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Die Erfindung betrifft ein Probiotika enthaltendes Depotsystem für dentale Anwendungen, ein dazugehöriges Herstellungsverfahren sowie eine bevorzugte Verwendung dieses Depotsystems.
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Technologischer Hintergrund
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Polymere und Polymergemische werden schon seit einiger Zeit als sogenannte Drug-Delivery-Systeme verwendet. Dazu werden Wirkstoffe in die Polymere eingebettet und am vorgesehenen Wirkort wieder freigesetzt. Für die Behandlung der Parodontitis sind beispielsweise mehrere kommerzielle erwerbbare Systeme auf dem deutschen Markt verfügbar. Sie unterscheiden sich unter anderem in der Wirkweise, so gibt es antiseptische oder antibiotische Präparate. Zu Ersteren gehören zum Beispiel ein mit Chlorhexidin beladener Gelatinechip (
WO 2011/001425 A1 ) sowie ein Gel auf Xanthan-Basis. Als Vertreter der Antibiotika wird unter anderem seit Ende 2010 ein Doxycyclin-haltiges Präparat vertrieben. Viele der Drug-Delivery-Systeme zeigen einen erfolgreichen Einsatz in Kombination mit einem mechanischen Debridement und später in der unterstützenden Parodontitistherapie (Bonito AJ, Lux L, Lohr KN: Impact of local adjuncts to scaling and root planning in periodontal disease therapy: a systematic review. J Periodontol 2005, 76, 1227-1236; Kalsi R, Vandana KL, Prakash S: Effect of local drug delivery in chronic periodontitis patients: A meta-analysis. J Indian Soc Periodontol 2011, 15, 304-309).
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Ein weiterer Ansatz ist der Einsatz von Probiotika (
US 8,540,980 B2 ). Dieser ist nicht nur im Rahmen der Prävention gastrointestinaler Erkrankungen in der Humanmedizin durch zahlreiche Studien belegt (Teughels W, Van Essche M, Sliepen I, Quirynen M: Probiotics and oral healthcare. Periodontol 2000 2008, 48, 111-147). Die Idee pathogene Bakterien durch nichtpathogene Keime auch in dentaler Plaque zu beeinflussen und zu verdrängen, ist schon seit Längerem bekannt und in vitro erfolgreich untersucht (Hillman JD, Socransky SS, Shivers M: The relationships between streptococcal species and periodontopathic bacteria in human dental plaque. Arch Oral Biol 1985, 30, 791-795).
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Diverse in vivo Untersuchungen benutzen probiotikahaltige Kautabletten und Mundspülungen und zeigen eine kariesprotektive Wirkung (Sundararaj SC, Thomas M V, Peyyala R, Dziubla TD, Puleo DA: Design of a multiple drug delivery system directed at periodontitis. Biomaterials 2013, 34, 8835-8842), eine Reduktion der entzündlichen Prozesse der Mundhöhle und eine reduzierte Sondierungstiefe (Rao Y, Lingamneni B, Reddy D: Probiotics in oral health - a review. J N J Dent Assoc 2012, 83, 28-32). Aktuell befindet sich ein neues probiotisches Gel zur lokalen subgingivalen Applikation von Lactobacillus reuteri auf dem deutschen Markt. Klinische Studien zeigen auch hier eine Reduktion der Entzündungsparameter, aber auch immer noch eine zu kurze Freisetzungsdauer und notwendige häufige Anwendung (Vicario M, Santos A, Violant D, Nart J, Giner L: Clinical changes in periodontal subjects with the probiotic Lactobacillus reuteri Prodentis: a preliminary randomized clinical trial. Acta Odontol Scand 71, 813-819).
