DE112019001290T5

DE112019001290T5 - Verwendung von Copolymeren für die Herstellung einer Formulierung für die Behandlung und Prophylaxe von Krankheiten, die durch das HSV-1 Virus verursacht werden

Info

Publication number: DE112019001290T5
Application number: DE112019001290.8T
Authority: DE
Inventors: Maria Nowakowska; Krzysztof Pyrć; Krzysztof Szczubiałka; Magdalena Pachota
Original assignee: Uniwersytet Jagiellonski
Current assignee: Uniwersytet Jagiellonski
Priority date: 2018-03-13
Filing date: 2019-03-13
Publication date: 2021-03-11
Also published as: PL235423B1; PL424871A1; WO2019177475A1

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Blockcopolymeren mit Ketten, die aus einem Poly(ethylenglykol) (PEG) Block und einem Poly(3-(methacryloylamino)propyl)-trimethylammoniumchlorid) (PMAPTAC) Block zusammengesetzt sind, für die Herstellung einer Formulierung für die Behandlung und Prophylaxe von Krankheiten, die durch das HSV-1 Virus verursacht werden.

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Blockcopolymeren für die Herstellung einer Formulierung für die Behandlung und Prophylaxe von Krankheiten, die durch das HSV-1 Virus verursacht werden.
Humane Herpesviren sind mit der häufigste Grund von Infektionen im Menschen. Eine der am meisten vorherrschenden Spezies dieser Familie ist das humane Herpesvirus Typ 1 (HSV-1; Herpes simplex 1), das auch als Herpes simplex Typ 1 bekannt ist. Bereits ein einziger Kontakt mit diesem Pathogen führt zu einer lebenslangen Infektion aufgrund der Fähigkeit des Virus in seiner latenten Form ruhend zu verbleiben. Es wird vermutet, dass bis zu 80 % der Weltbevölkerung mit dem Virus infiziert ist, wovon ungefähr 40 % symptomatische Krankheiten entwickeln. Die Reaktivierung des Virus, die mit einer geschwächten Antwort des Immunsystems einhergeht, führt zu der Bildung von charakteristischen Bläschen an den primären Infektionsstellen (vorwiegenden Lippen und Schleimhaut), aber in manchen Fällen repliziert das Virus an anderen Stellen des Körpers und verursacht z.B. Krankheiten des Augapfels oder des Gehirns. Die Verwendung von bestimmten Polymeren für die Behandlung von Herpes, der durch HSV-1 verursacht wird, ist im Stand der Technik bekannt.
Beispielsweise betrifft die Erfindung, die in der internationalen Patentanmeldung WO18015465A1 beschrieben ist, viruzidale Verbindungen, viruzidale Zusammensetzungen, die sie enthalten, und ihre Verwendungen in der Behandlung von viralen Infektionen, Sterilisierung und Desinfektion. Diese Verbindungen sind Sulfonylalkyl-Cyclodextrine, die mit Poly(ethylenglykol) substituiert sind. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind in der Behandlung von viralen Infektionen, die z.B. durch das Herpesvirus verursacht werden, anwendbar.
Die polnische Patentanmeldung P.416749, die von den Erfindern der vorliegenden Erfindung gemacht wurde, offenbart wiederum die Verwendung von Dextran, das kationisch durch quartäre Ammoniumgruppen modifiziert ist, für die Behandlung und Prophylaxe von Krankheiten, die durch das HSV-1 Virus verursacht werden.
Die Erfindung, die in der internationalen Anmeldung WO15082172A1 beschrieben ist, betrifft die Verwendung von Polydimethylsiloxan, das auch als Dimethicon bezeichnet wird, für die topische Behandlung von viralen Infektionen, wie Herpesvirus (HSV) Typ 1 und Typ 2 Infektionen. Die obige Verwendung von Polydimethylsiloxan ist insbesondere für die Behandlung von Herpes im Gesichts- und Genitalbereich geeignet. Die obige Erfindung betrifft weiterhin topische Formulierungen und Kits, die Polydimethylsiloxan in Kombination mit Kupfer für die Behandlung von Herpes im Gesichts- und Genitalbereich enthalten.
Auch bekannt sind Polymere, die auf Poly(ethylenglykol) (PEG) oder Polymeren, die kationische Gruppen enthalten, beruhen, die verwendet wurden, um die virale Replikation zu hemmen.
Die US Patentanmeldung US2009074721A offenbart eine pharmazeutische Zusammensetzung, die Verbindungen und/oder Zusammensetzungen umfasst, die zum Hemmen von viraler Replikation verwendet werden können. Die Zusammensetzungen enthalten eine Kombination von Poly(ethylenglykol), z.B. PEG-400, und eine aktive Substanz, die von Sterolen abgeleitet ist.
