PL235423B1 - Zastosowanie kopolimerów do wytwarzania preparatu do leczenia i profilaktyki chorób wywoływanych przez wirusa HS V-1 - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy zastosowania kopolimerów blokowych do wytwarzania preparatu do leczenia i profilaktyki chorób wywoływanych przez wirusa HSV-1.

Ludzkie herpeswirusy są jedną z najczęstszych przyczyn zakażeń u ludzi. Jednym z najczęściej występujących gatunków tej rodziny jest ludzki herpeswirus typu 1 (HSV-1; herpes simplex 1), nazywany również wirusem opryszczki typu 1. Już pojedynczy kontakt z tym patogenem prowadzi do rozwoju zakażenia, które w postaci utajonej utrzymuje się przez całe życie. Szacuje się, że nosicielami wirusa jest nawet 80% światowej populacji ludzkiej, natomiast u około 40% występują objawy chorobowe. Reaktywacja wirusa przy osłabieniu układu immunologicznego prowadzi do powstawania charakterystycznych owrzodzeń w miejscu pierwotnego zakażenia (głównie na wargach i na błonach śluzowych jamy ustnej), jednak w części przypadków zakażenie to może spowodować infekcję gałki ocznej lub mózgu.

W stanie techniki znane jest zastosowanie pewnych polimerów do leczenia opryszczki wywoływanej przez HSV-1.

Na przykład opisany w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO18015485A1 wynalazek dotyczy związków wirusobójczych, kompozycji wirusobójczych zawierających je i ich zastosowań w leczeniu zakażeń wirusowych, sterylizacji j dezynfekcji. Związki te są sulfonylalkilocyklodekstrynami podstawionymi poli(glikolem etylenowym). Związki według wynalazku mają zastosowanie do leczenia zakażeń wirusowych wywoływanych m.in. przez wirus opryszczki.

Z kolei polskie zgłoszenie P.416749 dokonane przez Twórców niniejszego wynalazku ujawnia zastosowanie kationowo modyfikowanego, za pomocą czwartorzędowych grup amoniowych, dekstranu do leczenia i profilaktyki chorób wywoływanych przez wirusa HSV-1.

Opisany w zgłoszeniu międzynarodowym WO15082172A1 wynalazek dotyczy zastosowania polidimetylosiloksanu, określanego również jako dimetikon, do miejscowego leczenia infekcji wirusowych, takich jak infekcje wywoływane przez wirus opryszczki (HSV) typu 1 i typu 2. Powyższe zastosowanie polidimetylosiloksanu jest szczególnie odpowiednie do leczenia opryszczki twarzowej lub opryszczki narządów płciowych. Powyższy wynalazek dotyczy ponadto preparatów do stosowania miejscowego i zestawów części zawierających polidimetylosiloksan w połączeniu z miedzią do leczenia opryszczki twarzowej lub opryszczki narządów płciowych.

Znane są również polimery na bazie poli(glikolu etylenowego) (PEG) albo na bazie polimerów zawierających grupy polikationowe, które znalazły zastosowanie do hamowania replikacji wirusów.

W zgłoszeniu amerykańskim US2009074721A ujawniono kompozycję farmaceutyczną zawierającą związki i/lub kompozycje użyteczne do hamowania replikacji wirusa. Kompozycje zawierają kombinację poli(glikolu etylenowego), np. PEG-400 oraz substancji aktywnej będącej pochodną steroli.

Dokument US2002025919A ujawnia związek przeciwwirusowy zawierający liniowy polimer niewęglowodanowy mający wiele łańcuchów bocznych, przy czym co najmniej jeden z łańcuchów bocznych jest podstawiony ugrupowaniem anionowym lub kationowym.

