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Verfahren zurVaccine-Herstellung Die Erfindung betrifft Verbesserungen
bezüglich der Herstellung von B. C. G.-Vaccine.
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B. C. G.-Vaccine wird nunmehr in verschiedenen Ländern im steigenden
Maße zur Immunisierung gegenüber Tuberkulose verwendet und besteht aus einer lebensfähigen
Kultur eines abgeschwächten Ochsen-Tuberkel-Bazillus, der als » Bazillus von Calmette
und Guerin « bezeichnet wird, woher sich die Abkürzung B. C. G. ableitet.
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Ein Hauptproblem bezüglich B. C. G.-Vaccine beruht darauf, daß sichergestellt
ist, daß die Vaccine eine ausreichende Anzahl lebensfähiger Organismen zur Zeit
der Inokulierung enthält. Ein Verfahren, das sich von besonderem Wert für die Lagerung
von B. C. G.-Vaccine zeigte, besteht in der Gefriertrocknung der Vaccine, welche
dann gewöhnlich in Ampullen gelagert wird. Zum Schutz der Organismen wurde vorgeschlagen,
die Gefriertrocknung in Gegenwart einer Vielzahl von Schutzmedien durchzuführen,
da sich von diesen Medien gezeigt hatte, daß sie das Ausmaß des Überlebens der Organismen
während der Gefriertrocknung steigern. Jedoch war es im allgemeinen nicht möglich,
gefriergetrocknete B. C. G.-Vaccine für irgendeinen längeren Zeitraum bei Raumtemperaturen
zu lagern, insbesondere in den wärmeren Ländern, und im allgemeinen wird die Vaccine
am besten bei Kühlsehranktemperaturen gelagert. Die niedrige Stabilität der gefriergetrockneten
B. C. G.-Vaccine gibt Anlaß zu beträchtlichen praktischen Schwierigkeiten beim Gebrauch.
Deshalb besteht das Ziel der Erfindung in der Herstellung einer gefriergetrockneten
B. C. G.-Vaccine mit verbesserter Lagerfähigkeit.
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Es wurde nun gefunden, daß die Art des Mediums, in welchem der Bazillus
kultiviert wird, von beträchtlicher Bedeutung für die Herstellung von gefriergetrockneter
B. C. G.-Vaccine mit verbesserter Stabilität bei der Lagerung ist. So wurde, nachdem
bisher mehr Aufmerksamkeit auf die Art des Schutzmediums, in welchem die Vaccine
gefriergetrocknet wird, gelegt worden war, nun gefunden, daß die Instabilität teilweise
auf Substanzen zurückzuführen ist, die in dem Kulturmedium, in welchem die Organismen
wachsen, vorhanden sind und in das gefriergetrocknete Produkt mitübernommen werden.
Insbesondere wurde gefunden, dal3 zur Herstellung einer gefriergetrockneten B. C.
G.-Vaccine von verbesserter Lebensfähigkeit nach Lagerung das angewandte Kulturmedium
ein solches sein soll, daß es weder aldehydische Substanzen noch Substanzen enthält,
welche während des Kulturverfahrens in Aldehyde übergeführt werden, und daß es daneben
keine andere Verbindung
enthält, welche in eine Substanz übergeführt wird, bei der
sich eine Inaktivierung des Organismus ergibt.
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Bei der technischen Herstellung von B. C. G.-Vaccine wurden gutes
Wachstum und demzufolge hohe Ausbeuten als wesentlich angesehen, und die angewandten
Medien enthielten eine übermäßige Menge von Kohlenstoff und Energiequellen, wobei
Glyzerin und/oder Glukose im allgemeinen zu diesem Zweck verwendet wurden. Glukose
ist natürlich ein Aldehyd, und es wurde gefunden, daß Glyzerin anscheinend in ein
Aldehyd übergeführt wird, so daß, obwohl ein kräftiges Wachstum von B. C. G. in
Medien, die diese Substanzen enthalten, stattfinden kann, die anschließende Lebensfähigkeit
der Organismen nach der Gefriertrocknung verschlechtert ist.
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Bei der Submerskultur vom B. C. G. ist es gebräuchlich, daß das Kulturmedium
ein nichtionisches Benetzungsmittel enthält. Auch hier wurde gefunden, daß es wünschenswert
ist, ein Benetzungsmittel zu wählen, welches, obwohl es selbst das Wachstum des
Organismus nicht behindert, nicht in eine Substanz übergeführt wird, welche wachstumshemmend
oder toxisch für den Organismus ist.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von gefriergetrockneter
B. C. G.-Vaccine, bei welchem B. C. G.-Organismen in einem dafür geeigneten Nährmedium
kultiviert und anschließend gefriergetrocknet werden, ist dadurch gekennzeichnet,
dal3 das Medium praktisch frei von Glyzerin, Monosaccharid, Zuckeralkoholen und
Polysacchariden, die eine Carbonylgruppe enthalten oder durch den Organismus zu
carbonylhaltigen Verbindungen übergeführt werden, ist. Falls ein Benetzungsmittel
verwendet wird, z. B. in Submerskultur, besteht dieses Benetzungsmittel vorzugsweise
aus einem nicht hydrolysierbaren, nichtionischen Benetzungsmittel. Bevorzugt wird
ein Medium verwendet, bei welchem die wesentlichen Stickstoff-und Kohlenstofferfordernisse
der Organismen durch Aminosäuren, Polypeptide und/oder Proteinhydrolysate gedeckt
werden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise in Submerskultur
durchgeführt, und das Medium enthält deshalb vorzugsweise mindestens eine Aminosäure
und/oder ein enzymatisches Abbauprodukt von Kasein und/oder ein Fleischproteinhydrolysat
und/oder einen Fleischextrakt, ein nicht hydrolysierbares, nichtionisches Benetzungsmittel,
vorzugsweise einen Polyoxyäthylenäther eines Phenols oder langkettigen Alkohols,
wie z. B. Nonyl-, Cetosteryl-oder Laurylalkohol, einen Puffer, um den p-Wert zwischen
etwa 5, 5 und 8, 5, vorzugsweise etwa 7, zu halten, und eine kleine Menge der durch
den Organismus verlangten Nährsalze, z. B. Eisen, Calcium, Zink und Kupfersalze.
