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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur histologischen Klassifizierung von Gewebeschnitten.
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Stand der Technik
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Die Histologie ist die Lehre von den menschlichen, tierischen und pflanzlichen Geweben, insbesondere deren Struktur und Funktion. Eine histologische Klassifizierung wird in der Regel an einem wenige Mikrometer dicken gefärbten Gewebeschnitte durchgeführt und betrifft die vorkommenden Gewebearten, Differenzierungen des Gewebes, bakterielle und parasitäre Krankheitserreger im Gewebe und Krankheitszustände des Gewebes. Die Klassifizierung kann auf ein oder mehrere Teilgebiete eines Gewebeschnittes eingeschränkt werden oder sich sogar nur auf eine oder mehrere einzelne Zellen beziehen. Die Krankheitszustände von menschlichem Gewebe betreffen entzündliche Erkrankungen, Stoffwechselerkrankungen und den Nachweis von Tumoren, insbesondere die Differenzierung zwischen gut- und bösartige Tumorformen.
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Die Herstellung eines histologischen Gewebeschnittes erfolgt in folgenden Schritten:
- – Gewebestabilisierung durch eine chemische Fixierung oder durch Gefrieren
- – Herstellung eines 2 bis 10 Mikrometer dicken Schnittes mit einem Mikrotom
- – Anfärben des Gewebeschnittes
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Die Gewebestrukturen, die Zellen des Gewebes selber und sogar intrazelluläre Strukturen (z. B. Zellkerne, Endoplamatische Retikulum, Mitochondrien) bleiben aufgrund der Gewebestabilisierung im Gewebeschnitt erhalten.
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Die Strukturen des Gewebeschnittes werden im histologischen Routinebetrieb mit Hilfe von lichtoptischen Mikroskopen und Scannern abgebildet bzw. abgerastert, wie sie beispielsweise in der Druckschrift
WO 00/36398 A9 beschieben werden. Ein derart aufgenommenes optisches Bild des Gewebeschnittes kann eine Ortsauflösung von etwa 250 Nanometer aufweisen, d. h., es werden Strukturen der entsprechenden Größe räumlich aufgelöst. Mit einer elektronenoptischen Abbildung oder neueren lichtoptischen Fluoreszenzverfahren, wie z. B. der STED-Mikroskopie (STED = Simulated Emission Depletion) kann die Ortsauflösung des optischen Bildes weiter erhöht werden, also noch kleinere Strukturen räumlich aufgelöst werden.
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Das Anfärben des Gewebeschnittes steigert den Kontrast in dem optischen Bild des Gewebeschnittes. Es gibt eine Vielzahl verschiedener histologischer Färbungen, die sich in ihrer Affinität zu bestimmten Gewebe- und Zellstrukturen unterscheiden und diese selektiv im optischen Bild sichtbar machen. Die Hämatoxylin-Eosin Färbung ist die am weitesten verbreitete Färbung in Routine- und Übersichtsuntersuchungen. Neben anderen spezifischen Färbungen gibt es Immunfärbungen, bei denen die Verteilung von Proteinen in Gewebeschnitten und in den Zellen des Gewebeschnittes sichtbar gemacht wird, indem spezifische Antikörper affin an bestimmte Proteine binden. Es werden neben Antigen-Antikörper Bindungen auch sogenannte In-Situ Hybridisieungsverfahren mit spezifischen DNS-Sonden (DNS = Desoxyribonukleinsäure) eingesetzt.
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Eine Färbung macht Strukturen des Gewebeschnittes bzw. Verteilungen des Färbemittels im Gewebeschnitt sichtbar. Die Histologie ist im Allgemeinen eine morphologische Diagnostik, da anhand des Erscheinungsbildes und färberischen Verhaltens der Gewebe- und Zellstrukturen die histologische Klassifizierung vorgenommen wird. Die Immunofärbung und die In-Situ-Hybridisierung sind in der Regel hoch spezifisch, so dass neben morphologischen Informationen auch molekulare Informationen abgeleitet werden können. Alle Informationen, die aus einem optischen Bild eines Gewebeschnittes gewonnen werden, werden im Folgenden unter dem Begriff „optische Informationen” zusammengefasst.
