-
Gebiet der Erfindung
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle
gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1, die für
Signalpeptide codieren.
-
Hintergrund der Erfindung
-
Viele
für medizinische oder industrielle Prozesse interessante
Proteine lassen sich in rekombinanten Expressionssystemen herstellen.
Beispiele für solche Expressionssysteme sind z. B. transformierte
Bakterien, die das für das interessierende Protein codierende
Gen auf einem Plasmid tragen. Da das Gen durch geeignete Maßnahmen
unter den Einfluß eines starken Promotors gestellt wird,
wird es vom Wirtorganismus in großem Maßstab synthetisiert
und angereichert oder ins Medium abgegeben; es kann dann aufgereinigt
und weiterverarbeitet werden.
-
Ein
großer Nachteil solcher bakterieller, d. h. prokaryotischer
Expressionssysteme ist der, dass mit diesen Verfahren viele eukaryontische
Proteine zwar synthetisiert werden können, nicht aber ihre
volle Aktivität entfalten, da etwaige erforderliche posttranslationale
Modifikationen von dem prokaryontischen Wirtorganismus nicht durchgeführt
werden. Hierzu zählen z. B. posttranslationale Glykosylierung
und/oder Phosphorylierung, Faltung mit Hilfe von Chaperonen, die
Ausbildung von Disulfitbrücken, die proteolytische Abspaltung
von Inhibitoren, die Verknüpfung mit Koenzymen und prosthetischen
Gruppen, die Bindung von Ionen und niedermolekularen Substanzen,
die Ubiquitinylierung und/oder Prenylierung und dergleichen.
-
In
diesen Fällen ist es günstiger, ein eukaryontisches
Expressionssystem zu verwenden, weil dieses die Möglichkeit
der posttranslationale Modifikationen bietet, insbesondere im Endoplasmatischen
Reticulum.
-
Um
die Ernte und Aufreinigung des herzustellenden Proteins zu erleichtern,
ist es vorteilhaft, wenn dieses vom Expressionssystem unmittelbar
in das umgebende Medium sezerniert wird. Auf diese Weise kann das Protein
leicht aus dem umgebenden Medium isoliert werden, und die Expressionssysteme
müssen nicht unbedingt lysiert werden, sondern können
unter Umständen weiter verwendet werden.
-
Im
anderen Fall – d. h., wenn das herzustellende Protein im
Zellinneren des Expressionssystems angereichert wird – müssten
die Zellen lysiert (d. h. getötet) werden, und es würde
ein aufwendiger Aufreinigungsprozess folgen.
-
Um
sicherzustellen, dass das herzustellende Protein in das umgebende
Medium sezerniert wird, bedient man sich sogenannter Signalpeptide.
-
Ein
Signalpeptid ist ein Bestandteil eines Proteins, der zusammen mit
der Sequenz für das eigentliche Protein auf der cDNA, der
mRNA oder einem ORF codiert ist, und der Informationen darüber
enthält, wie und wohin dieses Protein innerhalb der Zelle
transportiert werden soll. Proteine, die z. B. für den
Transport in das Endoplasmatische Retikulum (ER) und damit u. U.
für die spätere Sekretion bestimmt sind, besitzen
in ihrer Aminosäuresequenz ein Signal, das sie spezifisch
zur ER-Membran zielleitet. Bei sekretorischen Proteinen besteht
das Signal aus einer 15 bis 40 Aminosäuren langen N-terminal
lokalisierten Aminosäuresequenz. Obwohl die Primärstruktur
dieser Signalpeptide nicht konserviert ist, können drei
verschiedene Bereiche unterschieden werden: ein zentraler hydrophober
Kern wird N-terminal von positiv geladenen Aminosäuren
und C-terminal von polaren Aminosäuren flankiert. In den
meisten Fällen wird das Signalpeptid nach dem Membrandurchtritt proteolytisch
vom eigentlichen Protein durch das Enzym Signalpeptidase abgespalten.
Die Schnittstelle wird dabei durch kleine Aminosäurereste
in den Positionen –3 und –1 der C-terminalen polaren
Region der Signalsequenz definiert.
