PL235490B1

PL235490B1 - Kationowa pochodna dekstranu do zastosowania w hamowaniu replikacji wirusa HSV-1

Info

Publication number: PL235490B1
Application number: PL416749A
Authority: PL
Inventors: Maria Nowakowska; Krzysztof PYRĆ; Krzysztof Pyrć; Krzysztof SZCZUBIAŁKA; Krzysztof Szczubiałka; Justyna CIEJKA; Justyna Ciejka; Aleksandra MILEWSKA; Aleksandra Milewska; Magdalena PACHOTA; Magdalena Pachota
Original assignee: Univ Jagielloński
Priority date: 2016-04-04
Filing date: 2016-04-04
Publication date: 2020-08-24
Also published as: WO2017175132A1; PL416749A1

Description

Przedmiotem wynalazku jest polimer dekstranowy do zastosowania w profilaktyce i leczeniu infekcji wywołanych przez wirusa opryszczki pospolitej.

Herpes simplex 1 (HSV-1), wirus opryszczki pospolitej, jest jednym z najbardziej rozpowszechnionych patogenów spotykanych u ludzi. Statystyki wskazują, że około 50-90% populacji świata jest seropozytywna w stosunku do tego wirusa [1]. Typowe objawy pierwotnego zakażenia to owrzodzenia występujące głównie w obrębie twarzy na skórze, języku i wargach. Zakażenie wirusem HSV-1 może jednak prowadzić również do cięższych chorób, takich jak zapalenie oka lub zapalenie mózgu. Choroby te charakteryzują się ciężkim przebiegiem i mogą prowadzić do trwałych uszkodzeń zdrowia (np. ślepota), a nawet zgonu. Zakażenie następuje na skutek bezpośredniego kontaktu z nosicielem wirusa, w szczególności poprzez kontakt z miejscami zmienionymi chorobowo lub płynami biologicznymi (zwykle śliną). Zakażenie jest nieuleczalne. Oprócz fazy aktywnej infekcji tym wirusem, której skutki są widoczne w postaci zmian opryszczkowych, wirus powoduje infekcję utajoną. Tak więc osoba zakażona stanowi rezerwuar wirusa przez cały okres swego życia stając się jego nosicielem i źródłem dalszych zakażeń. W fazie utajenia wirusa wchodzi on w stan latencji, ustanawiając zakażenie w komórkach nerwowych. W sytuacji nawet niewielkich zaburzeń stanu zdrowia gospodarza lub zaistnienia sytuacji stresowych wirus powraca do stanu aktywnego i jest transportowany poprzez zakończenia nerwowe do komórek skóry. Neurotropowe i neuroinwazyjne właściwości wirusa HSV-1 skutkują rozwojem zagrażających życiu chorób neurologicznych takich jak zapalenie opon mózgowych, a także podejrzewa się, że zakażenie może sprzyjać rozwojowi choroby Alzheimera. Infekcja wirusowa HSV-1 jest szczególnie groźna dla osób z osłabionym układem immunologicznym i niemowląt.

Obecnie dostępnych jest kilka leków przeciwwirusowych, które wykazują aktywność przeciwko patogenom należącym do rodziny Herpesviridae. Najstarszym i najczęściej stosowanym lekiem jest acyklowir i jego pochodne. Leki te zawierają analogi guanozyny, które do pełnej aktywności wymagają fosforylacji przez kinazy kodowane w genomie herpeswirusów. Po aktywacji są one włączane do nowo tworzonej nici DNA w czasie replikacji herpeswirusów, hamując jej elongację. Leki te zmniejszają częstotliwość nawrotów oraz łagodzą uciążliwe dolegliwości przy zakażeniu pierwotnym [2]. Chociaż są one zwykle efektywne w stosunku do pierwotnego zakażenia, to nie zabezpieczają osoby zakażonej przed powtórnym pojawieniem się symptomów choroby, ponieważ nie eliminują wirusa w stanie utajonym. Obserwuje się także coraz częstsze pojawianie się szczepów wirusowych opornych na te leki. Tak więc istnieje potrzeba poszukiwania nowego podejścia do opracowania efektywnych terapii zakażenia wirusem HSV-1.

