DE1167840B - Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansaeure durch enzymatische Spaltung von Phenoxymethylpenicillin - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Internat. Kl.: C 07 d

Deutsche Kl.: 12 ρ-4/01

Nummer: 1167 840

Aktenzeichen: B 66403 IV d /12 ρ

Anmeldetag: 16. März 1962

Auslegetag: 16. April 1964

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure durch enzymatische Spaltung von Phenoxymethylpenicillin.

Die 6-Aminopenicillansäure wurde erstmals im Jahre 1950 von Sakaguchi und Murao aus Penicillin G durch Spaltung mit Mycel des Penecilliumstammes Q 176 dargestellt. Später erkannten Batchelor und Mitarbeiter die Bedeutung dieser Substanz als Ausgangsprodukt für die chemische Herstellung neuer Penicilline und beschrieben die Darstellung dieser Säure durch praecursorfreie Fermentation. Die technische Gewinnung von 6-Aminopenicillansäure ist jedoch infolge der relativ geringen Ausbeuten und der subtilen Isolierungs- und Reinigungsmethode für das gewünschte Produkt auf diesem Wege nur sehr schwierig durchzuführen.

Es ist auch schon vorgeschlagen worden, Penicilline zur Gewinnung von 6-Aminopenicillansäure auf enzymatischem Wege unter Verwendung verschiedener Bakterien, Actinomyceten und Pilze zu spalten. Bei diesen Verfahren werden die das spaltende Enzym enthaltenden Mikroorganismen entweder einer Gefriertrocknung unterworfen, oder die Zellen müssen infolge ihrer geringen enzymatischen Aktivität in Form dichter Suspensionen zur Anwendung gebracht werden. Andere Organismen liefern bei Durchführung der verschiedenen Verfahren nur sehr geringe Ausbeuten an 6-Aminopenicillansäure, oder sie bilden Farbstoffe und andere Stoffwechselprodukte, die bei der Aufarbeitung des bei der Spaltung entstehenden Gemisches und Reindarstellung des Endproduktes stören. Manche der zur Spaltung vorgeschlagenen Mikroorganismen stellen besondere Ansprüche hinsichtlich Nährlösung und Fermentationsbedingungen, oder sind in unerwünschter Weise sub- stratspezifisch.

Es wurde nun gefunden, daß Pleurotus ostreatus aus der Klasse der Basidiomyceten in hervorragender Weise für die technische Durchführung der Spaltung von Phenoxymethylpenicillin und dessen Salzen in 6-Aminopenicillansäure geeignet ist und daß damit die vorstehend erwähnten Nachteile bekannter, für die Penicillinspaltung vorgeschlagener Mikroorganismen vermieden und besonders hohe Ausbeuten an Spaltprodukt erzielt werden können. Basidiomyceten sind bisher für die Penicillinspaltung noch nicht vorgeschlagen worden. Es ist auch kein Vertreter dieser Klasse als penicillinamidasehaltig bekanntgeworden.

Aus der französischen Patentschrift 1 256 281 ist ein Verfahren zurSpaltung von Penicillinen zu 6-Aminopenicillansäure mit Hilfe verschiedener Mikroorga-Verf ahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure durch enzymatische Spaltung von Phenoxymethylpenicillin

Anmelder:

Biochemie

Gesellschaft mit beschränkter Haftung,

Kundl (Österreich)

Vertreter:

Dr. F. Zumstein,

Dipl.-Chem. Dr. rer. nat. E. Assmann

und Dipl.-Chem. Dr. R. Koenigsberger,

Patentanwälte, München 2, Bräuhausstr. 4

Als Erfinder benannt:

Dr. Ernst Brandl,

Dr. Walter Kleiber, Kundl (Österreich)

Beanspruchte Priorität:

Österreich vom 31. März 1961 (A 2672/61)

nismen bekannt. Hiernach werden die höchsten Spaltergebnisse mit Fursarium semitectum erreicht. Dieses bekannte Verfahren wurde mit jenem gemäß der Erfindung wie folgt verglichen:

Für die das erfindungsgemäße Verfahren betreffenden Vergleichsversuche diente der gleiche Stamm, der gemäß den Beispielen verwendet wurde, sowie Nährlösung und Versuchsanordnung entsprechend dem Beispiel 6.