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Der Zustand eines Gewebes kann sich in Bezug auf Krankheitszustände, Gewebedifferenzierungen und den Befall mit Krankheitserregern gegenüber einer anderen normal differenzierten bzw. gesunden Gewebeprobe durch eine charakteristische Substanzzusammensetzung bemerkbar machen. Der Gewebezustand wird also durch Konzentrationsmuster von Substanzen und damit molekularen Informationen charakterisiert. Sind die Konzentrationen der Substanzen hinreichend hoch, so können die Konzentrationsmuster durch eine massenspektrometrische Analyse nachgewiesen werden. Die Substanzen können alle Arten von biologischen Substanzen sein, z. B. Proteine, Nukleinsäuren, Lipide oder Zucker. Ein ungewöhnliches Muster kann sich dadurch ergeben, dass bestimmte biologische Substanzen unter- oder überexprimiert sind. Insbesondere Proteine können auch in charakteristischer Weise modifiziert vorliegen, z. B. durch posttranslationale Modifikationen.
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Die Massenspektrometrie mit Ionisierung einer Probe durch matrixunterstützte Laserdesorption (MALDI = Matrix Assisted Laser Desorption and Ionization) wird seit mehreren Jahren erfolgreich zur Bestimmung von Molekülmassen, zur Identifizierung und zur strukturellen Charakterisierung von biologischen Substanzen, insbesondere von Proteinen oder Peptiden, eingesetzt.
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Eine Gewebeprobe kann für die Bestimmung charakteristischer Konzentrationsmuster in bekannter Weise homogenisiert werden. Die darin befindlichen Substanzen werden aufgearbeitet und zusammen mit einer Lösung einer Matrixsubstanz auf einen Probenträger aufgebracht. Hiernach verdampft das Lösungsmittel und die Matrixsubstanz kristallisiert, wobei die biologischen Substanzen in den Matrixkristallen in Form einzelner, weit voneinander getrennter Moleküle mitkristallisieren. Ein Beschuss einer so präparierten homogenisierten Probe mit kurzen Laserpulsen ausreichender Energie führt dazu, dass die Matrixsubstanz explosionsartig verdampft und die biologischen Substanzen und ionisiert werden.
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In der bildgebenden massenspektrometrischen Analyse, also der Aufnahme eines massenspektrometrischen Bildes (IMS = Imaging Mass Spectrometry), werden anstelle homogenisierter Gewebeproben solche Gewebeschnitte untersucht, wie sie aus der Histologie bekannt sind. Ein Gewebeschnitt wird dazu auf einen elektrisch leitenden Probenträger aufgelegt. Auf den Gewebeschnitt wird dann mit einem geeigneten Verfahren eine Matrixlösung aufgebracht. Nach dem Trocknen der Matrixlösung wird der Probenträger in ein Massenspektrometer eingebracht. Für die nachfolgende bildgebenden massenspektrometrische Analyse kann das Rasterscan-Verfahren nach Caprioli (
US 5,808,300 A ) oder eine stigmatische Abbildung eines kleinen Bereichs der Gewebeprobe (Luxembourg et al., Analytical Chemistry, 76 (18), 2004, 5339–5344: „High-Spatial Resolution Mass Spectrometric Imaging of Peptide and Protein Distributions an a Surface”) verwendet werden. In beiden Fällen ergibt sich ein massenspektrometrisches Bild des Gewebeschnittes, d. h., die molekularen Informationen in den Massenspektren sind räumlich aufgelöst. Aus der Patentschrift
US 7,180,058 B1 ist zudem bekannt, die räumliche Auflösung von MALDI-MS dadurch zu erhöhen, dass der Laserstrahl durch einen transparenten Probenträger hindurch auf den darauf befindlichen Gewebeschnitt fokussiert wird, um Fokussierungsoptiken mit kurzer Brennweite verwenden zu können, die kleinere Fokusdurchmesser ermöglichen.
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Aus de Patentschrift
DE 10 2006 019 530 B4 sind verschiedene Verfahren zur Präparation von Gewebeschnitten für die bildgebende massenspektrometrische Analyse bekannt. Die Matrixlösung oder eine Rekristallisationslösung kann beispielsweise durch pneumatisches Sprühen, durch vibratives Vernebeln oder durch Nanospotting von Tröpfchen auf den Gewebeschnitt aufgebracht werden. Das Aufbringen der Matrixlösung ist nicht trivial, da (a) eine laterale Ver schmierung der biologischen Substanzen zu vermeiden ist, (b) die biologischen Substanzen möglichst aus dem Gewebeschnitt extrahiert und in die Kristalle der Matrixschicht eingebaut werden müssen, und (c) ein günstiges Verhältnis von biologisch relevanten Substanzen zu Verunreinigungen zu erzielen ist. Durch das Aufbringen der Matrixsubstanz auf den Gewebeschnitt und deren Wirkung auf den Gewebeschnitt sind derzeit massenspektrometrische Bilder von Gewebeschnitten auf eine Ortsauflösung zwischen zehn bis zweihundert Mikrometer begrenzt. Es können, somit keine Strukturen räumlich aufgelöst werden, die kleiner als 10 Mikrometer sind. Im Vergleich zu optischen Bildern der herkömmlichen Histologie ist die Ortsauflösung um mehr als eine Größenordnung geringer.