Większość dotychczas stosowanych terapii wykorzystuje hamowanie replikacji wirusa oraz hamowanie fuzji. Natomiast istotnym etapem w cyklu życiowym wirusa jest jego wejście do komórki, dlatego hamowanie tego etapu wydaje się być kluczowe.

Ze względu na zdolność wykorzystywania różnych receptorów komórkowych, HSV-1 wykazuje wyjątkowo małą specyficzność tkankową. Receptory komórkowe wykorzystywane przez HSV-1 to przede wszystkim 3-O-sulfonowany siarczan heparanu, białko HVEM (herpesvirus entry mediator) oraz nektyna 1 [1]. Ze strony wirusa natomiast za oddziaływanie z komórką odpowiedzialne są glikoproteiny powierzchniowe gB, gC, gD oraz heterodimer gH/gL. Proces wejścia wirusa do komórki jest zapoczątkowywany przez interakcję gB ze znajdującymi się na powierzchni komórki proteoglikanami zawierającymi siarczan heparanu [2]. Następnie dochodzi do oddziaływania gD z jednym z receptorów i wejścia wirusa do komórki poprzez fuzję błon lub endocytozę [3,4].

Opisanych zostało kilka klas związków stanowiących inhibitory wejścia HSV-1 do komórki gospodarza. Jedną z najliczniejszych grup stanowią peptydy, takie jak α-, β- i θ-defensyny, peptydy naturalnie występujące u naczelnych [5,6], czy peptydy syntetyczne, np. peptydy G1 i G2 posiadające ładunek dodatni o wysokiej gęstości [7]. Właściwości hamujące wejście HSV-1 do komórki wykazuje również wiele substancji pochodzenia naturalnego, ekstrahowanych z roślin [8,9], czy organizmów morskich [10]. Pojawiają się również nieliczne doniesienia o przeciwwirusowym działaniu oligonukleotydów [11,12] oraz nanocząstek [13,14].

Spośród dotychczas zbadanych materiałów polimerowych, które hamują infekcję poprzez oddziaływanie z receptorem wejścia - siarczanem heparanu, można wyróżnić kopolimer kwasu 4-styrenosulfonowego i kwasu maleinowego [3] oraz poliaminokwasy: poli-L-lizynę i poli-L-argininę [4].

W zgłoszeniu WO2006090365 oraz publikacji Yudovin-Farber I., et.al, pt.: „Inhibition of herpes simplex virus by polyamines”, Antivir Chem Chemother 2009, 20: 87-98 [15], badano także pochodne

PL 235 490 Β1 aminowe i amoniowe naturalnych polisacharydów (np. dekstran, pullulan). Wykazano, że dekstran podstawiony grupami aminowymi, w szczególności dekstran-propylo-1,3-diamina efektywnie hamuje replikację wirusa HSV-1, podczas gdy związek ten zmodyfikowany poprzez przekształcenie pierwszorzędowej grupy aminowej w grupę trimetyloamoniową (monoquaternary ammonium propyl-1,3-diamine, MQ-propane-1,3-diamine) aktywności tej nie wykazuje [15], w zupełnym przeciwieństwie do podobnych strukturalnie kationowych pochodnych dekstranu. Publikacje te wskazują, że to obojętne (pozbawione ładunku) pochodne diaminowe wykazują aktywność przeciwwirusową skierowaną przeciwko HSV-1, a pochodna o charakterze kationu pozbawiona jest tej aktywności.

Zgłoszenie P.391043 opisuje kationowe pochodne dekstranu, które zdefiniowano jako przydatne do neutralizacji działania heparyny. Dokument ten nie odnosi się do żadnej choroby czy terapii związanej z HSV. Mechanizm neutralizacji heparyny przeprowadzany jest w innych strukturach i polega na całkowicie odmiennym działaniu niż w przypadku hamowania aktywności wirusa HSV-1.

