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Die Erfindung betrifft einen Manipulationsbehälter für die Kryo-Mikroskopie mit zumindest einem Halter für eine Probenträgerfassung und zumindest einer Manipulationsöffnung zur Manipulation von Probenträgern bzw. Probenträgerfassungen.
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Die Kryofixierung ist ein in der Elektronenmikroskopie häufig eingesetztes Probenpräparationsverfahren. Dabei wird eine wasserhaltige Probe sehr rasch auf eine Temperatur von unter –150°C eingefroren (kryofixiert), d.h. sie wird zur Vermeidung der Bildung von Eiskristallen sehr schnell abgekühlt. Die Kryofixierung hat sich als besonders geeignet für strukturbiologische Untersuchungen erwiesen. Die zu untersuchenden Objekte, beispielsweise Zellen, Enzyme, Viren oder Lipidschichten, werden dadurch in einer dünnen, vitrifizierten Eisschicht eingebettet. Der große Vorteil der Kryofixierung liegt darin, dass die biologischen Strukturen in ihrem nativen Zustand erhalten werden können. Unter anderem kann ein biologischer Vorgang zu einem beliebigen Zeitpunkt durch Kryofixierung angehalten und in diesem vitrifizierten Zustand untersucht werden, z.B. im Kryo-Elektronenmikroskop aber auch in einem Lichtmikroskop mit entsprechender Probenkühlung, wobei die Kryo-Lichtmikroskopie vor allem zum Auffinden von relevanten Bereichen in der Probe dient, welche Bereiche vorgemerkt und anschließend in einem Kryo-Elektronenmikroskop genauer betrachtet werden.
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Die gefrorenen Proben, die sich in aller Regel auf einem an sich bekannten elektronenmikroskopischen Probenträger, wie beispielsweise einem Netzchen/Grid oder einem Stift für die Rasterelektronenmikroskopie befinden, müssen unter den genannten tiefkalten Bedingungen und unter Ausschluss von Wasser in entsprechende Probenträgerfassungen verbracht werden, welche in der Folge in passende Halterungen in den genannten Mikroskopen verbracht werden können. Eine typische Probenträgerfassung für die Verwendung im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist beispielsweise aus dem Dokument
US 8,395,130 B2 bekannt geworden, bei welcher ein Netzchen, welches als Probenträger die tiefkalte Probe trägt, mit Klammerelementen in einer entsprechenden Fassung fixiert werden kann.
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Hierzu wurde bisher auf eher improvisierte Lösungen zurückgegriffen, bei denen flüssiger Stickstoff beispielsweise in einem Styroporbehälter vorgehalten wurde, in welchem Behälter die erforderlichen Manipulationsschritte zum Verbringen des Netzchens in die Probenträgerfassungen erfolgten. Durch die Bildung von tiefkaltem Stickstoffgas aus dem flüssigen Stickstoff wurde zum einen die nötige niedrige Temperatur sichergestellt und zum anderen eine wasserfreie Atmosphäre in dem Styroporbehälter geschaffen, so dass die Kontamination der Proben mit Wasser und in der Folge mit Eiskristallen verhindert werden konnte.
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Um die Qualität der gefrorenen Proben nicht zu beeinträchtigen, ist es von großer Bedeutung, dass sie gekühlt und kontaminationsfrei zwischen den zum Einsatz kommenden Bearbeitungsgeräten, wie z.B. Kryofixiereinrichtung, Gefrierbruchvorrichtung, Beschichtungsvorrichtung bzw. Analysegeräten und hier vor allem Kryo-Lichtmikroskop und Kryoelektronenmikroskop, transferiert werden. Auch hierfür wurde bisher im Laboralltag eher auf improvisierte Lösungen zurückgegriffen oder Lade- und Transfersysteme im Eigenbau spezifisch angefertigt.