Die das bekannte Verfahren betreffenden Vergleichsversuche wurden mit dem in der französischen Patentschrift 1 256 281 beschriebenen Stamm Fusarium semitectum durchgeführt. Nährlösung und Versuchsbedingungen entsprachen den Bedingungen des Beispiels 2 der genannten französischen Patentschrift, ausgenommen die zugesetzte Penicillinmenge, die —■ wie bei der Spaltung mit Pleurotus ostreatus — auf 30000 E/ml Kalium-Phenoxymethylpenicillin erhöht wurde. Die in der Tabelle 1 angegebenen Zahlen sind Mittelwerte aus zwei Parallelläufen.

409 559/536

Tabelle 1

	Pleurotus ostreatus	6-Amino	97,8	Fusarium	semitectum	72,8	38,3
		penicillan säure	95,5		6-Amino	1526Oi 50,9
Stun den	Rest penicillin	E/ml °/0	80,3	Rest penicillin	penicillan säure	Π480
	E/ml	22130 73,8	E/ml	E/ml ! »/„
12	9915	27860 92,5	12990	13600 145,4
24	2290	29345	3240	23610 78,7
36	1100	28645	870	21840
48	1140	24125	440
72	1070	260

Aus diesen Zahlenangaben geht hervor, daß das erfindungsgemäße Verfahren zu höheren Ausbeuten führt und daß diese außerdem in kürzerer Zeit erreicht werden. Dies steht auch in Übereinstimmung mit den Beispielen der genannten französischen Patentschrift. In der Tabelle 2 sind die diesbezüglichen Ausbeuteziffern jenen aus den Beispielen gemäß der Erfindung gegenübergestellt.

Tabelle 2

Bei	Verfahren gemäß der französischen Patent schrift 1 256 281	penicillan- säure	Erfindungsgemäßes Verfahren	0/0 6-Amino
spiel	7-it · '< % 6-Amino-			penicillan säure
	jLQit m Stunden		Zeit in Stunden	82
1	36	65	48	94
2	48		36	85
3	48		24	88
4	72		36	90
5	72	48	95
6	48	30

Die nach den Beispielen des bekannten Verfahrens erreichten Ausbeuten an 6-Aminopenicillansäure sind nur im Beispiel 3 mit 65% angegeben. In diesem Beispiel wird auch festgehalten, daß noch 15% des eingesetzten Penicillins als Restpenicillin vorliegen, so daß also 20% des eingesetzten Penicillins bzw. der erhaltenen 6-Aminopenicillansäure zerstört wurden. Beim erfindungsgemäßen Verfahren ergänzen sich die Prozentangaben der erhaltenen 6-Aminopenicillansäure und des verbliebenen Restpenicillins bis zum Optimum der Einwirkungszeit praktisch auf 100. Dies darf als ein weiterer besonders wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens angesehen werden. Bei Verwendung von Pleurotus ostreatus benutzt man nicht nur einen sehr aktiven Enzymträger, der höhere Spaltausbeuten in kürzerer Zeit als in der genannten französischen Patentschrift angegeben gewährleistet, sondern es liegen sowohl für das eingesetzte Phenoxymethylpenicillin als auch für die gebildete 6-Aminopenicillansäure besonders günstige Stabilitätsverhältnisse vor.

Der Pleurotus ostreatus kann beim erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft in Form von in Gärung befindlichen Kulturen, lebenden oder toten Zellsuspensionen bzw. Myceltrockenpulvern eingesetzt werden. Man kann aber auch Autolysate oder Extrakte dieses Mikroorganismus anwenden, um das Phenoxymethylpenicillin verfahrensgemäß in 6-Aminopenicillansäure umzuwandeln.