Według niektórych badań inhibitorami wejścia są także sulfonowane galaktany i fukoidany, siarczan dekstranu, heparyna oraz sulfonowane ligniny [6-7812],

EP0066379 opisuje kompozycję do zwalczania HSV typu I i II, zawierającą sól sodową siarczanu dekstranu o masie molowej z zakresu od 4100 to 25000 i zwierającą co najmniej 0,2 równoważnika SO3 Na na jednostkę glukopiranozylową.

Zgłoszenie W02000024784 ujawnia pochodne dekstranu wykazujące biologiczną aktywność wobec HSV, mianowicie dekstranopolialdehydo-rezorcynę.

Celem wynalazku opisanego w niniejszym zgłoszeniu jest dostarczenie nowego skutecznego leku do leczenia i profilaktyki infekcji wywołanych przez HSV-1.

Istota wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest dekstran o wzorze I, kationowo modyfikowany za pomocą czwartorzędowych grup amoniowych, do zastosowania w leczeniu i profilaktyce chorób wywoływanych przez wirusa HSV-1. Korzystnie stosuje się dekstran zmodyfikowany przy pomocy chlorku glicydylotrimetyloamoniowego (GTMAC).

h₂c. ^oh

CH

I ch₂

I

H₃C---N⁺--CH₃

I ch₃

Wzór I

Korzystnie stosuje się dekstran o masie cząsteczkowej od 6 do 100 kDa. Kationowo zmodyfikowany dekstran ma stopień podstawienia w zakresie 20-100%, korzystnie 20-60%, bardziej korzystnie 25-60%.

Zastosowanie obejmuje polimery oparte na dekstranie w postaci maści lub kropli podawanych miejscowo na skórę lub do oka, doustnie, dootrzewnowo lub dożylnie w leczeniu ogólnoustrojowym.

Wynalazek został zilustrowany na figurach rysunku, które przedstawiają korzystne przykłady realizacji:

Fig. 1 przedstawia widmo IR-ATR dekstranów modyfikowanych kationowo o masie 6 kDa,

Fig. 2 - widmo IR-ATR dekstranów modyfikowanych kationowo o masie 40 kDa, a

Fig. 3 - widmo IR-ATR dekstranów modyfikowanych kationowo o masieWO kDa,

Fig. 4 ilustruje cytotoksyczność polimerów. Żywotność komórek została przedstawiona jako % wartości próbki kontrolnej, tj. nie traktowanej polimerami,

Fig. 5 przedstawia przeciwwirusową aktywność dekstranów modyfikowanych GTMAC, a

Fig. 6 ilustruje zależność aktywności anty-HSV-1 od stopnia podstawienia.

Przykłady wykonania

Przedmiot wynalazku został bliżej przedstawiony w przykładach realizacji.

PL 235 490 Β1

Przykład 1

Synteza kationowych dekstranów g dekstranu o masie cząsteczkowej 6 kDa, 40 kDa (DEX40, Sigma-Aldrich) lub 100 kDa (DEX100, Sigma-Aldrich) rozpuszczono w 25 ml wody destylowanej, a następnie dodano odpowiednią ilość (Tabela 1) chlorku glicydylotrimetyloamoniowego (GTMAC, Sigma-Aldrich). Roztwór zanalizowano dodając 1 ml 5 M roztworu NaOH. Mieszaninę intensywnie mieszano na mieszadle magnetycznym i ogrzewano pod chłodnicą zwrotną przez 4 godziny w temperaturze 80°C. Po zakończeniu syntezy mieszaninę reakcyjną ochłodzono do temperatury pokojowej i zneutralizowano roztworem HCI. Roztwór przelano do tuby dializacyjnej o masie cząsteczkowej odcięcia równej 3,5 kDa i dializowano względem wody tak długo, aż przewodnictwo dializowanego roztworu spadło poniżej 10 pS. Otrzymane polimery wyodrębniono poprzez liofilizację. Zostały one oznaczone akronimami, w których pierwsza liczba oznacza masę cząsteczkową w kilodaltonach, natomiast druga stopień podstawienia (DS) w procentach