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Weiterhin sind in situ polymerisierende Systeme unter Verwendung eines Vernetzungsmittels bekannt, das ein Reaktionsprodukt aus 1,2-Ethylenglykol-bis(dimilchsäure) und 1,6-Hexamethylendiisocyanat (ELA-NCO) ist. Diese polymeren Systeme sollen beispielsweise Einsatz als Gewebekleber (
EP 1 984 032 B1 ,
US 8,460,703 B2 ), Drug-Delivery-Depots zur Glaukomtherapie (
DE 10 2012111808 A1 ) und zur Behandlung der Osteoporose (
US 8,496,971 B2 ) finden.
EP 0 650 373 B1 beschreibt Alginatfasern mit im Faserkern eingelagerten Arzneimitteln, beispielsweise Chlorhexidin.
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Eine der Hauptursachen der Parodontitis sind pathogene Bakterien. Eine mögliche Behandlung stellt die Verabreichung von antibiotischen Wirkstoffen dar. Nachteilig ist hierbei, dass diese zwar die pathogenen Keime vernichten, jedoch bekämpfen sie ebenfalls die physiologisch wichtigen Bakterien. In der direkten Folge einer solchen Antibiotikatherapie ist der Mundraum ein von Bakterien neu zu besiedelnder Lebensraum. Diese Neubesiedlung kommt aber wiederum ebenfalls den pathogenen Keimen zugute, die sich erneut ausbreiten und den Therapieerfolg gefährden.
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Diesem Problem kann durch die Verabreichung von physiologisch unbedenklichen Bakterien (Probiotika) begegnet werden. Bisher erfolgt die Gabe von Probiotika in Form von Kautabletten und Gelen. Der Nachteil dieser Verabreichung ist die geringe Depotwirkung, die ungenaue Lokalisierung und die notwendige mehrmalige Anwendung.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Ein oder mehrere Nachteile des Standes der Technik werden mit Hilfe des erfindungsgemäßen Probiotika enthaltenden Depotsystems für dentale Anwendungen gelöst oder zumindest gemindert. Das Depotsystem ist dadurch gekennzeichnet, dass die Probiotika in Alginatpartikel eingebettet sind und die Alginatpartikel mit einem Vernetzungsmittel untereinander vernetzt sind.
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Die Erfindung stellt demnach ein neuartiges Depotsystem zur kontrollierten Freisetzung von Probiotika für dentale Anwendungen bereit. Die eingebetteten Probiotika werden an der applizierten Stelle über die Zeit freigesetzt und dienen als Konkurrenz zu pathogenen Bakterien. Hierfür wurden Materialien und Verfahren entwickelt, die die Überlebensfähigkeit und insbesondere die Möglichkeit zur Freisetzung der Probiotika über einen Zeitraum von bis zu zwei Wochen sichern. Das Depotsystem findet demnach Verwendung als Arzneimittel, hier in Form einer Stoffzusammensetzung, die Probiotika und eine Matrix umfasst, die eine zielgerechte Freisetzung der Probiotika zur Heilung oder zur Verhütung menschlicher oder tierischer Krankheiten ermöglicht. Besonders geeignet ist das Depotsystem als Arzneimittel für den dentalen Bereich von Mensch und Tier, beispielsweise in die Zahnfleischtasche zur Behandlung von Parodontitis appliziert. Das Depotsystem ist damit direkt am Wirkort lokalisiert und erlaubt die Besiedlung des entsprechenden Raumes mit Probiotika durch eine langanhaltende Depotwirkung.
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Der Vorteil des entwickelten Systems liegt insbesondere in der Möglichkeit, Probiotika über einen längeren Zeitraum lokalisiert mit einer einmaligen Gabe zu verabreichen. Im Vergleich zu anderen Darreichungsformen, die wiederholte Applikation in Tablettenform notwendig machen, bestehen bei diesem System zudem geringere Anforderungen an die Therapietreue des Patienten. Ein erneuter Zahnarztbesuch zur Entfernung des applizierten Depots wird dem Patienten ebenfalls erspart, da es degradabel ist und kurz- bis mittelfristig abgebaut wird. Eine weitere Besonderheit der Erfindung entsteht aus der Vernetzung von Alginat-Partikeln, die eine Nahrungsquelle für die Probiotika darstellen und dadurch ein Überleben dieser ermöglichen.