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Das Puffersystem besteht gewöhnlich aus Dinatriumhydrogenphosphat/Kaliumdihydrogenphosphat.
Das Kulturmedium enthält vorzugsweise L-Asparagin als Aminosäure und kann ebenso
Mononatriumglutamat und/oder L-Glutamin enthalten.
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Die Organismen werden im allgemeinen in das Medium bei einer Temperatur
von 35 bis 39° C, vorzugsweise 37° C, inokuliert und vorzugsweise während eines
Zeitraums von 8 bis 21 Tagen inkubiert, worauf die erzeugte Kultur gewöhnlich von
dem flüssigen Medium durch Zentrifugieren abgetrennt wird. Die Organismen können
dann in einem Gefriertrocknungsmedium wieder suspendiert, gefriergetrocknet und
in Ampullen unter Vakuum eingeschlossen werden. Es sind zahlreiche Medien, in welchen
B. C. G.-Vaccine vor der Gefriertrocknung suspendiert werden kann, bekannt. Derartige
Medien enthalten beispielshalber wäßrige Lösungen oder Suspensionen von einer oder
mehreren der folgenden Substanzen : Dextran, Lactose, Saccharose, Glukose, Gelatine,
Pepton, Natriumglutamat, Pferdeserum u. dgl., wobei Dextranlösungen besonders bevorzugt
werden.
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Die Gefriertrocknung der Organismen kann in irgendeiner bequemen
Weise durchgeführt werden, z. B. wie in der britischen Patentschrift 764 718 beschrieben.
Nach dieser Patentschrift werden die Organismen in Zumischung mit wäßriger Dextranlösung
gefriergetrocknet, wobei das zu trocknende Material vorzugsweise 1 bis 10 °/o (Gewicht
je Volumen) Dextran enthält. Ein nichtionisches Benetzungsmittel der in der vorhergehend
aufgeführten Patentschrift aufgeführten Art ist vorzugsweise ebenso vorhanden, wobei
ein besonders brauchbares Benetzungsmittel unter dem Handelsnamen Triton WR 1339
bekannt ist, welches aus einem Polyoxyäthylenäther eines Phenols besteht. Um eine
» tÇbertrocknung « zu vermeiden, enthält das Dextran vorzugsweise ebenso
eine Substanz,
die Wasser beibehält, z. B. Glukose (z. B. 7, 5 I/o Glukose, zugegeben zu einer
10°/oigen Dextranlösung). Es ist zu erwähnen, dal3 die Anwesenheit von Glukose oder
Glyzerin in der Gefriertrocknungshilfslösung zum Unterschied von dem Kulturmedium,
in welchem die Organismen gewachsen sind, anscheinend keinen nachteiligen Effekt
auf die Organismen ausübt. Die Zugabe von Mononatriumglutamat kann ebenso vorteilhaft
sein. Das tatsächliche Gefriertrocknungsverfahren ist weit bekannt, kann jedoch
beispielshalber, wie in der britischen Patentschrift 764718 beschrieben, durchgeführt
werden.
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Aus den folgenden Beispielen ergibt sich die überlegene Lebensfähigkeit
und Stabilität bei der Lagerung von B. C. G.-Vaccine, die in Medien frei von Nährstoffen,
welche toxisch für die Organismen sind oder bilden, gewachsen sind.
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Die in den Beispielen verwendeten Ausdrücke Triton 1/20 und Triton
1/4000 geben an, daß das Benetzungsmittel Triton WR 1339 in einer Verdünnung von
1 : 20 bzw. 1 : 4000 verwendet wurde.
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Beispiel 1 Um den nachteiligen Effekt von Glukose und Glyzerin in
Kulturmedien auf gefriergetrocknete B. C. G.-Vaccine zu zeigen, wurden 100ml von
drei Kulturmedien mit einer 1°/oigen Suspension einer 7 Tage alten B. C. G.-Kultur
(in Dubosmedium) inokuliert. Die Kulturmedien waren wie folgt zusammengesetzt :
A. Sautonmedium (modifiziert) L-Asparagin.. 4 g Glyzerin.. 40 ml Zitronensäure.
2 g K2HP04.. 0, 5 g MgS04..... 0, 5 g Ferriammoniumcitrat.. 0, 05 g Triton 1/20.....
5 ml Destilliertes Wasser.. auf 11 7, 7, 2 B. Dubos flüssiges Medium L-Asparagin..............
2, 0 g Enzymatisches Abbauprodukt von Kasein.... 0, 5 g Na2HPO4.. 2, 5 g K, HPO,......
