DE102011118018A1

DE102011118018A1 - Minicircles mit Transpositionskassetten und ihre Verwendung zur Transformation von Zellen

Info

Publication number: DE102011118018A1
Application number: DE102011118018A
Authority: DE
Inventors: Martin Schleef; Marco Schmeer
Original assignee: PlasmidFactory GmbH and Co KG
Current assignee: PlasmidFactory GmbH and Co KG
Priority date: 2011-10-25
Filing date: 2011-10-25
Publication date: 2013-04-25
Anticipated expiration: 2031-10-26
Also published as: DE102011118018B4

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Minicircle umfassend mindestens eine Nukleinsäuresequenz von Interesse, die in eine andere genetische Umgebung transponiert werden kann, und spezifische Transposase-Erkennungssequenzen zu beiden Seiten der Nukleinsäure von Interesse, charakterisiert dadurch, dass die Transposase-Erkennungssequenzen von einer Transposase erkannt und zur Transposition verwendet werden können. Außerdem betrifft die Erfindung Parentalplasmide für die Herstellung solcher Minicircles sowie Zellen, die solche Minicircles enthalten. Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zur Transformation einer Zielzelle mit Hilfe solcher Minicircles und dadurch erhaltene Zellen sowie Kits, die bei der Durchführung solcher Verfahren nützlich sind.

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung liegt im Gebiet der Biotechnologie. Genauer betrifft die Erfindung die Bereitstellung von Minicircle-basierten Vektoren für die Transformation von Zellen mittels Transposons.
Hintergrund
Herkömmliche Verfahren zur Gentherapie verwenden meist Plasmid-DNS als Vektoren zum Einschleusen von erwünschten DNS-Abschnitten in die Zielzellen. Plasmide haben in solchen Anwendungen jedoch mehrere Nachteile. Zum einen besteht die Möglichkeit unkontrollierter Plasmidreplikation nach der Transformation, die zur Verbreitung von auf dem Plasmid vorhandenen Resistenzgenen gegen Antibiotika führen kann. Außerdem enthalten Plasmide weitere prokaryotische DNS-Sequenzen, die z. B. in Eukaryonten zu immunogenen Reaktionen führen können. Nichtvirale Vektoren mit möglichst wenigen prokaryotischen Sequenzen sind daher für die Gentherapie sehr nützlich.
Zu diesem Zweck wurden Minicircles entwickelt, worunter man kleine, zirkuläre DNS-Moleküle versteht, die eine gewünschte Expressionskassette und möglichst wenige unerwünschte prokaryotische Sequenzen enthalten. Ein Verfahren zur Herstellung von Minicircles wurde in WO 96/26270 beschrieben.
Bigger et al. (J. Biol. Chem. 2001, 276: 23018–23027) beschreiben die Herstellung von Minicircles mittels der Einführung von Plasmiden mit loxP-Stellen in Bakterien, die die Cre-Rekombinase exprimieren können. Das Plasmid umfasst ferner eine eukaryotische Expressionskassette und eine Markersequenz. Nach Induktion von Cre wird das Plasmid in Minicircle und Miniplasmid gespalten, wobei der Minicircle nur die Expressionskassette enthält. Außerdem sind die loxP-Stellen mutiert, so dass die Reversibilität der Rekombination verringert wird.
Weitere Publikationen beschreiben ebenfalls die Herstellung von Minicircles unter Verwendung anderer Rekombinationssysteme, z. B. in Kreiss et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998, 49: 560–567) mittels λ-Integrase und in Chen et al. (Mol. Ther. 2003, 8: 495–500) mittels ΦC31-Integrase. Daher sind Minicircles heute als alternative Vektoren zur Transfektion von eukaryotischen Zellen etabliert.
Zur permanenten genetischen Transformation von Zielzellen kann das Einschleusen von Transpositionskassetten auf einem Vektor dienen, die mittels einer Transposase vom Vektor in eine zelluläre Nukleinsäure überführt werden können.
Es ist jedoch bekannt, dass in vielen Transposonsystemen die Transpositionseffizienz mit wachsender Länge der Transpositionskassette abnimmt (siehe z. B. D. J. Lampe et al., Genetics 1998, 149(1): 179–187; J. C. Way et al., Genetics 1985, 111(4): 705–713). Die Länge von DNS-Abschnitten, die effizient mittels Transposition in die DNS einer Zielzelle eingebracht werden können, ist daher beschränkt. Es besteht daher Bedarf an Verfahren, die eine effiziente Transformation zellulärer DNS mittels Transposition auch längerer DNS-Abschnitte erlauben.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Idee, die Minicircle-Technologie zur Transfektion von Zellen mit der Transformation mittels Transposonsystemen zu kombinieren. Neben den vorgenannten Vorteilen, die Transfektion mit Minicircles bekanntermaßen bietet, führt das Einschleusen einer Transpositionskassette, z. B. einer Dornröschen-(Sleeping Beauty)-basierten Transpositionskassette, auf einem Minicircle überraschenderweise zu höheren Transpositionssraten als die Einführung auf herkömmlichen Vektoren, wie etwa einem Plasmid.
Dementsprechend bezieht sich die Erfindung auf ein Minicircle umfassend mindestens eine Nukleinsäuresequenz von Interesse, die in eine andere genetische Umgebung transponiert werden kann, und Transposase-Erkennungssequenzen zu beiden Seiten der Nukleinsäure von Interesse, charakterisiert dadurch, dass die Transposase-Erkennungssequenzen von einer spezifischen Transposase, oder dem Derivat einer Transposase, erkannt und zur Rekombination verwendet werden können, wobei die spezifische Transposase vorzugsweise eine Dornröschen-Transposase (Sleeping-Beauty-Transposase) oder eine PiggyBac-Transposase ist.
In einer Ausführungsform kann die mindestens eine Nukleinsäuresequenz von Interesse eine Expressionskassette mit mindestens einem Gen, mindestens einer Isolatorsequenz oder einer Kombination davon, oder auch mehrere Gene, mehrere Isolatorsequenzen oder eine Kombination davon umfassen.
Der Minicircle kann mindestens eine Identifikationssequenz, innerhalb oder außerhalb des Bereichs zwischen den Transposase-Erkennungssequenzen, umfassen. Wenn mehrere Identifikationssequenzen vorliegen, können diese identisch oder unterschiedlich sein.
Ferner kann die Sequenz des Minicircles ein Paar Rekombinase-Erkennungssequenzen umfassen, die zu beiden Seiten der Nukleinsäure von Interesse innerhalb der Transposase-Erkennungssequenzen liegen.
In einer Ausführungsform enthält der Minicircle keinen Selektionsmarker zur Selektion bei der Amplifikation in prokaryotischen Zellen. Der Minicircle kann ein ringförmiges, vorzugsweise ein ringförmiges und superspiralisiertes, DNS-Molekül sein.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Erfindung auch Parentalplasmide, aus denen irgendein Minicircle gemäß der Erfindung durch Rekombination gewonnen werden kann. Ein Parentalplasmid ist hierbei ein Plasmid, das die komplette Sequenz des gewünschten Minicircles (Minicircle-Region) und zusätzlich ein Plasmidrückgrat (Miniplasmid-Region) enthält, wobei Minicircle-Region und Miniplasmid-Region durch Rekombinase-Erkennungssequenzen getrennt sind, die so angeordnet sind, dass sie von einer Rekombinase spezifisch rekombiniert werden können.
Die Erfindung bezieht sich auch auf Zellen, die einen Minicircle gemäß einer der erwähnten Ausführungsformen umfassen.
Unter einem weiteren Gesichtspunkt bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren zur Insertionsmutagenese oder zur genetischen Transformation einer eukaryotischen Zielzelle, das Verfahren umfassend Bereitstellen eines erfindungsgemäßen Minicircles umfassend eine Nukleinsäure von Interesse innerhalb der Zielzelle, und Transfektion der Zielzelle mit einem Vektor umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die für eine Transposase kodiert, die für die Transposase-Erkennungssequenzen des Minicircles spezifisch ist, wobei die Expression der Transposase von dem Vektor zur Rekombination der Nukleinsäuresequenz von Interesse mit einer Nukleinsäure der Zielzelle führt.
Das Bereitstellen des Minicircles kann durch Transfektion der Zielzelle mit dem Minicircle oder auch durch Erzeugung des Minicircles innerhalb der Zielzelle erreicht werden. Ferner können das Bereitstellen des Minicircles und die Transfektion mit dem Vektor zugleich in einer Kotransfektion oder nacheinander in beliebiger Reihenfolge durchgeführt werden. Die Zielzelle kann eine Wirbeltierzelle, z. B. eine menschliche Zelle, sein.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Erfindung auch Zellen, die durch ein Verfahren gemäß der Erfindung erhalten wurden.
Schließlich umfasst die Erfindung auch ein Kit zur Insertionsmutagenese oder zur genetischen Transformation einer eukaryotischen Zielzelle umfassend einen Minicircle gemäß einer der erwähnten Ausführungsformen und einen Vektor, der für eine Transposase kodiert, die für die Transposase-Erkennungssequenzen des Minicircles spezifisch ist. Für die Transposase-Erkennungssequenzen im Minicircle kann eine Dornröschen-Transposase spezifisch sein und die vom Vektor kodierte Transposase kann diese Dornröschen-Transposase oder ein Derivat davon sein, z. B. die hyperaktive Dornröschen-Transposase SB100X (auch SB100 genannt).
Beschreibung der Abbildungen
1A zeigt die Nukleinsäuresequenz des DR-Elements am äußeren Ende eines IR-Elements (SEQ ID NO: 1).
1B zeigt die Nukleinsäuresequenz des DR-Elements am inneren Ende eines IR-Elements (SEQ ID NO: 2).
1C zeigt die Aminosäuresequenz der Dornröschen-Transposase SB10 (SEQ ID NO: 3).
1D zeigt die Aminosäuresequenz der Dornröschen-Transposase SB100X (SEQ ID NO: 4).
1E zeigt die Nukleinsäuresequenz eines forward-Primers, der zur Amplifikation einer GFP-kodierenden Sequenz aus dem Plasmid pCMV-GFP verwendet werden kann (SEQ ID NO: 5).