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Alginsäure wird von Braunalgen und einigen Bakterien gebildet. Alginsäure ist ein Polysaccharid, bestehend aus den beiden Uronsäuren α-L-Guluronsäure (GuIUA) und β-D-Mannuronsäure (ManUA), welche 1,4-glycosidisch in wechselndem Verhältnis zu linearen Ketten verbunden sind. Die mittlere Molmasse beträgt 48.000-186.000 g·mol-1. Die hier verwendeten Salze der Alginsäure werden als Alginate bezeichnet. Bevorzugt werden Natriumalginat, Kaliumalginat, Ammoniumalginat, Calciumalginat und Gemische derselben eingesetzt.
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Vorzugsweise ist das Vernetzungsmittel ein Diisocyanat, insbesondere ein aliphatisches Diisocyanat. Derartige Vernetzungsmittel sind kommerziell verfügbar oder über bekannte Syntheseverfahren in hoher Ausbeute und Reinheit zugänglich. Ferner sind die für die Vernetzungsreaktion zwischen Alginatpartikeln und Vernetzungsmittel benötigten Funktionalitäten wechselseitig vorhanden. Die im Diisocyanat vorhandenen NCO-Gruppen reagieren dabei mit freien Hydroxylgruppen am Alginat.
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Besonders bevorzugt ist das Diisocyanat, ein Oligoester mit terminalen Isocyanatgruppen. Als Oligoester werden „Ester“ von Hydroxycarbonsäuren und somit auch Oligoglykolide, Oligolactide sowie gemischt zusammengesetzte Oligoester, insbesondere auf der Basis von Glykolid und Lactid, bezeichnet. Diese können beispielsweise durch ringöffnende Polymerisation oder Oligomerisation hergestellt sein. Der Oligoester weist in einer weiteren Ausführungsform einen mehrwertigen, insbesondere mindestens zweiwertigen, Alkohol auf. Als geeignete Alkohole kommen insbesondere Ethylenglykol (1,2-Ethandiol) und/oder Glycerin (1,2,3-Propantriol) in Betracht. Der Oligoester ist vorzugsweise aus einem mehrwertigen Alkohol und Hydroxycarbonsäuren, insbesondere Glykol- und/oder Milchsäure, gebildet. Bevorzugt ist mindestens eine Hydroxylgruppe des mehrwertigen Alkohols mit Hydroxycarbonsäureeinheiten, insbesondere mit Milch- und/oder Glykolsäureeinheiten, verestert. Im Falle eines zweiwertigen Alkohols ist es besonders bevorzugt, wenn beide Hydroxylgruppen in veresterter Form vorliegen. Die Hydroxylgruppen des mehrwertigen Alkohols sind vorzugsweise mit einer Kette aus 1 bis 10, insbesondere 2 bis 5, Hydroxycarbonsäureeinheiten verestert. Mit zunehmender Anzahl der Einheiten steigt die Viskosität des Oligoesters sowie des im Rahmen einer Reaktion mit dem Polysaccharid erhaltenen Polymersystems an. Die im Rahmen dieser Ausführungsform beschriebenen Oligoester aus mehrwertigem Alkohol und Hydroxycarbonsäureeinheiten tragen an der bzw. den terminalen Hydroxycarbonsäureeinheiten funktionelle Gruppen, welche die terminale Funktionalität des Oligoesters bilden und für die weitere Funktionalisierung zur Verfügung stehen. Zur endständigen Funktionalisierung der Oligoester werden diese mit Diisocyanaten umgesetzt. Die Oligoester sind bevorzugt terminal mit einer aliphatischen Isocyanatgruppe modifiziert. Die Verwendung von aliphatischen Diisocyanaten, insbesondere 1,6-Hexamethylendiisocyanat (HMDI), zur Funktionalisierung der Oligolactone ist besonders bevorzugt, da sich aus aromatischen Diisocyanaten cancerogene Diamine bilden können.