1, 0g Ferriammoniumcitrat.. 0, 05 g MgSO4. 0, 01 g CaCl2. 0, 5 mg ZnSO4.. 0, 1 mg
CuS04.. 0, 1 mg Tween 80.. 0, 2 g Wasser.. 900 ml NachSterilisation desselben wurdenlOOmlS°/oiges
Ochsenalbumin und 100 ml 7, 5-°/o-Glukose zu jedem Liter Medium zugegeben.
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C. Dubos flüssiges Medium-wie in B, jedoch unter Weglassung von Glukose
und Albumin und
Zugabe von 0, 5 I/o eines Fleischproteinhydrolysates
(Peptone Oxo).
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Nach einer l0tägigen Inkubation bei 37° C wurde dieKapazität jeder
Kultur auf einemHilger-Spekkerphotoelektrischen Absorptiometer gemessen (0,425,
0,27 und 0,19 für A, B bzw. C).
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10 ml jeder Kultur wurden mit 2000 U/min während 30 Minuten zentrifugiert.
Die überstehende Flüssigkeit wurde meistens völlig verworfen und die Zellablagerung
in einem Gefriertrocknungsmedium, welches Ochsenalbumin Fraktion V 5%, Rohrzucker
7,5%. Natriumglutamat 1% enthielt, wobei Triton WR1339 zu einer Endkonzentration
von 1/4000 zugegeben wurde, erneut suspendiert.
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0,1 ml jedr Suspension wurde in Ampullen gefüllt, welche unmittelbar
in dem Gefrierraum während 2 Stunden bei-50°C gefroren wurden. Danach wurden die
Ampullen in eine Gefriertrocknungsmaschine überbracht und über Nacht (etwa 20 Stunden)
bei einem Schlußvakuum von 0,02 mm Hg getrocknet. Die sekundäre Trocknung wurde
durchgeführt, nachdem die Ampullen mit der Hand verengt waren, auf einem mehrfachbehälter
über Phosphorpentoxyd während 4 Stunden. Die Ampullen wurden unter Vakuum bei 0,015
mm Hg verschlossen.
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Überlebensdauer bei 1L0° C in einem siedenden Wasserbad Die Ampullen
wurden in ein siedendes Wasserbad gegeben, und zwei von jedem Ansatz wurden an den
angegebenen Zeitpunkten entnommen. Es wurden Lebensfähigkeitszählungen im Duplikat
mit jedem durchgeführt, nachdem sie in Sauton-Triton-Lösung verdünnt wurden, auf
Olsäure-Albumin-Agar plus 10% Blut in Petrischalen. Die Kolonien wurden nach 14tägiger
Inkubation in Polyäthylenbeuteln bei 37° C gezählt.
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Ergebnisse 1. Uberlebensdauer bei 100° C
| Lebensfähige Zellen # 106 |
| A B @ |
| 0 Minuten 1, 54 3, 12 3, 94 |
| (Kontrolle) |
| 2 Minuten < 0,001 0,005 # |
| 4 Minuten < 0,001 0,002 # |
| 6 Minuten < 0, 001 0,001 # |
| 10 Minuten < 0, 001 0, 00029 oo |
| 15 Minuten < 0, 001 0, 00013 oo |
oc gibt an : Kolonien zu zahlreich, um eine genaue Zählung bei der verwendeten Verdünnung
zu erlauben.
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2. Lagerung bei 37° C während 5 Monaten Lebensfähige Zellen A.......
0, 017-106 B... 0, 0064-106 C... 0, 16-106 Beispiel 2 B. C. G.-Vaccine wurde auf
einem verbesserten Medium entsprechend der Erfindung kultiviert, in
drei unterschiedlichen
Hilfslösungen gefriergetrocknet und die Lebensfähigkeit der Vaccine nach einer Lagerung
für Zeiträume von 6 bis 24 Wochen bestimmt.
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Kulturmedium Mononatriumglutamat. 4 g L-Asparagin.... 4 g Enzymatisches
Abbauprodukt von Kasein... 1 g Na2HP04. 2, 5 g KH2PO4... 1 g Ferriammoniumcitrat...
100 mg Calciumchlorid. 1 mg Zinksulphat. 0, 2 mg Kupfersulphat. 0, 2 mg Triton WR
1339.. 0, 5 ml Destilliertes Wasser.. auf 21 Pg 7, 2 Verfahren Das Medium wurde
in 100-ml-Anteilen in Hefekulturkolben verteilt und im Autoklav unter 4, 54 kg Druck
während 15 Minuten sterilisiert. 10 ml eines 5/c-igen Fleischproteinhydrolysates
in destilliertem Wasser, sterilisiert durch Seitzfiltrierung, wurde zu jedem Kolben
vor der Inokulierung zugegeben.
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5 wurden mit 1% einer 7 Tage alten Kultur von B. C. G., gewachsen
auf Dubosmedium, inokuliert und bei 37° C 12 Tage lang inkubiert. Der durchschnittliche
photoelektrsche Absorptiometer-Ableswert zeigte 0, 26, was einem Äquivalent von
0, 91 mg/ml Feuchtgewicht der Zellen entspricht.
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Das Medium wurde bei 2000 U/min während 35 Minuten zentrifugiert
und nach Dekantieren der überstehenden Flüssigkeit erneut bei 1000 U/min.
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Die erhaltene Zellablagerung wurde in drei verschiedenen Gefriertrocknungsmedien
resuspsndiert, wobei die Undurchsichtigkeitsäquivalente von jedem bestimmt wurden.