1F zeigt die Nukleinsäuresequenz eines reverse-Primers, der zur Amplifikation einer GFP-kodierenden Sequenz aus dem Plasmid pCMV-GFP verwendet werden kann (SEQ ID NO: 6).
2 zeigt eine Skizze des Minicircles MC-IR-GFP mit einer GFP-Expressionskassette als Nukleinsäuresequenz von Interesse; GFP: GFP-kodierende Sequenz; Prom: Promotorsequenz; pA: Polyadenylierungssequenz; IR: IR-Element (Transposase-Erkennungssequenz); rec-tag: bei der Rekombination gebildeter Rest der Rekombinase-Erkennungssequenzen und Identifikationssequenz.
3a zeigt eine Skizze des Parentalplasmids pP-IR-GFP, aus dem der Minicircles MC-IR-GFP gebildet werden kann; GFP: GFP-kodierende Sequenz; Prom: Promotorsequenz; IR: IR-Element (Transposase-Erkennungssequenz); rec: Rekombinase-Erkennungssequenz für parA-Resolvase; 2tag: zwei Identifikationssequenzen; Rückgrat: Plasmidrückgrat, das die für die Amplifikation des Plasmids notwendigen Sequenzen und eine Expressionskassette für die patA-Resolvase enthält. Die Rekombinase-Erkennungssequenzen zur Spaltung in Miniplasmid und Minicircle sind dunkelgrau dargestellt.
3b zeigt eine Skizze des Parentalplasmids pP11-IR-GFP, aus dem der Minicircles MC-IR-GFP gebildet werden kann; GFP: GFP-kodierende Sequenz; Prom: Promotorsequenz; IR: IR-Element (Transposase-Erkennungssequenz); rec: Rekombinase-Erkennungssequenz für parA-Resolvase; 1 tag: eine Identifikationssequenz; Rückgrat: Plasmidrückgrat, das die für die Amplifikation des Plasmids notwendigen Sequenzen und eine Expressionskassette für die parA-Resolvase enthält. Die Rekombinase-Erkennungssequenzen zur Spaltung in Miniplasmid und Minicircle sind dunkelgrau dargestellt.
4 zeigt eine Vektorkarte des Plasmids pT2/BH (Addgene Zugangsnummer 26556), das geeignete IR-Elemente enthält und als Ausgangsmaterial für die Klonierung von Ursprungsplasmiden für Dornröschen-Minicircles verwendet werden kann.
5 zeigt eine schematische Darstellung eines geeigneten Verfahrens von der Klonierung von Ausgangsplasmiden (oberer Teil), über deren Klonierung zur Erzeugung von Parentalplasmiden (mittlerer Teil, z. B. pP-SB10 und pP-IR-GFP) und deren Rekombination (jeweilige Bildung und Aufreinigung von Minicircles; darunter) bis zur Transfektion oder Kotransfektion einer eukaryotischen Zielzelle (unten). Die beiden unten gezeigten Minicircles enthalten die Expressionskassette für eine Transposase (hier SB10; links) und eine GFP-Expressionkassette begrenzt durch IR-Elemente. Die Namen der Konstrukte sind jeweils in ihrer Mitte angegeben. GFP: GFP-kodierende Sequenz; Prom: Promotorsequenz; pA: Polyadenylierungssequenz; IR IR-Element (Transposase-Erkennungssequenz); rec-tag: bei der Rekombination gebildeter Rest der Rekombinase-Erkennungssequenzen und zugleich 2 spezifische Identifikationssequenzen; MCS: multiple Klonierungsstelle; SB10: SB10-kodierende Sequenz; AmpR: Ampizillin-Resistenzkassette; ori: Replikationsursprung. Die Rekombinase-Erkennungssequenzen zur Spaltung in Miniplasmid und Minicircle sind dunkelgrau dargestellt.
6A zeigt die Nukleinsäuresequenz des linken IR/DR-Elements Lmut44 (SEQ ID NO: 7).
6B zeigt die Nukleinsäuresequenz des rechten IR/DR-Elements Rmut13delta13 (SEQ ID NO: 8).
7 zeigt schematisch einen bevorzugten Aufbau von Parentalplasmiden zur Herstellung von Minicicles gemäß der Erfindung. NOI: Nukleinsäure von Interesse; FRT: Rekombinase-Erkennungssequenzen für Flp-Rekombinase; IR/DR: Transposase-Erkennungssequenzen; rec: Rekombinase-Erkennungssequenz für parA-Resolvase.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
MINICIRCLES
Die vorliegende Erfindung betrifft unter einem Gesichtspunkt einen Minicircle, umfassend mindestens eine Nukleinsäuresequenz von Interesse, die in eine andere genetische Umgebung transponiert werden kann, und Transposase-Erkennungssequenzen zu beiden Seiten der Expressionskassette, charakterisiert dadurch, dass die Transposase-Erkennungssequenzen von einer Transposase, oder dem Derivat einer Transposase, erkannt und zur Transposition verwendet werden können. Bevorzugte Transposasen sind Dornröschen-Transposasen (Sleepingbeauty-Transposasen) und PiggyBac-Transposasen.
„Minicircle” im Sinne dieser Erfindung bezeichnet eine zirkuläre doppelsträngige DNS, die mindestens eine Nukleinsäuresequenz von Interesse enthält, und im Wesentlichen frei ist von prokaryotischen Nukleinsäuresequenzen, wie sie typischerweise in Plasmiden vorgefunden werden, wie etwa Replikationsstartpunkten, Markergenen oder Resistenzgenen. Insbesondere von Promotoren enthalten Minicircles, wenn überhaupt, nur solche, die zur Expression von Genen der Expressionskassette dienen. Dadurch sind Minicircles besonders geeignet zum Einbringen von gewünschten Nukleinsäuresequenzen in Zielzellen, da Wirkungen unerwünschter DNS-Elemente, wie etwa die Expression oder Rekombination von Resistenzgenen, ausgeschlossen werden können und z. B. überflüssige und funktionslose Sequenzen vermieden werden.
Ein „Markergen” im Sinne der Erfindung ist eine DNS-Sequenz, die einer Zelle bzw. einem Organismus unter bestimmten Bedingungen einen Überlebensvorteil verschafft (z. B. Resistenzgene gegen bestimmte Antibiotika) oder zum Auffinden erfolgreich transformierter oder transfizierter Zellen eingesetzt wird. Beispielsweise kann ein Markergen ein Gen zur Expression eines fluoreszierenden Proteins sein, wie etwa GFP.
Eine „Nukleinsäuresequenz von Interesse” kann jede doppelsträngige DNS-Sequenz sein, die in eine eukaryotische Zielzelle eingebracht und in eine Nukleinsäure der Zielzelle transponiert werden soll. Bevorzugt ist eine Nukleinsäuresequenz von Interesse eine Expressionskassette für ein oder mehr Gene sein, z. B. 1, 2, 3, 4, 5 oder mehr Gene. In einer anderen Ausführungsform kann es sich um eine Nukleinsäuresequenz handeln, die nicht für ein Protein kodiert. Beispielsweise kann die Nukleinsäuresequenz von Interesse dazu dienen, einen Abstand zwischen zwei DNS-Abschnitten zu generieren oder DNS-bindende Faktoren (z. B.
Nukleinsäuren oder Proteine) unter bestimmten Bedingungen zu binden bzw. zu entlassen und so in die Genregulation der Zielzelle einzugreifen. Weiterhin kann es sich bei der Nukleinsäuresequenz von Interesse um eine RNS-kodierende Sequenz (z. B. für siRNA oder shRNA) handeln oder um andere genetische Elemente, die in der Zielzelle wirksam werden sollen, z. B. Isolatorsequenzen (also Sequenzmotive, die, wenn sie in das Genom integriert werden, die regulierende Wirkung eines chromosomalen Abschnitts auf seine benachbarten Regionen beeinflussen). Auch kann eine Nukleinsäuresequenz von Interesse eine Markersequenz sein, die im Verlauf einer Insertionsmutagenese in die zelluläre DNS eingebracht – und gegebenenfalls auch wieder entfernt – werden soll. Mittels DNS-Sequenzierung oder PCR ausgehend von der Markersequenz kann dann beispielsweise die Insertionsstelle der Sequenz bestimmt werden. Außerdem kann eine Nukleinsäuresequenz von Interesse eine beabsichtigte Wirkung in Form einer Stimulation zellulärer oder immunologischer Reaktionen (z. B. durch CpG-Motive, siehe A. Krieg et al., Nature 1995, 374: 546–9) haben.
Eine „Expressionskassette” ist eine DNS-Sequenz, die ein oder mehr Gene enthält sowie Sequenzen, die die Expression der Gene kontrollieren. Insbesondere umfasst eine Expressionskassette Promotorsequenzen, offene Leserahmen, die für die zu exprimierenden Polypeptide kodieren, und 3'-untranslatierte Bereiche, die bei Expression in Eukaryoten gewöhnlich eine Polyadenylierungssequenz enthalten. Eine Expressionskassette kann auch mehr als ein Gen (z. B. 2, 3, 4, 5 oder mehr Gene) enthalten, insbesondere einen Cluster von Genen, wie sie gewöhnlich für die Stammzellenprogrammierung verwendet werden. Ein solcher Cluster kann beispielsweise 3, 4 oder 5 Gene enthalten.
„Transposase-Erkennungssequenzen” sind solche DNS-Sequenzen, die von einer natürlichen Transposase oder einem Derivat einer natürlichen Transposase erkannt, gebunden und zur Reaktion gebracht werden können, so dass unter geeigneten Bedingungen die Rekombination der sich zwischen zwei Erkennungssequenzen befindenden DNS mit einem anderen (trans) oder demselben (cis) DNS-Molekül ermöglicht wird. Transposasen wiederum sind Enzyme aus Transposon-Systemen, die für den Transfer von Transposons zu anderen Bereichen des Genoms verantwortlich sind. Eine Transposase wird als „spezifisch” für gegebene Erkennungssequenzen betrachtet, wenn sie diese erkennen, binden und zur Reaktion bringen kann, so dass unter geeigneten Bedingungen die Transposition der sich zwischen zwei Erkennungssequenzen befindenden DNS in ein anderes (trans) oder dasselbe (cis) DNS-Molekül ermöglicht wird.