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Ein Vakuumkryotransfersystem stellt beispielsweise das System „Leica EM VCT100“ des Herstellers Leica Microsystems dar, mit dem eine Probenträgerfassung aus einem mit flüssigen Stickstoff gekühlten Manipulationsbehälter entnommen und in die ebenfalls mit flüssigem Stickstoff gekühlte Beobachtungskammer eines Elektronenmikroskops verbracht werden kann. Dieses System ist jedoch relativ aufwändig, da es sich um ein Vakuumsystem handelt und dieses lediglich einen beschränkten Manipulationsspielraum bietet und eine relativ komplexe Handhabung der entsprechenden Proben im Manipulationsbehälter mit sich bringt, wobei jedoch für die Kryo-Lichtmikroskopie eine relativ einfache Handhabung des Manipulationsbehälters erforderlich ist, bei dem lediglich eine einfache Kühlung und Wasserverdrängung durch flüssigen Stickstoff, der in den Manipulationsbehälter gefüllt wird, wünschenswert ist, um vor allem die flexible Anbindung eines solchen Manipulationsbehälters an verschiedene Analyse- und insbesondere Mikroskopsysteme zu ermöglichen.
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Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zu Grunde, einen Manipulationsbehälter der eingangs genannten Art dahingehend weiterzubilden, dass ein standardisiertes und bequemes Manipulieren von Probenträgern und Probenträgerfassungen und insbesondere das Verbringen von Probenträgern in wie oben beschriebene Probenträgerfassungen unter kalten und wasserfreien Bedingungen möglich wird und aus demselben Manipulationsbehälter das Verschieben der Probenträgerfassungen mit dem Probenträger beispielsweise in ein Kryo-Lichtmikroskop erfolgen kann, ohne den relativ hohen apparativen Aufwand eines Vakuumkryotransfersystems betreiben zu müssen.
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Zur Lösung dieser Aufgabe ist ein Manipulationsbehälter der eingangs genannten Art erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet, dass der Halter für eine Probenträgerfassung in einen den Manipulationsbehälter vollständig durchsetzenden Verschiebeweg einer Verschiebevorrichtung für die Probenträgerfassung bringbar ist. Die vorliegende Erfindung stellt somit einen Manipulationsbehälter zur Verfügung, der für die Zwecke der KryoLichtmikroskopie zur teilweisen Befüllung mit flüssigem Stickstoff geeignet ist und bei dem ein Halter für eine Probenträgerfassung, beispielsweise wie sie aus der
US 8,395,130 B2 bekannt ist, im Manipulationsbehälter angeordnet ist. Der Manipulationsbehälter umfasst erfindungsgemäß weiters eine Verschiebevorrichtung mit einem Verschiebeweg, der den Manipulationsbehälter vollständig durchsetzt, so dass die am Manipulationsbehälter angebrachte Verschiebevorrichtung in das Innere des Behälters geschoben werden kann, um dort die Probenträgerfassung, die mittels des Halters in den Verschiebeweg der Verschiebevorrichtung bringbar ist, aufzunehmen und weiter aus dem Manipulationsbehälter herauszuführen, so dass eine Probenträgerfassung in einem Arbeitsschritt aus dem Manipulationsbehälter in einen Probentisch eines Kryo-Lichtmikroskops verbracht werden kann, wenn der Manipulationsbehälter mittels der Verschiebevorrichtung geeignet an einem Kryo-Lichtmikroskop bzw. an dessen Probentisch angebracht bzw. mit diesem verbunden ist.
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Die Funktionalitiät, dass der Halter in den Verschiebeweg einer Verschiebevorrichtung bringbar ist, kann auf jegliche Weise realisiert sein. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es jedoch vorgesehen, dass der Halter für eine Probenträgerfassung entlang einer den Verschiebeweg der Verschiebevorrichtung querenden Schiene verschiebbar ist. Wenn, wie bei dieser bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung der Halter für eine Probenträgerfassung entlang einer Schiene verschiebbar ist, ist der Halter stets fest geführt, was es dem Anwender gestattet, den Halter ohne besonderes manuelles Geschick und vor allem unter Verwendung von einfachen Werkzeugen wie Metallstiften und dergleichen aus einer Manipulationsposition im Behälter in den Verschiebeweg der Verschiebevorrichtung zu bringen. Die Schiene kann hierbei jedes nur erdenkliche Profil aufweisen, wobei es jedoch für den Fachmann selbstverständlich ist, dass das Profil der Schiene eine der Form des Halters für eine Probenträgerfassung entsprechende Form aufweist, um den Halter sicher zu führen und eine gute Verschiebbarkeit des Halters in der Schiene zu gewährleisten.
