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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Gewinnen eines
Naturstoffes durch Synthese in einem Bioreaktor nach dem Oberbegriff
des Hauptanspruchs sowie einen entsprechenden Bioreaktor nach dem
Oberbegriff des Nebenanspruchs.
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Viele
medizinisch interessante Wirkstoffe wie beispielsweise Insulin,
Hyaluronsäure,
Streptokinase sowie eine große
Anzahl der in der Vergangenheit und heute verwendeten Antibiotika
(Penicillin, Erythromycin, Tetracyclin) und Krebstherapeutika (Mitomycin,
Epothilon), die meist auf aus Bakterien, Pilzen oder Pflanzen gewonnenen
Naturstoffen basieren, lassen sich großtechnisch durch Umsetzung
von biologischen Materialien mit Hilfe von Mikroorganismen in Bioreaktoren
synthetisieren (durch Fermentierung bzw. Fermentation). Dabei sind
Mikroorganismen wie Bakte rien-, Pilz-, Hefe- oder Zellkulturen oder
aber Enzyme (Fermente) in der Lage, Stoffe zu bilden, die sich auf
rein chemischem Wege nur sehr schwer bzw. gar nicht herstellen lassen.
Besonders Vertreter der Bakteriengruppen der Aktinomyceten und vor
allem der im Boden lebenden Myxobakterien zeichnen sich durch ihre
hohe Produktivität
aus und die Fähigkeit,
eine Vielzahl von wichtigen und strukturell einzigartigen biologisch
aktiven Wirkstoffen herzustellen. Diese biologisch aktiven Naturstoffe
aus Mikroorganismen werden auch als Sekundärmetabolite bezeichnet. Andere
Sekundärstoffe
stammen aus Pseudomonaden und Streptomyceten oder den bisher chemisch
kaum untersuchten Bakteriengattungen Photorhabdus und Xenorhabdus.
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Da
die Nachfrage nach Substanzen mit verbesserten oder neuen Wirkmechanismen,
unter anderem bei Antibiotika durch das zunehmende Problem der Resistenzbildung,
weiter steigt, werden Naturstoff-Biosynthesewege mit Hilfe von genetischen Methoden
modifiziert, das heißt,
neben der Erforschung neuer Mikroorganismen kommen auch genetisch
aktivierte oder manipulierte Organismen (z. B. Bakterien oder Pilze)
bei der Herstellung neuer oder veränderter Naturstoffe sowie der
Produktionsoptimierung zum Zuge.
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Die
Produktion wird üblicherweise
in einem Bioreaktor oder Fermenter durchgeführt, der ein Gemisch aus Nährmedium
sowie Enzymen oder Mikroorganismen oder Zellen (Biomasse) und Stoffwechselprodukten,
nachfolgend Kulturmedium oder Fermenterkultur genannt, enthält. Um die
gewünschten Stoffwechselprodukte
zu gewinnen, gibt es dabei mehrere Möglichkeiten:
- • Das Kulturmedium
muss dazu gegebenenfalls erst zentrifugiert und die überstehende
Lösung mit
den entsprechenden großen
Volumina an den passenden organischen Lösemitteln (Aceton, Ethylacetat,
Alkohole etc.) kontinuierlich extrahiert werden. Diese Extraktion
kann auch mit mindestens einer Reaktion (Komplexbildung o. ä.) gekoppelt
sein, um durch Verschiebung der Extraktionsgleichgewichte den Stoffübergang
zwischen den Phasen zu verbessern (Reaktivextraktion). Die Extrakte
müssen
dann gewaschen und nach Trocknen energie- und kostenintensiv zum
Trocknen eingeengt werden, um das Produkt zu erhalten. Neben dem
hohen Verbrauch an Reagenzien und Lösemitteln, die nur zum Teil
zurückgewonnen
werden können,
und der arbeitsintensiven Prozedur fällt auch der nachfolgende Trennungs- und Aufreinigungsprozess
des Rohgemisches, zum Beispiel durch Säulenchromatographie, negativ
ins Gewicht. Außerdem
wird die Kultur durch Zentrifugieren oder Zugabe des organischen
Lösemittels
abgestoppt. Diese Vorgehensweise ist somit nur für Forschungszwecke geeignet,
bei denen eine Identifikation mehrerer Produkte von Interesse ist.
- • Ein
Fortschritt gegenüber
dieser Vorgehensweise ist es, statt dieses Extraktionsprozesses
eine Filtration des gesamten Kulturmediums an einem Absorberharz
vorzunehmen und die gewünschten Produkte
mit wesentlich geringeren Volumina an organischen Lösemitteln
zu eluieren (Aufkonzentrierung und Anreicherung). Das Absorberharz kann
direkt dem Medium der Fermenterkultur zugesetzt werden, darf jedoch
das Wachstum der Mikroorganismen nicht negativ beeinflussen. Verwendet
werden z. B. Polystyrol-Divinylbenzol-Harze, die auch eine hohe
Hydrophobizität
zur Aufnahme der Wirkstoffe oder Metaboliten aufweisen. Durch den
Einsatz des Harzes können Materialkosten
und Energie eingespart, die Ausbeute an den gewünschten Produkten gesteigert und
die gebildeten Metabolite durch die Absorption und enge Bindung
vor einem Abbau oder einer weiteren Metabolisierung durch die produzierenden
Mikroorganismen geschützt
werden. Von Nachteil ist, dass mit dem Harz auch die Zellen abgetrennt
werden, was ein Abstoppen des Reaktorprozesses zur Folge hat.