Als „Derivate” einer gegebenen Transposase werden im Sinne dieser Erfindung solche Transposasen verstanden, die für dieselben Erkennungssequenzen spezifisch sind wie die gegebene Transposase. Die Aminosäuresequenz eines Derivats ist im Allgemeinen mit der Aminosäuresequenz der ursprünglichen Transposase verwandt und beispielsweise zu mindestens 60%, oder zu mindestens 70%, oder zu mindestens 80%, oder zu mindestens 90%, oder zu mindestens 95%, oder zu mindestens 99% mit ihr identisch.
Die Minicircles der Erfindung enthalten mehrere Transposase-Erkennungssequenzen. Bevorzugt enthalten Minicircles der Erfindung zwei Transposase-Erkennungssequenzen, je eine zu beiden Seiten der Nukleinsäuresequenz von Interesse, so dass sich die Nukleinsäure von Interesse innerhalb der beiden Transposase-Erkennungssequenzen befindet. Die Transposase-Erkennungssequenzen können sich unmittelbar an die Nukleinsäure von Interesse anschließen, oder die Sequenzen können durch einen Spacer getrennt sein. Spacer können zu beiden Seiten der Nukleinsäure von Interesse angebracht sein, oder nur an einer Seite. Die Spacer haben vorzugsweise eine Länge von 1–1000 bp, z. B. 1, 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 oder 1000 bp. Wenn zu beiden Seiten der Nukleinsäure von Interesse Spacer vorliegen, können diese gleiche oder unterschiedliche Längen haben. Mit „Spacer” wird hier jegliche DNS-Sequenz bezeichnet, die zwischen der Nukleinsäure von Interesse und den Transposase-Erkennungssequenzen liegt. Insbesondere kann ein Spacer auch eine oder mehrere Identifikationssequenzen wie unten beschrieben umfassen.
Je nach Art der Transposase, die zur Transposition verwendet wird, können die Erkennungssequenzen unterschiedlich beschaffen sein. In manchen Ausführungsformen enthalten die Erkennungssequenzen Wiederholungen. Beispiele für verschiedene Arten von Wiederholungen sind lange terminale Wiederholungen (LTRs), inverse Wiederholungen (IRs) oder direkte Wiederholungen (DRs). Wiederholungen dieser Typen können auch kombiniert miteinander Auftreten, zum Beispiel als DRs innerhalb von IRs (IR/DR). Mit „Wiederholungen” werden hierbei nicht nur vollständig identische Sequenzen bezeichnet, sondern auch Sequenzen, die hinreichend ähnlich zueinander sind, dass eine Homologie erkannt werden kann. Beispielsweise sind die in 1A und B dargestellten DR-Sequenzen aus einer Erkennungssequenz von Dornröschen-Transposasen zu etwa 80% identisch zueinander.
Dem Fachmann ist auch klar, dass Mutationen in Erkennungssequenzen eingefügt werden können, solange ihre Funkion dadurch nicht in unerwünschtem Ausmaß beeinträchtigt wird. In jedem Fall müssen die Erkennungssequenzen von einer solchen Beschaffenheit sein und in einer solchen Orientierung und Lage im Minicircle angeordnet sein, dass sie von einer spezifischen Transposase erkannt, gebunden und zur Reaktion gebracht werden können, so dass unter geeigneten Bedingungen die Transposition der sich innerhalb der Transposase-Erkennungssequenzen befindenden DNS ermöglicht wird.
Grundsätzlich können Erkennungssequenzen jeder beliebigen Transposase in Minicircles der Erfindung verwendet werden. Beispiele für Transposasen umfassen PiggyBac-Transposasen, Dornröschen-Transposasen und deren Derivate. Die Aminosäuresequenz eines Derivats ist im Allgemeinen mit der Aminosäuresequenz der ursprünglichen Transposase verwandt und beispielsweise zu mindestens 60%, oder zu mindestens 70%, oder zu mindestens 80%, oder zu mindestens 90%, oder zu mindestens 95%, oder zu mindestens 99% mit ihr identisch. Das Derivat einer Transposase besitzt ebenfalls Transposase-Aktivität und kann für dieselben oder andere Erkennungssequenzen wie die ursprüngliche Transposase spezifisch sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält der Minicircle zwei Erkennungssequenzen vom IR/DR-Typ, für welche Dornröschen-Transposasen (auch Sleeping-Beauty- oder SB-Transposasen genannt) spezifisch sind. Die Erkennungssequenzen, die von SB-Transposasen erkannt werden, sind IR-Sequenzen von etwa 210–250 Basenpaaren Länge und enthalten jeweils zwei DR-Sequenzen, eine an jedem Ende, die zu über 80% identisch miteinander sind. Die DR-Sequenz am äußeren, vom Mittelpunkt des zu transponierenden DNS-Abschnitts weiter entfernten, Ende hat hierbei die Sequenz von SEQ ID NO: 1 (siehe auch 1A) und die DR-Sequenz am inneren, dem Mittelpunkt des zu transponierenden DNS-Abschnitts näher gelegenen, Ende hat die Sequenz von SEQ ID NO: 2 (siehe auch 1B). Eine SB-Transposase kann sich zweier IR-Sequenzen für eine Transposition auch dann bedienen, wenn die IR Sequenzen keine exakten Wiederholungen darstellen, sondern in den Bereichen zwischen den jeweiligen DRs Sequenzunterschiede enthalten, solange die DRs selbst den in SEQ ID NO: 1 und 2 aufgeführten Sequenzen entsprechen (siehe Z. Ivics et al., Cell 1997, 91: 501–510). Dementsprechend hat/haben in weiter bevorzugten Ausführungsformen mindestens eine oder beide der Transposase-Erkennungssequenzen eine Länge von 210–250 Basenpaaren (beispielsweise von 225–240 Basenpaaren), wobei am von der Nukleinsäure von Interesse weiter entfernten Ende die Sequenz von SEQ ID NO: 1 liegt und am zu der Nukleinsäure von Interesse näheren Ende die Sequenz von SEQ ID NO: 2 liegt.
Dornröschen-Transposasen (SB-Transposasen) basieren auf der künstlichen Transposase SB10 (SEQ ID NO: 3; siehe auch 1C), die wiederum auf der Grundlage der inaktiven Transposasen verschiedener Tc1-artiger Elemente (TcEs) aus mehreren Spezies der echten Knochenfische entworfen wurde (siehe Z. Ivics et al., Cell 1997, 91: 501–510). Während die natürlich vorkommenden TcEs alle inaktiv sind, wurde die SB10-Transposase so mutiert, dass sie an den IR/DR-Sequenzen von TcEs (beispielsweise dem T-Element aus Tanichtbys albonubes) Transpositionen katalysieren kann und voll funktionsfähig ist. Eine weitere SB-Transposase ist SB100X (auch SB100 genannt), ein Derivat von SB10, das eine etwa 100fach erhöhte Transpositionsrate gegenüber SB10 aufweist (SEQ ID NO: 4; siehe L. Mátés et al., Nat. Genet. 2009, 41: 753–761; siehe auch 1C).
2 zeigt eine Skizze eines beispielhaften Minicircles gemäß der Erfindung mit einer GFP-Expressionskassette als Nukleinsäuresequenz von Interesse.
Das SB-Transposon-System bietet den besonderen Vorteil, dass es in einer Vielzahl verschiedener Wirbeltierzellen aus unterschiedlichsten Spezies aktiv ist (siehe Z. Ivics et al., Cell 1997, 91: 501–510) und daher einen vielseitigen Einsatz der Minicircles in Rekombinations- und Integrationsexperimenten zulässt. Insbesondere können SB-Minicircles zur Herstellung induzierter pluripotenter Stammzellen verwendet werden.
Minicircles gemäß der vorliegenden Erfindung können sehr unterschiedliche Größen haben, zum Beispiel zwischen 500 und 15000 bp, wie etwa 500 bp, 1000 bp, 1500 bp, 2000 bp, 2500 bp, 3000 bp, 4000 bp, 5000 bp, 6000 bp, 8000 bp, 10000 bp, 12000 bp oder 15000 bp. Bevorzugt sind Größen zwischen 1000 bp und 6000 bp, besonders bevorzugt sind Größen zwischen 2000 bp und 4000 bp.
Vorzugsweise sind die Minicircles der Erfindung superspiralisiert.
Bevorzugte Minicircles der Erfindung können in zwei Bereiche unterteilt werden, einen „inneren” und einen „äußeren” Bereich. Der innere Bereich umfasst die Region umfassend die Nukleinsäure von Interesse bis einschließlich der beiden Transposase-Erkennungssequenzen und ist damit zugleich eine Transpositionskassette. Der äußere Bereich umfasst. die Region zwischen den äußeren Enden der beiden Transposase-Erkennungssequenzen.
Gemäß der Erfindung sind Minicircles mit äußeren Bereichen ≤ 500 bp bevorzugt. Besonders bevorzugt sind Minicircles mit äußeren Bereichen ≤ 300 bp, z. B. mit äußeren Bereichen von 30, 50, 75, 100, 150, 200, 250 oder 300 bp.
Es wurde beobachtet, dass überraschenderweise von Transposase-Erkennungssequenzen flankierte DNS-Sequenzen durch die entsprechende Transposase effizienter transponiert werden, wenn die DNS-Sequenzen auf Minicircles statt auf Plasmiden vorliegen. Die dadurch auftretende höhere Transpositionsrate führt dazu, dass die Häufigkeit und Effizienz der Integration gewünschter DNS-Sequenzen in die DNS einer Zielzelle erheblich gesteigert werden kann, wenn diese Sequenzen in Form von Transpositionskassetten auf Minicircles bereitgestellt werden. Dies gilt insbesondere, wenn die Minicircles superspiralisiert sind.