Die US Patentanmeldung US2002025919A offenbart eine antivirale Verbindung, die ein lineares Polymer mit vielen Seitenketten umfasst, wobei mindestens eine der Seitenketten mit einem anionischen oder kationischen Rest substituiert ist.
Die Verwendung eines Bockpolymers, das auf PEG beruht, das einen polykationischen Block enthält, für die Herstellung einer Formulierung für die Behandlung und Prophylaxe von Krankheiten, die durch das HSV-1 Virus verursacht werden, ist nicht bekannt. Deshalb ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine neue Verwendung von auf PEG-beruhenden Blockcopolymeren und enthaltend einen polykationischen Block, für die Herstellung einer Formulierung für die Behandlung und Prophylaxe von Krankheiten, die durch das HSV-1 Virus verursacht werden, bereitzustellen, die durch das Hemmen der HSV-1 Replikation wirkt - wofür der polykationische Block verantwortlich ist, während sie seine geringe Zytotoxizität sicher stellt - wofür der PEG Block verantwortlich ist.
PEG_X-PMAPTAC_Y symbolisiert (PEG - Poly(ethylenglykol)), PMAPTAC - Poly(3-(methacryloylamino)propyl)trimethylammoniumchlorid), sowie hier verwendet, beschreibt ein erfindungsgemäßes Blockcopolymer, das aus einem PEG Block mit einem Polymerisationsgrad x und einem PMAPTAC Block mit einem Polymerisationsgrad y besteht.
Der Begriff „Behandlung“, so wie hier verwendet, bedeutet, aber ist nicht beschränkt auf alle Aktivitäten, die dazu führen, dass sich der Gesundheitszustand des Patienten verbessert, seine Gesundheit wieder hergestellt wird, und die Entfernung der Wirkungen der HSV-1 Aktivität. Der Begriff „Prophylaxe“, so wie hier verwendet, bedeutet wiederum, aber ist nicht beschränkt auf das Verhindern des Auftretens der Wirkung des HSV-1 Virus.
Der Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Blockcopolymeren mit Ketten, die aus einem Poly(ethylenglykol) Block (PEG) und einem Poly(3-(methacryloylamino)propyl)trimethylammoniumchlorid) Block (PMAPTAC) zusammengesetzt sind, für die Herstellung einer Formulierung für die Behandlung und Prophylaxe von Krankheiten, die durch das HSV-1 Virus verursacht werden.
Vorzugsweise besteht die Behandlung und Prophylaxe von Krankheiten, die durch das HSV-1 Virus verursacht werden, in dem Hemmen der Replikation des HSV-1 Virus. Weiter bevorzugt sind die Krankheiten, die durch das HSV-1 Virus verursacht werden, Herpes, herpetische Konjunktivitis, herpetische Keratitis und herpetische Enzephalitis.
Die Verwendung ist vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass das Poly(ethylenglykol) (PEG) Blockcopolymer und das Poly(3-(methacryloylamino)propyl)-trimethylammoniumchlorid) (PMAPTAC) - PEG_X-PMAPTAC_Y - ein Copolymer ist, in dem der Polymerisationsgrad x des PEG Blocks 45-47 beträgt, während der Polymerisationsgrad y des PMAPTAC Blocks im Bereich von 22-102 liegt. Weiter bevorzugt ist das Poly(ethylenglykol) (PEG) und Poly(3-(methacryloylamino)-propyl)trimethylammoniumchlorid) (PMAPTAC) Blockcopolymer ein PEG₄₇-PMAPTAC₅₃, PEG₄₇-PMAPTAC₇₄, PEG₄₅-PMAPTAC₅₁ oder PEG₄₅-PMAPTAC₅₈.
Bevorzugt ist die Verwendung dadurch gekennzeichnet, dass die Formulierung topisch verabreicht wird.
Weiter bevorzugt wird die Formulierung auf die Haut, die Lippen, die Schleimhaut der: Nase, des Genitalbereichs, oder auf das Auge aufgetragen.
Vorzugsweise ist die Verwendung dadurch gekennzeichnet, dass die Formulierung in einer Form vorliegt, die aus der Gruppe bestehend aus einer Lösung, einem Gel, einem Stift, einem Lippenstift, einer Creme, einem Serum, einem Puder, einem Bestäubungspuder, einer Salbe, Augentropfen oder einem Heftpflaster ausgewählt ist.
Vorzugsweise ist die Verwendung dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des PEG-PMAPTAC Blockcopolymers in der Formulierung von 10 µg/ml bis 100 mg/ml beträgt.