- • Auch
mit der gesteigerten Produktion des gewünschten Metaboliten durch genetisch
veränderte
Mikroorganismen oder Optimierung der Bedingungen stellt sich das
Problem, dass ab einer bestimmten Konzentration auch das Wachstum der
betreffenden Mikroorganismen gestört oder gar inhibiert werden
kann (Feedback-Inhibition), was sich dementsprechend störend oder
inhibierend auf die Biosynthese auswirkt.
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Der
vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein gattungsgemäßes Verfahren
so weiterzuentwickeln, dass es effektiver und damit kostengünstiger
wird. Der Erfindung liegt ferner die Aufgabe zugrunde, einen entsprechenden
Bioreaktor zu entwickeln, mit dem eine effektivere Produktion des
zu gewinnenden Naturstoffs möglich
wird.
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Diese
Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch
ein Verfahren mit den kennzeichnenden Merkmalen des Hauptanspruchs
in Verbindung mit den Merkmalen des Oberbegriffs des Hauptanspruchs sowie
durch einen Bioreaktor mit den Merkmalen des Nebenanspruchs. Vorteilhafte
Ausgestaltungen und Weiterentwicklungen der Erfindung ergeben sich
mit den Merkmalen der Unteransprüche.
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Das
vorgeschlagene Verfahren zum Gewinnen eines Naturstoffes durch Synthese
in einem Bioreaktor, bei dem der Naturstoff als Stoffwechselprodukt
oder Fermentationsprodukt in einem Kulturmedium erzeugt wird, das
in dem Bioreaktor enthalten ist und ein Nährmedium sowie Enzyme oder
Mikroorganismen umfasst, wobei der erzeugte Naturstoff mit Hilfe
eines sorbierenden Materials extrahiert wird, sieht also vor, dass
als sorbierendes Material mindestens ein molekular geprägtes Polymer
verwendet wird, wobei das Kulturmedium während des Extrahierens weiter
den Naturstoff erzeugt.
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Ein
Kerngedanke der vorliegenden Erfindung besteht also darin, z. B.
in einem Bypass des Bioreaktors oder in dem Kulturmedium selbst
statt eines unselektiven Absorbers spezifisch bindende molekular
geprägte
Polymere einzusetzen. Das vorgeschlagene Verfahren und der entsprechende
Bioreaktor Vorrichtung machen damit von der Möglichkeit Gebrauch, Metabolite
oder Reaktionsprodukte aus Fermentern oder Bioreaktoren selektiv
zu entfernen, anzureichern und aufzureinigen.
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Ferner
ist das Verfahren auch deshalb sehr effektiv, weil das Kulturmedium
auch während
des Extrahierens weiter den Naturstoff erzeugt, also eine kontinuierliche
Produktion ohne Unterbrechung der Erzeugung des Naturstoffs in dem
Kulturmedium ermöglicht.
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Die
vorliegende Erfindung ermöglicht
also die Einführung
von Selektivität
bei der Rückgewinnung
von Reaktionsprodukten aus biotechnologischen Prozessen mittels
eines Verfahrens mit mehreren Varianten, die alle als zentrales
Element den Einsatz einer spezifisch sorbierenden Komponente aufweisen.
Gegenüber
existierender unspezifischer Absorbermaterialien wird das Zielprodukt
durch selektive Bindung an die Bindungsstellen im molekular geprägten Polymer
(MIP) besser von den Inhaltsstoffen des Nährmediums oder Nebenprodukten
abgetrennt, effektiver aus dem Prozess entfernt und die Produktausbeute
gegebenenfalls gesteigert.
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Als
spezifisch sorbierende Komponente werden so genannte molekular geprägte Polymere
oder MIPS verwendet. Darunter versteht man stark quervernetzte synthetische
feste Polymere mit definierten Kavitäten (imprints), die mit Hilfe
von ausgewählten Zielmolekülen als
Templat- oder Printmoleküle
oder deren Moleküleinheiten
bzw. funktionellen Gruppen oder Zielmolekülanaloga hergestellt werden.
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Die
Aufnahme von Zielverbindungen durch die molekular geprägten Polymere
oder MIPs kann mittels Adsorption (Anlagerung) an der Oberfläche ebenso
wie durch Absorption (Einlagerung) im Inneren des Materials erfolgen.
Daher wird hier allgemein von "Sorption" oder "Sorbieren" gesprochen.
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Der
Unterschied der vorliegenden Erfindung zum Stand der Technik liegt
also in der Verwendung von molekular geprägten Polymeren zum kontinuierlichen
Entfernen des Produkts aus dem laufenden Fermentationsprozess im
präparativen
Maßstab
und zur gleichzeitigen und nicht nachgeschalteten Aufreinigung der
Zielsubstanz durch Abtrennung von den Nebenprodukten und den Inhaltsstoffen
des Nährmediums.
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Der
entsprechende Bioreaktor oder Fermenter zum Gewinnen des Naturstoffes
durch Synthese, der das Kulturmedium zum Erzeugen des Naturstoffs als
Stoffwechselprodukt oder Fermentationsprodukt enthält, wobei das
Kulturmedium ein Nährmedium sowie
Enzyme oder Mikroorganismen umfasst, und der ferner ein sorbierendes
Material zum extrahieren des erzeugten Naturstoffes enthält, ist
dementsprechend so ausgeführt,
dass das sorbierende Material mindestens ein molekular geprägtes Polymer
umfasst, wobei der Bioreaktor ferner eingerichtet ist zum Extrahieren
des Naturstoffs ohne Unterbrechung einer Erzeugung des Naturstoffs
in dem Kulturmedium.
