DE102012218624A1

DE102012218624A1 - Konfokales Laser-Raster-Mikroskop mit einer gepulst angesteuerten Laserlichtquelle

Info

Publication number: DE102012218624A1
Application number: DE102012218624.7A
Authority: DE
Inventors: Bernd Widzgowski
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2012-09-07
Filing date: 2012-10-12
Publication date: 2014-03-13
Anticipated expiration: 2032-10-13
Also published as: JP6389462B2; US20150212306A1; US9575300B2; DE102012218624B4; WO2014037401A1; EP2893385A1; JP2015530616A

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein konfokales Laser-Raster-Mikroskop (100) mit einer Beleuchtungseinrichtung (1), welche eine Laserlichtquelle (41), die zum Beleuchten einer Probe (25) eingerichtet ist, und eine Ansteuerschaltung (40) für die Laserlichtquelle (1), die dazu eingerichtet ist, zur Versorgung der Laserlichtquelle (41) ein gepulstes Ansteuersignal (48) auszugeben, aufweist, wobei die Ansteuerschaltung (40) so eingerichtet ist, dass sie sowohl eine Pulsamplitude (A) als auch eine Pulsbreite (W) wenigstens eines Pulses des gepulsten Ansteuersignals (48) in Abhängigkeit von wenigstens einer Eingangsgröße (S) bestimmt.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein konfokales Laser-Raster-Mikroskop mit einer Laserlichtquelle sowie ein Verfahren zum Einstellen der Intensität einer Laserlichtquelle in einem konfokalen Laser-Raster-Mikroskop.
Stand der Technik
Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der konfokalen Laser-Raster-Mikroskopie (engl. CLSM: "confocal laser scanning microscopy"), wie beispielsweise in der US 7,477,449 B2 beschrieben. Zur Bilderzeugung wird hier eine Stelle auf der zu beobachtenden Probe mit einem fokussierten Laserstrahl beleuchtet und das von dort ausgehende reflektierte oder Fluoreszenzlicht wird von einem ebenfalls auf diese Stelle fokussierten Sensor erfasst, wodurch eine hohe Auflösung erzielt werden kann.
Maßgeblichen Einfluss auf die Bildqualität hat der verwendete Laser. Insbesondere soll dessen Intensität möglichst exakt regelbar sein und dabei einen großen Intensitätsbereich abdecken, so dass er auch für möglichst viele unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe bzw. Fluorochrome eingesetzt werden kann. Eine Modulationsfrequenz bis in den Frequenzbereich von einem MHz hinein wird angestrebt. Weiterhin sollte die minimal einstellbare Intensität möglichst nahe bei Null liegen. Bei den Ein- und Ausschaltvorgängen sollten möglichst keine Über- oder Unterschwinger der abgegebenen Leistung auftreten.
Es ist daher wünschenswert, die Intensitätsregelung der Laserlichtquelle eines konfokalen Laser-Raster-Mikroskops zu verbessern.
Offenbarung der Erfindung
Erfindungsgemäß werden ein konfokales Laser-Raster-Mikroskop sowie ein Verfahren zur Regelung der Lichtintensität einer Laserlichtquelle in einem konfokalen Laser-Raster-Mikroskop mit den Merkmalen der unabhängigen Patentansprüche vorgeschlagen. Vorteilhafte Ausführungsformen sind Gegenstand der Unteransprüche sowie der nachfolgenden Beschreibung.
Vorteile der Erfindung
Im Rahmen der Erfindung wird ein konfokales Laser-Raster-Mikroskop mit einer gepulst angesteuerten Laserlichtquelle, vorzugsweise einer Laserdiode, ausgerüstet. Die gepulste Ansteuerung bietet mehrere Freiheitsgrade, wovon im Rahmen der Erfindung zumindest eine Pulsamplitude und eine Pulsbreite genutzt werden. Die Erfindung verbessert die Regelungsgüte und die -dynamik und vergrößert den zur Verfügung stehenden Helligkeitsbereich, insbesondere hin zu kleinen Lichtintensitäten, sowie die Wellenlängenstabilität.
Die Erfindung bietet insbesondere gegenüber einer kontinuierlichen Ansteuerung besondere Vorteile. Eine Modulationsfrequenz bis in den Frequenzbereich von einem MHz hinein oder höher wird ermöglicht. Weiterhin liegt die minimal einstellbare Intensität nahe bei Null. Bei den Ein- und Ausschaltvorgängen treten kaum Über- oder Unterschwinger der abgegebenen Leistung auf. Weiterhin wird das Signal/Rausch-Verhältnis insbesondere für geringe Intensitäten verbessert.