Vorzugsweise wird das Verfahren so durchgeführt, daß der zu kultivierende Pleutorus ostreatus in einer Nährlösung saprophytisch herangezüchtet wird, die das Wachstum gewährleistende assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Spurenmetalle enthält, wobei man je nach der Größe der verwendeten Kulturtanks eine oder mehrere vegetative Vorstufen einschaltet und nach einer bestimmten Vorgärzeit, im allgemeinen nach Abschluß der Wachstumsphase,

ίο das zu spaltende Penicillin zusetzt und so lange weiterfermentiert, bis ein genügend großer Anteil des Substrates in Form von 6-Aminopenicillansäure vorliegt. Man kann aber auch in der Weise vorgehen, daß man den Fermentationsprozeß in dem Zeitpunkt, in

dem der verwendete Mikroorganismus die höchste Enzymkonzentration erreicht hat, abbricht, das PiIzmycel bzw. die Zellen von der Kulturlösung abtrennt und nach Wiedersuspendierung des Rückstandes, z. B. in Wasser, physiologischer Kochsalzlösung oder

ao Pufferlösung, mit dem zu spaltenden Substrat in innigen Kontakt bringt; dies geschieht am besten durch Schütteln oder Rühren, wobei unter aeroben Bedingungen die Spaltwirkung des Enzym komplexes ermöglicht wird. Die Konzentration des eingesetzten

Penicillins, das auch kontinuierlich oder in Portionen während des Spaltprozesses zugesetzt werden kann, wird in Abhängigkeit von der Aktivität des Enzyms vorzugsweise so gewählt, daß die Einwirkungsdauer nur wenige Stunden, höchstens aber 2 Tage betragt,

so daß bei voller Ausnutzung der Enzymleistung die Eigenzerstörung des eingesetzten Penicillins und der gebildeten 6-Aminopenicillansäure möglichst gering gehalten wird. Der bei der Spaltung im Reaktionsgemisch vorliegende p_H-Wert kann im schwach sauren bis schwach alkalischen Bereich liegen; das Temperaturoptimum liegt bei 28 bis 30° C, doch ist die Spaltung von Phenoxymethylpenicillin und dessen Salzen sowohl bei tieferen als auch bei höheren Temperaturen durchführbar, wobei ähnliche Überlegungen gelten wie für die Wahl aer Enzym- und Substratkonzentration, welche die Spaltungsdauer mitbestimmen.

Besondere Ausführungsformen des Verfahrens sind im Rahmen der nachfolgenden Beispiele näher er-

läutert.

Beispiel 1

Das Mycel einer 14 Tage bei 24^e C bebrüteten Stammkultur des Pleurotus ostreatus (Nährboden

Sabouraud-Dextrose-Agar. abgefüllt in 16-160-mm-Propierröhrchen je 5 ml, in Schräglage erstarren gelassen) wird mit 5 ml nachstehend angeführte Nährlösung abgeschwemmt, in einem sterilen Probierröhrchen mittels eines Glasstabes zerkleinert und in 20 ml nachstehend angeführter steriler Nährlösung, die in einen 100-ml-Enghals-Erlenmeyerkolben abgefüllt ist, übertragen.

Nährlösung:

l g Stickstoff (in Form von filtriertem Bierhefe-

autolysat)
50 g Glucose

1 g Monokaliumphosphat
0,5 g Magnesiumsulfat-heptahydrat 0,5 g Calciumnitrat

0,1 g Natriumchlorid
0,C5 g Eisen(II)-sulfat-heptahydrat mit Brunnenwasser auf 1000 ml aufgefüllt ph 6,0

Nach der Abfüllung der Nährlösung werden 0,6% Spermöl zugesetzt. Die Nährlösung wird 40 Minuten bei 12O⁰C im Dampf autoklav sterilisiert. Sie wird nun auf einem Rotationsschüttelwerk bei 40 mm Hub und 260 Umdrehungen pro Minute während 96 Stunden bei 28⁰C geschüttelt. Das Mycel dieser ersten Submersstufe ist kugelig. Die gesamte Kultur wird in einer Glasrohre mittels eines gut eingepaßten Glasstempels unter sterilen Bedingungen zu breiiger Konsistenz verrieben.