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Eine
bevorzugte Ausführung
der Erfindung sieht vor, dass sich das sorbierende Material in mindestens
einem Bypass des Bioreaktors befindet, durch den das Kulturmedium
oder ein von festen Bestandteilen getrennter Teil des Kulturmediums
mit dem erzeugten Naturstoff geleitet wird. Um ein Unterbrechen
der Biosynthese durch das Extrahieren des zu gewinnenden Naturstoffs
zu verhindern und so eine kontinuierliche Produktion zu erreichen,
kann das Kulturmedium oder ein von festen Bestandteilen – beispielsweise
von den Mikroorganismen, bei denen es sich um Zellen handeln kann – getrennter
Teil des Kulturmediums dann kontinuierlich durch den Bypass des
Bioreaktors geleitet werden, in dem die Extraktion der produzierten
Metabolite durch das mindestens eine molekular geprägte Polymer
erfolgt. Je nach Art und Struktur der entstehenden Naturstoffe oder
Fermentationsprodukte kann auch eine Isolierung und Abtrennung mittels
Ionenaustauschchromatographie durchgeführt werden. Um das Kulturmedium
von den festen Bestandteilen zu trennen und damit das Extrahieren
mittels des molekular geprägten
Polymers zu erleichtern, kann es gefiltert wird, bevor ein gefilterter
Teil des Kulturmediums durch das sorbierende Material geleitet wird.
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Eine
vorteilhafte Weiterentwicklung der Erfindung sieht vor, dass sich
das sorbierende Material in mindestens zwei Kammern oder Säulen in
dem mindestens einen Bypass befindet, wobei abwechselnd ein in der
einen der Kammern oder Säulen
bereits sorbierter Teil des Naturstoffs eluiert wird, während die
mindestens eine andere Kammer oder Säule zum Sorbieren verwendet.
Das erleichtert die kontinuierliche Gewinnen des Naturstoffes.
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Vorzugsweise
wird das Nährmedium
dem Bioreaktor kontinuierlich zugeführt, während ihm ein von festen Bestandteilen
getrennter Teil des Kulturmediums entnommen wird. Dabei kann das
Zuführen zumindest
teilweise aus dem Bypass geschehen, indem bereits durch Eluieren
vom erzeugten Naturstoff befreites Nährmedium wieder in eine Hauptkammer oder
einem Reaktionsraum des Bioreaktors zurückgeführt wird.
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Verfahren
kann noch effektiver gestaltet werden, wenn das sorbierende Material
mit Wasser oder einer wässrigen
Lösung
oder einem organischen Lösungsmittel
oder Lösungsmittelgemisch
gewaschen wird, bevor ein bereits sorbierter Teil des Naturstoffs aus
dem sorbierenden Material eluiert wird.
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Die
für die
vorliegende Erfindung verwendeten molekular geprägten Polymere unterscheiden sich
von unspezifischen Polymeren in der Ausbildung zielmolekülspezifischer
Hohlräume
oder Kavitäten. Ein
Verfahren zur Herstellung der MIPs, bei dem es sich um eine Prägeprozedur
handelt, kann allgemein folgende Schritte umfassen:
- • eine über spezifische
Wechselwirkungen erfolgende Komplexbildung eines in einem geeigneten Lösemittel
(Porogen) gelösten
Printmoleküls (Templatmoleküls) oder
von dessen Moleküleinheiten
bzw. funk tionellen Gruppen mit einem sogenannten funktionellen Monomer
oder mehreren funktionellen Monomeren,
- • gefolgt
von dem Polymerisationsschritt zusammen mit einem Quervernetzer
zum Aufbau eines Netzwerks von Kavitäten definierter Größe und spezifischer
Bindungsstellen und Bindungsmuster in definierten Abständen
- • und
schließlich
einem Auswaschen des Templatmoleküls.
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Bei
dem funktionellen Monomer handelt es sich dabei um eine polymerisierbare
Einheit, die mit dem Printmolekül
wechselwirkt, wobei das Templat-Monomer-Molverhältnis vorzugsweise zwischen 4:1
und 1:20 liegt. Der erwähnte
Quervernetzer ist eine Einheit mit zwei oder mehr Verknüpfungsmöglichkeiten
mit den funktionellen Monomeren. Das Templat-Quervernetzer-Molverhältnis liegt
vorzugsweise zwischen 1:1 und 1:200.
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Das
mindestens eine molekular geprägte Polymer
kann insbesondere ein Copolymer sein, das herstellbar ist aus einem
Gemisch, umfassend
- • eine erste Komponente enthaltend
ein Monomer oder Mischungen von Monomeren aus der Gruppe:
Acrylsäure, Methacrylsäure, Trifluormethacrylsäure, Vinylbenzoesäure, Itaconsäure, Amide
dieser Säuren,
andere Carbonsäuren
und deren Amide; Acrylamidomethylpropansulfonsäure und andere Sulfonsäuren;
substituierte
oder unsubstituierte Vinylpyridine, Vinylpyrimidine, Vinylpyrazole,
Vinylimidazole, Vinyltriazine, Vinylpurine, Vinylindole, Vinylchinoline,
Vinylacridine, Vinylphenanthridine, Bis(acrylamido)pyridin und andere
heteroaromatische oder schwache Basen;
substituierte oder unsubstituierte
Styrole, Vinylnaphthaline, Vinylnaphthalincarbonsäuren, Vinylnaphthole,
Vinylanthracene, Vinylanthracencarbonsäuren, Vinylphenanthrene, Vinylphenanthrencarbonsäuren, Vinylbenzamidin
und andere aliphatische oder aromatische Vinylderivate;
Acryloylamino-benzamidin,
(Amidinoalkyl)-styrole mit Methyl, Ethyl oder Propyl als Alkyl,
N-Acryloyl-(amidinoalkyl)-anilin;
Iminodiessigsäure, Ethylendiamintetraessigsäure und
andere Vinylderivate mit chelatbildenden Gruppen zum Komplexieren
von Metallionen; Silane;
- • eine
zweite Komponente enthaltend einen Quervernetzer oder Mischungen
von Quervernetzern aus der Gruppe:
Isomere von Divinylbenzol,
Bis(acryloyl)-alkane mit Ethan, Propan, Butan als Alkan; Ethylenglykoldimethacrylat
(EDMA) und Trimethylolpropantrimethacrylat (TRIM) und andere auf
Acrylsäure oder
Methacrylsäure
basierende Systeme;
Pentaerythritoltriacrylat (PETRA) und Pentaerythritoltetraacrylat
(PETER) und andere Tri- und Tetrafunktionale Acrylat-Quervernetzer;
Acrylamideinheiten,
die an den Amidstickstoffen über
Methylenspacer oder andere aliphatische Spacer, Phenylenspacer oder
andere aromatische Spacer oder Pyridinylspacer oder andere heteroaromatische
Spacer miteinander verknüpft sind;
- • Printmoleküle zur Definition
von Kavitäten;
- • ein
Lösungmittel
oder Porogen.