Die Verwendung von zwei Freiheitsgraden ermöglicht eine besonders gute Anpassung an die jeweilige Probe, z.B. an ein jeweils eingesetztes Fluorchrom oder an einen zulässigen Wärmeeintrag.
Die Erfindung ermöglicht ein breites Spektrum für die Ansteuerung. Die auf die Probe ausgestrahlte Lichtmenge ist das Integral der Intensität über die Zeitdauer der Bestrahlung. Die Ansteuerschaltung ist so eingerichtet, dass die Laserlichtquelle mit einem Ansteuersignal einstellbarer Intensität und Zeitdauer versorgt wird. Die Zeitdauer des Stromes ist bis unter 100 ps einstellbar. Eine maximale Zeitdauer ist bis zum Dauerbetrieb hin möglich. Die Zeitdauer des Stromimpulses kann variabel und vorzugsweise auch extern im Wesentlichen kontinuierlich (bzw. in kleinsten digitalen Stellschritten) eingestellt werden. Weiterhin ist es möglich, die Pulsamplitude einzustellen. Vorzugsweise wird ein unterer Amplitudenschwellwert (sog. Laserschwelle bzw. Schwellenstromstärke) vorgegeben, unter dem ein sicheres Aussenden von Laserlicht nicht garantiert ist. Die Ansteuerschaltung ist vorzugsweise so eingerichtet, dass dieser nicht unterschritten wird.
Für eine weitere Reduktion der abgegebenen Lichtleistung an der Laserschwelle steht das Tastverhältnis bzw. die Pulsbreite als Freiheitsgrad zur Verfügung.
Im Rahmen der Erfindung kann ein zumindest zweidimensionales Kennfeld aus Pulsamplitude und Pulsbreite aufgespannt werden, wobei jedes Wertepaar eine mittlere Lichtintensität bzw. Lichtmenge charakterisiert. Zu jeder gewünschten Lichtintensität oder Lichtmenge kann also wenigstens ein Vektor bzw. Wertepaar aus Pulsamplitude und Pulsbreite gefunden werden. Meist werden in dem Kennfeld jedoch mehrere geeignet Wertepaare vorhanden sein, so dass auch weitere Randbedingungen, wie z.B. ein Intensitätsrauschen, eine bestimmte Leitungsaufnahme des Systems, eine maximale Effizienz der Anregung, ein minimales Ausbleichen der Probe, eine besondere Eignung für einen bestimmten Fluoreszenzfarbstoff usw., berücksichtigt werden können.
Besonders vorteilhaft wird auch die Erfassung von Messlicht an den zeitlichen Verlauf (Pulsbreite und/oder Frequenz) des Ansteuersignals angepasst. Vorzugsweise weist die Ansteuerschaltung deshalb einen Eingang und/oder Ausgang (bspw. TTL oder Schaltkontakt) für eine Pulsfrequenz des Ansteuersignals auf. Dadurch kann die Pulsfrequenz von extern vorgegeben werden, beispielsweise von einer Messeinrichtung, oder die Pulsfrequenz kann nach extern vorgegeben werden, beispielsweise an die Messeinrichtung. In beiden Fällen wird eine Abstimmung einer Anregungsfrequenz mit einer Erfassungs- bzw. Abtastfrequenz möglich, wodurch insbesondere Moiré-Artefakte in der Erfassung vermieden werden können.
Weitere Vorteile und Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung und der beiliegenden Zeichnung.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die Erfindung ist anhand eines Ausführungsbeispieles in der Zeichnung schematisch dargestellt und wird im Folgenden unter Bezugnahme auf die Zeichnung ausführlich beschrieben.
Figurenbeschreibung
1 zeigt schematisch einen Strahlengang in einem konfokalen Laser-Raster-Mikroskop gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung.
2 zeigt schematisch eine bevorzugte Ausführungsform einer Beleuchtungseinrichtung eines erfindungsgemäßen konfokalen Laser-Raster-Mikroskops.
Detaillierte Beschreibung der Zeichnung
Die 1 und 2 werden gemeinsam beschrieben, wobei in 1 eine bevorzugte Ausführungsform eines erfindungsgemäßen konfokalen Laser-Raster-Mikroskops schematisch dargestellt und insgesamt mit 100 bezeichnet ist und in 2 schaltplanartig die im Rahmen der Erfindung bevorzugte Beleuchtungseinrichtung 1 detaillierter dargestellt ist.
Das Mikroskop weist eine mit 1 bezeichnete Beleuchtungseinrichtung auf, die eine als Laserdiode ausgebildete Laserlichtquelle 41 aufweist. Die Laserlichtquelle 41 emittiert einen Beleuchtungslichtstrahl 5, der einen Strahlteiler 21 und ein Objektiv 23 passiert und auf eine Probe 25 trifft.
Von der Probe reflektiertes oder durch Fluoreszenz erzeugtes Messlicht 27 tritt durch das Objektiv 23 ein und wird am Strahlteiler 21 in einen Beobachtungsstrahlengang ausgekoppelt und einem Detektor 51 zugeführt.