Eine Bereitstellung von Transpositionskassetten in Minicircles beispielsweise zum Zweck der Insertionsmutagenese oder Transformation in einer Zielzelle ermöglicht damit zum einen, die generellen Vorteile der Minicircle-Technologie zu nutzen, die in der Vermeidung des Einbringens unnötiger und eventuell immunogener prokaryotischer Sequenzen in die Zielzellen liegen. Zusätzlich wird jedoch auch die Transpositionseffizienz gesteigert, was einen bedeutenden weiteren Vorteil der hier beschriebenen Technologie darstellt. Wie bereits im Abschnitt „Hintergrund” beschrieben, ist es bekannt, dass in vielen Transposonsystemen die Transpositionseffizienz mit wachsender Länge der Transpositionskassette abnimmt. Die Länge von DNS-Abschnitten, die effizient mittels Transposition in die DNS einer Zielzelle eingebracht werden können, ist daher beschränkt. Die beobachtete Erhöhung der Transpositionseffizienz bei Bereitstellen der Transpositionskassette auf einem Minicircle kann daher vorteilhaft genutzt werden, um längere DNS-Abschnitte mit einer Effizienz in die DNS einer Zielzelle zu transponieren, die mit bisherigen Verfahren nur bei erheblich kürzeren Abschnitten erreicht werden konnte. Insbesondere für die Transposition von Abschnitten, die mehrere Gene enthalten, sind Minicircle-Transposon-Konstrukte sehr interessant.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ist die Nukleinsäuresequenz von Interesse im Minicircle eine Expressionskassette mit mindestens einem Gen. Das Gen kodiert vorzugsweise für ein therapeutisch nützliches Protein. Jedoch können auch beliebige andere Gene in den Minicircles der Erfindung verwendet werden. Das Gen kann für ein Wildtyp-Protein, ein mutiertes Protein oder auch für ein Fusionsprotein kodieren, z. B. für ein GFP-Fusionsprotein. Die Expressionskassette kann auch mehrere Gene oder andere genetische Elemente enthalten. Wie oben erwähnt, kann es sich dabei beispielsweise um eine Sequenz handeln, die nicht für ein Protein kodiert, sondern lediglich dazu dient, einen Abstand zwischen zwei DNS-Abschnitten zu generieren oder DNS-bindende Faktoren (z. B. Nukleinsäuren oder Proteine) unter bestimmten Bedingungen zu binden bzw. zu entlassen und so in die Genregulation der Zielzelle einzugreifen. Weiterhin kann es sich bei der Sequenz in der Expressionskassette um eine RNS-kodierende Sequenz (z. B. für siRNA oder shRNA) handeln oder um andere genetische Elemente, die in der Zielzelle wirksam werden sollen, z. B. Isolatorsequenzen (also Sequenzmotive, die, wenn sie in das Genom integriert werden, die regulierende Wirkung eines chromosomalen Abschnitts auf seine benachbarten Regionen beeinflussen). Auch kann eine Nukleinsäuresequenz von Interesse eine Markersequenz sein, die im Verlauf einer Insertionsmutagenese in die zelluläre DNS eingebracht – und gegebenenfalls auch wieder entfernt – werden soll. Mittels DNS-Sequenzierung oder PCR ausgehend von der Markersequenz kann dann beispielsweise die Insertionsstelle der Sequenz bestimmt werden. Außerdem kann eine Nukleinsäuresequenz von Interesse eine beabsichtigte Wirkung in Form eine Stimulation zellulärer oder immunologischer Reaktionen (z. B. durch CpG-Motive, siehe A. Krieg et al., Nature 1995, 374: 546–9) haben.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform enthalten die Minicircles im inneren Bereich, die Nukleinsäure von Interesse flankierend, ein Paar Rekombinase-Erkennungssequenzen, für die eine entsprechende Rekombinase spezifisch ist. Eine für gegebene Rekombinase-Erkennungssequenzen spezifische Rekombinase ist hierbei jedes Enzym, das eine richtungsspezifische Rekombination an den Rekombinase-Erkennungssequenzen katalysieren kann. Im vorliegenden Fall müssen die beiden Rekombinase-Erkennungssequenzen so orientiert sein, dass bei der Rekombination der dazwischen liegende DNS-Abschnitt als ein zyklisches Molekül ausgeschnitten wird.
Mit Hilfe dieser Rekombinase-Erkennungssequenzen kann nach einer Insertionsmutagenese die Nukleinsäure von Interesse, die mittels der Transposase ins Genom der Zielzelle integriert wurde, durch Bereitstellen der entsprechenden, für die Erkennungssequenzen spezifischen Rekombinase innerhalb der Zielzelle wieder aus dem Genom entfernt oder ausgetauscht werden. Die Bereitstellung erfolgt vorzugsweise durch induzierbare Expression der Rekombinase in der Zielzelle. Bevorzugte Rekombinase-Erkennungssequenzen für solche Ausführungsformen der Erfindung sind FRT-Sequenzen, für die die Flp-Rekombinase aus dem Plasmid 2 μ spezifisch ist (siehe z. B. B. J. Andrews et al., Cell 1985, 40(4): 795–803). Es können jedoch auch andere Rekombinasen und Rekombinase-Erkennungssequenzen verwendet werden.
HERSTELLUNG VON MINICIRCLES
Die Minicircles der Erfindung können mittels Rekombination aus entsprechenden Plasmiden hergestellt werden, wie in WO 96/26270 oder EP 1620559 beschrieben. Hierbei geht man von einem Plasmid („Parentalplasmid”) aus, das die komplette Sequenz des gewünschten Minicircles (Minicircle-Region) und zusätzlich ein Plasmidrückgrat (Miniplasmid-Region) enthält (siehe 3). Zwischen der Minicircle-Region und der Miniplasmid-Region befinden sich beiderseits Rekombinase-Erkennungssequenzen, für die eine entsprechende Rekombinase spezifisch ist. Eine für gegebene Rekombinase-Erkennungssequenzen spezifische Rekombinase ist hierbei jedes Enzym, das eine richtungsspezifische Rekombination an den Rekombinase-Erkennungssequenzen katalysieren kann.
Das Parentalplasmid wird durch die spezifische Rekombinase zu einem Minicircle und einem verbleibenden Rest, dem Miniplasmid, rekombiniert. Hierbei müssen die beiden Rekombinase-Erkennungssequenzen so orientiert sein, dass bei der Rekombination die Trennung in Minicircle und Miniplasmid erfolgt und nicht ein einzelnes modifiziertes Plasmid entsteht.
Die Rekombinase-Erkennungssequenzen können sich unmittelbar an die Transpositionskassette anschließen, oder die Sequenzen können durch einen Spacer getrennt sein. Spacer können zu beiden Seiten der Transpositionskassette angebracht sein, oder nur an einer Seite. Die Spacer haben vorzugsweise eine Länge von 1–1000 bp, z. B. 1, 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 oder 1000 bp. Wenn zu beiden Seiten der Transpositionskassette Spacer vorliegen, können diese gleiche oder unterschiedliche Längen haben. Mit „Spacer” wird hier jegliche DNS-Sequenz bezeichnet, die zwischen der Transpositionskassette und den Rekombinase-Erkennungssequenzen liegt. Insbesondere kann ein Spacer auch eine oder mehrere Identifikationssequenzen wie unten beschrieben umfassen.
Beispiele für mögliche Rekombinasen sind die Integrasen aus den Bakteriophagen λ (siehe A. Landy et al., Science 1977, 197(4309): 1147–1160), P22 und Φ80 (siehe J. M. Leong et al., J. Biol. Chem. 1985, 260(7): 4468–4470), die HP1-Integrase aus Haemophilus influenzae (siehe M. A. Hauser et al., J. Biol. Chem. 1992, 267(10): 6859–6864), die Cre-Integrase aus dem Phagen P1, die Integrase aus. dem Plasmid pSAM2 (siehe EP350341 ), die Flp-Rekombinase aus dem Plasmid 2 μ (siehe B. J. Andrews et al., Cell 1985, 40(4): 795–803) oder die ΦC31-Integrase (siehe J. R. Bateman et al., Genetics 2006, 173(2): 769–777). Alternativ können auch Rekombinasen aus Transposons der Tn3-Familie verwendet werden, wie die parA-Resolvase aus RP4 (siehe L. Eberl et al., Mol. Microbiol. 1994, 12(1): 131–141), die Resolvasen der Transposons Tn3, Tn21 oder Tn522 (siehe W. M. Stark et al., Trends Genes. 1992, 8(12): 432–439), oder die Gin-Invertase aus dem Bakteriophagen μ.
Wie dem Fachmann offensichtlich ist, muss hierbei darauf geachtet werden, dass die verwendeten Rekombinase-Erkennungssequenzen von eventuell innerhalb der Minicircle-Region (z. B. in der Transpositionskassette) vorhandenen weiteren Rekombinase-Erkennungssequenzen (wie vorstehend beschrieben) verschieden sind und nicht von demselben Enzym rekombiniert werden können. Eine beispielhafte Anordnung von Rekombinase- und Transposase-Erkennungssequenzen auf einem erfindungsgemäßen Parentalplasmid ist in 7 abgebildet. Die „rec”-Sequenzen werden hierbei zur Herstellung des Minicircles genutzt. Die Transpositionskassette wird durch die IR/DR-Sequenzen beschränkt und enthält die Nukleinsäure von Interesse (NOI), die zusätzlich von zwei FRT-Sequenzen flankiert wird. Nach der Transposition kann die Nukleinsäure von Interesse durch Expression von Flp-Rekombinase und Rekombination der FRT-Sequenzen wieder aus dem Genom der Zielzelle ausgeschnitten werden.
Erfindungsgemäße Parentalplasmide können durch dem Fachmann bekannte mikrobiologische Strategien und Methoden hergestellt werden. Als Ausgangspunkt kann beispielsweise das Plasmid pT2/BH (Addgene Zugangsnummer 26556; siehe 4) dienen, das zwei IR/DR-Elemente enthält. Dazwischen befindet sich eine multiple Klonierungsstelle (MCS), in die ein oder mehr Expressionskassetten hineinkloniert werden können. Die dabei entstehende Transpositionskassette wird von Restriktionsschnittstellen für BamHI flankiert und kann mit diesem Enzym herausgeschnitten werden, wenn innerhalb der Transpositionskassette keine BamHI-Schnittstelle vorliegt. Alternativ kann ein solches Fragment auch durch Amplifikation mittels PCR ausgehend von Primern, die außerhalb des, aber nahe zum gewünschten Sequenzfragment liegen, gewonnen werden.