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Vorzugsweise ist der Oligoester mit terminalen Isocyanatgruppen mit OCN-(C3-C8-Alkylen)-NCO zweifach funktionalisierte 1,2-Ethylenglykol-bis(dimilchsäure) oder mit OCN-(C3-C8-Alkylen)-NCO dreifach funktionalisierte Glycerin-tri(dimilchsäure), wobei „funktionalisiert“ hier die Ausbildung jeweils einer bindenden Carbamatgruppe und die Beibehaltung jeweils einer endständigen Isocyanatgruppe pro OCN-(C3-C8-Alkylen)-NCO bedeutet. OCN-(C3-C8-Alkylen)-NCO stellt aliphatische Diisocyanate mit drei bis acht Methyleneinheiten dar, d.h. 1,3-Trimethylendiisocyanat bis 1,8-Octamethlyendiisocyanat. Besonders bevorzugt ist der Oligoester mit terminalen Isocyanatgruppen das Reaktionsprodukt aus 1,2-Ethylenglykol-bis(dimilchsäure) und 1,6-Hexamethylendiisocyanat (ELA-NCO).
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Es werden also insbesondere Probiotika in Alginatpartikeln verkapselt und diese mit ELA-NCO miteinander vernetzt. In den vernetzten Partikeln sind die Probiotika in der Regel über mindestens 14 Tage vital. Die zusätzliche Vernetzung untereinander mit Hilfe des Vernetzungsmittels, besonders bevorzugt mit ELA-NCO, mindert die Abbaugeschwindigkeit des Depots. Ohne Vernetzung ist beispielsweise im Mundraum davon auszugehen, dass der Abbau in weniger als 14 Tagen erfolgt. Durch die Vernetzung werden kovalente Bindungen zwischen den Alginatpartikeln geschaffen und eine Immobilisierung dieser im Verbund erreicht, sodass ein zu schnelles Ausschwemmen aus der Zahnfleischtasche verhindert wird. Ein weiterer Effekt der Reaktion mit ELA-NCO ist die experimentell beobachtete Verlangsamung der Freisetzung im Vergleich zu den freien Partikeln, sodass auch die angestrebte Verlängerung der Abbauzeit des Depots, insbesondere auf die Dauer von 2 Tagen bis 30 Tagen, erreicht werden kann. Durch die Vernetzung wird ferner der Einfluss der Partikelgröße verringert, da das Oberfläche-zu-Volumen-Verhältnis vereinheitlicht wird.
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Ein Volumenverhältnis zwischen Alginatpartikeln und Vernetzungsmittel liegt vorzugsweise im Bereich von 1 : 100 bis 1 : 1, insbesondere 1 : 50 bis 1:5.
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Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weisen die Alginatpartikel einen mittleren Durchmesser von 5 bis zu 2000 µm insbesondere von 5 bis 500 µm auf. Bedingt ist die Größe der Partikel durch den möglichen Einsatzort, in diesem Falle die Zahnfleischtasche.
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Unter einem Probiotikum wird vorliegend eine Zubereitung verstanden, die lebensfähige Mikroorganismen enthält. Die Zubereitung kann entweder aus einem einzigen Stamm einer Spezies oder aus Mischungen mehrerer Stämme oder Spezies bestehen. Vorzugsweise umfassen die verwendeten Spezies die probiotischen Milchsäurebakterien, wie Lactococcus lactis, Bifidobakterien (Bifidobacterium bifidum), Enterokokken (Enterococcus faecalis und Enterococcus faecium) sowie Hefen, insbesondere Saccharomyces boulardii und Saccharomyces cerevisiae.