0, 5 ml von jedem wurden in Ampullen abgefüllt und diese in dem Gefrierraum bei
-50° C für 90 Minuten gefroren. Die Ansätze wurden in den Exsikkator überbracht
und über Nacht getrocknet. Nachdem sie mit der Hand verengt worden waren, wurden
die Ansätze A und B sekundär r während 22 Stunden getrocknet, wobei das Endvakuum
0, 03 mm Hg betrug. Der Ansatz C wurde 1 Stunde getrocknet, wobei das Endvakuum
0, 03 mm Hg betrug. Alle Ampullen wurden unter dem angegebenen Vakuum versiegelt.
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Die Ansätze wurden in zwei gleiche Anteile aufgeteilt, wobei einer
bei 37° C und der andere bei 4° C gelagert wurde. Suspensionszählungen und Lebensfähigkeitszählungen
mit zwei Ampullen wurden in Duplikat durchgeführt, wobei die Verdünnung in Sauton-Triton,
Ölsäure-Albumin-Agar + 10% Blut angewandt wurde und wobei die Kolonien nach 18tägiger
Inkubation bei 37° C in Polyäthylenbeuteln ausgezählt wurden. Der Feuchtigkeitsgehalt
wurde nach dem Dampfdruckverfahren auf einer Mikrofeuchtigkeitsbestimmungsapparatur
bestimmt.
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Es wurden folgende drei Gefriertrocknungslösungen verwendet : A Dextran...
8, 3 °/o Glukose... 7, 50/o Triton.. 1/4000
B Dextran....... 5 o/0 Rohrzucker.................
7, 51/o Natriumglutamat... zoo Triton....... 1/4000 C Dextran.......... 2 °/o Natriumglutamat...
2°/o Triton... 1/4000 Ergebnisse
| Vaccine |
| ABC |
| Milligramm Feuchtigkeitsgewicht je Ampulle. 0, 6 0, 6 0, 5 |
| Suspensionszählung .................... 57, 4 # 106 49 # 106
36, 8-106 |
| Feuchtigkeitsgehalt, % .......................... 1,25 1,13
2,21 |
| Lebensfähige Zählung nach der Gefriertrocknung .. 19 # 106
14,6 # 106 8,8 # 106 |
| Überlebenswert, % ............................... 66,2 59,6
47,8 |
Lagerungsversuche bei 4 und 37° C
| Lebensfähige Zellen to6 |
| A B C |
| 40° C 37° C 4° C 37° C 4° C 37° C |
| 6 Wochen .......... 17, 3 7, 28 13, 6 8, 78 7, 95 3, 62 |
| 12 Wochen... 17, 1 6, 45 13, 3 4, 7 7, 3 2, 7 |
| 18 n....-2, 9-1, 3-1, 52 |
| 24 Wochen..... 16, 5 1, 63 12, 2 0, 52 6, 15 0, 36 |
-= Nicht untersucht.
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Untersuchung der Wirksamkeit der Vaccine bei Meerschweinchen Gruppen
von Albino-Meerschweinchen, sechs in einer Gruppe, wurden intradermal mit 0, 1 ml
mit den Rinder-B. C. G.-Vaccinen A, B und C behandelt, von
denen jede bei 4 oder
37°C während 24Wochen gelagert worden war. Die Tiere wurden tuberkulin untersucht
durch intradermale Injektion von zehn Tuberkulineinheiten (T. U.) von Old Tuberculin
und ihre Vaccinierungsveränderungen 14 und 28 Tage nach der Vaccinierung gemessen.
| Tage Tuberkulinreaktion |
| Lage- nach der Durch- Durchschnitt (mm) Durch- |
| (mm) bei Meerschweinchen Nr. |
| rung Vacci- schnitt bei Meerschweinchen Nr. schnitt |
| nation 1 2 3 4 1 5 6 1 2 3 4 5 6 |
| 14 8 8 7,5 6,5 7 6 7,2 7 7 10 10 7 10 8,5 |
| 4° C # |
| 28 8 7,5 7,5 5,5 7 6 6,1 15 13 14 14 15 12 14 |
| A # |
| 14 6 7 5,5 7,5 7 8 6,8 8 7 5 7 3 3 5,5 |
| 37° C # |
| 28 6 5 7 6 5 7 6,0 13 14 9 11 13 9 11,5 |
| 14 7 8 7,5 7,5 6,5 7,5 7,3 4 5 8 12 8 7 7,3 |
| 4° C # |
| 28 7,5 7 7,5 6,5 7 6,5 7,0 12 12 8 18 11 7 11,3 |
| B # |
| 14 5,5 7 5 7 6 7 6,2 6 6 3 6 @8 8 6,2 |
| 37° C # |
| 28 5 4,5 6 4,5 6 4,5 5,1 11 13 14 12 8 11 1,5 |
| 14 7 7 8 7,5 7 8 7,4 7 6 17 10 10 6 7,7 |
| 4° C # |
| 18 5,5 7 8 6 7 7 6,7 10 13 13 14 11 13 12,3 |
| C # |
| 14 6,5 5,5 6 5,5 6 6 5,6 3 5 6 6 4 5 4,8 |
| 37° C # |
| 28 6 6,5 5 4 4 4 4,9 11 7 8 10 10 11 9,5 |
Beispiel 3 Untersuchung der Bedeutung von Natriumglutamat in dem
Kulturmedium A. Mononatriumglutamat ....... 4 g L-Asparagin................ 4 g
Enzymatisches Abbauprodukt von Kasein........... 1 g Na4HP04........... 2, 5 g KH2PO4
............................. 1 g Ferriammoniumcitrat.......... 100 mg CaCl2.. 1
mg CuS04. 0, 2 mg ZnSO4 .................. 0, 2 mg Fleischproteinhydrolysat (Peptone
Oxo).. 20 g Triton 1/20.. 10 ml Destilliertes Wasser... auf 21 pH ................