Das erhaltene Restriktionsfragment, das die Transpositionskassette umfasst, kann nun in ein Vorläuferplasmid kloniert werden, das den Miniplasmid-Bereich sowie die Rekombinase-Erkennungssequenzen des gewünschten Parentalplasmids enthält. Falls erforderlich, kann das Fragment auch zunächst in ein weiteres Plasmid umkloniert werden, um ein mit dem Vorläuferplasmid kompatibles Restriktionsenzym verwenden zu können. Die Klonierung eines PCR-Fragments kann entweder auf die gleiche Weise oder über einen Shuttle-Vektor zur Klovierung von PCR-Fragmenten erfolgen. In allen Fällen muss sich die Insertionsstelle auf dem Vorläuferplasmid in dem Gebiet zwischen den Rekombinase-Erkennungssequenzen befinden, das nicht den Miniplasmid-Bereich enthält. Dadurch entsteht das zur Bildung von Minicircle und Miniplasmid notwendige Parentalplasmid.
Alternativ können auch die Transposase-Erkennungssequenzen mit der dazwischen liegenden MCS (eine „leere” Transpositionskassette) zuerst aus pT2/BH ins Vorläuferplasmid kloniert werden und anschließend die gewünschte Expressionskassette zwischen die IR/DR-Elemente auf dem resultierenden leeren Parentalplasmid eingefügt werden.
Dieses „Einfügen” kann mittels klassischer Ligation geeigneter DNS-Enden (stumpf oder „klebrig”) erfolgen oder auch per Rekombination (wie in Hartley, J. L., Temple, G. F., and Brasch, M. A. (2000) DNA Cloning Using in vitro Site-Specific Recombination. Genome Research 10, 1788–1795) beschrieben, wobei darauf zu achten ist, dass die im zuletzt genannten Fall verwendeten Rekombinationsmechanismen nicht störend mit denen der Spaltung in Minicircle und Miniplasmid interagieren.
Selbstverständlich kann ein geeignetes Parentalplasmid auch auf der Grundlage anderer Plasmide als der genannten konstruiert werden. Die verwendeten Restriktionsenzyme können ebenfalls andere sein. Entscheidend ist die Struktur des entstehenden Parentalplasmid, das eine Transpositionskassette zwischen zwei geeignet orientierten Rekombinase-Erkennungssequenzen enthalten muss.
Die Rekombination des Parentalplasmids kann in vitro oder in vivo erfolgen. Ein Vorteil der in vivo-Rekombination in Wirtszellen ist, dass das Parentalplasmid nicht aufgereinigt zu werden braucht, sofern die Expression der entsprechenden Rekombinase in den Wirtszellen induziert werden kann. Das hierfür notwendige Gen, das für die Rekombinase kodiert, kann in der Wirtszelle auf einem anderen Nukleinsäuremolekül vorliegen. Besonders vorteilhaft ist es, wenn das Rekombinase-Gen auf denn Parentalplasmid innerhalb der Miniplasmid-Region vorliegt. Vorzugsweise ist die Expression der Rekombinase induzierbar, zum Beispiel über eine Temperaturänderung oder Zugabe eines Metaboliten. Nach Induktion der Rekombinase-Expression in der Wirtszelle wird das Parentalplasmid in zwei superspiralisierte, zirkuläre Moleküle, den Minicircle und das Miniplasmid, gespalten, die nach Zelllyse voneinander getrennt werden können oder bereits in der Zelle die auf der Nukleinsäuresequenz kodierte Information realisieren.
Wirtszelle kann somit auch die Zielzelle sein, wobei dafür die Expressionssteuerung der Rekombinase in eukaryotischen Zellen gewährleistet sein muss. Umgekehrt kann die Transposase auch in prokaryotischen Zellen induzierbar sein, z. B. um diese im Genom zu modifizieren.
Alternativ kann ein Minicircle auch durch herkömmliche Restriktions- und Ligationstechniken aus einem Parentalplasmid hergestellt werden. Hierbei wird der Bereich des Plasmids, der den Minicircle bilden soll, zum Beispiel mittels eines Restriktionsenzyms aus dem Plasmid herausgeschnitten und zu einem Minicircle ligiert. Der Minicircle kann auch aus mehreren getrennten Abschnitten zusammengesetzt werden. Zu beachten ist hierbei jedoch, dass ein so hergestellter Minicircle im Allgemeinen nicht superhelikal ist, sofern er nicht nachträglich in vitro superspiralisiert wird.
In einer Ausführungsform der Erfindung kann der Minicircle und/oder sein Parentalplasmid weiterhin mindestens eine Identifikationssequenz zur Aufreinigung des Minicircles, aber auch zu anderen Zwecken enthalten. Als Identifikationssequenz kann jede Sequenz dienen, die die Trennung der Minicircles von den Miniplasmiden ermöglicht. Insbesondere kann es sich dabei um Sequenzen handeln, die an einen spezifischen Liganden binden und so den Minicircle mit dem Liganden komplexieren können. Bei dem Liganden kann es sich um ein DNS-bindendes Protein oder um eine Nukleinsäure handeln. Die Aufreinigung kann anschließend z. B. über chromatographische Verfahren, insbesondere gegen die Identifikationssequenz gerichtete Affinitätschromatographie unter Verwendung des immobilisierten Liganden, vorgenommen werden. Geeignete Aufreinigungssysteme umfassen z. B. die Tripelhelix-Affinitätschromatographie (THAC; siehe P. Wils et al., Gene Therapy 1997, 4(4): 323–330), das lacO/lacI-System (siehe J. Lundeberg et al., Genet. Anal. Techn. Appl. 1990, 747–52), das repU/dso-System (siehe A. Müller et al., Nucleic Acids Research 1995, 23(11): 1894–1900) oder Systeme aus dem Repressor des Bakteriophagen λ oder des Bakteriophagen 434 und dem entsprechenden Promotor, für welchen der jeweilige Repressor spezifisch ist.
Die Identifikationssequenz kann sich vor der Rekombination im Minicircle- oder im Miniplasmid-Bereich des Parentalplasmids befinden. Bevorzugt sind Ausführungsformen, in denen sich die Identifikationssequenz im Minicircle-Bereich des Parentalplasmids, oder in besonders bevorzugten Ausführungsformen in der Transpositionskassette befindet, d. h. zusammen mit der Nukleinsäure von Interesse zwischen den Transposase-Erkennungssequenzen. Findet in einem solchen Minicircle-Bereich eines Parentalplasmids (oder seinen Ursprungs- oder Vorläuferplasmiden) während des Herstellungsprozesses eine spontane und unbeabsichtigte Rekombination zwischen den Transposase-Erkennungssequenzen oder den Rekombinase-Erkennungssequenzen statt, entsteht ein defektes Produkt, in dem neben den Nukleinsäuresequenz von Interesse auch die Identifikationssequenz deletiert ist. Durch gegen die Identifikationssequenz gerichtete Affinitätsaufreinigung werden somit nur intakte Minicircles isoliert. Dadurch wird das Problem der Verunreinigung von Minicircle-Präparationen durch defekte Deletionsprodukte ohne Transpositionskassette vermieden.
Ein Minicircle kann auch mehr als eine Identifikationssequenz enthalten. Hierbei können die Identifikationssequenzen identisch sein und als direkte Wiederholungen oder durch einen Spacer getrennte Wiederholungen vorliegen. Es können aber auch zwei oder mehr verschiedene Identifikationssequenzen zu unterschiedlichen Zwecken verwendet werden. Beispielsweise kann eine Sequenz, die mit einem Oligonukleotid-Liganden eine Tripelhelix ausbilden kann, außerhalb der Transpositionskassette vorliegen, um die Minicircles vor der Transfektion aufzureinigen, und zugleich eine lacOs-Sequenz innerhalb der Transpositionskassette enthalten sein, um nach der Transfektion die Transposition ins Genom nachzuweisen oder ihre Effizienz zu messen.
Veranschaulicht am Parentalplasmid aus 7 ist der Bereich innerhalb der rec-Sequenzen, in dem auch die Nukleinsäure von Interesse (NOI) liegt, geeignet, um eine oder mehrere Identifikatonssequenzen aufzunehmen, mit denen ein Minicircle identifiziert und vom bei der Herstellung entstehenden Miniplasmid getrennt werden soll. Der Bereich zwischen den IR/DR-Sequenzen, in der die NOI liegt, ist geeignet, um eine oder mehrere Identifikationssequenzen aufzunehmen, mit denen ein transponiertes genetisches Element identifiziert und gegebenenfalls aus dem Genom reisoliert werden soll. Der Miniplasmid-Bereich außerhalb der rec-Sequenzen ist geeignet, um eine oder mehrere Identifikatonssequenzen aufzunehmen, mit denen ein Miniplasmid identifiziert und vom bei der Herstellung entstehenden Minicircle getrennt werden soll.
ZELLEN
Unter einem anderen Gesichtspunkt betrifft die Erfindung auch eine Zelle, die einen Minicircle gemäß der Erfindung enthält. Hierbei kann es sich um eine Zelle aus einer beliebigen Spezies handeln. Insbesondere sind prokaryotische und eukaryotische Zellen, die Minicircles gemäß der Erfindung enthalten, von der Erfindung umfasst. In manchen Ausführungsformen ist die Zelle eine Wirbeltierzelle, bevorzugt eine menschliche Zelle. In manchen Ausführungsformen ist die Zelle eine Stammzelle, bevorzugt eine embryonale Stammzelle oder induzierbare pluripotente Zelle.
Zellen, die einen Minicircle gemäß der Erfindung enthalten, können durch herkömmliche Transfektionsverfahren hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Verwendet werden kann beispielsweise die chemische Transfektion mittels Calciumphosphat (siehe F. L. Graham et al., Virology 1973, 52(2): 456–467), mittels Dendrimeren (seihe H. L. Fu et al., Journal of Control Release 2007, 124(3): 181–188) oder mittels kationischen Polymeren (siehe EP 1505089 ). Weitere Methoden sind Lipofektion (siehe P. L. Felgner et al., P. N. A. S. 1987, 84(21): 7413–7417), Elektroporation (siehe E. Neumann et al., EMBO J. 1982, 1(7): 841–845), optische Transfektion (siehe M. Tsukakoshi et al., Applied Physics B-Photophysics and Laser Chemistry 1984, 35(3): 135–140), Magnetofektion (siehe F. Scherer et al., Gene Ther. 2009, 9(2): 102–109) oder Impalefektion (siehe T. E. McKnight et al., Nano Letters 2004, 4(7): 1213–1219). Auch können partikelbasierte Verfahren wie die Genkanone angewendet werden (siehe US 5,219,746 ). Bevorzugte Verfahren sind die Calciumphosphat-Transfektion, die Lipofektion und die Elektroporation.