Tabela 1. Ilość GTMAC użytego do syntezy kationowych dekstranów

Polimer	Masa dekstranu [g]	GTMAC [ml]	Liczba moli GTMAC przypadająca na 1 mol grup glukozowych w dekstranie
dex₆ds₂₃	0,5	2,25	5
DEX₆DS₄i	0,5	4,5	10
DEX6DS₃7	0,5	6,75	16
DEXiDS₅₂	0,5	13,5	32
DEX₄oDS₂₆	0,5	4,5	10
dex₁₀₀ds_3J	0,5	4,5	10

Przykład 2

Wyznaczanie stopnia podstawienia kationowych dekstranów na podstawie analizy elementarnej

Dekstran oraz jego kationowe pochodne poddano analizie elementarnej w celu wyznaczenia stopnia podstawienia (DS) jednostek glukozowych grupami GTMAC, zdefiniowanego jako liczba grup GTMAC przypadających na 1 jednostkę glukozową w dekstranie. Wyniki zebrano w Tabeli 2.

Tabela 2. Wyniki analizy elementarnej otrzymanych kationowych pochodnych dekstranu oraz wartości DS obliczone na ich podstawie

Polimer	c	H	N	N/C	DS [%]
DEX₆DS₀	40,75	6,544	0	0	0
DEXJDS₂3	42,49	6,98	1,550	0,04	23
DEX₆DS₄i	41,23	7,214	2,32	0,06	41

PL 235 490 Β1

dex₆ds₃₇	42,33	6,632	2,24	0,05	37
dex₆ds₅₂	43,38	7,491	2,87	0,07	52
DEX4₀DS_o	40,965	6,52575	0	0	0
dex₄₀ds₂₆	40,89	7,103	1,64	0,04	26
DEX₁₀₀DS₀	40,965	6,52575	0	0	0
DEX;noDS35	41,53	7,372	2,12	0,05	35

Przykład 3

Widma IR kationowych pochodnych dekstranu

W celu potwierdzenia podstawienia dekstranu przez GTMAC, zmierzono widma IR. O obecności grup GTMAC w zmodyfikowanym dekstranie świadczy pasmo przy ok. 1475 cm·¹. Wyniki zebrano w Tabeli 3 i na Fig. 1-3.

Tabela 3

Polimer	DS [%]	Położenie pasma - drgania asymetryczne C-H pochodzące od GTMAC [cm¹]
DEX_ĆDS_O	0	-
DEX₆DS4i	41	1477
dex₆ds₂₃	23	1477
dex₆ds₃₇	37	1477
dex₆ds₅₂	52	1478
DEX4oDS_o	0	-
DEX4oDS26	26	1475
DEX_iOTDSg	0	*
DEX₁₀₀DS_J5	35	1477

Przykład 4

Potencjał zeta kationowych pochodnych dekstranu

Potencjał zeta został zmierzony przy użyciu urządzenia NanoZetasizer firmy Malvern. Pomiary wykonano dla próbek o stężeniu 1 mg/ml w 0,015 M NaCI. Wyniki zebrane są w Tabeli 4.