7, 2 B. L-Asparagin.......... 4 g Enzymatisches Abbauprodukt von Kasein. 1 g Na,
HP04.. 2, 5 g KH2PO4.... 1 g Ferriammoniumcitrat... 100 mg Cal2.. 1 mg CUS04 0,
2 mg ZnSO4 .................. 0, 2 mg Fleischproteinhydrolysat (Peptone Oxo)...
20 mg Triton 1/20....... 10 ml Destilliertes Wasser.. auf 21 pH. 7, 2 Verfahren
Die Medien wurden in 100-ml-Mengen in Hefeiulturkolben verteilt und im Autoklav
unter 4, 54 kg Druck während 15 Minuten sterilisiert.
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10 von jedem Medium wurden mit 111/o einer 1 Woche alten B. C. G.-Kultur
inokuliert.
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Nach 14 Tagen wurde das Wachstum mit 2000 U/min während 35 Minuten
abzentnfugiert und der Niederschlag in den folgenden Trocknungsmedien wieder suspendiert
: A Dextran.... 8, 3 °/o Glukose.... 7, 5% Triton..... 1/4000 B Dextran..... 5 o/0
Saccharose... 7, 50/o Triton.. 1/4000 C Dextran 5% Saccharose....... 7, zoo Natriumglutamat...
1 °/o Triton... 1/4000 Es ergaben sich sechs Ansätze, die insgesamt als AA, AB,
AC, BA, BB und BC bezeichnet wurden, wobei der erste Buchstabe die Art des Kulturmediums
und der zweite Buchstabe das Trocknungsmedium angibt.
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0, 5 ml von jedem Ansatz wurden in Ampullen gefüllt, die wahrend
19 Minuten bei-50° C tiefgefroren wurden. Diese wurden über Nacht während 16 Stunden
mit einem schließlichen Vakuum von 0, 05 mm Hg gefriergetrocknet. Die sekundäre
Trocknung über P205 wurde über Nacht 22 Stunden lang fortgeführt. Das Endvakuum
betrug 0, 025 mm Hg. Die Ampullen wurden unter Vakuum verschlossen.
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Die Ansätze wurden in zwei gleiche Anteile aufgeteilt, einer wurde
bei 4° C und der andere bei 37° C gelagert.
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Lebensfähigkeitszählungen wurden in der Suspension im Duplikat und
an zwei Ampullen, von denen jede im Duplikat zu den angogebenen Zeitpunkten numeriert
wurde, wie im Beispiel 2 durchgeführt.
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Ergebnisse
| AAABACBABBBC |
| 0,35 0, 29 0,30 0,31 0,30 0, 30 |
| Milligramm je Ampulle ........................ 0, 6 0,5 0,5
0,5 0,5 0, 5 |
| Feuchtigkeit, 0, 8 0, 39 0, 45 0, 795-0, 58 |
| Lebensfähige Zellen in der Suspension. # 106/ml ...... 156
112 121 60, 3 55, 8 82, 5 |
| Lebensfähige Zellen nach der Trocknung... 47, 8 21, 6 23 25,
4 15, 5 17 |
| Überlebensrate, % ...................... 61 38,5 38 84,5 55,5
41, 2 |
Lagerungsversuche
| Lebensfähige Zellen # 106/ml Vaccine |
| Zeit |
| AA AB AC BA BB BC |
| Nach der |
| Gefrier- |
| trocknung 47, 8 21, 6 23 25, 4 15, 5 17 |
| 4° C 37° C 4° C 37° C 4° C 37° C 4° C 37° C 4° C 37° C 4° C
37° C |
| IMonat...- ! 41-3, 5-4, 8-20, 4-2, 04-4, 4 |
| 2 Monate...-21, 1-0, 76-1, 96-i 12, 2-0, 51-1, 92 |
| 4 Monate.... 29, 2 10, 9 1, 33 0, 13 1, 17 0, 38 18, 1 ! 4,
65 0, 85 0, 063 1, 01 0, 57 |
Es ist ersichtlich, dal3 die Ergebnisse von beiden Kulturmedien
ähnlich sind, wobei Medien-A-Vaccine eine geringfügig bessere Lebensfähigkeit nach
der Lagerung bei 37° C zeigt.
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Beispiel 4 Vergleich des neuen Kulturmediums mit Sauton-Triton-Kulturmedium
A. Sautonmedium Asparagin. 4 g Glyzerin. 40 ml Zitronensäure. 2 g K2HP04. 0, 5 g
MgS04. 0, 5 g Ferriammoniumcitrat 0, 05 g Triton 1/20... 5 ml Destilliertes Wasser..
auf 11 p. auf 7, 2 B. Neues Medium Mononatriumglutamat. 4 g L-Asparagin.. 4g Enzymatisches
Abbauprodukt vom Kasein (Bacto Casitone). 1 g Na2HP04. 2, 5 g K2HP04 Ig Ferriammoniumcitrat..