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Dazu
wird das Copolymer durch radikalische und/oder ionische Polymerisation
gewonnen, wobei die Printmoleküle
nach Abschluss der Polymerisation ausgewaschen werden, um die gewünschten
Kavitäten
zu bilden, die durch Auswahl entsprechende Printmoleküle oder
Templatmoleküle
maßgeschneidert
werden können
abhängig
davon, was für
ein Naturstoff sorbiert werden soll. Der Begriff Copolymer ist hier
weit zu verstehen und soll die Möglichkeit
eingeschließen,
dass die oben genannte erste Komponente und/oder die zweite (quervernetzende)
Komponente unter Umständen
auch jeweils verschiedene Monomere enthalten.
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Die
erwähnten
Printmoleküle
können
Moleküle
sein, die
- • aromatische
Einheiten wie z. B. Benzol- oder Naphtalineinheiten enthalten,
- • heterocyclische
und/oder heteroaromatische Einheiten enthalten, z. B. Pyrrole, Furane,
Thiophene, Pyrane, Oxazole, Thiazole, Indole, Chinoline, Chromane
und andere Heterocyclen,
- • Ester-,
Amid-, Amino-, Carboxy-, Keto-, Oxo-, Etter-, Methoxy- Ethoxy-,
Hydroxygruppen enthalten,
- • ausgedehntere
mono-, bi- oder tricyclische Strukturen mit mindestens 8 Ringgliedern
enthalten,
- • Spirogruppen
enthalten,
- • Struktureinheiten
mit konjugierten Doppelbindungen enthalten,
- • Terpenstrukturen
enthalten,
- • Steroidstrukturen
enthalten,
- • lineare
oder cyclische Peptidsequenzen enthalten, beispielsweise Proteine
oder Ezymderivate,
- • Fette
oder Fettsäuren
enthalten oder
- • lineare
oder cyclische, lang- oder kurzkettige Kohlenhydratstrukturen enthalten.
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Ausführungsbeispiele
der Erfindung werden nachfolgend unter Bezugnahme auf 1 beschrieben.
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Die 1 zeigt
eine schematische Ansicht eines Bioreaktors in einer Ausführung der
Erfindung.
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Der
in 1 dargestellte Bioreaktor weist einen als Reaktionsraum
dienenden Rührkessel 1 mit einem über einen
Motor 2 angetriebenen Rührwerk auf.
Dieser Reaktionsraum enthält
ein Kulturmedium zum Erzeugen eines Naturstoffes, wobei das Kulturmedium
ein Nährmedium
sowie Enzyme oder Mikroorganismen (Biomasse) umfasst. Ferner weist
der Bioreaktor einen Bypass auf, der von einem Auslass 3 des
Rührkessels 1 zu
einem Einlass 4 des Rührkessels 1 führt. Der
Auslass 3 kann sich, wie hier gezeigt, oben seitlich am
Rührkessel
befinden oder alternativ unten seitlich oder in einem Kesselboden
befinden. In dem Bypass, in dessen Verlauf mehrere Dreiwegeventile 5 geschaltet
sind, befindet sich ein sorbierendes Material, das in zwei Filtervorrichtungen 6 enthalten
ist. Diese Filtervorrichtungen 6 sind hier als waagerecht
orientierte Säulen
ausgeführt, wobei
die Säulen
selbstverständlich
auch vertikal angeordnet sein können.
Als sorbierendes Material enthalten dies Säulen ein oder mehrere selektive
geprägte
Polymermaterialien zum sorbieren des erzeugten Naturstoffs, eventuell
auch für
mehrere relevante Reaktionsprodukte.
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Im
vorliegenden Beispiel sind in den Filtervorrichtungen 6 hinter
jeweils einem Filter 7 ein erstes MIP 8, ein zweites
MIP 9 und ein drittes MIP 10 untergebracht, durch
die ein durch Vorfilter 11 von der Biomasse abgetrennter
Teil des Kulturmediums geführt
wird. Dazu wird dieser Teil des Kulturmediums durch den Bypass hindurchgeleitet,
wobei durch eine ent sprechende Ansteuerung der Dreiwegeventile 5 (das
Bezugszeichen 5 ist hier der Übersichtlichkeit halber nur
bei einigen dieser Ventile eingefügt) jeweils eine der zwei parallel
durchströmbaren
Säulen
passiert wird. Dadurch können
die zwei Säulen
in einem Parallelmodus beladen und eluiert werden. Während also
die eine Säule
beladen wird, indem der Naturstoff dort von den MIPs 8, 9 und 10 sorbiert
wird und ein Rest des Kulturmediums wieder dem Rührkessel 1 zugeführt wird,
wird der bereits sorbierte Naturstoff aus der jeweils anderen Säule eluiert.