In der Beleuchtungseinrichtung 1 ist weiterhin eine Ansteuerschaltung 40 vorgesehen, welche die Laserdiode 41 mit Strom versorgt. Die Ansteuerschaltung 40 ist dazu eingerichtet, eine Soll-Lichtmenge als Sollwert zu empfangen und zu verarbeiten. Der Sollwert wird im vorliegenden Beispiel von einer Recheneinheit 39 geliefert wird, welche zur Steuerung des Mikroskops 100 eingerichtet ist. Weiterhin werden Messdaten von dem Detektor 51 an die Recheneinheit 39 übertragen und dort ausgewertet. Die Recheneinheit 39 steuert dabei auch den Detektor 51 an.
Die Ansteuerschaltung 40 weist mehrere funktionelle Einheiten auf, welche im Folgenden erläutert werden. Ein Schaltungsteil 44 ist als Steuerschaltungsteil, z.B. ASIC oder FPGA, ausgebildet und zur Steuerung der Ansteuerschaltung 40 der ausgebildet und eingerichtet. Der Steuerschaltungsteil 44 weist einen Eingang für eine Eingangsgröße S sowie einen Anschluss E/A für ein Frequenzsignal auf, die in der gezeigten Ausführungsform mit der Recheneinheit 39 verbunden sind. An dem Eingang wird ein Sollwertsignal als Eingangsgröße S, hier eine Soll-Intensität oder Soll-Lichtmenge, zugeführt. Der Anschluss E/A kann, wie später erläutert, zur Verbesserung des Betriebs des Detektors 51 dienen.
Der Steuerschaltungsteil 44 ist dazu eingerichtet, aus einer zugeführten Soll-Lichtmenge anhand eines insbesondere in dem Steuerschaltungsteil 44 gespeicherten Kennfelds 45 je einen Sollwert für ein Tastverhältnis R (Verhältnis von Pulsbreite W zu Pulsperiodendauer T) und eine Pulsamplitude A zu bestimmen.
Der Sollwert R für das Tastverhältnis wird einem PWM-Schaltungsteil 46 zugeführt, welches daraus ein PWM-Signal erzeugt.
Der Sollwert für die Pulsamplitude A wird einem PAM-Schaltungsteil 47 zusammen mit dem vom PWM-Schaltungsteil 46 erzeugten PWM-Signal zugeführt, woraus der PAM-Schaltungsteil 47 ein im Rahmen der Erfindung mit variabler Pulsbreite W bzw. Tastverhältnis R und variabler Pulsamplitude A erzeugtes Ansteuersignal 48 erzeugt, welches über einen Strommessschaltungsteil 49 an die Laserdiode 41 geführt wird.
Der Strommessschaltungsteil 49 wird als Teil einer gemäß der hier dargestellten bevorzugten Ausführungsform implementierten Laserregelung verwendet. Zusätzlich weist die Beleuchtungseinrichtung 1 für eine Rückführung bzw. Messung des Beleuchtungslichts 5 im Rahmen der Laserregelung eine Photodiode 43 und eine Photomessschaltung 42 auf. Zur Photodiode 43 wird ein kleiner Teil des Beleuchtungslichts 5 ausgekoppelt. Über die rückgeführten Strom- und Intensitäts- bzw. Lichtmengenwerte kann der Steuerschaltungsteil 44 die Erzeugung des Ansteuersignals 48 regeln.
Die Erfindung ermöglicht, Pulsamplitude und Pulsbreite für jeden Puls des Ansteuersignals 48 gezielt einzustellen und somit eine mittlere Lichtintensität und Lichtmenge des Beleuchtungsstrahls 5 vorzugeben. Im Rahmen der Erfindung können insbesondere durch Reduzierung der Pulsbreite auch sehr geringe mittlere Intensitäten und Lichtmengen erzielt werden.
Zur Verbesserung der Messung des Messlichts 27 und somit der Gesamtfunktionalität des Mikroskops 100 ist die Ansteuerschaltung 40 über den Anschluss E/A mit der Recheneinheit 39 verbunden und überträgt über den Anschluss E/A als Ausgang ein Frequenzsignal, welches die Frequenz des Ansteuersignals 48 beschreibt. Dies erlaubt der Recheneinheit 39, die Messung mit dem Detektor 51 mit einer Abtastfrequenz durchzuführen, die von der Frequenz des Ansteuersignals 48 abhängt, um auf diese Weise z.B. Moiré-Artefakte der Messung zu vermeiden. Alternativ oder zusätzlich kann der Anschluss E/A als Eingang dienen oder es kann je ein Anschluss als Ausgang und als Eingang vorgesehen sein. Bei einem Eingang würde die Frequenz des Ansteuersignals 48 in Abhängigkeit von der Abtastfrequenz vorgegeben. In beiden Fällen wird zweckmäßigerweise erreicht, dass die die Frequenz des Ansteuersignals 48 ein ganzzahlige Vielfaches (1, 2, 3, ...) der Abtastfrequenz ist.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Patentliteratur