100 mg CaCl2. 1 mg CuS04. 0, 2 mg ZnSO4.. 0, 2 mg Fleischproteinhydrolysat (Peptone
Oxo)... 20 g Triton 1/20.. 10 ml Destilliertes Wasser.. auf 21 PH 7, 2 Verfahren
Die Medien wurden in 100-ml-Mengen in Hefekulturkolben verteilt. Diese wurden mit
einer 1%igen Suspension einer 7 Tage alten B. C. G.-Kultur inokuliert und bei 37°
C 12 Tage lang inkubiert. Die Organismen wurden geerntet durch Zentrifugieren bei
2000U/min während 35 Minuten. Die Organismen wurden in einer Lösung aus 5, 40/o
Dextran, 7, 5% Glukose, 1/4000 Triton wieder suspendiert und in Ampullen in 0, 5-ml-Mengen
eingefüllt. Sie wurden während 2 Stunden bei -56° C gefroren und dann 16 Stunden
lang gefriergetrocknet. Nach der Verengung der Ampullen wurden diese sekundär 20
Stunden lang getrocknet und dann unter einem Vakuum von 0, 0017 mm Hg verschlossen.
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Beide Ansätze wurden bei 4 und 37° C gelagert, Lebensfähigkeitszählungen
wurden an den angegebenen Zwischenräumen durch Verdünnung in Sauton-Triton-Medium
und Zählung der Kolonien nach einer
14-bis 16tägigen Inkubation bei 37° C auf blsäure-Albumin-Agar
mit einem Gehalt von 50/o gelagertem menschlichem Blut vorgenommen. Es wurden von
jedem Ansatz zwei Ampullen gezählt. Die erhaltenen Ergebnisse wurden in der Tabelle
aufgeführt.
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Ergebnisse
| A A I B |
| Triibung...... 0, 410 0, 410 |
| Milligramm je Ampulle.. 0, 7 0, 7 |
| Lebensfähigkeitszählung in Suspen- |
| sion-106/ml Suspension.. 57, 8 40, 3 |
| Nach der Gefriertrocknung, Lebens- |
| fähigkeitszählung Vaccine 5, 7 12, 0 |
Lagerungsversuche
| Lebensfähigkeits- A B |
| zählungen # 106 nach |
| 4° C 37° C 4° C 37° C |
| IMonat... 1, 5 0, 0299, 92, 9 |
| 2 Monaten .......... 1,03 ohne 8,8 0,67 |
| 3 Monaten .......... 3,2 ohne 11,0 0,3 |
Beispiel 5 Vergleich des neuen Kulturmediums mit Sauton-Triton-Medium A. Sautonmedium
(wie im Beispiel 4).
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B. Neues Medium (wie im Beispiel 4).
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Verfahren Die Medien wurden in 100-ml-Mengen in die Hefekulturkolben
verteilt. Diese wurden mit einer l"/cigen Suspension einer 7 Tage alten B. C. G.-Kultur,
gewachsen an Dubosmedium, inokuliert und bei 37° C 12 Tage lang inkubiert. Die Organismen
wurden durch Zentrifugierung bei 2000 U/min während 35 Minuten geerntet. Die Organismen
wurden dann in einem Gefriertrocknungsmedium, welches aus Dextran (8, 3°/o), Glukose
(7, 5%) und Triton 1/4000 bestand, wieder suspendiert. Die Trübungswerte der Suspension
wurden dann so eingeregelt, daß die Lebensfähigkeitszählungen dichter beisammen
lagen, d. h. von Medium A war der Trübungswert 0, 43 5 mg/ml, für Medium B war der
Trübungswert 0, 2=0, 8mg/ml. Die Suspensionen wurden in Ampullen in 0, 5-ml-Mengen
eingefüllt und 2 Stunden bei-54° C tiefgefroren. Die erste Trocknung wurde dann
während 16 Stunden durchgeführt, die Ampullen wurden dann mit der Hand verengt und
sekundär während 16 Stunden getrocknet. Schließlich wurden sie unter einem Vakuum
von 0, 2 mm Hg verschlossen.
-
Lebensfähigkeitszählungen wurden nach 3wöchiger Lagerung bei 4 bzw.
30° C vorgenommen. Lagerungsversuche bei einer erhöhten Temperatur von 70° C in
einem Wasserbad wurden ebenso durchgeführt. Die Ergebnisse sind nachfolgend aufgeführt
:
Ergebnisse
| A B @ |
| 0,43 0, 23 |
| Milligramm je 0,75 0,4 |
| Zählung in Suspension Suspension. 47, 5 23, 5 |
| Zählung nach Gefriertrocknung Vaccine 5, 9 14, 7 |
| Nach der Lagerung bei |
| 4° C 30° C 4° C 30° C |
| Lebensfähigkeitszählung nach 3 Wochen.. 5, 9 1 1, 1 14, 7 11,
3 |
Lagerung bei 70° C
| Lebensfähigkeitszählung # 106/ml Vaccine nach Lagerung bei
70° C für |
| 0 Stunden ½ Stunde 1 Stunde 2 Stunden 3 Stunden 4 Stunden 6
Stunden 7 Stunden 24 Stunden |
| Ansatz A ......... 4,1 0,056 0,038 0,028 0,028 0,016 0,0031
0,0033 ohne |
| Ansatz B ......... 18,4 12,0 12,4 10,0 10,7 < 1,0 < 1,0
< 1,0 0,22 |
Beispiel 6 Vergleich zwischen einem weiteren glyzerinfreien Kulturmedium und Sauton-Triton-Medium
Kulturmedium A. Sautonmedium (wie im Beispiel 4).