IC ml dieser verriebenen Kultur werden zur Beimpfung der zweiten Submersstufe (500-ml-Weithals-Erlenmeyerkolben, gefüllt mit 100 ml der oben beschriebenen Nährlösung) verwendet. Es wird auf einem Rotationsschüttelwerk bei 40 mm Hub und 260 Umdrehungen pro Minute während 96 Stunden bei 28⁰C geschüttelt; hierauf wird die Kultur mittels eines geeigneten Tauchrührwerks unter sterilen Bedingungen bei lOOC bis 1500 Umdrehungen pro Minute während einer Minute homogenisiert. Zu diesem Zweck wird der im Dampf autoklav während 30 Minuten bei 12O⁰C sterilisierte Dispergierkopf des Rührwerks in da„ unter sterilen Bedingungen geöffnete und waagerecht gehaltene Kulturgefäß eingeführt.

10 ml des homogenisierten Produktes aus der zweiten Submersstufe werden nun zur Beimpfung eines Kulturgefäßes der dritten Submersstufe (500-ml-Weithals-Erlenmeyerkolben, der mit 100 ml der oben beschriebenen Nährlösung gefüllt ist) verwendet. Es wird unter den gleichen Bedingungen wie in der zweiten Submersstufe während 96 Stunden bei 28 ⁰C geschüttelt und hierauf unter den gleichen Bedingungen homogenisiert.

Zur Spaltung des Penicillins werden nun 100-ml-Erlenmeyerkolben, die mit 20 ml der oben angegebenen sterilen Nährlösung gefüllt sind, verwendet, wo Dei mit 2 ml der vorstehend beschriebenen dritten Submersstufe beimpft wird. Nach 36stündigem Schütteln auf einer Rundschüttelmaschine bei 40 mm Hub, 260 Umdrehungen pro Minute und 28 ⁰C werden 40000 Einheiten Kalium-Phenoxymethylpenicillin in fester Form pro Millimeter Kolbeninhalt zugesetzt. In 8stündigen Intervallen werden zur Bestimmung des Restpenicillins bzw. der gebildeten 6-Aminopenicillansäure jeweils zwei kleine Teilmengen zur Prüfung entnommen; nach Extraktion desPenicillins wird auf jodometrischem Wege das Verhältnis der Konzentration des Substrates zur Konzentration des Spaltproduktes bestimmt. Nach 48 Stunden sind 82% des eingesetzten Penicillins gespalten. Das Spaltprodukt ist säure.

Beispiel 3

IC ml der gemäß Beispiel 1 gewonnenen, homogenisierten zweiten Submersstufe werden zur Beimpfung eines mit 40 ml der im Beispiel 1 angegebenen Nährlösung gefüllten 500-ml-Erlenmeyerkolbens verwendet. Der Kolben wird während 66 Stunden bei 30 mm Hub und 230 Umdrehungen pro Minute bei 30⁰C auf einer Rundschüttelmaschine geschüttelt; hierauf werden 300 000 Einheiten pro Milliliter Kalium-Phenoxymethylpenicillin zugesetzt; 24 Stunden später ist das zugesetzte Penicillin ζ α 85 % gespalten.

Beispiel 4

2-1-Erlenmeyerkolben werden mit 100 ml folgender Nährlösung gefüllt:

1,5 g Stickstoff (in Form von Maisquellwasser,

50 g Trockensubstanz) 75 g Glucose

1,5 g Monokaliumphosphat 1,0 g Magnesium sulfat-heptahydrat 1,0 g Calciumnitrat
0,2 g Natriumchlorid
0,01 g Zinkchlorid

mit Brunnenwasser auf 1000 ml aufgefüllt Ph 6,5

Die Kolben werden 20 Minuten bei 120°C sterilisiert und sodann mit je 10 ml des im Beispiel 1 beschriebenen homogenisierten Produktes aus der dritten Submersstufe beimpft. Die Kolben werden hierauf während 48 Stunden auf einem Reziprokschüttler mit 150 Bewegungen pro Minute und 5 cm Ausladung bei 26⁰C geschüttelt; hierauf werden 50 000 Einheiten pro Milliliter Kalium-Phenoxymethylpenicillin zugefügt. Nach weiterem 36stündigem Schütteln sind 88 % des eingesetzten Penicillins gespalten.