Dazu wird eine Elutionsflüssigkeit 12 durch
die Filtervorrichtung 6 geleitet, die gerade nicht beladen
wird. Der Naturstoff sammelt sich dann als Eluat 13 hinter
den Filtervorrichtungen 6. Die Produktion des Naturstoffs kann
so kontinuierlich erfolgen, insbesondere ohne Unterbrechung der
Reaktion im Rührkessel 1.
Zusätzlich
können
sowohl die Filtervorrichtungen 6 als auch die Vorfilter 11 mit
Wasser durchströmt
werden, das von einem Wassertank 14 aus einspeisbar ist, und
dadurch gereinigt werde. Abfall sammelt sich dann in Abwasserbehältern 15.
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Schließlich sind
in der 1 auch eine Pumpe 16 zum Befördern des
gefilterten Teils des Kulturmediums durch den Bypass sowie weitere
Pumpen 17 zu erkennen. Die Pumpe 16 könnte selbstverständlich auch
an anderer Stelle im Verlauf des Bypasses angeordnet sein, beispielsweise
zwischen den Vorfiltern 11 und den Filtervorrichtungen 6 oder schon
vor den Vorfiltern 11, also an oder unmittelbar hinter
dem Auslass 3. Auch müssen
nicht unbedingt alle der weiteren Pumpen 17, die insbesondere
dem Transport der Elutionsflüssigkeit 12 bzw.
des Eluats 13 dienen, vorhanden sein, um ein Funktionieren
des Bioreaktors mit dem als Ernteeinheit dienenden Bypass zu gewährleisten.
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Die
Vorfilter 11 dienen zum Ausfiltern der beispielsweise durch
Zellen gegebenen Biomasse und haben typischerweise eine porosität im Mikrometerbereich.
Anstelle dieser Vorfilter 11 kann bei anderen Ausführungen
der Erfindung auch ein entsprechender Filter in den Reaktionsraum,
hier also in den Rührkessel 1,
integriert sein, der dort vor dem Auslass 3 angeordnet
sein kann. Eine andere Alternative sieht vor, dass im Kulturmedium
enthaltene Zellen dadurch am Passieren des Bypasses gehindert werden,
dass das Kulturmedium im Bereich des Auslasses 3 lokal
mit Ultraschall beaufschlagt wird, was dort zu einem Ausflocken
oder Ausfallender Biomasse führt,
die dadurch an einem Verlassen des Reaktionsraums gehindert wird.
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Beispielhaft
wird das skizzierte Verfahren zum Gewinnen eines Naturstoffes nachfolgend
noch detaillierter beschrieben. Dabei ist der Aufbau aus hier in
Bezug genommene 1 nur als Beispiel zu verstehen.
Die spezifisch sorbierenden molekular geprägten Polymere können alternativ
auch in eine bereits kommerziell erhältliche Produktentnahmeeinheit oder
Ernteeinheit eines kontinuierlichen Prozesses integriert werden.
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Das
Verfahren wird in dem Bioreaktor durchgeführt, dessen Reaktionsraum mit
Nährmedium
befüllt
und mit einer Vorkultur der speziell herangezüchteten Mikroorganismen oder
Zellen geimpft wird, so dass die Organismen, Zellen, Enzyme oder
das Mycel einer Flüssigkeit
bzw. Dispersion verteilt sind, die ein Kulturmedium bildet. Die
Befüllung
mit Nährmedium/Nährsubstanzen
kann auf einmal (Batch-Prozesse), sukzessive (Fed-Batch-Prozesse)
oder kontinuierlich erfolgen. Ein bestimmter Sauerstoffdruck oder eine
bestimmte Konzentration an gelöstem
Sauerstoff wird durch Zudosierung oder Regulierung der Rührgeschwindigkeit
eingestellt und mittels Sonden in Medium und Abluft überprüft, ebenso
der CO2-Gehalt in der Abluft. Außerdem wird
die Temperatur durch Heiz- und Kühlkreisläufe geregelt.
Der pH-Wert wird automatisch mittels an den pH-Sensor gekoppelten
Pumpen kontrolliert und kann auch über die Fütterungsrate der Substrate
(Zucker, Aminosäuren, Polyalkohole,
Carbonsäureanionen
und andere Kohlenstoff-, Stickstoff- und evtl. Phosphorquellen)
erreicht werden. Das Wachstum kann durch UV-Vis-Detektion verfolgt
werden.
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Das
geprägte
Sorbens-Polymer kann bei einfachen Ausführungen der Erfindung direkt
dem Medium der Fermenterkultur zugesetzt werden, aus dem selektiv
die produzierten oder abgesonderten Metabolite akkumulativ gebunden
und kontinuierlich entfernt werden. Das Polymer wird dann durch
Sieben oder Zentrifugieren vom Kulturmedium abgetrennt, gewaschen
und mit einer nur kleinen Menge an Lösemittel desorbiert oder extrahiert,
welches dann zum Trocknen eingedampft und aufkonzentriert wird.
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Vorzugsweise
befindet sich das molekular geprägte
Polymer aber, wie bei der in 1 gezeigten
Ausführung,
in einem Bypass des Fermenters und dort in einer Kammer oder in
Säulen,
durch die das zentrifugierte oder anderweitig von den festen Bestandteilen
abgetrennte Fermenterkulturmedium durchgeleitet oder -gepumpt wird,
wobei die produzierten Metabolite (der zu gewinnende Naturstoff)
selektiv am Absorbermaterial haften bleiben (bleibt). Dadurch ist
eine kontinuierliche Extraktion des Produkts (oder von Nebenprodukten)
durch MIP aus dem laufenden Fermentationspro zess möglich, ohne diesen
dabei abzubrechen.
