccm aufweist,
werden dann auf einer Drehschüttelmaschine mit 280 U/min (Radius etwa
5 cm) geschüttelt. In Abständen von 24 Stunden nach der Zugabe des Steroids
werden von der gesamten Gärmaische Proben entnommen. Je 8 ccm der Probe werden
mit 1 ccm Methylisobutylketon extrahiert, worauf die Methylisobutylketonextrakte
in Mengen von 0, 1 und 0,2 ccm auf »Whatman«-Papier Nr. 1
aufgetragen
und 3 Stunden mit einem Toluol-Propylenglykol-Gemisch chromatographiert werden.
Die Chromatogramme werden dann entwickelt und im ultravioletten Licht auf die Gegenwart
des Steroidsubstrats untersucht.
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7Tage nach der Zugabe des Steroids wird die Gärmaische aus jedem der
Kolben direkt durch ein Büchner-Seitz-Klärfilter vakuumfiltriert. Die vereinigten
Filtrate werden dann dreimal mit Anteilen von 1000 ccm Methylisobutylketon--Chloroform
extrahiert. Die Methylisobutylketonextrakte werden dann vereinigt, zweimal mit
je 1500ccm Wasser gewaschen und im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand
(etwa 991 mg) wird aus Aceton-Hexan umkristallisiert, wobei etwa
285 mg 6a-Fluor- 16a-hydroxyepihydrocortison- 16a, 17a-acetonid erhalten
werden, das mit dem im Beispiel. 1
erhaltenen Produkt identisch ist.