-
Ein
typisches eukaryontisches Signalpeptid, das den Transport des zu
synthetisierenden Proteins ins ER bewerkstelligt, weist z. B. folgende
Aminosäuresequenz auf:
MMSFVSLLVGIFWATEAEQLTKCEVFQ
-
Die
für das Signalpeptid codierende Sequenz wird, da sie im
Bereich des 5'-Endes der Nukleinsäuresequenz angeordnet
ist, bei der Translation am Ribosom als erstes synthetisiert, so
dass sich, wenn das Signalpeptid weit genug aus dem Ribosom herausragt,
das SRP (signal recognition particle) an die naszierende Polypeptidkette
und das Ribosom anlagert und die Translation stoppt. An der Oberfläche
des rauhen ER befindet sich ein SRP-Rezeptor, der das Ribosom bindet
und in Position an das Translocon bringt. Das SRP dissoziiert daraufhin
und kann erneut zur Markierung dienen. Die Polypeptidkette wird
nun durch das Translocon in das Lumen des ER weitersynthetisiert.
Anschließend entfernt das Enzym Signalpeptidase die Signalsequenz.
Ist die Translation abgeschlossen, wird das Protein im ER-Lumen – ggf.
mit Hilfe von Chaperonen – gefaltet. Hinzu kommen ggf.
weitere Schritte, die unter dem oben bereits eingeführten
Begriff der posttranslationalen Modifikation zusammengefasst werden.
-
In
der Biotechnologie macht man sich solche Signalpeptide zunutze,
um sicherzustellen, dass das herzustellende Protein in das die Zellen
umgebende Medium sezerniert wird. Hierzu wird ein Expressionssystem verwendet,
bei dem eine für das herzustellende Protein codierende
cDNA in einen 3' gelegenen Bereich einer für ein Signalpeptid
codierenden cDNA einkloniert wird. In der Regel geschieht das über
eine downstream von der Signalsequenz gelegene Restriktionsschnittstelle.
Da diese in der Regel mindestens zwei Nukleotidtripletts aufweist,
erhält man auf diese Weise ein Konstrukt, bei welchem die
Signalsequenz und die für das herzustellende Protein codierdende
Sequenz durch mindestens zwei Nukleotidtripletts getrennt ist; das
translatierte Protein weist also mindestens zwei Aminosäurereste
zwischen dem Signalpeptid und dem herzustellenden Protein auf.
-
Ein
solches Konstrukt ist z. B. aus Curry et al (1988), Expression
and Secretion of a Cellulomonas fimi Exoglucanase in Saccharomyces
cerevisiae; Appl Environ Microbiol 54(2):476–484,
bekannt.
-
Da
die anschließend tätig werdende Signalpeptidase
das Signalpeptid sequenzspezifisch an dessen C-terminalem Ende entfernt,
erhält man auf diese Weise ein Protein, das an seinem N-Terminus
mindestens zwei überzählige Aminosäuren
aufweist; diese können u. U. die Aktivität des
hergestellten Proteins gefährden oder im Falle einer pharmazeutischen
Verwendung allergen wirken.
-
Beschreibung der Erfindung
-
Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Nukleinsäuremolekül
und/oder ein Verfahren bereitzustellen, das bei Verwendung eines
Signalpeptids die Expression und Sekretion von hochaktiven und funktionellen
Proteinen in einem geeigneten Expressionssystem ermöglicht.
-
Diese
Aufgabe wird mit einem Nukleinsäuremolekül bzw.
einem Verfahren gemäß den unabhängigen Ansprüchen
gelöst. Die Unteransprüche geben bevorzugte Ausführungsformen
an.
-
Demnach
ist ein Nukleinsäuremolekül vorgesehen, das für
ein Signalpeptid codiert, und das dadurch gekennzeichnet ist, dass
das Nukleinsäuremolekül im Bereich seines 3'-Endes
eine Schnittstelle für eine Restriktionsendonuklease aufweist.
-
Bevorzugt
handelt es sich bei dem Signalpeptid um ein eu- oder prokaryontisches
Signalpeptid, das die translatierten Proteine einer Sekretion zuleitet.
Mit Hilfe eines solchen Nukleinsäuremoleküles
läßt sich auf einfache Weise die Expression und
Sezernierung eines funktionellen Proteins durch ein Expressionssystem realisieren.