40

45

Beispiel 2

55

Mit 100 ml der nach Beispiel 1 erhaltenen dritten Submersstufe werden 101 fassende Submerstanks aus Nirostastahl beimpft, die mit einem Vortex-Belüftungsund -Rührsystem aasgestattet und mit 41 der im Beispiel 1 beschriebenen sterilen Nährlösung gefüllt sind. Nach einer 86 Stunden dauernden Fermentationszeit (500 Umdrehungen pro Minute, Propellerrührer mit cm Durchmesser) wird das gewonnene Pilzmycel von der Kulturlösung abgetrennt, gewaschen und in 21 Phosphatpuffer bei pn 7,0 suspendiert, worauf 100 000 Einheiten Kalium-Phenoxymethylpenicillin pro Milliliter zugesetzt werden. Nach 36stündigem Rühren sind 94% des eingesetzten Penicillins gepalten.

Beispiel 5

Die Heranführung der dritten Submersstufe gemäß Beispiel 1 wurde zwecks Gewinnung einer größeren Impfgutmenge so variiert, daß 50 ml des homogenisierten Produkts aus der zweiten Submersstufe zur Beimpfung von 2-1-Erlenmeyerkolben, die mit 500 ml der im Beispiel 1 beschriebenen Nährlösung gefüllt waren, verwendet werden. Nach 72stündigem Schütteln bei 28⁰C auf einer Rundschüttelmaschine mit 40 mm Hub und 260 Umdrehungen pro Minute wird der Inhalt von sieben derartigen 2-1-Kolben als Einsaat 6-Aminoperiicillan- 50 für ein mit 751 der im Beispiel 4 beschriebenen Nährlösung gefülltes 100-1-Fermentationsgefäß, welches mit einer Einrichtung zum Rühren und Belüften ausgestattet ist, verwendet. Nach 96 Stunden Fermentationszeit, wobei mit einer Umdrehungsgeschwindigkeit von 210 Umdrehungen pro Minute und einer Luftzufuhr von 11 pro Liter Nährlösung pro Minute gearbeitet wurde, erfolgt der Zusatz von 60 000 Einheiten pro Milliliter Kalium-Phenoxymethylpenicillin. Die beschriebenen Fermentationsbedingungen werden 60 aufrechterhalten, wobei nach weiteren 48 Stunden eine 90%ige Spaltung des eingesetzten Penicillins erreicht wird.

Beispiel 6

1,51 der gemäß Beispiel 5 herangeführten, homogenisierten dritten Submersstufe werden zur Beimpfung eines mit 171 der im Beispiel 1 beschriebenen Nährlösung gefüllten, 241 fassenden, mit einem Schikanen-

system ausgerüsteten Submersgefäßes verwendet und 96 Stunden bei Rühren mit 450 Umdrehungen pro Minute und einer Luftzufuhr von 0,8 1 pro Liter Nährlösung pro Minute herangeführt. Hierauf werden 20 000 Einheiten pro Milliliter Kalium-Phenoxymethylpenicillin zugesetzt und 30 Stunden wie vorstehend beschrieben, weiterfermentiert, wodurch eine Spaltung des eingesetzten Penicillins von 95% erzielt wird.