PL 235 490 Β1

Tabela 4. Potencjał zeta i mg/ml roztworów kationowych pochodnych dekstranu w 0,015 M NaCL

Polimer	DS [%]	Potencjał zeta [mV]
DEX4oDSq	0	-1,87 ±0,64
DEX«DS₂₍,	26	+14,0 ±1,61
DEX₁₀₀DS₀	0	-2,85 ±0,94
DEKiooDSji	35	+25,2+1,42
DE^DSfl	0	1,80 ± 1,78
DLA.-DS,..	23	+9,48 ± 1,80
DEX_f,DS₄i	41	+9,69 ± 1,73
ΟΕΧζΌδιγ	37	+ 11,5 ±2,29
DEX_fiDSs2	52	+16,4 + 1,50

Przykład 5

Wpływ kationowo modyfikowanych dekstranów na żywotność komórek

Cytotoksyczność kationowych pochodnych dekstranu sprawdzono z wykorzystaniem testu ΧΤΤ. Analiza została przeprowadzona na linii komórkowej Vero E6, która jest permisywna dla wirusa HSV-1. Test ten opiera się na badaniu aktywności enzymów mitochondrialnych, poprzez określenie ich zdolności do redukcji substratu do barwnego produktu. Żywotność komórek wyznaczono przez pomiar absorbancji przy 450 nm w stosunku do kontroli, którą stanowiły komórki hodowane w pożywce bez dodatków. Komórki hodowano przez 2 dni w mieszaninie pożywki MEM z dodatkiem soli Hanka, oraz pożywki M199 z dodatkiem soli Earle’a w stosunku 2:1 suplementowanej 3% inaktywowaną termicznie płodową surowicą cielęcą (FBS) oraz penicyliną i streptomycyną, z dodatkiem badanego polimeru.

Przedstawione na Fig. 4 wyniki jasno wykazują bardzo niską cytotoksyczność zsyntetyzowanych polimerów w testowanych stężeniach.

Przykład 6

Wpływ kationowo modyfikowanych dekstranów na replikację wirusa opryszczki typu 1 (HSV-1)

Po ustaleniu stężeń związków, które nie miały toksycznego wpływu na komórki zbadano ich wpływ na replikację wirusa HSV-1. Komórki preinkubowano z dekstranami o odpowiednich stężeniach przez 30 min, a następnie, nadal w obecności dekstranów, zakażano wirusem o TCID50-400. Po 2 godzinach usuwano niezwiązane cząstki wirusa przez 3-krotne przemycie roztworem PBS i inkubowano, również w obecności dekstranów, przez kolejne 2 dni. Po tym czasie z pożywki komórkowej izolowano DNA i wykorzystywano jako matrycę w reakcji real-time PCR. Zdolność dekstranów do hamowania replikacji HSV-1 wyznaczono jako spadek liczby kopii wirusa w mililitrze pożywki.

Fig. 5 przedstawia przeciwwirusową aktywność dekstranów modyfikowanych GTMAC. Do analizy wykorzystano dekstrany o różnej masie molowej (6,40 i 100 kDa) modyfikowane GTMAC. Jako kontrolę (Ctrl) wykorzystano odpowiednie niemodyfikowane dekstrany. Dla wszystkich związków zastosowano stężenie 500 gg/ml.

Na podstawie diagramu wyraźnie widać, że dekstran modyfikowany GTMAC hamuje namnażanie się wirusa HSV-1 w porównaniu z odpowiednią próbką kontrolną.

PL 235 490 B1

W następnej kolejności ustalono wpływ stopnia podstawienia GTMAC na aktywność przeciwwirusową przy stałej masie molowej dekstranu (6 kDa).

Fig. 6 przedstawia zależność aktywności anty-HSV-1 od stopnia podstawienia. Wykorzystano 3 różne stopnie podstawienia polimeru: 23%, 37% oraz 52%. Przedstawiony diagram wyraźnie wskazuje, że aktywność przeciwwirusowa polimeru koreluje ze stopniem podstawienia.

Literatura:

[1] Spear PG: Herpes simplex virus: receptors and ligands for cell entry. Cell Microbiol 2004, 6:401-410.

[2] Shukla D, Spear PG: Herpesviruses and heparan sulfate: an intimate relationship in aid of viral entry. J Clin Invest 2001, 108:503-510.