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Die Alginatpartikel mit eingebetteten Probiotika können über unterschiedliche Verfahren hergestellt werden. Die meisten Verfahren zur Herstellung, wie als einfachstes Beispiel die Eintropftechnik, beruhen auf dem Austausch von Natrium- und Calciumionen bei Kontakt von Natriumalginattropfen mit einer Calciumchloridlösung. Hierbei bedingt die Tropfengröße die Partikelgröße. Die unterschiedlichen Verfahren zielen somit auf die Verkleinerung der Tropfen ab. Dies geschieht unteranderem durch Ultraschall, Elektrostatik, Sprayvernebelung oder in flüssigen Medien durch z.B. Emulsionsverfahren. Vielseitige Verfahren wurden bereits entwickelt und stehen zur Produktion unterschiedlichster Partikelgrößen zur Verfügung. Beispiele zur Herstellung von sphärischen Alginatpartikeln mit einem Partikeldurchmesser von 800 ± 100 µm sind U. Prüsse et al., Chem. Pap. (2008) 62: 364 zu entnehmen.
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Ein weiterer Aspekt der Erfindung liegt in der Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung des vorangehend beschrieben Depotsystems zur kontrollierten Freisetzung von Probiotika, insbesondere für dentale Anwendungen. Das Verfahren umfasst die Schritte:
- a) Bereitstellen von Alginatpartikeln, in die Probiotika eingebettet sind; und
- b) Vernetzen der Alginatpartikel mit einem Vernetzungsmittel.
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Weitere bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung.
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Figurenliste
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Die Erfindung wird nachfolgend anhand eines Ausführungsbeispiels und dazugehöriger Zeichnungen näher erläutert. Die Figuren zeigen:
- 1 eine schematische Darstellung des Aufbaus des erfindungsgemäßen Depotsystem mit in Alginatpartikeln eingebetteten Probiotika, wobei die Partikeln untereinander vernetzt sind; und
- 2 die Freisetzung von Lactococcus lactis aus ELA-NCO vernetzten und Lactococcus lactis-beladenen Alginatpartikeln mit unterschiedlichen Mischungsverhältnissen von Vernetzungsmittel und Alginatpartikel.
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Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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Der 1 ist in stark schematisierter der Aufbau eines erfindungsgemäßen Depotsystems 10 nach einer Ausführungsform der Erfindung zu entnehmen. Das Depotsystem umfasst eine Vielzahl Alginatpartikeln 12, in die Probiotika 14 eingebettet sind. Die Alginatpartikel 14 sind untereinander kovalent durch Umsetzung mit einem Vernetzungsmittel 16 verbunden. Nachfolgend wird in konkreten Ausführungsbeispielen das erfindungsgemäße Depotsystem 10 erläutert.
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Herstellung der Alginatpartikel mit eingebetteten Probiotika
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Die Einbettung der Probiotika erfolgt durch Einbringen von Bakterien in eine Natriumalginatlösung analog der Herstellung von sphärischen Alginatpartikeln mit einem Partikeldurchmesser von 800 ± 100 µm, wie sie in U. Prüsse et al., Chem. Pap. (2008) 62: 364 beschrieben ist. Nach der im Zuge des Verfahrens stattfindenden Abbindereaktion liegen die Bakterien immobilisiert im Innern der Alginat-Partikel vor. Es wurde eine 2 %ige Natriumalginatlösung mit 107 KBE/ml Bakteriensuspension von L. lactis angesetzt und es wurden über entsprechende Eintropftechnik in eine 3 % ige CaCl2-Lösung sphärische Partikel mit einer Größe von etwa 2 mm Durchmesser hergestellt. Die Größenbestimmung der Partikel erfolgte geometrisch mit einem Maßstab.