Es kann nämlich hiermit ein Konstrukt erzeugt werden, das
für ein Expressionsprodukt codiert, das unmittelbar in
Anschluß an den C-Terminus der Sequenz für das
Signalpeptid das zu exprimierende und sezernierende Protein aufweist.
-
Das
translatierte Protein wird dann mit Hilfe des Signalpeptids in ein
bestimmtes Zellkompartiment verbracht, so z. B. in das endoplasmatische
Reticulum, wo das Signalpeptid durch eine Signalpeptidase sequenzspezifisch
abgespalten wird. Aufgrund der Tatsache, dass – anders
als im Stand der Technik – zwischen Signalpeptid und zu
exprimierendem Protein keine weiteren, durch Einfügung
einer geeigneten Schnittstelle in die cDNA bedingte Aminosäurereste
vorhanden sind, erhält man nach der proteolytischen Abspaltung
des Signalpeptids ein in seiner Sequenz dem nativen Protein entsprechendes
Protein ohne einen N-terminalen Überhang, der ggf. die
Aktivität oder die pharmakologische Wirkung des zu exprimierenden
Proteins gefährden könnte.
-
Bevorzugt
ist vorgesehen, dass es sich bei besagtem Signalpeptid um ein prokaryontisches
oder ein eukaryontisches Signalpeptid handelt.
-
Häufig
weisen native Nukleinsäuremoleküle, die für
Signalpeptide codieren, keine geeignete Restriktionsschnittstelle
auf, zumindest nicht im Bereich ihrer 3'-Enden. Es ist daher bevorzugt
vorgesehen, dass die Schnittstelle für eine Restriktionsendonuklease
durch eine stille Punktmutation in der nativen Nukleotidsequenz
des Nukleinsäuremoleküls für das Signalpeptid
erzeugt ist. Auf diese Weise bleibt die Funktion des Signalpeptides
erhalten, und es kommen die oben genannten Vorteile zum Tragen.
-
Weiterhin
ist bevorzugt ein Nukleinsäuremolekül vorgesehen,
das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
- a) Nukleinsäuremolekül gemäß der
obigen Beschreibung;
- b) Nukleinsäuremoleküle, die für
eine Form eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz gemäß SEQ
ID No: 2 codieren, wobei das codierte Polypeptid eine Signalpeptid-Funktion
hat, und wobei die Nukleinsäuremoleküle gleichzeitig
im Bereich ihres 3'-Endes eine Schnittstelle für eine Restriktionsendonuklease
aufweisen;
- c) Nukleinsäuremoleküle, die die Nukleotidsequenz
gemäß SEQ ID No: 1 aufweisen, und die für
eine Form des besagten Polypeptids codieren;
- d) Nukleinsäuremoleküle, die für
ein Fragment oder ein Derivat eines Polypeptids, das durch ein Nukleinsäuremolekül
gemäß a) oder b) codiert wird, codieren, wobei
in besagtem Derivat ein oder mehrere Aminosäurereste im
Vergleich zu besagtem Polypeptid konservativ substituiert sind,
und wobei besagtes Fragment oder Derivat eine Signalpeptid-Funktion
hat;
- e) Nukleinsäuremoleküle, deren komplementärer
Strang unter stringenten Bedingungen mit einem Nukleinsäuremolekül
gemäß a)–c) hybridisiert, und die für
ein Polypeptid mit Signalpeptid-Funktion codieren;
- f) Nukleinsäuremoleküle, die eine mindestens
95%ige Sequenzidentität mit einem Nukleinsäuremolekül
gemäß a)–d) aufweisen, und die für
ein Polypeptid mit Signalpeptid-Funktion codieren;
- g) Nukleinsäuremoleküle, die eine mindestens
70%ige Sequenzidentität mit einem Nukleinsäuremolekül gemäß a)–d)
aufweisen, und die für ein Polypeptid mit Signalpeptid-Funktion
codieren;
- h) oder der komplementäre Strang eines Nukleinsäuremoleküls
gemäß a)–f).
-
Unter
dem Begriff „Fragment" soll im Folgenden ein Polypeptid
verstanden werden, das mindestens eine Aminosäure weniger
als das ursprünglich beanspruchte Polypeptid aufweist.
-
Unter
dem Begriff „Derivat" soll im Folgenden ein Polypeptid
verstanden werden, das mindestens eine Aminosäuren-Substitution
im Vergleich zu dem ursprünglich beanspruchten Polypeptid
aufweist.