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Um die Handhabung der Proben bzw. der Probenträger und Probenträgerfassungen im erfindungsgemäßen Manipulationsbehälter weiter zu vereinfachen, ist es gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung vorgesehen, dass entlang der Schiene zumindest eine Ruheposition für den Halter für eine Probenträgerfassung im Verschiebeweg der Verschiebevorrichtung definiert ist und zumindest eine weitere Ruheposition für den Halter für eine Probenträgerfassung definiert ist, in der der Halter plan an einer Ablage für eine Probenträgerfassung anliegt, sodass eine Probenträgerfassung von der Ablage auf den Halter für eine Probenträgerfassung verschoben werden kann. Gemäß dieser bevorzugten Variante werden somit zumindest zwei bevorzugte Ruhepositionen für den Halter bereitgestellt, in der im einen Fall der Halter eine definierte Lage einnimmt, in der der Halter im Verschiebeweg der Verschieberichtung positioniert ist, um die Probenträgerfassung nach der Manipulation zu ergreifen und in der Folge zu verschieben und, im anderen Fall, der Halter plan an einer Ablage für eine Probenträgerfassung anliegt, d.h. der Halter nahtlos an der Ablage anliegt, um das einfache Verschieben der Probenträgerfassung von der Ablage, auf der der Probenträger bzw. die Probenträgerfassung manipuliert werden, auf den Halter für die Probenträgerfassung zu gestatten.
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Die besagten Ruhepositionen für den Halter für die Probenträgerfassung können durch Anschläge, Rastelemente oder Ähnliches definiert sein. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es jedoch vorgesehen, dass die Ruhepositionen durch die Wirkung von Magnetkraft definiert sind. In diesem bevorzugten Fall sind entsprechende Magnetelemente in den Halter und in unter den Halter angeordnete Teile des erfindungsgemäßen Manipulationsbehälters, wie z.B. in die Schiene integriert, so dass sich an den gewünschten Ruhepositionen eine magnetische Anziehungskraft zwischen den Magnetelementen und dem Halter für eine Probenträgerfassung ergibt, während zwischen diesen Ruhepositionen keine Magnetwirkung oder eine magnetische Abstoßung hergestellt wird, so dass der Halter für eine Probenträgerfassung bevorzugt die Ruheposition einnimmt und in dem Fall das eine entgegengesetzte Magnetwirkung zwischen den gewünschten Ruhepositionen hergestellt wird, nur die Ruhepositionen konstant eingenommen werden können.
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Der Halter für eine Probenträgerfassung, der beim erfindungsgemäßen Manipulationsbehälter zum Einsatz kommt, dient dazu, die Probenträgerfassung für das Einsetzen des Probenträgers festzuhalten und nach dem Einsetzen des Probenträgers die Probenträgerfassung zusammen mit dem Probenträger in den Verschiebeweg der Verschiebevorrichtung zu bringen und dort festzuhalten. Zu diesem Zweck ist es bevorzugt vorgesehen, dass der Halter für eine Probenträgerfassung zumindest zwei voneinander unabhängige Klammerelemente zum kraftschlüssigen Halten der Probenträgerfassung aufweist. Durch das Vorsehen von Klammerelementen kann eine Probenträgerfassung einfach auf den Halter unter die Klammerelemente geschoben werden und es sind keine weiteren Elemente zu betätigen, um die Probenträgerfassung auf dem Halter ausreichend festzulegen.
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Um das Einschieben eines Probenträgers in eine Probenträgerfassung, beispielsweise wie in Dokument
US 8,395,130 B2 , zu erleichtern, ist die Erfindung bevorzugt dahingehend weitergebildet, dass der Halter für eine Probenträgerfassung einen zumindest bis in die Wirkebene der Klammerelemente ragenden federbelasteten Stempel zum Betätigen der Probenträgerfassung aufweist. Beim Einsetzen der Probenträgerfassung in den Halter bzw. beim Einschieben der Probenträgerfassung in den Halter kann ein solcher federbelasteter Stempel in einer zurückgezogenen Position gehalten und in der Folge freigegeben werden, sodass der Stempel gegen die Klemmwirkung der Klammerelemente gegen entsprechende Bereiche der Probenträgerfassung drückt, um entsprechende Klammerelemente an der Probenträgerfassung in eine Position zu drücken, in der ein Probenträger eingesetzt werden kann.