-
B. Neues Medium.
-
Mononatriumglutamat. 4 g L-Asparagin........... 4 g Enzymatisches
Abbauprodukt von Kasein (Bacto Casitone). 1 g Na2HPO4 ............................
2,5 g KH2PO4 ............................. 1 g Ferriammoniumcitrat.. 100 mg CaCl2
............................. 1 mg CuSO4 .. 0, 2 mg ZnSO4 ................ 0, 2
mg L-Glutamin. 0, 2 °/o Triton 1/20 ....................... 10 ml Destilliertes
Wasser.. auf 21
Verfahren Die Medien wurden in 100-ml-Mengen in Hefekulturkolben
verteilt. Diese wurden dann mit einer 1%igen, 1 Woche alten B. C. G.-Kultur, gewachsen
auf Dubosmedium, inokuliert und bei 37° C 12 Tage lang inkubiert. Die Organismen
wurden durch Zentrifugen bei 2000 U/min während 35 Minuten geerntet und wurden dann
in einem Gefriertrocknungsmedium aus Dextran (8, 3"/o), Glukose (7, 511/o,) und
Triton 1/4000 wieder suspendiert. Die Trübungswerte betrugen für Medium A 0, 46
(äquivalent zu 1, 6 mg/ml) und für Medium B 0, 23 (äquivalent zu 0, 8 mg/ml).
-
Die Suspensionen wurden in 0, 5-ml-Mengen in Ampullen gefüllt und
während 24 Stunden bei -53°C tiefgefroren. Die Ampullen wurden dann der Hauptgefriertrocknung
während 16 Stunden unterworfen, verengt und sekundär während 19 Stunden getrocknet.
-
Sie wurden dann unter einem Vakuum von 0, 02 mm Hg verschlossen.
-
Beide Ansätze wurden bei 70° C für Zeiträume bis zu 24 Stunden gelagert.
Lebensfähigkeitszählungen wurden wie im Beispiel 4 vorgenommen, wobei die folgenden
Ergebnisse erhalten wurden : Ergebnisse Lagerung bei 70° C
| Lebensfähigkeitszählung Vaccine nach Lagerung bei 70° C während |
| 0 Stunden l 1/2 Stunde 1 1 Stunde 1 2 Stunden 1 3 Stunden l
4Stunden | 6Stunden 24Stunden |
| Ansatz A .. 6,7 0,182 0,125 0,044 0,167 0,167 0,0049 - |
| Ansatz B .. 28,5 10,0 10,0 10,0 10,0 1,0 1,0 0,093 |
Anmerkung : Für die Lebensfähigkeitszählungen am Ansatz B wurden ausreichende Verdünnungen
nicht vorgenommen. Die angegebenen Werte bezeichnen die minimale Anzahl von lebensfähigen
Organismen, deren Anwesenheit in den untersuchten Verdünnungen geschätzt wurde.
-
Beispiel 7 Vergleich zwischen einem neuen Kulturmedium und Triton-Medium
Kulturmedien A. Sautonmedium (wie im Beispiel 4).
-
B. Neues Medium (wie im Beispiel 4).
-
Verfahren Die Medien wurden in 100-ml-Mengen in Hefekulturkolben
verteilt, welche dann mit einer 1%igen Suspension einer 1 Woche alten B. C. G.-Kultur,
gewachsen auf Dubosmedium, inokuliert wurden. Die Inkubation wurde 12 Tage lang
bei 37° C durchgeführt
und die Organismen dann durch Zentrifugieren
bei 2000 U/min während 35 Minuten geerntet.
-
Die Organismen wurden dann in eine Gefriertrocknungslösung aus Dextran
(8, 3%), Saccharose (7, 5%) und Triton 1/4000 wieder suspendiert. Die Trübungswerte
waren für Medium A 0, 46 (äquivalent zu 1, 6 mg/ml) und für Medium B 0, 23 (äquivalent
zu 0, 8 mg/ml). Die Suspensionen wurden dann in 0, 5-ml-Mengen in Ampullen gefüllt
und während 2 Stunden
bei-54° C tiefgefroren. Die Haupttrocknung wurde während 16
Stunden durchgeführt, die Ampullen wurden mit der Hand verengt und sekundär während
14 Stunden weiterhin getrocknet. Die Ampullen wurden dann unter einem Vakuum von
0, 015 mm Hg verschlossen.
-
Beide Ansätze wurden bei 70°C während Zeiträumen von bis zu 24 Stunden
gelagert und Lebensfähigkeitszählungen wie im Beispiel 4 durchgeführt.
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Ergebnisse Lagerung bei 70° C
| Lebensfähigkeitszählung # 106/ml Vaccine nach Lagerung bei
70° C während |
| 0 Stunden ½ Stunde 1 Stunde 2 Stunden 5 Stunden 6 Stunden 24
Stunden |
| 0 Stunden @ ½ Stunde 1 Stunde 2 Stunden 5 Stunden 6 Stunden
l 24 Stunden |
| Ansatz A... 0, 44 0, 00245 0, 00094 0, 00012 0, 00021 0, 000041 |
| Ansatz B... 1, 46 0, 59 0, 23 0, 196 0, 079 0, 08 0, 0001 |
Diese Ansätze wurden auf Grund der Verwendung von Saccharose in dem Gefriertrocknungshilfsmittel
übertrocknet, wobei der Feuchtigkeitsgehalt von A und B 0, 257 bzw. 0, 2590/o betrug.
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Dies erklärt die niedrige Lebensfähigkeitszählung unmittelbar nach
der Gefriertrocknung und nach der anschließenden Lagerung.