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Zur
Rückgewinnung
worden die Wirkstoffe dann vom gewaschenen Sorbens desorbiert oder eluiert
und das Eluat zum Trocknen eingedampft und aufkonzentriert.
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Bei
der in 1 dargestellten Säulenvariante werden die MIPs
in zwei Säulen
gefüllt,
die in einem Parallelmodus beladen und eluiert werden: Während an
der einen die Sorption stattfindet, wird die andere simultan desorbiert
und umgekehrt, so dass der Fluss an umgeleitetem Kulturmedium konstant
gehalten werden kann.
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Vor
der Elution der Zielwirkstoffe sollten die beladenen Polymere zur
Abtrennung der zu einem gewissen Anteil mit aufgenommenen Nährmediumssubstanzen
oder Nebenprodukte mit Wasser oder wässrigen Lösungen, geeigneten organischen
Lösemitteln
oder Lösemittelgemischen
gewaschen werden.
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Die
Freisetzung, Elution oder Desorption der bevorzugt aufgenommenen
Zielmetaboliten erfolgt mit geeigneten Lösemitteln oder Lösemittelgemischen.
Zur Anwendung können
Wasser, alle denkbaren wässrigen
Lösungen
und organischen Lösemittel kommen,
auch in Mischungen untereinander und mit Wasser und auch mit gelösten organischen
oder anorganischen Verbindungen.
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Die
Freisetzung des bevorzugt aufgenommenen Stoffes beziehungsweise
der Stoffgruppe sowie die Abtrennung der mit aufgenommenen Fremdsubstanzen
kann auch durch eine kontinuierliche Elution mit den oben erwähnten geeigneten
Lösemitteln
oder Lösemittelgemischen
erfolgen.
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Zur
Abtrennung der Zellen oder anderer fester Bestandteile aus dem Fermenterkulturmedium kann
eine Membran oder ein Filter aus den verschiedensten Materialien
wie z. B. Cellulose, Polypropylen etc. verwendet werden, deren Porengröße sich
im Mikrometerbereich bewegt und die es Inhaltsstoffen des Kulturmediums
von geringerem Molekulargewicht (so auch den Zielmetaboliten) erlaubt,
in die mit MIP befüllte
Kammer oder Säule
des Bypasses hineinzudiffundieren, um dort mit den MIP in Kontakt
zu kommen. Diese Membran kann auch schon direkt mit als Membran
vorliegenden MIP gekoppelt sein oder aus geprägtem Polymer bestehen.
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Die
Variante des Verfahrens, bei der sich das molekular geprägte Polymer
in einem Bypass des Fermenters befindet, bietet sich besonders für kontinuierliche
Bioreaktorprozesse an, bei denen ein steter Zulauf an Nährmedium
bzw. -substanzen und ein gleichgroßer Ablauf an Fermenterkulturmedium
stattfindet. Das Nährmedium
kann dann wieder in den Reaktionsprozess zusammen mit frischem Nährmedium
zurückgeführt werden.
Denkbar ist aber auch bei den hier beschriebenen kontinuierlichen
Reaktorverfahren der Zusatz der MIP direkt zum Medium.
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Bei
den batch- oder fed-batch-Befüllungsverfahren
wird der Reaktor nach einer bestimmten Reaktions- oder Wachstumszeit
im allgemeinen wieder komplett entleert, da die Nährstoffe
aufgebraucht sind und eine bestimmte Konzentration an Produkt(en)
sich negativ auf das Wachstum der betreffenden Mikroorganismen auswirken
kann, so dass der Produktionsprozess ein Gleichgewicht erreicht. Molekular
geprägte
Polymere, die direkt ins Kulturmedium eingebracht werden, können nach
Aufnahme der relevanten Metaboliten aus dem Reaktor wieder entfernt
und der Reaktionsprozess nach erneuter Zudosierung von Nährmedium
bzw. -substanzen weiter am Laufen gehalten werden, was ein erneutes
Ansetzen der z. T. schwer zu kultivierenden Biomasse einspart.
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Das
hier vorgeschlagene Verfahren kann zur selektiven Entfernung, Aufreinigung
und Anreicherung von Metaboliten, die von Organismen oder genetisch
manipulierten Organismen produziert werden, aus Fermentern oder
Bioreaktoren angewendet werden. Als Beispiele für die Anwendung des Verfahrens
wären neben
weiteren Bereichen zu nennen:
- • in der
pharmazeutischen und Kosmetikindustrie die biotechnologische Herstellung
medizinisch-pharmakologischer
hochreiner Produkte wie z. B. moderner Insuline, Antibiotika, Krebstherapeutika
oder ähnlich
biologisch aktiver Wirkstoffe, auch von Arzneimitteln wie Aspirin
(Acetylsalicylsäu
re),
- • Glykoproteine,
Steroide etc.,
- • Einsatz
bei der Herstellung/Anreicherung von Feinchemikalien, Vitaminen,
Aminosäuren,
Proteinen für
menschliche Nahrungsmittel oder Tierfutter,
- • Einsatz
bei der Herstellung von Ethanol, Zitronensäure, Milchsäure, Süßstoffen, Aceton, Butanol,
Lysin, Polysacchariden u. a. für
biologisch abbaubare Polymere,
- • zur
unterstützenden
Steuerung durch Entfernen von Nebenprodukten von biotechnologischen Prozessen
allgemein z. B. in der Nahrungsmittelindustrie,
- • zur
Unterstützung
von Abbauprozessen in dezentralen Reaktoren, die im Umweltbereich
eingesetzt werden und die sich biologischer Prozesse bedienen,
- • Antikörper, insbesondere
monoclonale Antikörper
oder Antikörperbestandteile
oder engineerten Antikörper
(antibody engineering Produkte).