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Bevorzugt umfasst die Verschiebevorrichtung eine durch ein erstes aussen am Manipulationsbehälter angesetztes Rohr in den Innenraum des Manipulationsbehälters geführte Hohlwelle, in welcher eine Schubstange zur Betätigung eines Greifers für die Probe geführt ist, wodurch die Probenträgerfassung aus dem Halter für eine Probenträgerfassung entnommen werden kann, wenn der Halter im Verschiebeweg der Verschiebevorrichtung ruht, woraufhin die Verschiebevorrichtung zurückgezogen und die Probenträgerfassung aus dem Halter herausgezogen werden kann. Hierauf kann der Halter für eine Probenträgerfassung aus dem Verschiebeweg der Verschiebevorrichtung wegbewegt werden und die Verschiebevorrichtung durch den Manipulationsbehälter hinaus und bevorzugt in einen Probentisch eines Kryo-Lichtmikroskops verschoben werden.
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Um den Manipulationsbehälter und insbesondere dessen durch die Verschiebevorrichtung bereitgestellte Funktionalität bestmöglich nutzen zu können, ist die Erfindung bevorzugt dahingehend weitergebildet, dass die Verschiebevorrichtung durch ein zweites, dem ersten Rohr gegenüberliegendes, aussen am Manipulationsbehälter angesetztes Rohr aus dem Manipulationsbehälter führbar ist. Dadurch, dass ein zweites Rohr dem ersten Rohr gegenüberliegend am Manipulationsbehälter angesetzt ist, durch welches die Verschiebevorrichtung geführt werden kann, kann eine Probe mit der Verschiebevorrichtung in besagter kalter und trockener Stickstoffatmosphäre aus dem Manipulationsbehälter herausgeführt und an ein nachfolgendes Gerät in aller Regel ein Kryo-Lichtmikroskop herangeführt bzw. übergeben werden, ohne den Behälter mit den teilweise relativ groß bauenden Teilen besagter Geräte in Berührung bringen zu müssen bzw. mit diesen Teilen zu kollidieren.
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In diesem Zusammenhang ist es insbesondere bevorzugt, wenn das zweite Rohr Anschlussmittel zum Anschließen des Rohrs an einem Mikroskoptisch aufweist. Auf diese Weise kann ein ausreichend dichtender Verschluss zwischen dem Manipulationsbehälter und einem Mikroskoptisch hergestellt werden, so dass Zutritt von feuchter Luft zur Probe bei der Manipulation und beim Transferieren der Probenträger bzw. der Probenträgerfassungen wirksam vermieden werden kann.
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Um jedoch auch dann den Zutritt von feuchter Luft zur Probe im Manipulationsbehälter zu verhindern, wenn der der Manipulationsbehälter mit dem zweiten Rohr nicht an einem Mikroskoptisch angeschlossen ist, ist die Erfindung bevorzugt dahingehend weitergebildet, dass das zweite Rohr mittels einer Verschlusseinrichtung verschließbar ist. Eine solche Verschlusseinrichtung kann ein Deckel, ein Schieber oder ein das zweite Rohr durchsetzender, drehbarer Bolzen mit einer Bohrung sein.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist zur weiteren Sicherstellung einer wasserfreien Atmosphäre im Manipulationsbehälter der Manipulationsbehälter von einer transparenten Abdeckung bedeckt, die von Distanzstiften am Manipulationsbehälter gehalten ist. Eine derart von Manipulationsbehälter beabstandete Abdeckung begrenzt die Menge flüssigen Stickstoffs bzw. des aus diesem gebildeten kalten Stickstoffgases, die benötigt wird, um Feuchtigkeit aus der Umgebung wirkungsvoll aus dem Inneren des Manipulationsbehälters zu verdrängen, wobei gleichzeitig zumindest geringfügige Manipulationsmöglichkeiten durch den Spalt zwischen der Abdeckung und dem Manipulationsbehälter gegeben sind. Für aufwändigere Manipulationen kann die Abdeckung klarerweise vollständig abgenommen werden.
