DE102008032164B4 - Verfahren und Vorrichtung zur Trennung eines Analytgemisches und zur Detektion der Analytsubstanzen mittels kontinuierlicher trägerfreier Elektrophorese - Google Patents
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Abstract
Verfahren zur Trennung eines Analytgemisches und zur Detekktion der Analytsubstanzen mittels kontinuierlicher trägerfreier Elektrophorese (CFFE), bei welchem ein Analytgemisch eine Separationskammer hydrodynamisch durchströmt, wobei ein elektrisches Feld quer zur Hauptflussrichtung in die Separationskammer eingekoppelt wird, durch welches die einzelnen Analytsubstanzen unterschiedlich gegenüber der Hauptflussrichtung abgelenkt werden, wobei die Analytsubstanzen optisch detektiert werden, dadurch gekennzeichnet, dass die markerfreien Analytsubstanzen mittels Raman-Spektroskopie mit oberflächenverstärkter Raman-Streuung (SERS) detektiert werden.
Description
- Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Trennung eines Analytgemisches und zur Detektion der Analytsubstanzen mittels kontinuierlicher trägerfreier Elektrophorese (continuous free-flow electrophoresis, CFFE), bei welchem ein Analytgemisch eine Separationskammer hydrodynamisch durchströmt, wobei ein elektrisches Feld quer zur Hauptflussrichtung in die Separationskammer eingekoppelt wird, durch welches die einzelnen Analytsubstanzen unterschiedlich gegenüber der Hauptflussrichtung abgelenkt werden, wobei die Analytsubstanzen optisch detektiert werden.
- Ferner betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Trennung eines Analytgemisches und zur Detektion der Analytsubstanzen mittels kontinuierlicher trägerfreier Elektrophorese (CFFE) mit einer Separationskammer, welche in einer Hauptflussrichtung vom Analytgemisch hydrodynamisch durchströmt und in welche quer zur Hauptflussrichtung ein elektrisches Feld eingekoppelt wird, und mit einer optischen Detektionseinrichtung zur wenigstens bereichsweisen räumlichen Erfassung der Separationskammer.
- Neben der Chromatographie zählt die Elektrophorese, und zwar insbesondere die sogenannte Kapillarelektrophorese, zu den am häufigsten eingesetzten Trennmethoden. Die Elektrophorese beruht auf unterschiedlichen Wanderungsgeschwindigkeiten von geladenen Molekülen in einem elektrischen Feld, welche von der Art und Anzahl der Ladungen sowie vom Molekülradius abhängig sind. Diese stoffspezifische Abhängigkeit wird als elektrophoretische Mobilität µ bezeichnet.
- Eine andere elektrophoretische Technik ist die kontinuierliche trägerfreie Elektrophorese (continuous free-flow electrophoresis, CFFE) die ursprünglich als Trenntechnik zur Isolierung und Reinigung von Zellen und Proteinen entwickelt wurde.
- Während bei der Kapillarelektrophorese das elektrische Feld entlang der Fließrichtung angelegt wird und sich somit eine longitudinale Wanderung und Trennung der Analytmoleküle ergibt, wird das elektrische Feld bei der CFFE quer zu einem Fluss des Analytgemisches appliziert, welches die Separationskammer hydrodynamisch durchströmt. Dabei wirken auf jedes Analytmolekül zwei senkrecht aufeinander stehende Geschwindigkeitsvektoren. Ein Geschwindigkeitsvektor wirkt entlang des Pufferflusses mit dessen Betrag, der zweite entlang des elektrischen Feldes mit einem Betrag, der von der elektrophoretischen Mobilität des entsprechenden Analyten abhängig ist. Der resultierende Summationsvektor ist um einen Winkel von der Flussrichtung abgelenkt. Bei einem Gemisch aus mehreren Analytmolekülen, die sich in ihren elektrophoretischen Mobilitäten unterscheiden, ergeben sich voneinander verschiedene Summationsvektoren, die eine Ablenkung der Analytmoleküle von der Hauptflussrichtung und damit eine zweidimensionale Trennung des Substanzgemisches nach sich zieht. In einem sich etablierenden Gleichgewichtszustand können die aufgetrennten Substanzen für weitere Bearbeitungsschritte am Ausgang der Trennkammer kontinuierlich gesammelt oder abgeleitet werden, während die Trennung bei der Kapillarelektrophorese nur diskontinuierlich im Zyklus zwischen Probeninjektion und Separation erfolgen kann.
- Die kontinuierliche trägerfreie Elektrophorese wurde mittlerweile für den Einsatz in verschiedenen Modi adaptiert, die aus der Kapillarelektrophorese bekannt sind. Beispiele sind Zonenelektrophorese, Isotachophorese, Feldsprungelektrophorese und isoelektrisches Fokussieren.