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Es sind drei verschiedene Verfahren bekannt, die auf optischen Bildern beruhende Histologie mit massenspektrometrischen Bildern zu koppeln (Bruker Application Note #MT-89: „Advances in Molecular Histology with the MALDI Molecular Imager”). Zum einen kann die Aufnahme eines optischen Bildes und eines massenspektrometrischen Bildes an zwei verschiedenen aufeinanderfolgenden Gewebeschnitten einer Gewebeprobe getrennt durchge führt werden. Da zwei aufeinanderfolgende Gewebeschnitte aufgrund von mechanischen Toleranzen beim Herstellen der beiden Gewebeschnitte in der Regel nicht ausreichend deckungsgleich sind, ist hier eine räumliche Zuordnung zwischen den beiden Bildern nur sehr eingeschränkt möglich. Zum zweiten kann zuerst ein optisches Bild und danach ein massenspektrometrisches Bild von einem einzelnen Gewebeschnitt aufgenommen werden. In diesem Fall darf die Färbung des Gewebeschnittes die Extraktion der biologischen Substanzen und deren nachfolgende Ionisierung nicht beeinflussen. Da die meisten histologischen Färbungen diese Anforderungen nicht erfüllen und den Informationsgehalt der Massenspektren in einem zu starken Maße herabsetzen, wird diese Vorgehensweise nur selten angewendet. Zum dritten kann zuerst ein massenspektrometrisches Bild und danach ein optisches Bild aufgenommen werden. Die auf einen Gewebeschnitt aufgebrachte Matrixschicht wird nach der Aufnahme des massenspektrometrischen Bildes wieder vom dem Gewebeschnitt abgelöst. Danach wird der Gewebeschnitt der histologischen Routine entsprechend angefärbt und ein optisches Bild aufgenommen.
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Die so gewonnenen Arten von Bildern eines Gewebeschnittes werden in der Regel in einer graphischen Darstellung übereinandergelegt. Die ortsaufgelösten Massenspektren werden dabei in der graphischen Darstellung oft auf einzelne ausgewählte Massen oder auf eine Klassenzugehörigkeit reduziert. Die Zuordnung zu bestimmten Klassen erfolgt dabei mit Hilfe von statistischen Analyseverfahren. Das optische Bild dient nur als Orientierungshilfe im massenspektrometrischen Bild, das wie beschrieben eine geringere Ortsauflösung aufweist. Aus der Veröffentlichung von Schwamborn et al. (International Journal of Molecular Medicine, 20, 155–157, 2007: ”Identifying prostate carcinoma by MALDI-Imaging”) ist zudem bekannt, dass morphologische Informationen aus einem optischen Bild eines Gewebeschnittes dazu verwendet werden, räumlich aufgelöste Massenspektren mit Hilfe eines überwachten Lernverfahrens zu klassifizieren und krankheitsspezifische Muster in den Massenspektren zu finden.
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Bei jeder Art von Klassifizierung, also auch einer histologischen Klassifizierung von Gewebeschnitten, treten verschiedene Arten von Zuordnungsfehlern auf. Aus diesen ergeben sich statistische Kenngrößen, die die Gute der Klassifizierung festlegen. Zu den Kenngrößen zählen die Sensitivität (Richtig-Positiv-Rate), die Spezifität (Richtig-Negativ-Rate), die Falsch-Positiv-Rate (Fehlalarm), die Falsch-Negativ-Rate. Es gibt zudem die Wahrscheinlichkeit, dass ein Gewebeschnitt bei einer positiven Diagnose tatsächlich den entsprechenden Krankheitszustand aufweist (Relevanz) bzw. dass ein Gewebeschnitt bei einer negativen Diagnose tatsächlich den Krankheitszustand nicht aufweist. Des Weiteren lassen sich die Korrektklassifikationsrate und Falschklassifikationsrate angeben.