US 7477449 B2 [0002]

Claims

Konfokales Laser-Raster-Mikroskop (100) mit einer Beleuchtungseinrichtung (1), welche eine Laserlichtquelle (41), die zum Beleuchten einer Probe (25) eingerichtet ist, und eine Ansteuerschaltung (40) für die Laserlichtquelle (1), die dazu eingerichtet ist, zur Versorgung der Laserlichtquelle (41) ein gepulstes Ansteuersignal (48) auszugeben, aufweist, wobei die Ansteuerschaltung (40) so eingerichtet ist, dass sie sowohl eine Pulsamplitude (A) als auch eine Pulsbreite (W) wenigstens eines Pulses des gepulsten Ansteuersignals (48) in Abhängigkeit von wenigstens einer Eingangsgröße (S) bestimmt.
Konfokales Laser-Raster-Mikroskop (100) nach Anspruch 1, wobei die Ansteuerschaltung (40) so eingerichtet ist, dass sie das gepulste Ansteuersignal (48) mit unterschiedlichen Pulsamplituden (A) für aufeinander folgende Pulse des gepulsten Ansteuersignals (48) erzeugen kann.
Konfokales Laser-Raster-Mikroskop (100) nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Ansteuerschaltung (40) so eingerichtet ist, dass sie das gepulste Ansteuersignal (48) mit unterschiedlichen Pulsbreiten (W) für aufeinander folgende Pulse des gepulsten Ansteuersignals (48) erzeugen kann.
Konfokales Laser-Raster-Mikroskop (100) nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Ansteuerschaltung (40) einen Eingang (E/A) für ein Eingangssignal aufweist und so eingerichtet ist, dass sie das gepulste Ansteuersignal (48) mit einer Frequenz abhängig von einem an dem Eingang anliegenden Eingangssignal erzeugen kann.
Konfokales Laser-Raster-Mikroskop (100) nach Anspruch 4, mit einer Messeinrichtung (39, 51), die mit dem Eingang (E/A) verbunden und so eingerichtet ist, dass sie ein von der Probe (25) ausgehendes Messlicht (27) mit einer Abtastfrequenz erfasst und als Eingangssignal ein durch die Abtastfrequenz definiertes Signal ausgibt, wobei die Ansteuerschaltung (40) so eingerichtet ist, dass sie das gepulste Ansteuersignal (48) mit einer Frequenz abhängig von dem an dem Eingang anliegenden Eingangssignal erzeugt.
Konfokales Laser-Raster-Mikroskop (100) nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Ansteuerschaltung (40) einen Ausgang (E/A) für ein Ausgangssignal aufweist und so eingerichtet ist, dass sie als Ausgangssignal ein Signal ausgeben kann, das von einer Frequenz des gepulsten Ansteuersignals (48) abhängt.
Konfokales Laser-Raster-Mikroskop (100) nach Anspruch 6, mit einer Messeinrichtung(39, 51), die mit dem Ausgang (E/A) verbunden und so eingerichtet ist, dass sie ein von der Probe (25) ausgehendes Messlicht (27) mit einer von der Frequenz des gepulsten Ansteuersignals (48) abhängigen Abtastfrequenz erfasst.
Konfokales Laser-Raster-Mikroskop (100) nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Ansteuerschaltung (40) so eingerichtet ist, dass sie einen Sollwert für eine Lichtintensität oder Lichtmenge als die wenigstens eine Eingangsgröße (S) empfängt.
Konfokales Laser-Raster-Mikroskop (100) nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Ansteuerschaltung (40) eine Speichereinrichtung (45) aufweist, in der wenigstens ein Zusammenhang zwischen Pulsamplitude (A), Pulsbreite (W) und der wenigstens einen Eingangsgröße (S) gespeichert ist und/oder einspeicherbar ist.
Verfahren zum Einstellen einer Lichtintensität einer Laserlichtquelle (41) eines konfokalen Laser-Raster-Mikroskops (100), wobei die Laserlichtquelle mit einem gepulsten Ansteuersignal (48) versorgt wird, wobei sowohl eine Pulsamplitude (A) als auch eine Pulsbreite (W) wenigstens eines Pulses des gepulsten Ansteuersignals (48) in Abhängigkeit von wenigstens einer Eingangsgröße (S) vorgegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei ein von der Probe (25) ausgehendes Messlicht mit einer Abtastfrequenz erfasst wird, welche in Abhängigkeit von einer Frequenz des gepulsten Ansteuersignals (48) vorgegeben wird, oder umgekehrt.