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Beispiel 1 - Vernetzen der Alginatpartikel mit ELA-NCO
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Zur Vernetzung einer ELA-NCO-Matrix mit den Alginat-Partikeln wurde zunächst ELA-NCO mit 2 %igem Alginat manuell in einer Mikrotiter-Platte homogen vermischt. Dafür wurde ein Endvolumen von 200 µl gewählt, sodass 20 µl ELA-NCO mit 180 µl 2 %igem Alginat miteinander verbunden wurden. Im Anschluss daran wurden die Alginat-L. lactis-Partikel (siehe oben) mit der ELA-NCO-Alginat-Matrix vermengt. Für die Freisetzungskinetik wurden jeweils drei Alginat-L. lactis-Partikel der ELA-NCO-Alginat-Matrix hinzugefügt. Nachfolgend wurde die ELA-NCO-Alginat-Matrix mit den eingebetteten Alginat-L. lactis-Partikel bei 37 °C für 30 min polymerisiert. Anschließend erfolgte eine Kultivierung der polymerisierten Matrix-Partikel-Mischung in künstlichem Speichel bei 37 °C und 5 % CO2-Atmosphäre unter statischen Bedingungen über einen Zeitraum von 8 Tagen. Alle 24 h wurde die Lebendkeimzahl (KBE/ml) mittels serieller Verdünnungsreihe in 1x PBS bestimmt.
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Beispiel 2 - Vernetzen der Alginatpartikel mit ELA-NCO
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Die Vernetzung erfolgte analog zur Vorschrift gemäß Beispiel 1, wobei ein Mischungsverhältnis von ELA-NCO zu den Alginatpartikeln mit eingebetteter Probiotika 1:20 betrug.
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Beispiel 3 - Vernetzen der Alginatpartikel mit ELA-NCO
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Die Vernetzung erfolgte analog zur Vorschrift gemäß Beispiel 1, wobei ein Mischungsverhältnis von ELA-NCO zu den Alginatpartikeln mit eingebetteter Probiotika 1:40 betrug.
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Freisetzungsversuche
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Alginat
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Der 2 sind die Ergebnisse von Freisetzungsversuchen von Lactococcus lactis aus den ELA-NCO vernetzten und Lactococcus lactis-beladenen Alginatpartikeln der Beispiele 1 - 3 zu entnehmen. Dazu wurden jeweils 3 Alginat-L. lactis-Partikel in die entsprechende Mischung aus ELA-NCO und Alginat gegeben, für 30 min bei 37 °C polymerisiert und anschließend bei 37 °C und 5 % CO2-Atmosphäre unter statischen Bedingungen in künstlichem Speichel kultiviert.
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Der Kunstspeichel (nach Pratten et al. 1998, J Antimicrob Chemother 42(4): 453-459; pH=6,7) hatte die folgende Zusammensetzung: 0,1 % [w/v] Lab Lemco Powder (Oxoid™ Lab-Lemco Rindfleischextraktpuder; ThermoFisher), 0,5 % [w/v] Proteose Pepton Nr. 3 (BD Bacto™ Proteose Peptone No. 3, BD Biosciences; VWR), 0,2 % [w/v] Hefeextrakt (Oxoid™ Hefeextrakt-Pulver, ThermoFisher), 6 mM NaCI, 2,7 mM KCI, 1,5 mM K2HPO4, 3,5 mM KH2PO4.
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Im Abstand von jeweils 24 h wurden Proben entnommen und die kumulierte Freisetzungsmenge an Lactococcus lactis im Kunstspeichel bestimmt (auf kulturellem Weg durch Bestimmung der koloniebildenden Einheiten nach serieller Verdünnung). Die Verläufe zeigen eine Verzögerung der Freisetzung von L. lactis durch die Vernetzung mit der ELA-NCO-Alginat-Matrix. Als Vergleich diente eine 2 %ige nicht polymerisierte Alginat-Matrix (Ctrl Alginat).
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- WO 2011/001425 A1 [0002]
- US 8540980 B2 [0003]
- EP 1984032 B1 [0005]
- US 8460703 B2 [0005]
- DE 102012111808 A1 [0005]
- US 8496971 B2 [0005]
- EP 0650373 B1 [0005]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- U. Prüsse et al., Chem. Pap. (2008) 62: 364 [0024]
- Pratten et al. 1998, J Antimicrob Chemother 42(4): 453-459 [0029]