Die Verwendung von Blockcopolymeren mit Ketten, die aus einem Poly(ethylenglykol) Block (PEG) und einem Poly(3-(methacryloylamino)propyl)trimethylammoniumchlorid) Block (PMAPTAC) zusammengesetzt sind, für die Herstellung einer Formulierung für die Behandlung und Prophylaxe von Krankheiten, die durch das HSV-1 Virus verursacht werden, erlaubt es eine hohe Wirksamkeit der Behandlung bei sehr niedriger Toxizität der verwendeten Mittel zu erreichen. Darüber hinaus ist es möglich, die kationischen Blockcopolymere, die in der Beschreibung angegeben sind, in der Behandlung von Infektionen zu verwenden, die durch Stämme verursacht werden, die gegenüber den gegenwärtig in der medizinischen Praxis verwendeten aktiven Substanzen resistent sind. Die Polymere, die erfindungsgemäß verwendet werden, die durch die RAFT Technik erhalten wurden, sind sehr gut definiert (sie haben ein/e gut kontrollierte/s Molekulargewicht und Molekulargewichtsverteilung), im Gegensatz zu anderen Polymeren, insbesondere denen, die durch herkömmliche radikalische Polymerisation erhalten werden, und natürliche Polymere. Es ist dem Fachmann - einem Mediziner - deshalb möglich, ein PEG_X-PMAPTAC_Y Polymer mit einem geeigneten Polymerisationsgrad zu wählen, so dass es das geeignete Verhältnis von Wirksamkeit gegenüber der Toxizität für die Behandlung eines bestimmten Patienten aufweist, d.h. einem bestimmten Fall von hepatischer Krankheit, und für einen bestimmten Verabreichungsweg.
Die PEG-PMAPTAC Polymere, die in der Erfindung verwendet werden, wurden nach einer kontrollierten radikalischen Polymerisation (CRP) des RAFT Typs hergestellt, d.h. einer radikalischen Polymerisation mit Additions-Fragmentierungs-Kettentransfer, wie sie in der Veröffentlichung „Synthesis of Oppositely Charged Block Copolymers of Poly(ethylenglykol) via Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer Radical Polymerization and Characterization of Their Polyion Complex Micelles in Water", Shin-ichi Yusa, Yuuichi Yokoyama, and Yotaro Morishima, Macromolecules 2009, 42, 376-383, auf die in der vorliegenden Beschreibung Bezug genommen wird, beschrieben ist. Das oben beschriebene Verfahren besteht aus dem Umsetzen von Poly(ethylenglykol), das an einem Ende mit einer Methoxygruppe funktionalisiert ist, mit 4-Cyanopentansäure-dithiobenzonat (CPD), das als ein Kettentransfermittel (CTA) wirkt. Zu dem so erhaltenen PEG-CTA wurde anschließend der PMAPTAC Block in einer Polymerisationsreaktion angeheftet, die mit 4,4-Azobis(4-cyanopentansäure) (V-501) gestartet wurde. Das Polymer wurde durch zwei Präzipitationen mit Methanol in der Anwesenheit von überschüssigem Azeton gereinigt.
Die Polymerisationsgrade der erhaltenen PEG_X-PMAPTAC_Y Polymere wurde durch Gelpermeationschromotographie (GPC) und Kern-Magnetresonanzspektroskopie (¹H-NMR) bestimmt.
Die Erfinder haben festgestellt, dass im Rahmen der vorliegenden Erfindung, die Copolymere, die zum Hemmen des HSV-1 Virus verwendet werden sollen, eine geeignete Kombination aus individuellen Blocklängen aufweisen müssen, so dass nicht alle PEG-PMAPTAC Polymere dieselbe Wirksamkeit zeigen. Ohne dass es gewünscht ist, an in irgendeine Theorie gebunden zu sein, sieht es so aus als ob die Länge es PEG Blocks einen bestimmten Minimalwert aufweisen muss, um wirksam die Toxizität des PMAPTAC Blocks zu reduzieren, wohingegen die Länge des PMAPTAC Blocks lang genug sein muss, um mit der Zelle/dem Virus zu interagieren, aber sie darf nicht zu lang sein, so dass das Polymer nicht toxisch ist (Polykationen sind für gewöhnlich toxisch und ihre Toxizität steigt mit dem Molekulargewicht).
Die Polymere, die erfindungsgemäß verwendet werden, haben eine sehr große Fähigkeit die HSV-1 Virus Replikation zu hemmen, bei einer sehr niedrigen Zytotoxizität selbst bei hohen Konzentrationen (1 mg/ml). Bei einer Polymerkonzentration von 500 mg/ml wurde eine Reduktion des Virustiters um ungefähr 6 Größenordnungen (99,9999%) beobachtet. Die IC₉₀ Werte (90% Hemmkonzentration, die Konzentration des Arzneimittels (Formulierung), die 90% der Virusreplikation hemmt), berechnet für die PEG₄₇-PMAPTAC₅₃ und PEG₄₆-PMAPTAC₇₃ Polymere betragen jeweils 4,12 mg/ml und 34,66 mg/ml. Die funktionalen Tests, die durchgeführt wurden, zeigten, dass das Polymer mit den Zellen interagiert, was eine Schutzschicht bildet, welche die Fähigkeit des Virus zu absorbieren und anschließend zu infizieren, beschränkt.
Der Gegenstand der Erfindung wird durch die folgenden Figuren dargestellt, welche die Informationen, die in den Ausführungsformen enthalten sind, ergänzen:

1 zeigt einen Graph, der die Zytotoxizität von Blockpolymeren zeigt. Die Zellüberlebensfähigkeit wurde als % des Wertes der Kontrollprobe, die nicht mit Polymeren behandelt wurde, dargestellt.
2 zeigt Graphen, welche die antivirale Aktivität von Blockcopolymeren zeigen. Die Menge viraler DNA im Medium wurde durch quantitative PCR (A) bestimmt, während die Zahl der funktionalen viralen Partikel durch einen Plaque Assay (B) bestimmt wurde.
3 zeigt einen Graph, der die Aktivitätsmechanismen von Blockpolymeren zeigt. Eine Reihe von funktionalen Tests, welche die Addition eines Inhibitors an verschiedenen Stufen der viralen Infektion einschließt, erlaubt es, zu bestimmen an welcher Stufe die Hemmung auftritt. Die antivirale Aktivität ist als die logarithmische Abnahme in der Anzahl der Kopien an viraler DNA in einem Milliliter des Mediums dargestellt.
4 zeigt Bilder, die durch konfokale Mikroskopie erhalten wurden, welche die Hemmung der HSV-1 Infektion durch Blockcopolymere zeigt. Die Bilder stellen die maximalen Projektionen dar.
5 zeigt die antivirale Aktivität des PEG₄₆-PMAPTAC₅₂ Blockcopolymers in einem Mausmodell. Die Tiere wurden infiziert, indem die Haut geritzt wurde. Die medizinischen Formulierungen wurden anschließend alle 12 Stunden für 4 Tage verabreicht, und eine Beobachtung der Tiergesundheit wurde für die nächsten 3 Tage durchgeführt. Das Fortschreiten der Krankheit wurde nach dem folgenden Schema bewertet: 0 - keine Symptome, 1 - Bläschenbildung, 2 - leichtes Geschwür, 3 - große Flecken an Geschwüren, 4 - konfluentes Geschwür, 5 - Lähmung der Hinterläufe, 6 - Tod. Gruppen:0 - keine Behandlung, keine Infektion; NaCI - Placebo Formulierung, keine Infektion; Mock - keine Behandlung, Mock Infektion; HSV-1 - keine Behandlung, HSV-1 Infektion; HSV-1 + ACV - Aciclovirbehandlung, HSV-1 Infektion; HSV-1 + PEG₄₆-PMAPTAC₅₂ - Behandlung mit PEG₄₆-PMAPTAC₅₂, HSV-1 Infektion.