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Aufgabe der Erfindung
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Es ist die Aufgabe der Erfindung, die Güte der histologischen Klassifizierung von Gewebeschnitten zu verbessern.
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Beschreibung der Erfindung
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Die Aufgabe wird durch ein Verfahren nach Patentanspruch 1 gelöst. Bevorzugte Ausführungsformen sind in den abhängigen Patentansprüchen 2 bis 16 ausgeführt.
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Die Erfindung besteht darin, dass ein massenspektrometrisches und ein optisches Bild von einem einzelnen Gewebeschnitt aufgenommen werden, wobei das optische Bild eine höhere Ortsauflösung als das massenspektrometrische Bild aufweist, und dass optische Informationen, die Strukturen eines Teilgebietes des Gewebeschnittes betreffen, mit massenspektrometrischen Informationen des Teilgebietes verknüpft werden, wobei die Strukturen im massenspektrometrischen Bild nicht räumlich aufgelöst sind. Das Teilgebiet kann dabei beispielsweise nur eine einzelne Zelle umfassen.
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Das optische Bild weist dabei bevorzugt eine fünffach bis zweihundertfach höhere Ortsauflösung als das massenspektrometrische Bild auf. Die Ortsauflösung des massenspektrometrischen Bildes liegt typischer Weise zwischen zehn und zweihundert Mikrometer, während die Ortsauflösung des optischen Bildes unter zwei Mikrometer beträgt.
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Aus dem Stand der Technik ist zwar bekannt, dass ein optisches Bild und ein massenspektrometrisches Bild von einem einzigen Gewebeschnitt aufgenommen werden. Allerdings werden die optischen Bilder bisher für eine Orientierung im massenspektrometrischen Bild bzw. für eine Zuordnung der massenspektrometrischen Informationen auf grobe Gewebestrukturen verwendet. Es ist aber möglich, von einem einzelnen Gewebeschnitt ein massenspektrometrisches und ein optisches Bild aufzunehmen, wobei überraschenderweise die Ortsauflösung des optischen Bildes bezogen auf herkömmliche histologische Anforderungen nicht vermindert ist. Dies gilt insbesondere auch für den bevorzugten Fall, dass die bildgebende massenspektrometrische Analyse (also die Aufnahme des massenspektrometrischen Bildes) vor der Aufnahme des optischen Bildes erfolgt. Es stehen damit zwei unabhängige inhaltsreiche Informationsquellen ohne Qualitätseinschränkungen zur Verfügung, mit denen unabhängig voneinander eine histologische Klassifizierung möglich ist, deren erfindungsgemäße Verknüpfung aber die Güte der histologischen Klassifizierung entscheidend verbessert. Im Gegensatz zum Stand der Technik werden also beide Arten von Informationen für die histologische Klassifizierung verwendet, wodurch in einigen Fällen eine Klassifizierung mit hinreichender Güte überhaupt erst ermöglicht wird.
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Die optischen Informationen, die für eine histologische Klassifizierung relevant sind, werden in bekannter Weise aus dem optischen Bild abgeleitet und betreffen beispielsweise die Form und Anordnung von Zellen oder die Form von intrazellulären Strukturen (wie z. B. Zellkerne, endoplasmatisches Retikulum, Mitochondrien), und zwar jeweils unter Berücksichtigung der verwendeten Färbung des Gewebeschnittes.
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Um die optischen Informationen über die Strukturen in einem Teilgebiet des Gewebeschnittes zu erhalten, wird in bevorzugter Weise ein Ausschnitt des optischen Bildes, der das Teilgebiet vollständig oder teilweise enthält, vergrößert dargestellt. In besonders bevorzugter Weise werden mehrere Ausschnitte des optischen Bildes, die alle das Teilgebiet vollständig oder teilweise enthalten, gleichzeitig oder nacheinander vergrößert dargestellt, wobei die Lage und/oder die Vergrößerung der Ausschnitte unterschiedlich sind. Um eine vergrößerte Darstellung eines Ausschnittes des optischen Bildes zu erhalten, kann einerseits ein zweites optisches Bild aufgenommen werden, das dem Ausschnitt mit entsprechender Vergrößerung entspricht. Es kann andererseits aus dem bereits aufgenommenen optischen Bild des Gewebeschnittes eine vergrößerte Darstellung eines Ausschnittes berechnet werden. In diesem bevorzugten Fall spricht man von einem „virtuellen Mikroskop”, da die Vergrößerung eines Ausschnittes oder auch die Rückkehr zu einem Ausschnitt mit geringerer Vergrößerung rein rechnerisch ohne die physikalische Aufnahme eines neuen optischen Bildes erfolgt.