Nie są natomiast znane zastosowania polimerów blokowych na barie PEG zawierających blok polikationowy do wytwarzania preparatu do leczenia i profilaktyki chorób wywoływanych przez wirusa HSV-1. Dlatego też celem niniejszego wynalazku jest zapewnienie nowego zastosowania polimerów blokowych, na bazie PEG i zawierających blok polikationowy do wytwarzania preparatu do leczenia i profilaktyki chorób wywoływanych przez wirusa HSV-1, którego działanie polega na hamowaniu replikacji wirusa HSV-1 - za co odpowiada blok polikationowy, przy jednoczesnym zapewnieniu jego niskiej cytotoksyczności - za co odpowiada blok PEG.

Oznaczenia PEGx-PMAPTACy (PEG - poli(glikol etylenowy), PMAPTAC - poli(chlorek (3-(metakryloiloamino)propylo)trimetyloamoniowy) stosowane w opisie określają polimer blokowy zgodnie z wynalazkiem składający się z bloku PEG o stopniu polimeryzacji x i bloku PMAPTAC o stopniu polimeryzacji y.

Określenie „leczenie” stosowane w niniejszym opisie oznacza, lecz nieograniczająco, wszelkie czynności prowadzące do polepszenia stanu pacjenta, przywrócenia zdrowia, usuwania skutków aktywności wirusa HSV-1. Z kolei określenie „profilaktyka” stosowane w niniejszym opisie oznacza, ale nieograniczająco, zapobieganie pojawienia się skutku działania wirusa HSV-1.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kopolimerów blokowych o łańcuchach złożonych z bloku poli(glikolu etylenowego) (PEG) i bloku poli(chlorku (3-(metakryloiloamino)propylo)trimetyloamoniowego) (PMAPTAC) do wytwarzania preparatu do leczenia i profilaktyki chorób wywoływanych przez wirusa HSV-1.

PL 235 423 B1

Korzystnie leczenie i profilaktyka chorób wywoływanych przez wirusa opryszczki HSV-1 polega na hamowaniu replikacji wirusa HSV-1. Bardziej korzystnie chorobami wywołanymi przez wirus HSV-1 są opryszczka, opryszczkowe zapalenie spojówki, opryszczkowe zapalenie rogówki i opryszczkowe zapalenie mózgu.

Zastosowanie korzystnie charakteryzuje się tym, że kopolimerem blokowym poli(glikolu etylenowego) (PEG) i poli(chlorku (3-(metakryloiloammo)propylo)trimetyloamoniowego) (PMAPTAC) - PEGx-PMAPTAy, - jest kopolimer, w którym stopień polimeryzacji x bloku PEG wynosi 45-47, natomiast stopień polimeryzacji bloku y PMAPTAC jest w zakresie 22-102. Korzystniej kopolimerem blokowym poli(glikolu etylenowego) (PEG) i poli(chlorku (3-(metakryloiloamino)propylo)trimetyloamoniowego) (PMAPTAC) jest PEG47-PMAPTAC53, PEG47-PMAPTAC74, PEG45-PMAPTAC51 lub PEG45-PMAPTAC58.

Korzystnie zastosowanie charakteryzuje się tym, że preparat podaje się miejscowo. Korzystniej preparat podaje się na skórę, usta, błonę śluzową nosa, okolic płciowych lub do oka. Korzystnie zastosowanie charakteryzuje się tym, że preparat jest w postaci wybranej z grupy obejmującej roztwór, żel, sztyft, szminkę, pomadkę, krem, serum, puder, zasypkę, proszek, maść, krople do oczu lub plaster.

Korzystnie zastosowanie charakteryzuje się tym, że stężenie kopolimeru blokowego PEG-PMAPTAC w preparacie wynosi od 10 do 500 gg/ml.