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Das
hier vorgeschlagene Verfahren hat gegenüber vergleichbaren herkömmlichen
Verfahren aufgrund des Einsatzes von MIP als Absorber insbesondere
folgende Vorteile:
- • Nur die ausgewählte Zielverbindung
bzw. -verbindungsklasse wird spezifisch aus dem Kulturmedium aufgenommen,
wodurch eine Verlängerung
der Betriebsdauer der selektiven Filterkomponente ermöglicht werden
kann.
- • Absorption
von Metaboliten im Spurenbereich wird möglich, da die Möglichkeit
gegeben ist, gegenüber
unspezifischen Absorbern die Bindungskonstante für eine Zielsubstanz durch maßgeschneiderte
Bindungsmuster und korrekte Organisation in den molekular geprägten Bindungsstellen
zu erhöhen.
- • Im
Gegensatz zum unspezifischen Absorber wird das Zielprodukt durch
selektive Bindung an die Bindungsstellen im MIP besser von den Inhaltsstoffen
des Nährmediums
abgetrennt.
- • Eine
kontinuierliche spezifische Aufnahme und Entfernung eines oder mehrerer
Produkte aus dem Prozess erhöht
die Produktausbeute.
- • Es
ergibt sich die Möglichkeit
der direkten oder indirekten Steuerung der Produktzusammensetzung
oder Bildung neuer Produktanaloga durch selektive Entfernung aus
dem Gleichgewicht.
- • Eine
sterile Handhabung durch automatisiertes gezieltes Extrahieren der
gewünschten
Produkte wird erleichtert.
- • Eine
Erfüllung
der strengen FDA-, GMP- und anderer Normen wird erleichtert.
- • Ein
flexibler Einsatz von individuell maßgeschneiderten MIPS für eine große Anzahl
von verschiedenen biologisch aktiven Substanzen wird möglich.
- • Anders
als bei einer Verwendung einfacher Polystyrol-Divinylbenzol-Harze
als Absorber können von
den MIPs auch hydrophile Bindungsstellen für Wirkstoffe bereitgestellt
werden.
- • Eine
Regeneration und Wiederverwendung der selektiven Filterkomponente
wird ermöglicht.
- • Eine
Variierung und Anpassung des Systems an die jeweils vorliegende
Abtrennungsproblematik ist möglich.
- • Vorteilhaft
ist die mechanische und chemische (z. B. PH) Stabilität der verwendeten
MIPs.
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Gegenstand
der vorliegenden Erfindung ist die Nutzung von molekular geprägten Polymeren
im Zusammenhang mit der selektiven Entfernung von Stoffen aus Bioreaktoren
sowie das gesamte oben vorgestellte Verfahren, bei dem sich das
molekular geprägte
Polymer entweder direkt im Reaktor oder in einem Bypass des Fermenters
befindet, mit den genannten Aufnahme gegebenenfalls Trenn-, Wasch-, Desorptions-
oder Elutionsschritten, und den jeweils verwendeten Materialien,
Reagenzien, Anordnungen oder Verfahren. Die benötigten molekular geprägten Polymere
können
gewonnen werden durch die Auswahl und Modifikation von funktionellen
Monomeren bzw. einem Gemisch aus funktionellen Monomeren, von Quervernetzern
bzw. einem Gemisch aus Quervernetzern, von Porogen oder Porogengemischen sowie
von Radikalstartern für
bestimmte Zielmetaboliten oder deren Derivate und durch die Erstellung
eines geeigneten Wasch- und Aufreinigungsprotokolls für neu hergestellte
Polymere. Auch können
neuartige funktionelle Monomere für diese Zwecke hergestellt
werden.
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Typische
verwendete funktionelle Monomere (polymerisierbare Einheit, die
mit dem Printmolekül wechselwirkt)
können
sein:
Carbonsäuren
(Acrylsäure,
Methacrylsäure,
Trifluormethacrylsäure,
Vinylbenzoesäure,
Itaconsäure)
sowie deren Amide, Sulfonsäuren
(Acrylamidomethylpropansulfonsäure),
heteroaromatische
bzw. schwache Basen wie substituierte oder unsubstituierte Vinylpyridine,
Vinylpyrimidine, Vinylpyrazole, Vinylimidazole, Vinyltriazine, Vinylpurine,
-indole, -chinoline, -acridine, -phenanthridine, Bis(acrylamido)pyridin,
aliphatische
oder aromatische Vinylderivate wie substituierte oder unsubstituierte
Styrole, Vinylnaphthaline, Vinylnaphthalincarbonsäuren, Vinylnaphthole,
Vinylanthracene, Vinylanthracencarbonsäu ren, Vinylphenanthrene, Vinylphenanthrencarbonsäuren und ähnliche
kondensierte Aromaten, Vinylbenzamidin, Acryloylamino-benzamidin,
(Amidinoalkyl)-styrole (-alkyl: -methyl, -ethyl, -propyl), N-Acryloyl-(amidinoalkyl)-anilin,
Vinylderivate mit chelatbildenden Gruppen (Iminodiessigsäure, Ethylendiamintetraessigsäure u. ä.) zum Komplexieren
von Metallionen, Silane sowie auch
Mischungen genannter Monomere.
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Auch
andere funktionelle Monomere können zum
Einsatz kommen wie zum Beispiel komplexere Monomere, in denen mehrere
funktionelle Gruppen (gleiche oder verschiedene) miteinander verknüpft vorliegen.