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Beispiel 8 Einfluß von Glyzerin in 1. dem Wuchsmedium, 2. dem Gefriertrocknungsmedium.
-
Kulturmedien A. Sautonmedium (wie im Beispiel 4).
-
B. Neues Medium (wie im Beispiel 4).
-
Verfahren Vier Hefekulturkolben von jedem Medium mit 100 ml Medium
darin wurden mit einer 1°/oigen Suspension einer 1 Woche alten B. C. G.-Kultur,
gewachsen auf Dubosmedium, inokuliert.
-
Nach 14tägiger Inkubation bei 37° C wurde der Wuchs in den Kolben
bei 2000 U/min während 30 Minuten zentrifugiert. Nach der Entfernung der überstehenden
Flüssigkeit wurde das Wachstum in 30 ml sterilem destilliertem Wasser wieder suspendiert.
Das Wachstum wurde erneut bei 2000 U/min während 30 Minuten abzentrifugiert. Die
überstehende Flüssigkeit wurde dann völlig verworfen.
-
Diese Waschung wurde noch einmal wiederholt ; da Glyzerin mit Wasser
sehr stark mischbar ist, ist anzunehmen, daß sämtliche Spuren dieser Substanz von
der OberSäche der Zellen entfernt worden waren, welche in dem Sautonmedium kultiviert
worden waren. Die Zellen wurden dann wie folgt wieder suspendiert :
| Kultur- |
| Gefriertrocknungslösung |
| medium |
| Ansatz 1 A » Mist. desiccans « 0, 48 |
| Ansatz 2 B » Mist. desiccans « 0, 24 |
| Ansatz 3 B » Mist. desiccans « 0, 29 |
| + 0, 02"/oGyzerin |
Mit der Bezeichnung » Mist. desiccans « ist die folgende Zusammensetzung angegeben
: Ochsen-Albuminfraktion V 5%, Saccharose 7,5%, L. Natriumglutamat 1%, Triton 0,
025 % in destilliertem Wasser.
-
0, 5 ml der Ansätze 1, 2 und 3 wurden in Ampullen gefüllt, welche
90 Minuten bei-50° C tiefgefroren wurden. Diese wurden dann hauptgetrocknet in einem
Gefriertrockner über Nacht, verengt und sekundär während 1 Stunde getrocknet. Die
Ampullen wurden unter einem Vakuum von 0, 03 mm Hg verschlossen.
-
Die Ampullen wurden einer Temperatur von 70° C in einem Wasserbad
ausgesetzt. Lebensfähigkeitszählungen wurden an den angegebenen Zwischenräumen nach
dem im Beispiel 4 beschriebenen Verfahren durchgeführt.
-
Ergebnisse
| Suspensions-°/o ÜberlebensrateLebensfähigkeitszählung-lO/ml
Vaccine nach der Lagerung |
| zählung der Gefrier-bei 70° C während |
| Suspension trocknung 0 Stunden ½ Stunde 1 Stunde ß 3 Stunden
j 6 Stunden |
| Ansatz 1.. 77, 3 7,14 2,76 0, 018 0, 013 0, 0036 0, 002 |
| Ansatz 2 .. 61,9 44,6 13,8 12,92 8,83 10,45 6,42 |
| Ansatz 3 .. 41,7 79,7 16,6 14,5 12,7 11,7 10,2 |
Beispiel 9 In diesem Beispiel ist ausfiihrlicher die tatsächliche
Herstellung von B. C. G.-Vaccine auf einem neuen Medium erläutert.
-
Kulturmedium Mononatriumglutamat.. 4 g L-Asparagin................
4 g Enzymatisches Abbauprodukt von Kasein.. 1 g NA, HPO 4 2, 5 g KH, PO,... Ig Ferriammoniumcitrat..
100 mg CaCl2 ....... 1 mg CuS04.. 0, 2 mg ZnSO4 ....... 0, 2 mg L-Glutamin.. 4 g
Triton 1/20.. 10 ml Destilliertes Wasser... auf 21 100-ml-Mengen dieses Mediums
wurden in 2-1-Hefekulturkolben gefüllt und bei 4, 54 kg Druck während 20 Minuten
autoklaviert. Die Kolben wurden dann mit einer 1°/oigen Suspension einer 7 Tage
alten Duboskultur von B. C. G. inokuliert.
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Die Kulturen wurden bei 37° C während 12 Tagen inkubiert, die Bakterienzellen
wurden durch Zentrifugieren bei 2000 U/min während 35 Minuten abgetrennt und dann
in einer wäßrigen Lösung von Dextran (8, 3<'/o), Glukose (7, 5°/o) und Triton
1/4000 wieder suspendiert.
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Die Trübung der Suspension wurde auf einem Hilger-Spekker-photoelektrischen
Absorptionsmeter bestimmt und durch Beziehung zu einer Vergleichskurve eingeregelt,
um den erforderlichen Feuchtigkeitsgehalt je Ampulle Vaccine zu ergeben.
-
0, 5-ml-Mengen der Vaccine wurden dann in Ampullen gefüllt und bei55°
C während 90 Minuten gefroren. Die Ampullen wurden auf einem Hoch-
vakuum-Hauptgefriertrockner
16 Stunden lang getrocknet, verengt, um das Verschließen zu erleichtern, und in
einen Hochvakuum-Sekundärgefriertrockner für weitere 16 Stunden überbracht. Sie
wurd'en dann unter Vakuum (0, 02 mm Hg) verschlossen.