Des Weiteren kann ein Minicircle gemäß der Erfindung direkt in der Zielzelle hergestellt werden, wie schon vorstehend erwähnt. Hierbei wird die Zielzelle zunächst mit einem Parentalplasmid des Minicircles transfiziert und anschließend die Expression der entsprechenden Rekombinase in der Zielzelle veranlasst, so dass die Prozessierung des Parentalplasmids mittels Rekombination zu Minicircle und Miniplasmid ermöglicht wird. Hierfür muss die Expressionssteuerung der Rekombinase in eukaryotischen Zellen gewährleistet sein, und ein für die Rekombinase kodierendes Gen muss in der Zielzelle vorliegen. Das Rekombinase-Gen kann sowohl in die genomische DNS der Zielzelle integriert sein oder auch auf einem anderen Nukleinsäuremolekül vorliegen. Besonders vorteilhaft ist es, wenn das Rekombinase-Gen auf dem Parentalplasmid innerhalb der Miniplasmid-Region vorliegt.
VERFAHREN ZUR INSERTIONSMUTAGENESE ODER TRANSFORMATION
Unter einem weiteren Gesichtspunkt umfasst die Erfindung ein Verfahren zur Insertionsmutagenese oder zur genetischen Transformation einer eukaryotischen Zielzelle. Die Zielzelle kann eine beliebige eukaryotische Zelle sein, ist aber vorzugsweise eine Wirbeltierzelle. Besonders bevorzugt sind menschliche Zellen, einschließlich beispielsweise embryonaler Stammzellen oder induzierbarer pluripotenter Zellen.
Im Rahmen dieses Verfahrens wird ein Minicircle gemäß der Erfindung in der Zielzelle bereitgestellt und die Zielzelle mit einem Vektor transfiziert, der ein Gen für eine entsprechende, für die Transposase-Erkennungssequenzen des Minicircles spezifische Transposase enthält. Insbesondere kann die Transposase eine SB-Transposase oder eine Piggy-Bac-Transposase sein. Besonders bevorzugt sind Vektoren, die für die Transposasen SB10 oder SB100X kodieren.
Wie bereits vorstehend beschrieben, umfasst das Bereitstellen des Minicircles in der Zielzelle vorzugsweise die Transfektion der Zielzelle mit dem Minicircle. Hierzu geeignete Transfektionsverfahren sind dem Fachmann bekannt, wie ebenfalls vorstehend beschrieben. Besonders bevorzugte Verfahren sind die Calciumphosphat-Transfektion, die Lipofektion und die Elektroporation. Alternativ zur Transfektion mit dem Minicircle kann der Minicircle jedoch auch direkt in der Zielzelle hergestellt werden.
Bei dem Vektor, der das entsprechende Transposase-Gen enthält (Transposase-Vektor), kann es sich um einen beliebigen Typ Vektor aus dem Stand der Technik handeln, der zur Transfektion von eukaryotischen Zielzellen geeignet ist. Insbesondere kann der Vektor ein Plasmid, ein Miniplasmid, ein Cosmid, ein Minicircle, ein einzel-, doppel- oder mehrsträngiges lineares DNS-Molekül, eine RNS, ein Protein, ein vitaler Vektor oder ein zelluläres Zwischenprodukt der viralen Vermehrung, ein virus-like-particle (VLP) oder ein Mikroorganismus sein. Besonders bevorzugt im Sinne der Erfindung ist ein Minicircle, da hierbei der wichtige Vorteil gewahrt bleibt, kein unnötiges fremdes Material in die Zielzelle einzubringen, das beispielsweise zu unerwünschten immunogenen Nebenwirkungen führen könnte. Entscheidend ist, dass die Expressionssteuerung der Transposase in eukaryotischen Zellen gewährleistet ist. Vorzugsweise ist die Expression der Transposase in der Zielzelle induzierbar, beispielsweise über eine Temperaturänderung oder die Zugabe eines Metaboliten.
Die Transfektion der Zielzelle mit dem Transposase-Vektor kann vor, zugleich mit oder nach der Bereitstellung des Minicircles in der Zielzelle erfolgen. Beispielsweise können der Transposase-Vektor und der Minicircle in einer Kotransfektion zugleich in die Zielzelle eingebracht werden. Wird der Minicircle innerhalb der Zielzelle aus dem Parentalplasmid erzeugt, kann die Transfektion mit dem Transposase-Vektor vor, zugleich mit oder nach des Transfektion mit dem Parentalplasmid erfolgen. Eine Ausführungsform des Verfahrens ist schematisch in 5 dargestellt.
Nachdem sowohl der Minicircle als auch der Transposase-Vektor in der Zielzelle bereitgestellt wurden, wird die Expression des Transposase-Gens in der Zielzelle eingeleitet. Dies führt zur Rekombination der Transposase-Erkennungssequenzen und zur Integration der Nukleinsäuresequenz von Interesse im Genom der Zielzelle.
KITS
Des Weiteren umfasst die Erfindung unter einem weiteren Gesichtspunkt auch Kits zur Insertionsmutagenese oder zur genetischen Transformation einer eukaryotischen Zielzelle. Ein Kit umfasst hierbei einen Minicircle gemäß der Erfindung und einen entsprechenden Transposase-Vektor, der für eine für die Transposase-Erkennungssequenzen auf dem Minicircle spezifische Transposase kodiert. In einer besonderen Ausführungsform stammen die Transposase-Erkennungssequenzen im Minicircle aus dem SB-Transposon, während der Transposase-Vektor für eine SB-Transposase, z. B. SB10 oder SB100X, kodiert. In einer weiteren Ausführungsform kann die Transposase auf einem Minicircle kodiert sein bzw. beide – die Transposase und die Transpositionskassette – jeweils auf unterschiedlichen Minicirclemolekülen oder demselben Minicirclemolekül liegen.
Der Minicircle und/oder der Transposase-Vektor können in dem Kit trocken, z. B. lyophilisiert, vorliegen. Alternativ können sie auch in einem Puffer gelöst und die Lösung flüssig oder gefroren sein. Des Weiteren können sie gemischt oder voneinander getrennt in verschiedenen Behältern vorhanden sein. Zusätzlich zum Minicircle und dem Transposase-Vektor kann der Kit auch weitere Bestandteile enthalten, die zur Ausführung eines Verfahrens gemäß der Erfindung nützlich sind, wie etwa Chemikalien, Reagenzien, Puffer, Lösungsmittel oder Medien für die Ausführung der Verfahren der Erfindung. Insbesondere kann der Kit Reagenzien enthalten, die für eine chemische Transfektion oder eine Lipofektion notwendig sind. Manche oder alle der Reagenzien können in abgemessenen Einheitsmengen vorliegen, z. B. um den Pipettieraufwand des Nutzers auf ein Mindestmaß zu beschränken.
Zusätzlich kann der Kit auch Beschreibungen des Minicircles und/oder des Transposase-Vektors, wie etwa Vektorkarten oder Sequenzen enthalten. Ebenso können Anweisungen zur Durchführung der betreffenden Ausführungsform der Erfindung Bestandteil des Kits sein.
Beispiele
BEISPIEL 1:
Konstruktion eines Parentalplasmids (GFP-Parentalplamid) für Minicircles umfassend eine Transpositionskassette für GFP
Das Plasmid pCMV-GFP (3487 bp, Artikel-Nr. PF463, PlasmidFactory, Bielefeld, DE), das eine Expressionskassette für Grün fluoreszierendes Protein (GFP) enthält, wird als Ausgangsmaterial zur gezielten Amplifikation der darauf enthalten GFP-Expressionskassette verwendet. Die beiden Primer (Forward: 5'-CGCCGAATTCGCCGGTTAATTAAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATG-3', s. auch 1E; und Reverse: 5'-GCGCGAATTCCGGCGTTAATTAACCCCTGAACCTGAACATAAAATGAATGCAATTGTTG-3' s. auch 1F) erzeugen durch PCR ein EcoRI-Fragment, das die genannte Expressionskassette umfasst. Das Fragment wird mittels Agarosegelelektrophorese und eines NucleoSpin^® Extract II Gel-Extraktions-Kits (Macherey-Nagel, Düren, DE) aufgereinigt.
Das Plasmid pT2/BH (Addgene Zugangsmummer 26556; siehe 4) enthält das linke IR/DR-Element Lmut44 (s. auch 6A; SEQ ID NO: 7) und das rechte IR/DR-Element Rmut13delta13 (s. auch 6B; SEQ ID NO: 8). Dazwischen befindet sich eine multiple Klonierungsstelle (MCS), in die die amplifzierte Expressionskassette hineinkloniert werden kann. Dieses Plasmid wird mit dem Enzym EcoRI (Artikel Nr. R0101L, NEB, Frankfurt, DE) in der MCS geschnitten und mit Alkalischer Phosphatase (Artikel Nr. M0290L, NEB, Frankfurt, DE) dephosphoryliert. Anschließend wird das EcoRI-Fragment mit der GFP-Expressionskassette mit T4-Ligase (Artikel Nr. M0202L, NEB, Frankfurt, DE) in den linearisierten Vektor ligiert, um das Plasmid pT2-IR-GFP zu erhalten.
Nach Vermehrung und Herstellung des Plasmids wird die Transpositionskassette, die die IR/DR-Elemente und zwischen ihnen die Expressionskassette umfasst, mit BamHI (Artikel Nr. R0136L, NEB, Frankfurt, DE) aus dem Plasmid ausgeschnitten. Die überhängenden Einzelstrangenden werden mit Klenow-Polymerase (DNA-Polymerase I, Artikel Nr. M0210L, NEB, Frankfurt, DE) aufgefüllt und das Fragment wie oben beschrieben aufgereinigt.