-
Grundsätzlich
sind jedoch durch die obige Definition auch solche Nukleinsäuremoleküle
erfasst, die zwar eine von den beanspruchten Sequenzen SEQ ID No:
1 oder SEQ ID No: 2 abweichende Sequenz aufweisen, bei denen sich
diese Sequenzunterscheide jedoch nicht in Sequenzabweichungen des
codierten Polypeptids äußern, da es sich um sogenannte „stille
Punktmutationen" (Punktmutationen in der dritten Stelle eines Tripletts)
handelt, die aufgrund der Degenerierung des Genetischen Codes nicht
zu einem Aminosäureaustausch führen (sogenannte
"wobble"-Mutationen).
-
Unter
dem Begriff „konservativ substituiert" soll im folgenden
eine Substitution eines Nukleinsäuremoleküls,
d. h. eine oder mehrere Basenaustauschmutationen, verstanden werden,
die dazu führen, dass eine an einer Stelle ursprünglich
vorhandene Aminosäure durch eine Aminosäure ersetzt
wird, die die Eigenschaften des Polypeptids nicht oder nicht wesentlich
verändert. In der Regel trifft dies für substituierende
Aminosäuren mit ähnlichen chemischen Eigenschaften
zu.
-
So
fasst man u. A. die Aminosäuren Alanin, Glycin, Isoleucin,
Leucin, Methionin und Valin zu den aliphatischen Aminosäuren
zusammen. Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin werden zu den aromatischen
Aminosäuren gezählt, Serin, Threonin, Asparagin,
Glutamin und Tyrosin zählen zu den polaren Aminosäuren,
Lysin, Arginin und Histidin zählen zu den basischen Aminosäuren,
Asparaginsäure (Aspartat) und Glutaminsäure (Glutamat)
zählen zu den sauren Aminosäuren und Cystein und
Tyrosin zu den Aminosäuren mit ionisierbaren Resten.
-
Grundsätzlich
sind jedoch durch die obige Definition auch solche Nukleinsäuremoleküle
erfasst, die zwar eine von den beanspruchten Sequenzen abweichende
Sequenz aufweisen, diese Sequenzunterscheide sich jedoch nicht in
Sequenzabweichungen des codierten Polypeptids äußern,
da es sich um sogenannte „stille Punktmutationen" (Punktmutationen
in der dritten Stelle eines Tripletts) handelt, die aufgrund der
Degenerierung des Genetischen Codes nicht zu einem Aminosäureaustausch
führen.
-
Ein
besonders bevorzugtes Signalpeptid ist das Signalpeptid Mel1 aus
Schizosaccharomyces pombe. Die native cDNA-Sequenz für
dieses Signalpeptid sieht aus wie folgt (SEQ ID No. 4):
-
Das
native Peptid, seine Sequenz und seine Eignung als Signalpeptid
zur Sekretion von Proteinen wurde von Goddard et al. (2005),
Development of a semi-quantitative plate-based agalactosidase gene
reporter for Schizosaccharomyces pombe and its use to isolate a
constitutively active Mam2; Yeast 2005; 22: 31–41, beschrieben.
-
Die
Erfinder haben nun erstmals gezeigt, dass durch Einführung
einer stillen Punktmutation in das drittletzte Triplett (siehe den
unterstrichenen Bereich der obigen Sequenz) eine Schnittstelle für
eine Restriktionsendonuklease erzeugt werden kann.
-
Bei
besagter Schnittstelle kann es sich um die Schnittstelle für
eine Typ I-Restriktionsendonuklease, eine Typ II-Restriktionsendonuklease
oder eine Typ III-Restriktionsendonuklease handeln.
-
Besonders
bevorzugt ist jedoch eine Schnittstelle für eine Typ II-Restriktionsendonuklease.
Zu diesen zählt insbesondere die Restriktionsendonuklease
NcoI, die die folgende Sequenz erkennt.