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Die geringere Ortsauflösung des massenspektrometrischen Bildes wird durch den hohen molekularen Informationsgehalt der Massenspektren ausgeglichen. Die massenspektrometrischen Informationen sind neben einem lokalen Massenspektrum, das dem Teilgebiet zugeordnet ist, auch Unterschiede des lokalen Massenspektrums zu Massenspektren sein, die anderen Teilgebieten des Gewebeschnittes zugeordnet sind, oder zu Massenspektren aus anderen Datenquellen (z. B. Datenbanken) sein. Des Weiteren bestehen massenspektrometrische Informationen bevorzugt darin, dass das lokale Massenspektrum mit Hilfe einer statistischen Analyse einer Klasse oder mehreren Klassen zugeordnet wird. Dafür wird das lokale Massenspektrum in der Regel mit Massenspektren von anderen Teilgebieten des Gewebeschnittes und/oder mit Massenspektren aus anderen Datenquellen verglichen. Entsprechende statistische Analyse sind beispielsweise: Neuronale Netze (z. B.: Linear Vector Quantization (LVQ), Neural Gas (NG), Self-Organizing Map (SOM)), Support-Vector-Maschinen (SVM), Genetische Algorithmen zur Clusteranalyse, Hauptkomponentenanalyse (Principal Component Analysis (PCA)), Entscheidungsbäume oder Nächste-Nachbarn-Klassifikatoren (k-Nearest-Neighbor (KNN)). Die Klassen entsprechen denen der histologischen Klassifizierung und betreffen die in dem Gewebeschnitt vorkommenden Gewebearten, Differenzierungen des Gewebes, Krankheitserreger und Krankheitszustände.
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Es werden hier auch sogenannte Peaklisten oder reduzierte Massenspektren als Massenspektren aufgefasst. Eine Peakliste ist eine Liste von Wertepaaren, die aus einem gemessenen Rohspektrum extrahiert werden und die jeweils die Masse und die Signalstärke einer Signalspitze („peak”) in dem gemessenen Rohspektrum enthalten. Ein reduziertes Massenspektrum enthält nur die Signale eines oder mehrerer Massefenster, die in der Regel durch den Anwender festgelegt werden.
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Um einen Gewebeschnitt mit ausreichender Güte histologisch klassifizieren zu können, kann es erforderlich sein, dass jeweils die optischen und massenspektrometrischen Informationen von mehreren Teilgebieten des Gewebeschnittes verknüpft werden. Die histologische Klassifizierung kann auf einen Bereich oder mehrere Bereiche des Gewebeschnittes eingeschränkt sein und sich insbesondere auf eine einzelne Zelle oder mehrere einzelnen Zelle beziehen.
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Beschreibung der Abbildungen
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Die zeigt in den Schritten A bis E, dass von einem Gewebeschnitt (1) zuerst ein massenspektrometrisches Bild (20) und danach ein optisches Bild (30) aufgenommen wird, wobei die Ortsauflösung des massenspektrometrische Bild (20) etwa 30 Mikrometer und die Ortsauflösung des optischen Bildes (30) etwa einen halben Mikrometer beträgt.
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Die zeigt in den Schritten F und G, dass ein Teilgebiet (40) des Gewebeschnittes (1) ausgewählt wird, ein das Teilgebiet (40) enthaltender Ausschnitt (50) des optischen Bildes (30) vergrößert dargestellt wird und optische Informationen über Zellen (31, 33, 35) in dem Teilgebiet (40) mit massenspektrometrischen Informationen des Teilgebietes (40) verknüpft werden, um den Gewebeschnitt (1) histologisch zu klassifizieren. Das Teilgebiet (40) ist dabei im massenspektrometrischen Bild (20) nicht räumlich aufgelöst.
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Bevorzugte Ausführungsbeispiele
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Die und zeigen in den Schritten A bis G ein bevorzugtes Ausfünhrungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens zur histologischen Klassifizierung eines Gewebeschnittes.