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Die Erfindung wird nachfolgend anhand eines in der Zeichnung schematisch dargestellten Ausführungsbeispiels näher erläutert. In dieser zeigen
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1 eine perspektivische Gesamtansicht des erfindungsgemäßen Manipulationsbehälters;
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2 eine perspektivische Detailansicht des erfindungsgemäßen Manipulationsbehälters teilweise im Schnitt;
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3a und 3b eine perspektivische Detailansicht des Halters für eine Probenträgerfassung ohne und mit einer eingesetzten Probenträgerfassung;
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4 eine Ansicht entsprechend jener von 2, bei welcher der Halter für eine Probenträgerfassung in den Verschiebeweg der Verschiebevorrichtung gebracht ist; und
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5 eine weitere Darstellung entsprechend der 2, bei der eine Probenträgerfassung mit Hilfe eines Greifers aus dem Halter für eine Probenträgerfassung entnommen und der Halter für die Probenträgerfassung aus dem Verschiebeweg der Verschiebevorrichtung gebracht wurde.
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In 1 ist ein erfindungsgemäßer Manipulationsbehälter mit 1 bezeichnet. Der Manipulationsbehälter weist eine Manipulationsöffnung 2 zur Manipulation von Probenträgern bzw. Probenträgerfassungen auf und verfügt weiters über eine Verschiebevorrichtung 3, deren Verschiebeweg 11 den Manipulationsbehälter 1 vollständig durchsetzt. Mit 4 ist eine transparente Abdeckung bezeichnet, die mit Hilfe von Distanzstiften 5 am Manipulationsbehälter gehalten ist.
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In der größeren Darstellung gemäß 2 ist zu erkennen, dass der Manipulationsbehälter 1, bei welchem in dieser Darstellung die Abdeckung 4 nicht dargestellt ist, in seiner Manipulationsöffnung 2 bzw. dem entsprechenden Manipulationsraum 6 über eine Reihe von Einbauten verfügt, die die Manipulation von Proben bzw. der Probenträgerfassungen ermöglichen bzw. vereinfachen. Es ist zu erkennen, dass eine Probenträgerfassung 7 auf einer entsprechenden Ablage 8 abgelegt werden kann, an der ein Halter 9 für eine Probenträgerfassung 7 plan anliegt, so dass eine Probenträgerfassung 7 von der Ablage 8 auf den Halter 9 für eine Probenträgerfassung 7 verschoben werden kann. Der Halter 9 ist entlang einer Schiene 10 verschiebbar, welche den Verschiebeweg 11 der Verschiebevorrichtung 3 quert. Der Manipulationsbehälter 1 ist durch eine entsprechende Isolierung 12 zur Aufnahme von flüssigem Stickstoff ausgebildet.
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In 3a ist zu erkennen, dass der Halter 9 für eine Probenträgerfassung über zwei voneinander unabhängige Klammerelemente 13 verfügt, mit deren Hilfe eine Probenträgerfassung 7 kraftschlüssig festgehalten werden kann. Der Halter 9 weist weiters einen federbelasteten Stempel 14 auf, der in die Wirkebene der Klammerelemente ragt und speziell ausgebildete Betätigungselemente 15 zum Betätigen einer Probenträgerfassung aufweist. Mit Hilfe des Hebels 16 kann der federbelastete Stempel 14 gegen die Wirkung der nicht dargestellten Feder in Richtung des Pfeils 17 gedrückt werden und in der Führung 18 in dieser zurückgezogenen Position festgelegt werden. In der zurückgezogenen Position des Stempels 14 kann nun eine Probenträgerfassung 7 auf den Halter 9 verschoben werden, wobei die Klammerelemente 13 die Probenträgerfassung 7 am Halter 9 festhalten, wie dies in 3b gezeigt ist. In der 3b ist der federbelastete Stempel 14 ebenfalls in der vorgeschobenen Position dargestellt, wobei erkennbar ist, dass die Betätigungselemente 15 entsprechende Klammerelemente 19 an der Probenträgerfassung 7 aufbiegen, so dass ein Netzchen oder Grid in die Probenträgerfassung eingeschoben werden kann.