Ausführungsformen
Das Verfahren zur Herstellung von PEG₄₇-PMAPTAC₅₃ Blockpolymer zur Verwendung im Rahmen der Patentanmeldung ist wie folgt. (3-(Methacryloylamino)propyl)-trimethylammoniumchlorid (MAPTAC, 5,53 g, 25,0 mmol), Initiator (4,4'-Azobis(4-Cyanopentansäure), V-501, 69,2 mg, 0,247 mmol)) und das Makrokettentransfermittel (PEG₄₇-CTA, 1,13 g, 0,501 mmol) wurden in 41 mL Wasser gelöst. Die Mischung wurde entgast indem Argon für 30 Minuten hindurch geleitet wurde. Die Polymerisation wurde bei 70° C für 5 Stunden durchgeführt. Die Postreaktionsmischung wurde gegen reines Wasser für 2 Tage dialysiert. PEG₄₇-PMAPTAC₅₃ wurde durch Lyophilisierung isoliert, um 5,58 g des Materials (83,8% Ausbeute) zu erhalten.
Es liegt im Bereich des fachmännischen Könnens, das Verfahren zum Erhalten der verbleibenden Polymere zu bestimmen, die durch diese Patentbeschreibung abgedeckt sind.
Beispiel 1. Wirkung von Blockcopolymeren auf das Überleben von Zellen.
Die Zytotoxizität der Blockcopolymere wurde unter Verwendung des XTT Tests überprüft. Die Analyse wurde mit der Vero E6 Zelllinie (Cercopithecus aethiops epitheliale Nierenzellen, ATCC CRL-1586) durchgeführt, die für HSV-1 Virus empfänglich ist. Dieser Test beruht auf der Untersuchung von mitochondrialer Enzymaktivität, indem ihre Fähigkeit, das Substrat zu einem gefärbten Produkt zu reduzieren, bestimmt wird. Die Überlebensfähigkeit der Zellen wurde durch Messen der Absorption bei 450 nm im Vergleich zur Kontrolle, die Zellen waren, die in Medium ohne das Hinzufügen von Polymeren kultiviert wurden, bestimmt. Die Zellen wurden für 2 Tage in DMEM Medium (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), das mit 3% Hitze inaktiviertem fötalem Kälberserum (FBS) und Penicillin und Streptomycin ergänzt war, unter Hinzufügen des getesteten Polymers, kultiviert.
Die Ergebnisse, die in 1 dargestellt sind, zeigen die geringe Zytotoxizität der untersuchten Polymere selbst bei hohen Konzentrationen (500 µg/ml). Die CC₅₀ von beiden Verbindungen liegt über 2.000 µg/ml.
Beispiel 2. Wirkung der Blockcopolymere auf die Herpes simplex Typ 1 (HSV-1) Replikation.
Nach Bestimmung der Konzentrationen der Verbindungen, die keine toxische Wirkung auf die Zellen hatten, wurde ihre Wirkung auf die HSV-1 Virus Replikation untersucht. Die Zellen wurden mit Polymeren der geeigneten Konzentrationen für 30 min vorinkubiert und anschließend, immer noch in Anwesenheit dieser Polymere mit HSV-1, Stamm 17+ mit TCID₅₀ (Gewebekultur infektiöse Dosis, infiziert 50% der Kultur) = 400 pro Milliliter, infiziert. Nach 2 Stunden wurden ungebundene Viruspartikel durch 3 Waschungen mit PBS entfernt und für 2 weitere Tage, ebenfalls in der Anwesenheit der Polymere inkubiert. Nach dieser Zeit wurde die virale DNA aus dem Zellmedium isoliert und als ein Template in der real-time quantitativen PCR Reaktion (vorwärts gerichtete Sequenzen 5'-CAT CAC CGA CCC GGA GAG GGA C-3', rückwärts gerichtet 5'-GGG CCA GGC GCT TGT TGG TGT A-3', 5'-FAM CCG CCG AAC TGA GCA GAC ACC CGC GC BHQ1-3' Sonde), verwendet. Die Fähigkeit der Polymere die HSV-1 Replikation zu hemmen, wurde als die logarithmische Abnahme in der viralen DNA Kopienzahl in einem Milliliter des Mediums (2) bestimmt. Darüber hinaus wurde die Menge an funktionalen Viruspartikeln in dem Medium unter Verwendung eines Standard Plaque Assay bestimmt. Die Menge der Viruspartikel in dem Medium ist als die Zahl der Plaque bildenden Einheiten (PFU) gezeigt.
Die getesteten Blockcopolymere zeigen antivirale Aktivität und hemmen die Multiplikation des HSV-1 Virus. Die berechneten IC₉₀ Werte, die durch das real-time PCR Verfahren bestimmt wurden, betrugen jeweils 4,115 µg/ml für PEG₄₇-PMAPTAC₅₃ und 36,66 µg/ml für PEG₄₆-PMAPTAC₇₃, während die Werte, die durch den Plaque Assay bestimmt wurden, jeweils 1,4 µg/ml für PEG₄₇-PMAPTAC₅₃ und 1,685 µg/ml für PEG₄₆-PMAPTAC₇₃ betrugen. Die Werte des Selektivitätsindex, die durch das real-time PCR Verfahren bestimmt wurden, betrugen jeweils > 121,5 für PEG₄₇-PMAPTAC₅₃ und > 14,43 für PEG₄₆-PMAPTAC₇₃, während die Werte, die durch den Plaque Assay bestimmt wurden, > 357,14 für PEG₄₇-PMAPTAC₅₃ und > 296,74 für PEG₄₆-PMAPTAC₇₃ betrugen.
Beispiel 3. Mechanismus der antiviralen Aktivität von Blockcopolymeren.
Der Mechanismus der antiviralen Aktivität von Blockcopolymeren wurde unter Verwendung einer Reihe von funktionalen Tests, die auf der Verwendung eines Inhibitors zu verschiedenen Stufen der viralen Infektion beruhen, untersucht:

• Test I (Inaktivierungstest) - wechselwirkt das Polymer direkt mit dem Virus, macht es es unmöglich Zellen zu infizieren?
• Test II (Interaktionstest) - wechselwirkt das Polymer direkt mit der Zelle, macht es sie resistent gegenüber viraler Infektion?
• Test III (Adsorptionstest) - interferiert das Polymer mit der Interaktion des Virus mit seinem adhäsiven Faktor auf der Zelloberfläche, wodurch das Virus gehindert wird, die Zelle anzugreifen?
• Test IV (Faltungs-, Verpackungs- und Freisetzungstest) - interferiert das Polymer mit den späten Stufen der viralen Infektion (z.B. Zusammenbau, Verpackung, Freisetzung), wodurch es die Bildung von infektiösen Nachkommenvirionen verhindert?

Es wurde gefunden, dass die Hemmung der HSV-1 Infektion durch Blockcopolymere auf der Stufe der Adsorption des Virus an die Zelle und durch die Wechselwirkung des Polymers mit der Zelle auftritt. Beruhend auf 3, konnte eine signifikante Verringerung in der Zahl der viralen DNA Kopien gefunden werden, was in dem Faltungs-, Verpackungs- und Freisetzungstest gezeigt wurde, was wahrscheinlich die Folge der Hemmung der Infektion zu einer früheren Stufe ist, jedoch können zusätzliche hemmende Wirkungen zu einer späteren Stufe der Infektion nicht ausgeschlossen werden.
Beispiel 4. Darstellung der Wirkung von Copolymeren auf die HSV-1 Infektion mittels konfokaler Mikroskopie (4).
Um die Wirkung von Blockcopolymeren auf die virale Infektion zu zeigen, wurden Zellen mit Copolymeren präinkubiert und anschließend mit HSV-1 infiziert. Eine Stunde später wurden die Zellen fixiert und hinsichtlich der Anwesenheit von chromosomaler DNA (DAPI), F-Actin (Phalloidin konjungiert mit Alexa 633 fluoreszierendem Farbstoff) und Virus (spezifische Antikörper für das VP5 virale Kapsidprotein) gefärbt.
In 4 ist eine Verringerung in der Menge des Virus, das in Zellen anwesend ist, die mit Blockcopolymeren behandelt wurden, klar sichtbar.
Beispiel 5. PEG-PMAPTAC Blockcopolymer Toxizitätsuntersuchung in einem Mausmodell.
Das Ziel des Experiments war es, die maximale nicht-toxische Dosis des PEG-PMAPTAC Blockcopolymers in dem Mausmodell zu bestimmen. Das Testmaterial waren 6 Wochen alte weibliche Balb/c Mäuse, die mit verschiedenen Mengen an PEG₄₆-PMAPTAC₅₂ Blockpolymer behandelt wurden. Nur gesunde Individuen, die zufällig ausgewählt wurden, qualifizierten sich für das Experiment. Die Tiere wurden in Gruppen aufgeteilt.