Beispiel 7

IO

a) 50 ml gemäß Beispiel 2 gewonnener Kulturbrei werden in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben gefüllt, mit 2 % Kochsalz und 2 °/₀ Chloroform versetzt und unter zeitweiligem Umschütteln durch 48 Stunden bei 45⁰C autolysiert. Dem dünnflüssig gewordenen Kulturbrei werden 50 000 Einheiten pro Milliliter Kalium-Phenoxymethylpenicillin zugesetzt. Nach 36stündigem Schütteln auf einer Rotationsschüttelmaschine bei 40 mm Hub, 260 Umdrehungen pro Minute und einer Temperatur von 28 ⁰C sind 96% des eingesetzten Penicillins gespalten.

b) 500 ml gemäß Beispiel 2 gewonnener Kulturbrei werden durch Abnutschen von den flüssigen Anteilen befreit und 50 g des erhaltenen Feuchtmycels unter Homogenisierung in 500 ml kaltes Aceton (+2⁰C) eingetragen. Die Mycelsuspension wird 10 Minuten gerührt und hierauf auf einer Porzellannutsche abgesaugt. Diese Acetonbehandlung wird noch zweimal wiederholt, wobei auf gute Zerkleinerung der Mycelklumpen geachtet wird. Die Entfernung des im Mycel zurückgebliebenen Acetons erfolgt im Vakuumexsikkator. Es werden 9 g Trockenpulver mit einer dem Frischmycel entsprechenden Spaltaktivität erhalten.

Zur Extraktion des Enzyms aus dem Trockenpulver dient eine 0,2 n-Natriumacetatlösung von pH 6,0, die wie folgt zubereitet wird: 27,2 g Natriumacetat mit 3 Mol Kristallwasser werden mit destilliertem Wasser auf 11 aufgefüllt und mit konzentrierter Essigsäure auf pn 6,0 eingestellt.

7 g Trockenpulver werden nun durch 15stündiges Schütteln mit 175 ml der oben beschriebenen Natriumacetatlösung bei Zimmertemperatur extrahiert. Hierauf wird der pH-Wert mit Natronlauge auf 7,5 eingestellt und der Extrakt durch Zentrifugieren von den Mycelanteilen befreit.

Der Extrakt wird nun mit destilliertem Wasser auf 375 ml aufgefüllt (= Volumen des 7 g Trockenpulver entsprechenden Kulturbreies). 50 ml dieses verdünnten Extraktes werden in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben gefüllt und nach Zusatz von 50 000 Einheiten pro Milliliter Kalium-Phenoxymethylpenicillin 36 Stunden auf einer Rotationsschüttelmaschine bei 40 mm Hub, 260 Umdrehungen pro Minute und 28 ⁰C geschüttelt, wobei 54% des eingesetzten Penicillins gespalten werden.

c) 50 ml gemäß Beispiel 2 gewonnener Kulturbrei werden durch Abnutschen von der Kulturbrühe befreit. Das erhaltene Feuchtmycel wird dreimal mit je 100 ml destilliertem Wasser gewaschen und nach dem letzten Abnutschen in einer Gefriertrocknungsanlage (Leybold G 02) gefriergetrocknet. Nach einer Lagerung von 1 Woche im Vakuumexsikkator bei Zimmertemperatur wird das Trockenmycel pulverisiert, in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben gebracht, in 50 ml destilliertem Wasser suspendiert und unter gleichen Bedingungen wie im Beispiel 7, b) geschüttelt. Es werden 83% des eingesetzten Penicillins gespalten.

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure durch enzymatische Spaltung von Phenoxymethylpenicillin, dadurch gekennzeichnet, daß man das Phenoxymethylpenicillin oder dessen Salze mit dem Mikroorganismus Pleurotus ostreatus aus der Klasse der Basidiomyceten oder dessen Autolysaten oder Extrakten spaltet.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Phenoxymethylpenicillin oder dessen Salze einer gärenden Kultur des Pleurotus ostreatus zusetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Spaltung eine nährstofffreie Suspension des Pleurotus ostreatus oder seines Myceltrockenpulvers verwendet.

In Betracht gezogene Druckschriften: Französische Patentschrift Nr. 1 256 281.

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