- Während kommerzielle Geräte Separationskammer- bzw. Trennbettvolumen von mehreren Millimetern haben und die Trennzeit mehrere Minuten beträgt, konnten für miniaturisierte Strukturen mit Volumen von wenigen Mikro- oder Nanolitern Trennzeiten von Sekunden und Subsekunden erreicht werden. So konnte beispielsweise ein Gemisch von Fluorescein und Rhodamin-110 im Modus der Zonenelektrophorese innerhalb von 100 ms getrennt werden, wie aus der Druckschrift Anal. Chem. 2003, Vol. 75, S. 5759-5766 bekannt ist, welche die Merkmale des jeweiligen Oberbegriffs der Patentansprüche 1 und 2 offenbart. Ein Verfahren und eine Vorrichtung dieser Art sind auch aus der Druckschrift Anal. Chem. 2006, Vol. 78, S. 3815-3819 bekannt.
- Ein erheblicher Nachteil bei diesen bekannten gattungsgemäßen Verfahren ist, dass gegenwärtig eine Verfolgung einer zweidimensionalen Trennung der Analytsubstanzen nur mittels optischer Verfahren nach vorangegangener Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen möglich ist. Eine Markierung durch Farbstoffe verändert jedoch einerseits physiko-chemische Eigenschaften der Analytsubstanzen und führt damit zu verfälschten analytischen Aussagen und behindert andererseits mögliche weitere Untersuchungen.
- Aus
DE 10 2005 029 070 B3 der Anmelderin ist bereits ein markerfreies Verfahren bekannt geworden, bei dem die Analytsubstanzen jedoch nicht optisch detektiert werden, sondern durch Messung der elektrischen Leitfähigkeit an einer Vielzahl von Punkten in der Separationskammer und anschließende Visualisierung der ermittelten Leitfähigkeitswerte. - Aus der Druckschrift Anal. Chem. 1995, Vol. 67, S. 4255-4260 sowie der Druckschrift Journal of Chromatography A, 1988, Vol. 805, S. 269-275 ist es grundsätzlich bekannt, bei der Kapillar-Elektrophorese zur Detektion die Raman-Spektroskopie einzusetzen. Es hat sich jedoch herausgestellt, dass die normale Raman-Spektroskopie bei der kontinuierlichen trägerfreien Elektrophorese nicht geeignet ist.
- Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Vorrichtung der gattungsgemäßen Art so weiterzuentwickeln, dass eine optische Detektion der Analytsubstanzen ohne vorangegangene Markierung möglich ist.
- Diese Aufgabe wird mit einem Verfahren der eingangs bezeichneten Art erfindungsgemäß dadurch gelöst, dass die markerfreien Analytsubstanzen mittels Raman-Spektroskopie mit oberflächenverstärkter Raman-Streuung (SERS) detektiert werden.
- Es hat sich herausgestellt, dass es möglich ist, markerfreie Analytsubstanzen optisch mittels der Raman-Spektroskopie mit oberflächenverstärkter Raman-Streuung zu detektieren. Bei der Raman-Spektroskopie wird die Frequenzverschiebung der vom Molekül emittierten Strahlung aufgrund von inelastischen Streuungen zur Analyse benutzt. Die Raman-Signale stellen für jeden Analyten einen eindeutigen spektroskopischen Fingerabdruck dar und dienen so zur Zuordnung des Molekültyps. Normalerweise zeigen Moleküle einen sehr kleinen Raman-Streuquerschnitt, so dass eine hohe Laserintensität oder eine hohe Analytkonzentration benötigt wird, um detektierbare Signale zu erhalten. Zur Verstärkung des Raman-Signales kann man die Analytmoleküle in die Nähe bestimmter rauher Oberflächen (z.B. Silber) bringen, um einen sogenannten „surface enhanced Raman scattering - SERS“-Effekt zu erhalten.
- Zur Lösung der eingangs gestellten Aufgabe sieht die Erfindung auch eine Vorrichtung zur Durchführung des vorgenannten Verfahrens vor, die sich dadurch auszeichnet, dass die optische Detektionseinrichtung eine Einrichtung zur Raman-Schwingungsspektroskopie mit oberflächenverstärkter Raman-Streuung (SERS) ist.