Zastosowanie kopolimerów blokowych o łańcuchach złożonych z bloku poli(glikolu etylenowego) (PEG) i bloku poli(chlorku (3-(metakryloiloamino)propylo)trimetyloamoniowego) (PMAPTAC) do wytwarzania preparatu do leczenia i profilaktyki chorób wywoływanych przez wirusa HSV-1 pozwala na uzyskanie wysokiej efektywności leczenia przy równoczesnej bardzo małej toksyczności stosowanych środków. Ponadto możliwe jest zastosowanie wskazanych w opisie kationowych kopolimerów blokowych w leczeniu zakażeń wywoływanych przez szczepy lekooporne na dotychczas stosowane w praktyce medycznej substancje aktywne. Polimery stosowane według niniejszego wynalazku, otrzymane techniką RAFT, są bardzo dobrze zdefiniowane (mają dobrze kontrolowaną masę cząsteczkową i jej dyspersję) w przeciwieństwie do innych polimerów, zwłaszcza otrzymanych metodą konwencjonalnej polimeryzacji rodnikowej, i polimerów naturalnych. Istnieje zatem możliwość dobrania przez znawcę dziedziny - lekarza - polimeru PEGx-PMAPTACy o odpowiednich stopniach polimeryzacji, tak aby miał on odpowiedni stosunek efektywności działania do toksyczności do zastosowania do leczenia w odniesieniu do konkretnego pacjenta, tzn. konkretnego przypadku choroby opryszczkowej, i do konkretnej drogi podania.

Polimery PEG-PMAPTAC stosowane w wynalazku zostały otrzymane sposobem kontrolowanej polimeryzacji rodnikowej (CRP) typu RAFT, czyli polimeryzacji rodnikowej z addycyjno-fragmentacyjnym przeniesieniem łańcucha, opisanym w publikacji „Synthesis of Oppositely Charged Block Copolymers of Poly(ethylene glycol) via Reversible Addition-Fragmentation Chain Transfer Radical Polymerization and Characterization of Their Polyion Complex Micelles in Water”, Shin-ichi Yusa, Yuuichi Yokoyama, and Yotaro Morishima, Macromolecules 2009, 42, 376-383, której treść jest włączona doniniejszego opisu patentowego przez odniesienie. Wymieniony powyżej sposób polega na reakcji poli(glikolu etylenowego) funkcjonalizowanego na jednym końcu grupą metoksylową z ditiobenzoesanem kwasu 4-cyjanopentanowego (4-cyanopentanoic acid dithiobenzoate (CPD)), pełniącego funkcję czynnika przeniesienia łańcucha (CTA). Do tak otrzymanego PEG-CTA został następnie dołączony blok PMAPTAC w reakcji polimeryzacji inicjowanej kwasem 4,4'-azobis(4-cyjanopentanowym) (4,4'-azobis(4-cyanopentanoic acid) (V-501). Polimer został oczyszczony poprzez dwukrotne strącenie metanolem w obecności nadmiaru acetonu.

Stopnie polimeryzacji otrzymanych polimerów PEGx-PMAPTACy zostały wyznaczone za pomocą chromatografii żelowej (gel permeation chromatography, GPC) i spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego (1H-NMR).

Twórcy wynalazku ustalili w ramach opracowywania niniejszego wynalazku, że kopolimer do zastosowania według niniejszego wynalazku, aby działać hamująco na wirusa HSV-1, musi mieć odpowiednią kombinację długości poszczególnych bloków, zatem nie wszystkie polimery PEG-PMAPTAC wykazują analogiczną skuteczność działania. Nie chcąc wiązać się z żadną teorią, wydaje się, że długość bloku PEG musi mieć pewną minimalną wartość, by skutecznie obniżał toksyczność bloku PMAPTAC, natomiast długość bloku PMAPTAC musi być odpowiednio duża, by skutecznie oddziaływał z komórką/wirusem, natomiast nie może być zbyt duża, by polimer nie był toksyczny (polikationy są zwykle toksyczne, a ich toksyczność rośnie z masą cząsteczkową).