Kontrollgruppe - unbehandelt (n = 5)
Kontrollgruppe - Hydrogel enthaltende physiologische Salzlösung (n = 5) Versuchsgruppe - ein Hydrogel enthaltendes Blockcopolymer bei einer Konzentration von 10% w/v (n = 5)
Versuchsgruppe - ein Hydrogel enthaltendes Blockcopolymer bei einer Konzentration von 5% w/v (n = 5)
Versuchsgruppe - ein Hydrogel enthaltendes Blockcopolymer bei einer Konzentration von 1% w/v (n = 5)
Versuchsgruppe - ein Hydrogel enthaltendes Blockcopolymer bei einer Konzentration von 0,1% w/v (n = 5).

Das Testmaterial wurde direkt in die geschädigte Haut in einem Volumen von 100 µl/Maus zweimal am Tag für 4 Tage aufgetragen. Die Tiere wurden an der lateralen Dorsalseite rasiert, die Haut wurde mit einer Nadel geritzt, und die Polymer enthaltende Formulierung in einem Volumen von 100 µl/Maus wurde auf den freigelegten Bereich aufgetragen. Die Behandlung wurde alle 12 Stunden an 4 aufeinanderfolgenden Tagen wiederholt. Die Tiere wurden täglich für 7 aufeinanderfolgende Tage hinsichtlich Hautanomalien und dem allgemeinen Gesundheitszustand untersucht und gewogen. Detaillierte klinische Beobachtungen wurden täglich ab dem Tag, an dem die Verbindung verabreicht wurde, gemacht. Körpergewichtsmessungen wurden bevor das Testmaterial aufgetragen wurde und täglich während der Beobachtung durchgeführt. Nachdem das Experiment abgeschlossen war, wurden Organe (Leber, Nieren, Milz) aus den Tieren entfernt, um die Gewichte in den einzelnen Gruppen zu vergleichen.
In der Tierstudie, nach direkter Anwendung auf verletzte Haut, verursachte das PEG₄₆-PMAPTAG₅₂ Blockcopolymer bei Konzentrationen von 10%, 5%, 1%, 0,1% w/v keine klinischen Symptome. Nach Abschluss der Nekropsie wurden keine makroskopischen Veränderungen an den Organen beobachtet. Als Ergebnis wurde gefunden, dass das untersuchte Polymer in Konzentrationen von 0,1% bis 10% w/v nicht toxisch in Tieren ist.
Beispiel 6. Untersuchung der PEG₄₆-PMAPTAG₅₂ Blockcopolymeraktivität in einem Mausmodell.
Das Ziel des Experiments war es, die Aktivität des PEG₄₆-PMAPTAG₅₂ Blockcopolymers zu bestimmen und seine antivirale Wirkung auf die Infektion von Mäusen, die durch das HSV-1 Virus verursacht wurde, zu überprüfen. Nur gesunde Individuen, die zufällig ausgewählt wurden, qualifizierten sich für das Experiment. Die Tiere wurden in Gruppen eingeteilt.

Kontrollgruppe - Mock (n = 5)
Kontrollgruppe - Salzlösung (n = 5)
Kontrollgruppe - Null (n = 5)
Copolymer + HSV-1 Gruppe (n = 5)
Aciclovir + HSV-1 Gruppe (n = 5)
HSV-1 Gruppe (n = 5)