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Als
Quervernetzer (Einheit mit zwei oder mehr Verknüpfungsmöglichkeiten mit den funktionellen
Monomeren) können
dienen:
Isomere des Divinylbenzols, Bis(acryloyl)-alkane (-alkane:
-ethan, -propan, -butan), Systeme basierend auf Acrylsäure oder
Methacrylsäure
wie zum Beispiel Ethylenglykoldimethacrylat (EDMA) und Trimethylolpropan-trimethacrylat
(TRIM),
Tri- und Tetrafunktionale Acrylat-Quervernetzer wie zum
Beispiel Pentaerythritoltriacrylat (PETRA) und Pentaerythritoltetraacrylat
(PETER) sowie
Quervernetzer, die funktionelle Gruppen enthalten wie
zum Beispiel Acrylamideinheiten, die an den Amidstickstoff über über aliphatische
(Methylen- u. ä.),
aromatische (Phenylen- u. ä.)
oder heteroaromatische (Pyridinyl- u. ä.) Spacer miteinander verknüpft sind.
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Auch
andere Quervernetzer können
zum Einsatz kommen.
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Als
Porogene (Lösungsmittel,
die als Solventien für
die Polymerisierungsreaktion dienen und Porosität in das geprägte Polymer
induzieren) können Lösemittel
verschiedener Dielektrizitätskonstante verwendet
worden, die Parameter wie unterschiedliche Quelleigenschaften des
Polymers, unterschiedliche Morphologie des Polymers mit verschiedenen Strukturen
und Porendurchmessern/Porosität
oder unterschiedliche Bindungsstärken
der nonkovalenten Wechselwirkungen beeinflussen. Zu nennen wären:
aliphatische
oder alicyclische Kohlenwasserstoffe wie Hexan, Heptan oder Cyclohexan,
aromatische
Kohlenwasserstoffe wie Toluol, halogenierte Kohlenwasserstoffe wie
Chloroform, Dichlormethan oder 1,2-Dichlorethan, ferner
Methanol,
Ethanol, Propanol und weitere kurzkettige Alkohole, Ether, Acetonitril,
Tetrahydrofuran, Ethylacetat, Aceton, Dimethyilformamid, Dioxan,
Dimethylsulfoxid,
auch in Mischungen untereinander und mit
Wasser.
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Als
Initiatoren (Radikalstarter) können 2,2'-Azobis-isobutyronitril (AIBN),
2,2'-Azobis-(2,4-dimethylvaleronitril)
(ADVN) und andere verwendet werden, Auch die Verwendung von UV-Licht
zum Initiieren ist möglich.
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Das
Gemisch zum Herstellen des molekular geprägten Polymers enthält schließlich neben
den genannten Kom ponenten des funktionellen Monomers, des Quervernetzer,
des Lösungsmittels
und ggf. des Radikalstarters auch Printmoleküle, die auch als Templatmoleküle bezeichnet
werden und die Kavitäten
definieren, die in dem jeweiligen MIP entstehen sollen, damit dieses
die gewünschten
spezifischen Sorptionseigenschaften erhält. Für die Auswahl der Printmoleküle und die
Mengenverhältnisse gilt
dabei typischerweise das schon weiter oben im allgemeinen Beschreibungsteil
Gesagte. Nach Abschluss der Polymerisation werden die Printmoleküle, um die
herum sich das Copolymer gebildet hat, mit einem geeigneten Lösungsmittel
ausgewaschen.
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Die
molekular geprägten
Polymere können in
folgender Form hergestellt werden bzw. nach dem Herstellungsprozess
in folgenden Formen vorliegen:
- • Herstellung
von Polymermonolithen und nachfolgende Fragmentierung,
- • Aufpfropfen
des geprägten
Polymers auf vorgeformte Partikel,
- • Herstellung
von Polymerkügelchen
aus Suspensions-, Emulsions- oder Dispersionspolymerisation,
- • Polymerpartikel,
die an Dünnschichten
oder Polymermembranen gebunden sind,
- • Polymermembranen,
- • Oberflächengeprägte Polymerphasen,
wobei die gebildeten Komplexe der Templatmoleküle mit den funktionellen Monomeren
an aktivierte Oberflächen
wie zum Beispiel Silizium- oder Glasoberflächen binden und nach dem Auswaschen
definierte geprägte
Strukturen ergeben.
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Das
Polymer kann in eine Trennsäule,
in eine Filtervorrichtung oder in eine Kammer aus Kunststoff, Glas,
Edelstahl oder anderen Materialien, eingebracht wer den oder an Dünnschichten,
Oberflächen unterschiedlicher
Materialien oder Polymermembranen gebunden sein oder auch selbst
als Membran eingesetzt werden. Alternativ können die Partikel frei in der
flüssigen
Phase schwimmend eingesetzt werden. Auch andere Vorrichtungen zur
Aufnahme des Polymers können
zum Einsatz kommen.
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Auch
eine Kombination oder sukzessive Anordnung von mehreren Sorptionsschritten
mit denselben oder verschiedenen selektiven Polymermaterialien für mehrere
relevante Reaktionsprodukte ist denkbar.
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Auch
die Reaktorform kann variieren. Insbesondere kann anstelle des in 1 gezeigten
Rührkesselreaktors
mit dem Rührkessels 1 auch
ein Airlift- oder Schlaufenreaktor verwendet werden.
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Der
Strom des von den festen Bestandteilen befreite Fermenterkulturmediums
kann sowohl durch die Trennsäule,
Filtervorrichtung, Membran etc. hindurchgeleitet werden als auch
fast parallel am sorbierenden Material vorbeigeleitet werden. Auch
andere Verfahren können
zum Einsatz kommen.