Polimery zastosowane według wynalazku wykazują bardzo silną zdolność hamowania replikacji wirusa HSV-1, przy jednoczesnej bardzo niskiej cytotoksyczności nawet przy wysokich stężeniach

PL 235 423 B1 (1 mg/ml). Przy stężeniu polimerów 500 μg/ml zaobserwowano redukcję miana wirusa o około 6 rzędów wielkości (99,9999%). Wartości IC90 (90% inhibitory concentration; stężenie leku (preparatu), które hamuje replikację wirusa w 90%) wyliczone dla polimerów PEG47-PMAPTAC53 i PEG46-PMAPTAC73 wynoszą odpowiednio 4,12 μg/ml oraz 34,66 μg/ml. Przeprowadzone testy funkcjonalne wykazały, że polimer oddziałuje na komórki, tworząc warstwę ochronną ograniczającą zdolność wirusa do adsorpcji, a w efekcie do zakażenia.

Przedmiot wynalazku został zilustrowany za pomocą poniższych figur, uzupełniających informacje zawarte w przykładach wykonania:

Fig. 1. ilustruje wykres przedstawiający cytotoksyczność polimerów blokowych. Żywotność komórek została przedstawiona jako % wartości próbki kontrolnej, nie traktowanej polimerami.

Fig. 2. ilustruje wykresy przedstawiające przeciwwirusową aktywność kopolimerów blokowych. Ilość DNA wirusowego w pożywce została wyznaczona metodą real-time PCR (A), natomiast liczbę funkcjonalnych cząstek wirusa wyznaczono metodą testu łysinkowego (B).

Fig. 3. ilustruje wykres przedstawiający mechanizm aktywności kopolimerów blokowych. Seria testów funkcjonalnych polegających na dodawaniu inhibitora na różnych etapach infekcji wirusowej, pozwala określić, na jakim etapie następuje hamowanie. Aktywność przeciwwirusową przedstawiono, jako logarytmiczny spadek liczby kopii DNA wirusowego w mililitrze pożywki.

Fig. 4. ilustruje obrazy uzyskane za pomocą mikroskopii konfokalnej przedstawiające hamowanie infekcji H5V-1 przez kopolimery blokowe. Obrazy przedstawiają projekcje maksymalne.

P r z y k ł a d y w y k o n a n i a

Sposób otrzymania polimeru blokowego PEG47-PMAPTAC53 użytego do zastosowania według patentu przedstawia się następująco. Chlorek (3-(metakryloiloamino)propylo)trimetyloamoniowy (MAPTAC, 5,53 g, 25,0 mmol), inicjator (kwas 4,4'-azobis(4-cyjanopentanowy), V-501,69,2 mg, 0,247 mmol) i makroczynnik przeniesienia łańcucha (PEG47-CTA, 1,13 g, 0,501 mmol) zostały rozpuszczone, w 41 mL wody. Mieszaninę odgazowano przepuszczając przez nią argon przez 30 minut. Polimeryzację prowadzono w 70°C przez 5 godzin. Mieszaninę poreakcyjną dializowano względem czystej wody przez 2 dni. PEG47-PMAPTAC53 wyizolowano poprzez liofilizację uzyskując 5,58 g substancji (wydajność 83,8%).

W zakresie rutynowej wiedzy znawcy jest ustalenie sposobu otrzymania pozostałych polimerów objętych niniejszym opisem.

P r z y k ł a d 1. Wpływ kopolimerów blokowych na żywotność komórek

Cytotoksyczność kopolimerów blokowych sprawdzono z wykorzystaniem testu XTT. Analiza została przeprowadzona na linii komórkowej Vero E6 (komórki nabłonka nerki Cercopithecus aethiops, ATCC CRL-1586), która jest permisywna dla wirusa HSV-1. Test ten opiera się na badaniu aktywności enzymów mitochondrialnych, poprzez określenie ich zdolności do redukcji substratu do barwnego produktu. Żywotność komórek wyznaczono przez pomiar absorbancji przy 450 nm w stosunku do kontroli, którą stanowiły komórki hodowane w pożywce bez dodatku polimerów. Komórki hodowano przez 2 dni w pożywce OMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) suplementowanej 3% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy cielęcej (FBS) oraz penicyliną i streptomycyną, z dodatkiem badanego, polimeru.