Sechs Wochen alte weibliche Balb/c Mäuse wurden an der lateralen Seite des Rückens rasiert, die Haut wurde mit einer Nadel geritzt, und die Polymer enthaltende Formulierung wurde in einem Volumen von 100 µl pro Maus auf den freigelegten Bereich aufgetragen und verblieb dort für 30 min. Anschließend wurde HSV-1 mit 1×10⁷ PFU in einem Volumen von 100 µl auf die Wunde mit einem Klebstreifen zusammen mit der Formulierung zur Behandlung aufgetragen. Nach 2 Stunden wurde der Klebstreifen entfernt, und die Formulierung wurde erneut aufgetragen. Die Behandlung wurde alle 12 Stunden für 4 aufeinander folgende Tage wiederholt. Täglich wurde eine Bewertung des Krankheitsfortschritts (0 - keine Symptome, 1 - Bläschenbildung, 2 - leichtes Geschwür, 3 - große Flecken an Geschwüren, 4 - konfluentes Geschwür, 5 - Lähmung der Hinterläufe, 6 - Tod) und des allgemeinen Gesundheitszustands (0 - guter Zustand, keine Krankheitsanzeichen, 1 - Apathie, gekräuseltes Fell, Braunfärbung, 2 - Gewichtsverlust nicht mehr als 20% des Ausgangswerts, 3 - Gewichtsverlust größer als 20% des Ausgangswerts; 4 - Agonie, 5 - Tod) durchgeführt.
Am 7. Tag starben die meisten HSV-1 infizierten Mäuse, die keine Behandlung erhielten, und deshalb wurden die verbleibenden Versuchstiere getötet und seziert. Bis zum letzten Tag der Beobachtung zeigten alle Tiere der Kontrollgruppen ebenso wie die Tiere, die mit HSV-1 infiziert wurden, welche die ACV Behandlung erhielten, keine Krankheitszeichen, und ihre Gesamtgesundheit war gut. Von der PEG₄₆-PMAPTAG₅₂ Behandlungsgruppe entwickelten 3 Tiere kleine Bläschen oder kleine Geschwüre in dem infizierten Bereich der Haut und eine generalisierte Apathie bis zum Ende der Beobachtung. Die Sezierergebnisse zeigten einen vergrößerten Magen und heterogenes Bauchspeicheldrüsengewebe in zwei Fällen.
Die Ergebnisse des Experiments sind in 5 zusammengefasst.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

WO 18015465 A1 [0003]
WO 15082172 A1 [0005]
US 2009074721 A [0007]
US 2002025919 A [0008]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

„Synthesis of Oppositely Charged Block Copolymers of Poly(ethylenglykol) via Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer Radical Polymerization and Characterization of Their Polyion Complex Micelles in Water", Shin-ichi Yusa, Yuuichi Yokoyama, and Yotaro Morishima, Macromolecules 2009, 42, 376-383 [0020]

Claims

Verwendung von Blockcopolymeren mit Ketten, die aus einem Poly(ethylenglykol) (PEG) Block und einem Poly(3-(methacryloylamino)propyl)trimethylammoniumchlorid) (PMAPTAC) Block zusammengesetzt sind, für die Herstellung einer Formulierung für die Behandlung und Prophylaxe von Krankheiten, die durch das HSV-1 Virus verursacht werden.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung und Prophylaxe von Krankheiten, die durch das HSV-1 Herpesvirus verursacht werden, in der Hemmung der HSV-1 Virus Replikation besteht.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Krankheiten, die durch das HSV-1 Virus verursacht werden, Herpes, herpetische Konjunktivitis, herpetische Keratitis und herpetische Enzephalitis sind.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Poly-(ethylenglykol) (PEG) und Poly(3-(methacryloylamino)propyl)trimethylammoniumchlorid) (PMAPTAC) Blockcopolymer - PEG_X-PMAPTAC_Y - ein Copolymer ist, in dem der Polymerisationsgrad x des PEG-Blocks 45-47 beträgt, während der Polymerisationsgrad y des PMAPTAC-Blocks im Bereich von 22-102 liegt.
Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Poly(ethylenglykol) (PEG) und Poly(3-(methacryloylamino)propyl)trimethylammoniumchlorid) (PMAPTAC) Blockcopolymer ein PEG₄₇-PMAPTAC₅₃, PEG₄₇-PMAPTAC₇₄, PEG₄₅-PMAPTAC₅₁ oder PEG₄₅-PMAPTAC₅₈ ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Formulierung topisch verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Formulierung auf die Haut, die Lippen, die Nasenschleimhaut, den Genitalbereich oder auf das Auge aufgetragen wird.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Formulierung in einer Form vorliegt, die aus der Gruppe bestehend aus einer Lösung, einem Gel, einem Stift, einem Lippenstift, einer Creme, einem Serum, einem Puder, einem Bestäubungspuder, einer Salbe, Augentropfen oder einem Heftpflaster ausgewählt ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des PEG-PMAPTAC Blockcopolymers in der Formulierung von 10 µg/ml bis 100 mg/ml beträgt.