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Im Schritt A wird ein etwa zehn Mikrometer dicker Gewebeschnitt (1) auf einem Objektträger (3) bereitgestellt. Dafür wird eine Gewebeprobe zuerst durch Gefrieren stabilisiert und anschließend mit einem Mikrotom geschnitten.
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Im Schritt B wird eine Matrixschicht (
6) auf den Gewebeschnitt (
1) aufgebracht. Die Vorrichtung (
4) ist in der Patentschrift
DE 10 2006 019 530 B4 beschrieben und erzeugt aus einer gelösten Matrixsubstanz vibrativ einen Nebel (
5) aus kleinen Tröpfchen, die sich auf dem Gewebeschnitt (
1) absetzen und trocknen. Das Vernebeln und anschließende Trocknen der Matrixtröpfchen auf dem Gewebeschnitt (
1) wird zyklisch wiederholt, bis die Matrixschicht (
6) optimal für eine bildgebende massenspektrometrische Analyse geeignet ist.
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Im Schritt C wird ein massenspektrometrisches Bild (20) des in Schritt B präparierten Gewebeschnittes (1) aufgenommen. Der Gewebeschnitt (1) wird mit Laserpulsen eines fokussierten Laserstrahls (7) abgerastert. Jeder Rasterpunkt wird dabei mindestens einmal mit einem Laserpuls bestrahlt. Die durch den MALDI-Prozess erzeugten Ionen (8) werden in einem nicht dargestellten Flugzeitmassenspektrometer analysiert, so dass jedem Rasterpunkt sog. lokales ein Massenspektrum zugeordnet ist. Das massenspektrometrische Bild (20) weist damit neben zwei räumlichen Achsen (X, Y) auch eine Massenachse (m/z) auf, d. h., man erhält für jede einzelne Masse ein zweidimensionales Bild.
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Die Ionen werden in einem Massenspektrometer prinzipiell nach ihrem Verhältnis von Masse zu Ladung (m/z, auch „ladungsbezogene Masse” genannt) getrennt. Aus einem gemessenen Massenspektrum lässt sich die ladungsbezogene Masse m/z und daraus ihre physikalische Masse m bestimmen. Da die Ionisierung durch matrixunterstützte Laserdesorption im Wesentlichen nur einfach geladene Ionen liefert, wird im Folgenden vereinfachend nur von der „Masse” und nicht der „ladungsbezogenen Masse” gesprochen.
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Die Ortsauflösung wird in der bildgebenden massenspektrometrischen Analyse in der Regel durch die Präparation des Gewebeschnittes (1) begrenzt und beträgt hier etwa 30 Mikrometer. Der Fokusdurchmesser des Laserstrahls (7) ist dementsprechend angepasst. Um von einem Rasterpunkt zum nächsten zu gelangen, wird der Objektträger (3) mit einer nicht dargestellten Bewegungsvorrichtung entlang der X- und Y-Achse verschoben.
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Die massenspektrometrische Analyse kann prinzipiell in verschiedenartigen Massenspektrometern durchgeführt werden. Es werden für die bildgebende massenspektrometrische Analyse derzeit meistens Flugzeitmassenspektrometer (Time-Of-Flight Mass Spectrometer = TOF-MS) mit oder ohne Reflektor eingesetzt. Es können aber beispielsweise auch Flugzeitmassenspektrometer mit orthogonalem Inneneinschuss, Innenfallen oder Ionenzyklotronresonanz – Massenspektrometer verwendet werden.
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Im Schritt D wird die Matrixschicht (6) vom Gewebeschnitt (1) abgelöst, beispielsweise durch aufeinanderfolgendes Waschen mit Methanol und Aceton. Danach wird der freigelegte Gewebeschnitt (1) nach einem histologischen Standardprotokoll mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt.
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Im Schritt E wird ein optisches Bild (30) des Gewebeschnittes (1) mit einem hochauflösenden lichtoptischen Scanner (9) aufgenommen, wie er in der histologischen Klassifizierung von gefärbten Gewebeschnitten üblich ist. Obwohl die Ortsauflösung im massenspektrometrischen Bild (20) nur 30 Mikrometer beträgt, ist der Scanner (9) so eingestellt, dass das optische Bild (30) eine Ortsauflösung von nur einen halben Mikrometer aufweist. Der Abstand von zwei räumlich aufgelösten Bildpunkten ist im optischen Bild (30) also etwa sechzigfach kleiner als im massenspektrometrischen Bild (20). Die Achsen des optischen Bildes (30) sind deshalb anders gekennzeichnet (X*, Y*). Es ist überaus überraschend, dass der Informationsgehalt des optischen Bildes (30) nicht oder nur sehr geringfügig dadurch eingeschränkt wird, dass zuvor die Matrixschicht (6) auf den Gewebeschnitt (1) aufgebracht und wieder abgelöst wird.