Przedstawione na Fig. 1. wyniki obrazują niską cytotoksyczność badanych polimerów nawet w wysokich stężeniach (500 μg/ml). CC50 obydwu związków wynosi powyżej 2000 μg/ml.

P r z y k ł a d 2. Wpływ kopolimerów blokowych na replikację wirusa opryszczki typu 1 (HSV-1)

Po ustaleniu stężeń związków, które nie miały toksycznego wpływu na komórki zbadano ich wpływ na replikację wirusa HSV-1. Komórki preinkubowano z polimerami o odpowiednich stężeniach przez 30 min, a następnie, nadal w obecności tych polimerów, zakażano wirusem HSV-1, szczep 17+ o TCID50 (tissue culture infective dose, dawka zakażająca 50% hodowli tkankowej) = 400 na mililitr. Po 2 godzinach usuwano niezwiązane cząstki wirusa przez 3-krotne przemycie roztworem PBS i inkubowano, również w obecności polimerów, przez kolejne 2 dni. Po tym czasie z pożywki komórkowej izolowano DNA wirusowe i wykorzystywano je jako matrycę w reakcji ilościowej real-time, PCR (sekwencje starterów: forward 5'-CAT CAC CGA CCC GGA GAG GGA C-3', reverse 5'-GGG CCA GGC GCT TGT TGG TGT A-3', sonda 5'-FAM CCG CCG AAC TGA GCA GAC ACC CGC GC BHQ1-3'), Zdolność polimerów do hamowania replikacji HSV-1 wyznaczono jako logarytmiczny spadek liczby kopii DNA wirusowego w mililitrze pożywki (Fig. 2.). Dodatkowo, ilość funkcjonalnych cząstek wirusa w pożywce wyznaczono za pomocą standardowego testu łysinkowego. Ilość cząstek wirusa w pożywce przedstawiono jako liczbę jednostek tworzących łysinkę (PFU, ang. plaque-forming unit).

Testowane kopolimery blokowe wykazują działanie przeciwwirusowe i hamują namnażanie się wirusa HSV-1. Wyliczone wartości IC90 wyznaczone metodą real-time PCR wynosiły odpowiednio

PL 235 423 B1

4,115 gg/ml dla PEG47-PMAPTAC53 oraz 34,66 gg/ml dla PEG46-PMAPTAC73, natomiast wyznaczone metodą testu łysinkowego odpowiednio 1,4 gg/ml dla PEG47-PMAPTAC53 oraz 1,685 gg/ml dla PEG46PMAPTAC73. Wartości indeksu selektywności wyznaczone metodą real-time PCR wynoszą odpowiednio >121,5 dla PEG47-PMAPTAC53 oraz >14,43 dla PEG46-PMAPTAC73, natomiast wyznaczone metodą testu łysinkowego >357,14 dla PEG47-PMAPTAC53 oraz >296,74 dla PEG46-PMAPTAC73.

P r z y k ł a d 3. Mechanizm aktywności przeciwwirusowej kopolimerów blokowych

Mechanizm aktywności przeciwwirusowej kopolimerów blokowych zbadano przy pomocy serii testów funkcjonalnych opierających się na zastosowaniu inhibitora na różnych etapach infekcji wirusowej:

• Test I (test inaktywacji) - czy polimer oddziałuje bezpośrednio z wirusem, czyniąc go niezdolnym do zakażenia komórek?

• Test II (test interakcji) - czy polimer oddziałuje bezpośrednio z komórką, czyniąc ją odporną na zakażenie wirusem?

• Test III (test adsorpcji) - czy polimer zakłóca interakcję wirusa z jego czynnikiem adhezyjnym na powierzchni komórki, uniemożliwiając przyłączanie się wirusa do komórki?

• Test IV(test składania, pakowania i uwalniania) - czy polimer zakłóca późne etapy infekcji wirusowej (np. składanie, pakowanie, uwalnianie) uniemożliwiając powstanie zakaźnych wirionów potomnych?