[3] Subramanian RP, Geraghty RJ: Herpes simplex virus type 1 mediates fusion through a hemifusion intermediate by sequential activity of glycoproteins D, H, L, and B. Proc Natl Acad Sci USA 2007, 104:2903-2908.

[4] Clement C, Tiwari V, Scanlan PM, Valyi-Nagy T, Yue BY, Shukla D: A novel role for phagocytosis-like uptake in herpes simplex virus entry. J Cell Biol 2006, 174:1009-1021.

[5] Hazrati E, Galen B, Lu W, Wang W, Ouyang Y, Keller MJ, Lehrer RI, Herold BC: Human alpha- and beta-defensins block multiple steps in herpes simplex virus infection. J Immunol 2006, 177:8658-8666.

[6] Yasin B, Wang W, Pang M, Cheshenko N, Hong T, Waring AJ, Herold BC, Wagar EA, Lehrer RI: Theta defensins protect cells from infection by herpes simplex virus by inhibiting viral adhesion and entry. J Virol 2004, 78:5147-5156.

[7] Tiwari V, Liu J, Valyi-Nagy T, Shukla D: Anti-heparan sulfate peptides that block herpes simplex virus infection in vivo. J Biol Chem 2011,286:25406-25415.

[8] Chen SD, Gao H, Zhu QC, Wang YQ, Li T, Mu ZQ, Wu HL, Peng T, Yao XS: Houttuynoids A-E, antiherpes simplex virus active flavonoids with novel skeletons from Houttuynia cordata. Org Lett 2012, 14:1772-1775.

[9] Lin LT, Chen TY, Chung CY, Noyce RS, Grindley TB, McCormick C, Lin TC, Wang GH, Lin CC, Richardson CD: Hydrolyzable tannins (chebulagic acid and punicalagin) target viral glycoprotein-glycosaminoglycan interactions to inhibit herpes simplex virus 1 entry and cellto-cell spread. J Virol 2011,85:4386-4398.

[10] Vo TS, Ngo DH, Ta QV, Kim SK: Marine organisms as a therapeutic source against herpes simplex virus infection. Eur J Pharm Sci 2011,44:11-20.

[11] Sauter MM, Gauger JJ, Brandt CR: Oligonucleotides designed to inhibit TLR9 block Herpes simplex virus type 1 infection at multiple steps. Antiviral Res 2014, 109:83-96.

[12] Shogan B, Kruse L, Mulamba GB, Hu A, Coen DM: Virucidal activity of a GT-rich oligonucleotide against herpes simplex virus mediated by glycoprotein B. J Virol 2006, 80:4740-4747.

[13] Baram-Pinto D, Shukla S, Gedanken A, Sarid R: Inhibition of HSV-1 attachment, entry, and cell-to-cell spread by functionalized multivalent gold nanoparticles. Small 2010, 6:1044-1050.

[14] Mishra YK, Adelung R, Rohl C, Shukla D, Spors F, Tiwari V: Virostatic potential of micronano filopodialike ZnO structures against herpes simplex virus-1. Antiviral Res 2011, 92:305-312.

[15] Yudovin-Farber I, Gurt I, Hope R, Domb AJ, Katz E: Inhibition of herpes simplex virus by polyamines. Antivir Chem Chemother 2009, 20: 87-98.

Claims

1. Dekstran modyfikowany kationowo za pomocą czwartorzędowych grup amoniowych o wzorze 1 do zastosowania w leczeniu i profilaktyce chorób wywoływanych przez wirusa HSV-1, który ma stopień podstawienia w zakresie 20-60%.

CH ch₂

H₃c---N*--CH_ł

Ch₃

Wzór I

2. Dekstran według zastrz. 1, zmodyfikowany przy pomocy chlorku glicydylotrimetyloamoniowego (GTMAC).

3. Dekstran według zastrz. 1 albo 2, o masie cząsteczkowej od 6 do 100 kDa.

4. Dekstran według zastrz. 1-3, w którym stopień podstawienia jest zawarty w zakresie 25-60%.