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Im Schritt F Wird ein Teilgebiet (40) des Gewebeschnittes (1) ausgewählt. Das Teilgebiet (40) liegt in einem Ausschnitt (50) des optischen Bildes (30). Da beide Bilder (20, 30) von einem einzelnen Gewebeschnitt (1) stammen, sind die beiden Bilder (20, 30) deckungsgleich, so dass eine räumliche Zuordnung zwischen den Bildpunkten der beiden Bilder (20, 30) leicht möglich ist. Die Auswahl des Teilgebietes (40) kann sowohl im optischen Bild als auch im massenspektrometrischen Bild erfolgen.
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Das massenspektrometrische Bild (20) wird hier bevorzugt so reduziert, dass nur das Signal einer einzelnen Masse oder die Signale von wenigen Massen dargestellt werden. Im letzteren Fall können unterschiedlichen Massen beispielsweise farblich codiert werden. Eine besonders bevorzugte Art der reduzierten Darstellung besteht darin, dass jedes Massenspektrum mit Hilfe einer statistischen Analyse einer Klasse oder mehreren Klassen zugeordnet wird und nur die Verteilung der Klassenzugehörigkeit bildlich dargestellt wird.
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Im Schritt G werden optische Informationen über Strukturen in dem Teilgebiet (40) mit massenspektrometrischen Informationen des Teilgebietes (40) verknüpft werden, um den Gewebeschnitt (1) zumindest im Teilgebiet (40) histologisch zu klassifizieren.
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Um die optischen Informationen zu gewinnen, wird der Ausschnitt (50) des optischen Bildes (30) vergrößert dargestellt, und zwar mit einem virtuellen Mikroskop. Die Ortsauflösung im optischen Bild (30) ist so hoch, dass die Zellen (31, 33, 35) im Teilgebiet (40) und ihre intrazelluläre Strukturen, wie z. B. die Zellkerne (32, 34, 36), räumlich aufgelöst werden. Die optischen Informationen beziehen sich hier auf die unterschiedliche Färbung der Zelle (31) gegenüber den umliegenden Zellen (33, 35) und auf die unterschiedliche Form ihres Zellkerns (32). Es ist weiterhin möglich, dass nacheinander mehrere Ausschnitte vergrößert dargestellt werden, wobei die Lage und/oder die Vergrößerung der Ausschnitte unterschiedlich sind. Das virtuelle Mikroskop erlaubt es auch, in das Teilgebiet (40) weiter hineinzuzoomen.
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Im massenspektrometrischen Bild (20) sind innerhalb des Teilgebietes (40) keine Strukturen räumlich aufgelöst worden. Die massenspektrometrischen Informationen beziehen sich somit zum einen auf ein lokales Massenspektrum (21), das dem Teilgebiet (40) zugeordnet ist. Zum zweiten ist ein Differenzspektrum (22) zwischen dem lokalen Massenspektrum (21) und einem Referenzspektrum einer Datenbank dargestellt, wobei diejenigen Signale, die nur im lokalen Massenspektrum (21) vorhandenen sind, durchgezogen dargestellt sind und diejenigen Signale, die nur im Referenzspektrum vorhanden sind, gestrichelt dargestellt sind. Des Weiteren wird das lokale Massenspektrum (21) mit Hilfe einer statistischen Analyse den Klassen A, B und C zugeordnet, wobei die Klasse A für einen positiven Befund, die Klasse B für einen negativen Befund und die Klasse C für eine fehlgeschlagene Zuordnung zu den Klassen A und B steht. Die Zuordnung (23) ist hier unscharf und entspricht einer Wahrscheinlichkeit für die Klassenzugehörigkeit.
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Durch die Verknüpfung der beiden unterschiedlichen Informationsquellen wird die Güte der histologischen Klassifizierung entscheidend verbessert. Um den ganzen Gewebeschnitt (1) an verschiedenen Stellen zu klassifizieren bzw. die Güte der Klassifizierung weiter zu erhöhen, können die Schritte F und G in anderen Teilgebieten wiederholt werden.