Ustalono, że hamowanie infekcji HSV-1 przez kopolimery blokowe zachodzi na etapie adsorpcji wirusa do komórki oraz poprzez oddziaływanie polimeru z komórką. Z wykresu stanowiącego Fig. 3. można odczytać znaczny spadek liczby kopii DNA wirusowego widoczny w teście składania, pakowania i uwalniania, który prawdopodobnie jest konsekwencją zahamowania infekcji na wcześniejszym jej etapie, nie można jednak wykluczyć dodatkowego działania inhibitorów na późnych etapach infekcji.

P r z y k ł a d 4. Obrazowanie wpływu kopolimerów blokowych na infekcję HSV-1 za pomocą mikroskopii konfokalnej (Fig. 4.)

W celu zobrazowania wpływu kopolimerów blokowych na infekcję wirusową komórki preinkubowano z polimerami, a następnie zakażono HSV-1. Po godzinie komórki utrwalono i wyznakowano na obecność DNA chromosomowego (DAPI), f-aktyny (falloidyna skoniugowana z barwnikiem fluorescencyjnym Alexa 633) oraz wirusa (przeciwciała specyficzne wobec białka wirusowego kapsydu VP5).

Na Fig. 4. wyraźnie widoczne jest zmniejszenie ilości wirusa obecnego w komórkach traktowanych kopolimerami blokowymi.

Claims (9)

1. Zastosowanie kopolimerów blokowych o łańcuchach złożonych z bloku poli(glikolu etylenowego) (PEG) bloku poli(chlorku (3-(metakryloiloamino)propylo)trimetyloamoniowego) (PMAPTAC) do wytwarzania preparatu do leczenia i profilaktyki chorób wywoływanych przez wirusa HSV-1.

2. Zastosowanie według zastrzeżenia 1, znamienne tym, że leczenie i profilaktyka chorób wywoływanych przez wirusa opryszczki HSV-1 polega na hamowaniu replikacji wirusa HSV-1.

3. Zastosowanie według zastrzeżenia 1, znamienne tym, że chorobami wywołanymi przez wirus HSV-1 są opryszczka, opryszczkowe zapalenie spojówki, opryszczkowe zapalenie rogówki i opryszczkowe zapalenie mózgu.

4. Zastosowanie według zastrzeżenia 1, znamienne tym, że kopolimerem blokowym poli(glikolu etylenowego) (PEG) i poli(chlorku (3-(metakryloiloamino)propylo)trimetyloamoniowego) (PMAPTAC) - PEGx-PMAPTACy, - jest kopolimer, w którym stopień polimeryzacji x bloku PEG wynosi 45-47, natomiast stopień polimeryzacji y bloku PMAPTAC jest w zakresie 22-102.

5. Zastosowanie według zastrzeżenia 4, znamienne tym, że kopolimerem blokowym poli(glikolu etylenowego) (PEG) i poli(chlorku (3-(metakryloiloamino)propylo)trimetyloamoniowego) (PMAPTAC) jest PEG47-PMAPTAC53, PEG47-PMAPTAC74, PEG45-PMAPTAC51 lub PEG45PMAPTAC58.

6. Zastosowanie według dowolnego z powyższych zastrzeżeń, znamienne tym, że preparat podaje się miejscowo.

7. Zastosowanie według zastrzeżenia 6, znamienne tym, że preparat podaje się na skórę, usta, błonę śluzową nosa, okolic płciowych lub do oka.

PL 235 423 Β1

8. Zastosowanie według dowolnego z powyższych zastrzeżeń, znamienne tym, że preparat jest w postaci wybranej z grupy obejmującej roztwór, żel, sztyft, szminkę, pomadkę, krem, serum, puder, zasypkę, proszek, maść, krople do oczu lub plaster.

9. Zastosowanie według dowolnego z powyższych zastrzeżeń, znamienne tym, że stężenie kopolimeru blokowego PEG-PMAPTAC w preparacie wynosi od 10 do 500 μg/ml.