Das Vorläuferplasmid, das zur Aufnahme der Transpositionskassette dient (siehe P. Mayrhofer et al., J. Gene Med. 2008, 10(11): 1253–1269), enthält eine MCS, die von Rekombinase-Erkennungssequenzen der parA-Resolvase flankiert ist, zwei Identifikationssequenzen und eine Expressionskassette der parA-Resolvase außerhalb der Rekombinase-Erkennungssequenzen. Dieses Plasmid wird mit dem Enzym EcoRV (Artikel Nr. R0195L, NEB, Frankfurt, DE) in der MCS geschnitten und mit Alkalischer Phosphatase (Artikel Nr. M0290L, NEB, Frankfurt, DE) dephosphoryliert. Anschließend wird die Transpositionskassette mit T4-Ligase in den linearisierten Vektor ligiert, um das GFP-Parentalplasmid pP-IR-GFP (3a; Klonierungschritte in 5, rechts) zu erhalten.
BEISPIEL 2:
Konstruktion eines weiteren Parentalplasmids (GFP-Parentalplamid) für Minicircles umfassend eine Transpositionskassette für GFP
Das Plasmid pCMV-GFP (3487 bp, Artikel-Nr. PF463, PlasmidFactory, Bielefeld, DE), das eine Expressionskassette für Grün fluoreszierendes Protein (GFP) enthält, wird als Ausgangsmaterial zur gezielten Amplifikation der darauf enthalten GFP-Expressionskassette verwendet. Die beiden Primer (Forward: 5'-CGCCGAATTCGCCGGTTAATTAAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATG-3', s. auch 1E; und Reverse: 5'-GCGCGAATTCCGGCGTTAATTAACCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTG-3' s. auch 1F) erzeugen durch PCR ein EcoRI-Fragment, das die genannte Expressionskassette umfasst. Das Fragment wird mittels Agarosegelelektrophorese und eines NucleoSpin^® Extract II Gel-Extraktions-Kits (Macherey-Nagel, Düren, DE) aufgereinigt.
Das Plasmid pT2/BH (Addgene Zugangsmummer 26556; siehe 4) enthält das linke IR/DR-Element Lmut44 (s. auch 6A; SEQ ID NO: 7) und das rechte IR/DR-Element Rmut13delta13 (s. auch 6B; SEQ ID NO: 8). Dazwischen befindet sich eine multiple Klonierungsstelle (MCS), in die die amplifizierte Expressionskassette hineinkloniert werden kann. Dieses Plasmid wird mit dem Enzym EcoRI (Artikel Nr. R0101L, NEB, Frankfurt, DE) in der MCS geschnitten und mit Alkalischer Phosphatase (Artikel Nr. M0290L, NEB, Frankfurt, DE) dephosphoryliert. Anschließend wird das EcoRI-Fragment mit der GFP-Expressionskassette mit T4-Ligase (Artikel Nr. M0202L, NEB, Frankfurt, DE) in den linearisierten Vektor ligiert, um das Plasmid pT2-IR-GFP zu erhalten.
Nach Vermehrung und Herstellung des Plasmids wird die Transpositionskassette, die die IR/DR-Elemente und zwischen ihnen die Expressionskassette umfasst, mit BamHI (Artikel Nr. R0136L, NEB, Frankfurt, DE) aus dem Plasmid ausgeschnitten. Die überhängenden Einzelstrangenden werden mit Klenow-Polymerase (DNA-Polymerase I, Artikel Nr. M0210L, NEB, Frankfurt, DE) aufgefüllt und das Fragment wie oben beschrieben aufgereinigt.
Das Vorläuferplasmid pP11, das zur Aufnahme der Transpositionskassette dient (siehe P. Mayrhofer et al., J. Gene Med. 2008, 10(11): 1253–1269, nun jedoch ohne MCS, ohne Spacer und mit einer statt zwei Identifikationssequenzen) enthält eine MCS, die von Rekombinase-Erkennungssequenzen der parA-Resolvase flankiert ist, und eine Expressionskassette der parA-Resolvase außerhalb der Rekombinase-Erkennungssequenzen. Dieses Plasmid wird mit dem Enzym PmeI (Artikel Nr. R0560L, NEB, Frankfurt, DE) in der MCS geschnitten und mit Alkalischer Phosphatase (Artikel Nr. M0290L, NEB, Frankfurt, DE) dephosphoryliert. Anschließend wird die Transpositionskassette mit T4-Ligase in den linearisierten Vektor ligiert, um das GFP-Parentalplasmid pP11-IR-GFP (3b) zu erhalten.
BEISPIEL 3:
Konstruktion eines Parentalplasmids (SB10-Parentalplasmid) für Minicircles umfassend eine SB10-Expressionskassette
Das Plasmid pSB10 (4732 bp, Addgene Zugangsnummer 24551), das für die Dornröschen-Transposase SB10 kodiert, wird mit den Restriktionsenzymen SalI (Artikel Nr. R0138L, NEB, Frankfurt, DE) und EcoRI (Artikel Nr. R0101L, NEB, Frankfurt, DE) verdaut, wobei ein Fragment entsteht, das die Expressionskassette umfasst. Die überhängenden Einzelstrangenden werden mit Klenow-Polymerase (DNA-Polymerase I, Artikel Nr. M0210L, NEB, Frankfurt, DE) aufgefüllt und das Fragment wie oben beschrieben aufgereinigt.
Das Vorläuferplasmid aus Beispiel 1 (siehe P. Mayrhofer et al., J. Gene Med. 2008, 10(11): 1253–1269) enthält eine MCS, die von Rekombinase-Erkennungssequenzen der parA-Resolvase flankiert ist, zwei Identifikationssequenzen und eine Expressionskassette der parA-Resolvase außerhalb der Erkennungssequenzen. Dieses Plasmid wird mit dem Enzym EcoRV (Artikel Nr. R0195L, NEB, Frankfurt, DE) in der MCS geschnitten und mit Alkalischer Phosphatase (Artikel Nr. M0290L, NEB, Frankfurt, DE) dephosphoryliert. Anschließend wird die Transpositionskassette mit T4-Ligase in den linearisierten Vektor ligiert, um das SB10-Parentalplasmid pP-SB10 (Klonierungschritte in 5, links) zu erhalten.
Statt des Vorläuferplasmids aus Beispiel 1 (P. Mayrhofer et al., J. Gene Med. 2008, 10(11): 1253–1269) kann auch pP11 aus Beispiel 2 verwendet werden, um die SB10-Transpositionskassette aufzunehmen. Dieses Plasmid wird dafür mit dem Enzym PmeI (Artikel Nr. R0560L, NEB, Frankfurt, DE) in der MCS geschnitten und mit Alkalischer Phosphatase (Artikel Nr. M0290L, NEB, Frankfurt, DE) dephosphoryliert. Anschließend wird die Transpositionskassette mit T4-Ligase in den linearisierten Vektor ligiert, um das SB10-Parentalplasmid pP11-SB10 zu erhalten.
Statt des Plasmids pSB10 kann in diesem Verfahren ebenso das Plasmid pSB100X (L. Mátés et al., Nat. Genet. 2009, 41: 753–761) verwendet werden, das für die Dornröschen-Transposase SB100X kodiert. Dabei wird das SB100X-Parentalplasmid als pP-SB100X (2 tag) erhalten.
BEISPIEL 4:
Herstellung von Minicircles aus GFP- bzw. SB10-Parentalplasmiden
Die Kultivierung wird bei 37°C in einem MBR-Bioreaktor (MBR BIO REACTOR, Schweiz) mit einem Gesamtvolumen von 7 1 bei einer Füllmenge von 51 durchgeführt. Die Anpassung des pHs auf pH 7 wird mit 2 M Natriumhydroxidlösung und 2 M Phosphorsäure durchgeführt. Die Flussrate der Luft wird auf 5 l/min eingestellt. Die Sauerstoffkonzentration (60%) wird durch die Variierung der Rührergeschwindigkeit im Bereich von 500 bis 2000 pro Minute kontrolliert. Es wird LB-Medium ohne Zugabe von Antibiotika verwendet. Das Verfahren wird sowohl mit pP-IR-GFP- als auch p2-SB10-Parentalplasmiden durchgeführt.
Der Bioreaktor wird mit 50 ml einer Vorkultur von E. coli K12, die mit Parentalplasmid transformiert und für etwa 15 h bei 28°C kultiviert wurden, angeimpft. Die Vorkulturen werden unter selektiven Bedingungen unter Zugabe von 75 mg/ml Kanamycin kultiviert. Das LB-Medium der Vorkulturen wird mit Glucose angereichert, um eine vorzeitige Expression der parA-Resolvase, die unter der Kontrolle des P_BAD-Promotors steht, zu verhindern.
Die Expression der parA-Resolvase wird bei einer OD₆₀₀ zwischen 3,5 und 5,0 durch die Zugabe von L-Arabinose zum Medium induziert. Nach einer Stunde weiteren Wachstums werden die Zellen mittels Zentrifugation für 6 min bei 9039 g geerntet, in Lagerbeutel überführt, eingefroren und bei –20°C gelagert, bevor die Rekombinationsprodukte aufgereinigt werden.
Während der Kultivierung im Bioreaktor werden mit einem automatischen Probensammler Proben entnommen und bei 4°C zur weiteren Analyse gelagert. Die OD₆₀₀ wird gemessen und die Plasmide werden aufgereinigt (NucleoBond^® PC 100, Macherey-Nagel, Düren), um die Plasmidausbeute und die Rekombinationseffizienz zu bestimmen.
Aus der erhaltenen Biomasse werden die Rekombinationsprodukte Minicircle und Miniplasmid mittels kommerziell erhältlicher Plasmidisolierungskits (NucleoBond^® PC 10000, Macherey & Nagel, Düren) aufgereinigt.
Zur Isolierung des Minicircles aus der Mischung aus Minicircle und Miniplasmid wir eine spezifische Affinitätschromatographie verwendet. Hierzu wird ein biotinylierter Repressor des Lactose-Operons an Streptavidin Sepharose High Performance (GE Healthcare) gekoppelt (vgl. Mayrhofer et al., 2008).