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In 4 ist zu erkennen, dass die Verschiebevorrichtung 3 ein erstes Rohr 20 aufweist, weches aussen am Manipulationsbehälter 1 angesetzt ist, und dass ein zweites Rohr 21 vorgesehen ist, welches dem ersten Rohr 20 gegenüberliegend und ebenfalls aussen am Manipulationsbehälter 1 angesetzt ist. Die Verschiebevorrichtung 3 umfasst weiters eine Hohlwelle, die auch in 1 zu erkennen und mit dem Bezugszeichen 22 versehen ist und die durch das erste Rohr 20 geführt ist und die auch weiter durch das zweite Rohr 21 geführt werden kann, wobei in der Hohlwelle 22, von der in 4 nur mehr das Endstück zu erkennen ist, eine Schubstange geführt ist, die zur Betätigung eines Greifers 23 für die Probe bzw. die Probenträgerfassung 7 dient. Im Gegensatz zur 2 ist in 4 zu erkennen, dass der Halter 9 entlang der Schiene 10 in den Verschiebeweg der Verschiebevorrichtung 11 gebracht wurde, so dass die Probenträgerfassung 7 mit dem Greifer 23 aus dem Halter 9 bzw. aus dessen Klemmelementen 10 entnommen werden kann. Durch einen Anschlag 24 ist eine Ruheposition definiert, in der der Halter 9 plan an der Ablage 8 für die Probenträgerfassung 7 anliegt, wie dies auch in 2 zu erkennen ist. Mit 25 ist eine Verschlusseinrichtung bezeichnet, mit der das zweite Rohr 21 verschlossen werden kann, um den übermäßigen Austritt von Stickstoff bzw. den Zutritt von feuchter Luft in das Innere des Manipulationsbehälters 1 zu verhindern, wenn der Manipulationsbehälter 1 nicht beispielsweise an ein Kryo-Lichtmikroskop angeschlossen ist.
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In 5 ist nun ein Zustand dargestellt, in dem der Greifer 23 eine Probenträgerfassung 7 ergriffen hat, der Halter 9 aus dem Verschiebeweg 11 der Verschiebeeinrichtung 3 gebracht wurde, so dass in einem nachfolgenden Schritt der Greifer 23 mittels der Hohlwelle 22 durch das zweite Rohr 21 in Richtung des Pfeils 26 aus dem Manipulationsbehälter 1 geschoben werden kann, sodass die Probenträgerfassung 7 beispielsweise in einem Probentisch eines Lichtmikroskops abgelegt werden kann, sofern der Manipulationsbehälter 1 mittels nicht näher dargestellten Anschlussmitteln mit dem Rohr 21 an einen Probentisch angeschlossen ist. Mit 27 sind Ablagebuchten für Probenträger bzw. Probenträgerfassungen im Manipulationsbehälter 1 dargestellt. Weiters ist zu erkennen, dass die Ablage 8 die Schiene 10 und die Ablagebuchten 27 eine strukturelle Einheit bilden, die unter Vermittlung eines Zwischenteils 28 mit der Verschiebevorrichtung 3 des erfindungsgemäßen Manipulationsbehälters 1 verbunden ist.
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Bezugszeichenliste
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- 1
- Manipulationsbehälter
- 2
- Manipulationsöffnung
- 3
- Verschiebevorrichtung
- 4
- Abdeckung
- 5
- Distanzstifte
- 6
- Manipualtionsraum
- 7
- Probenträgerfassung
- 8
- Ablage
- 9
- Halter
- 10
- Schiene
- 11
- Verschiebeweg
- 12
- Isolierung
- 13
- Klammerelemente
- 14
- Stempel
- 15
- Betätigungselemente
- 16
- Hebel
- 17
- Pfeil
- 18
- Führung
- 19
- Klammerelemente
- 20
- erstes Rohr
- 21
- zweites Rohr
- 22
- Hohlwelle
- 23
- Greifer
- 24
- Anschlag
- 25
- Verschlusseinrichtung
- 26
- Pfeil
- 27
- Ablagebuchten
- 28
- Zwischenteil
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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- US 8395130 B2 [0003, 0008, 0013]