- Die Erfindung ist nachstehend anhand der Zeichnung beispielhaft näher erläutert. Diese zeigt in:
-
1 in vergrößertem Maßstab eine Prinzipdarstellung einer Separationskammer und -
2 beispielhaft zwei Raman-Spektren zweier verschiedener Substanzen. - Eine Vorrichtung zur Trennung eines Analytgemisches und zur Detektion der Analytsubstanzen mittels kontinuierlicher trägerfreier Elektrophorese ist in
1 allgemein mit1 bezeichnet. Die Vorrichtung1 weist eine miniaturisierte Separationskammer2 auf, die Außenabmessungen von beispielsweise 4 mm × 12 mm hat. Diese Separationskammer2 weist an ihrem Eingang ein Probenreservoir3 und ein Pufferreservoir4 auf, welche jeweils über Zuführungskanäle5 mit der Separationskammer2 verbunden sind. - Am in Hauptströmungsrichtung
6 gesehen anderen Ende der Separationskammer2 sind Fraktionierungskanäle7 vorgesehen. Zu beiden Seiten der Separationskammer2 ist jeweils ein Elektrolytreservoir8 bzw.9 mit Verbindungskanälen10 vorgesehen, welche ein elekrisches Trennfeld quer zur Hauptströmungsrichtung6 bereitstellen. Die Trennspannung zwischen den Elektrolytreservoirs8 ,9 liegt in einer Größenordnung von üblicherweise 1000 Volt. - Aufgrund der miniaturisierten Ausführung der Vorrichtung
1 besitzt die Vorrichtung ein großes Flächen-Volumenverhältnis und daher eine schnellere Wärmeabfuhr als makroskopische Systeme. - Während die Analytsubstanzen in der Separationskammer
2 getrennt und auf verschiedene Fraktionierungskanäle6 fokussiert werden, erfolgt die optische Detektion der Substanzen im Bereich der Separationskammer2 der Vorrichtung1 . Dazu wird Licht einer optischen Detektionseinrichtung entsprechender Wellenlänge auf vorgegebene Messpunkte in der Separationskammer2 gerichtet und parallel dazu das jeweilige Spektrum gemessen, z.B. lassen sich die Substanzen durch Detektion in den Fraktionierungskanälen6 eindeutig den entsprechenden Fraktionierungskanälen6 zuordnen. Somit können die getrennten Substanzen gezielt gesammelt und weiteren Analysen zugeführt werden. - Die optische Einrichtung ist in
1 nicht dargestellt, weil sie für sich betrachtet bekannt ist. Bei einer solchen optischen Einrichtung kann es sich um eine Einrichtung handeln, mit der eine molekülsensitive Schwingungsspektroskopie oder eine Kernspinresonanzspektroskopie durchführbar ist. -
2 zeigt für zwei Substanzen typische Raman-Spektren. Die durchgezogene Linie repräsentiert die Substanz Myoglobin, die gestrichelte Linie die Substanz Bacteriorhodopsin. Dabei sind die Raman-Intensitäten über der Wellenzahl in cm-1 aufgetragen. - Das Spektrum für Myoglobin wurde erfindungsgemäß mittels kontinuierlicher trägerfreier Elektrophorese durch Raman-Spektroskopie aufgenommen und ist einem bekannten Spektrum für Bacteriorhodopsin gegenübergestellt, erkennbar unterscheiden sich die Spektren deutlich.
Claims (2)
- Verfahren zur Trennung eines Analytgemisches und zur Detekktion der Analytsubstanzen mittels kontinuierlicher trägerfreier Elektrophorese (CFFE), bei welchem ein Analytgemisch eine Separationskammer hydrodynamisch durchströmt, wobei ein elektrisches Feld quer zur Hauptflussrichtung in die Separationskammer eingekoppelt wird, durch welches die einzelnen Analytsubstanzen unterschiedlich gegenüber der Hauptflussrichtung abgelenkt werden, wobei die Analytsubstanzen optisch detektiert werden, dadurch gekennzeichnet, dass die markerfreien Analytsubstanzen mittels Raman-Spektroskopie mit oberflächenverstärkter Raman-Streuung (SERS) detektiert werden.
- Vorrichtung zur Trennung eines Analytgemisches und zur Detektion der Analytsubstanzen mittels kontinuierlicher trägerfreier Elektrophorese (CFFE) zur Durchführung des Verfahrens nach
Anspruch 1 mit einer Separationskammer, welche in einer Hauptflussrichtung vom Analytgemisch hydrodynamisch durchströmt und in welche quer zur Hauptflussrichtung ein elektrisches Feld eingekoppelt wird, und mit einer optischen Detektionseinrichtung zur wenigstens bereichsweisen räumlichen Erfassung der Separationskammer, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Detektionseinrichtung eine Einrichtung zur Raman-Schwingungsspektroskopie mit oberflächenverstärkter Raman-Streuung (SERS) ist.
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| Anal. Chem. 2003, Vol. 75, S. 5759-5766 * |
| Anal. Chem. 2006, Vol. 78, S. 3815-3819 * |
| Applied Spectroscopy, 1997, Vol. 51, Nr. 9, S. 1394-1399 * |
| Current Opinion in Chemical Biology, 2002, Vol. 5, Nr. 5, S. 711-716 * |
| Journal of Chromatography A, 1988, Vol. 805, S. 269-275 * |
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