Mit 5 ml dieser Chromatograhiematrix wird eine XK 16 Chromatographiesäule befüllt und mit dem fünffachen Säulenvolumen 50 mM Tris pH 8, 400 mM NaCl equilibriert. Die Mischung der Rekombinationsprodukte (1 mg/ml in 50 mM Tris pH 8, 400 mM NaCl) wird anschließend in einem ÄKTA-System (GE Healthcare) bei einer Flussrate von 0,5 ml/min auf das Säulenmaterial aufgetragen. Die Säule wird mit 50 mM Tris pH 8, 400 mM NaCl bei einer Flussrate von 1 ml/min gewaschen bis das am Gerät detektierte UV_260nm-Signal auf eine stabile Basislinie absinkt. Nun wird die Minicircle-DNS mit 50 mM Tris pH8, 500 mM NaCl, 5 mM IPTG eluiert, danach wird die Säule mit 50 mM Tris pH 8, 1 M NaCl und 50 mM Tris pH 8 gewaschen und zur weiteren Verwendung erneut eqilibriert.
Durch Präzipitation wird die DNS aus der Hochsalzmischung entfernt und schließlich in Wasser resuspendiert.
Die DNS der MC-IR-GFP und MC-SB10 werden jeweils auf eine Konzentration von 1 mg/ml eingestellt.
Statt des Parentalplasmids pP-SB10 kann alternativ auch das Parentalplasmid pP-SB100X als Ausgangsmaterial verwendet werden. Dabei wird der Minicircle MC-SB100X erhalten.
Außerdem kann statt des Parentalplasmids pP-IR-GFP kann alternativ auch das Parentalplasmid pP11-IR-GFP als Ausgangsmaterial verwendet werden. Dabei wird der Minicircle MC-IR-GFP mit einer statt mit zwei tag-Sequenzen erhalten.
BEISPIEL 5:
Kotransfektion von Zielzellen mit GFP- und SB10-Minicircles und Transposition der Expressionskassette
Jurkat-Zellen (humane T-Zell-Leukämie-Linie, DSMZ) werden in RPMI 1640-Medium in Anwesenheit von FCS (fötalem Kälberserum; PAA, Linz) bei 37°C und 5% CO₂ kultiviert.
Zur Transfektion werden die Zellen in serumfreiem Medium resuspendiert, so dass eine Zelldichte von ca. 7,5 × 10⁵ Zellen/ml entsteht. 400 μl dieser Zellsuspension werden mit 20 μg MC-IR-GFP und 10 μg MC-SB10 versetzt und durch vorsichtiges Umschwenken gut durchmischt. Der elektroporative Gentransfer erfolgt anschießend mit einem Bio-Rad Gene-Pulser II (Bio-Rad, Foster City, CA, USA). Hierzu werden die Zellen in entsprechende Küvetten mit einem Elektrodenabstand von 4 mm gegeben und bei einer am Gerät eingestellten Spannung von 200 V und einer Kapazität von 1600 μF elektroporiert. Die Küvette mit der Zellsuspension wird unmittelbar danach für 5 min auf Eis gelagert, anschließend werden die Zellen in Kulturschalen mit vorgewärmtem Kulturmedium (37°C, mit FCS) pipettiert und wie oben beschrieben weiter kultiviert.
Die Kotransfektion der beiden DNS (20 μg MC-IR-GFP und 10 μg MC-SB10) führt zur konstitutiven Expression der SB10-Transposase in den Zielzellen. Nach Erreichen einer ausreichenden Menge an SB10 Protein in der Zelle interagiert dieses mit den für die Transposition relevanten DNS-Strukturen und die Transposition erfolgt. Eine Transfektion unter Weglassen von MC-SB10 (also ohne Transposase-Expression) führt zu keiner Transposition, wohl aber zur Expression des GFP vom episomalen Vektor aus.
Die Detektion und Quantifizerung durch die GFP-Expression fluoreszenter Zellen erfolgt zu definierten Zeitpunkten, z. B. 24 h, 48 h, etc. nach Transfektion mit einem handelsüblichen Fluoreszenzmikroskop mit entsprechendem Filtersatz. Die Bestimmung der Effizienz der Transposition beruht auf der Annahme, dass, neben einer sich über die Zeit ausverdünnenden transienten GFP-Expression nicht-transponierter Sequenzen, die GFP-Expression der im Chromosom der Zielzelle integrierten Expressionseinheiten mit der Zeit konstant bleibt. Als Maß für die Transpositionseffizienz wird deshalb der konstante Basiswert der GFP-Expression verwendet, der nach dem Abklingen der transienten Expression gemessen wird.
Statt des Minicircles MC-SB10, kann in diesem Verfahren alternativ auch 10 μg des Minicircle MC-SB100X mit 20 μg MC-IR-GFP versetzt und analog vorgegangen werden.
Darüber hinaus kann auch lediglich eine der beiden kotransfizierten DNS ein Minicircle sein, während das andere ein Standardplasmid ist (siehe auch Beispiel 6).
Die Verfahren aus den Beispielen 1–5 sind auch schematisch in 5 dargestellt.
Die Transposition nach Kotransfektion kann durch die Verwendung induzierbarer und in eukaryontischen Zellen funktionsfähiger Promotoren gesteuert werden. Im hier gezeigten Beispiel erfolgte sie unreguliert.
BEISPIEL 6:
Vergleich der Transpositionseffizienz zwischen Transposon-Minicircle und Transposon-Plasmid
Der Versuch aus Beispiel 5 wird wiederholt, allerdings wird statt des Minicircles MC-IR-GFP eine äquimolare Menge des Vergleichsplasmids pT2-IR-GFP (siehe Beispiel 2) transfiziert. Die Transpositionseffizienz wird mit derjenigen aus Beispiel 5 verglichen.
Die Effizienz der Transposition im Vergleich zwischen Plasmid-basierter Transposition (Transfektion mit pP-IR-GFP) und Minicircle-basierter Transposition (Transfektion mit MC-IR-GFP, siehe Beispiel 5) zeigt, dass die Zahl der durch Minicircle-Transposons transformierten Zellen höher ist als die, deren Transposon auf einem Plasmid kodiert vorliegt. Die Effizienz wird nicht dadurch gesteigert, dass die SB10 Transposase Minicircle-basiert statt Plasmid-basiert vorliegt, sofern äquimolare Mengen an MC-SB10- und pSB10-DNS pro Zelle verglichen werden.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

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Mayrhofer et al., 2008 [0105]

Claims

Ein Minicircle umfassend: a) mindestens eine Nukleinsäuresequenz von Interesse, und b) Transposase-Erkennungssequenzen zu beiden Seiten der Nukleinsäure von Interesse, charakterisiert dadurch, dass die Transposase-Erkennungssequenzen von einer spezifischen Transposase, oder dem Derivat einer Transposase, erkannt und zur Transposition verwendet werden können, wobei die spezifische Transposase vorzugsweise eine Dornröschen-Transposase oder eine PiggyBac-Transposase ist.
Der Minicircle aus Anspruch 1, wobei die mindestens eine Nukleinsäuresequenz von Interesse eine Expressionskassette mit mindestens einem Gen, mindestens einer Isolatorsequenz oder einer Kombination davon umfasst.
Der Minicircle aus einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei der Minicircle mindestens eine Identifikationssequenz innerhalb des Bereichs zwischen den Transposase-Erkennungssequenzen umfasst, oder wobei der Minicircle mindestens eine Identifikationssequenz außerhalb des Bereichs zwischen den Transposase-Erkennungssequenzen umfasst.
Der Minicircle aus einem der Ansprüche 1–3, wobei der Minicircle ein Paar Rekombinase-Erkennungssequenzen umfasst, die zu beiden Seiten der Nukleinsäure von Interesse innerhalb der Transposase-Erkennungssequenzen liegen.
Der Minicircle aus einem der Ansprüche 1–4, wobei der Minicircle keinen Selektionsmarker zur Amplifikation in prokaryotischen Zellen enthält.
Der Minicircle aus einem der Ansprüche 1–5, wobei der Minicircle ein ringförmiges, superspiralisiertes DNS-Molekül ist.
Eine Zelle umfassend den Minicircle aus einem der Ansprüche 1–6.
Verfahren zur Insertionsmutagenese oder zur genetischen Transformation einer eukaryotischen Zielzelle, das Verfahren umfassend: a) Bereitstellen eines Minicircles umfassend eine Nukleinsäuresequenz von Interesse aus einem der Ansprüche 1–6 innerhalb der Zielzelle; b) Transfektion der Zielzelle mit einem Vektor umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die für eine Transposase kodiert, die für die Transposase-Erkennungssequenzen des Minicircles spezifisch ist; c) Expression der Transposase von dem Vektor; und d) Rekombination der Nukleinsäuresequenz von Interesse mit einer Nukleinsäure der Zielzelle.
Das Verfahren aus Anspruch 8, wobei das Bereitstellen aus Schritt a) durch Transfektion der Zielzelle mit dem Minicircle oder durch Erzeugung des Minicircles innerhalb der Zielzelle erreicht wird.
Das Verfahren aus einem der Ansprüche 8 oder 9, wobei die Schritte a) und b) i) zugleich in einer Kotransfektion durchgeführt werden; oder ii) wobei Schritt a) vor Schritt b) durchgeführt wird; oder iii) wobei Schritt a) nach Schritt b) durchgeführt wird.
Das Verfahren aus einem der Ansprüche 8–10, wobei die Zielzelle eine Wirbeltierzelle ist, und vorzugsweise eine menschliche Zelle ist.
Eine Zelle erhalten durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8–11.
Ein Kit zur Insertionsmutagenese oder zur genetischen Transformation einer eukaryotischen Zielzelle umfassend: a) den Minicircle aus einem der Ansprüche 1–8, und b) einen Vektor, der für eine Transposase kodiert, die für die Transposase-Erkennungssequenzen des Minicircles spezifisch ist.
Das Kit aus Anspruch 13, wobei für die Transposase-Erkennungssequenzen im Minicircle a) eine Dornröschen-Transposase spezifisch ist und die vom Vektor b) kodierte Transposase die Dornröschen-Transposase oder ein Derivat davon ist, wobei die Dornröschen-Transposase vorzugsweise die hyperaktive Dornröschen-Transposase SB100X ist.