5'-c^c a t g g-3'
3'-g
g t a c^c-5'
-
Durch
besagte Punktmutation haben die Erfinder aus der oben gezeigten
Sequenz für das native Signalpeptid Mel1 aus Schizosaccharomyces
pombe folgende Sequenz erzeugt (SEQ ID No. 1):
-
Es
wurde also ein t gegen ein c getauscht. Da sowohl das native Triplett
GTT als auch das erfindungsgemäß erzeugte Triplett
GTC (siehe unterstrichener Bereich in der obigen Sequenz) für
die Aminosäure Valin codieren, ändert sich die
Aminosäuresequenz des Signalpeptids nicht. Dennoch wird
auf diese Weise in der Signalsequenz eine Schnittstelle für
NcoI erzeugt, die in folgender Darstellung derselben Sequenz unterstrichen
ist:
-
Durch
die Einführung der Punktmutation, die zur Schaffung der
NcoI-Schnittstelle führt, wird also die Funktionalität
des codierten Signalpeptids nicht beeinträchtigt.
-
Durch
Verwendung eines Signalpeptids, dessen codierende Nukleinsäuresequenz
im Bereich ihres 3'-Endes eine Schnittstelle für eine Restriktionsendonuklease
aufweist, oder durch Einführung einer solchen Schnittstelle
mit Hilfe einer stillen Punktmutation, läßt sich
ein Konstrukt aus Signalpeptid und zu exprimierendem und sezernierendem
Peptid herstellen, bei dem Signal- und Peptidsequenz nicht durch
u. U. störende Aminosäurereste getrennt sind.
Das Signalpeptid wird folglich im Laufe der posttranslationalen
Prozessierung durch die Signalpeptidase bündig abgetrennt,
und es bleibt die native Sequenz des herzustellenden Proteins ohne
störende Reste zurück, die u. U. weiter prozessiert
und schließlich sezerniert wird. Man erhält auf
diese Weise ein hochaktives, funktionales und leicht aufzureinigendes
Protein.
-
In
Abweichung von obigem Beispiel lässt sich die Erfindung
auch mit Schnittstellen für andere Restrictionsendonucleasen
verwirklichen, insbesondere mit Schnittstellen für Typ
II-Restrictionsendonucleasen, wie z. B. EcoRI, BamHI, DpnI, HindIII,
TaqI, NotI, HinfI, Sau3A, PovII, SmaI, HaeIII, AluI, EcoRV, KpnI,
PstI, SacI, SalI, SphI, XbaI. Dieser Enzymtyp schneidet die DNA
innerhalb der Erkennungssequenz, benötigt kein ATP und
hat außerdem keine Methyltransferase-Aktivität.
Dem Fachmann sind die Schnittstellen bzw. die Erkennungssequenzen
dieser Restriktionsendonukleasen aus der Literatur bekannt, so dass
er unter Ausnutzung der hier erstmals vorgestellten technischen
Lehre ohne weitere Erfinderische Tätigkeit die erfindungsgemäßen
Prinzipien auch mit Schnittstellen für andere Restrictionsendonucleasen
verwirklichen kann.
-
Weiterhin
ist ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül
vorgesehen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es in einem Vektor
oder einem Plasmid enthalten ist. Für dieses Plasmid ist
vorgesehen, dass es sowohl die Durchführung von Vermehrungs-
und Klonierungsschritten im Bakterium Escherichia coli erlaubt,
d. h. in die Zellen desselben durch Transformation eingeschleust
werden kann und von diesen durch extrachromosomale Replikation vermehrt
werden kann. Ferner ist vorgesehen, dass besagtes Plasmid nach Insertion einer
zu exprimierenden cDNA durch geeignete Massnahmen in einen Expressionsorganismus
eingeschleust werden kann. Das Vorhandensein geeigneter Sequenzabschnitte
auf dem Plasmid ermöglicht auch dessen Replikation im Expressionsorganismus,
sowie die Transkription einer hybriden mRNA aus besagter Signalpeptidsequenz
und der mRNA des zu exprimierenden Proteins.
-
Ein
solcher Vektor ist z. B. in 3 dargestellt.
-
Bevorzugt
handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekül,
wie bereits erwähnt, um das Signalpeptid Mel1-SP aus der
Spalthefe Schizosaccharomyces pombe. Hierbei handelt es sich in
Schizosaccharomyces pombe um das Signalpeptid der Melibiase (α-Galactosidase).
Naturgemäß eignet sich dieses Signalpeptid besonders
gut zur Expression von Proteinen in diesem häufig verwendeten
Expressionssystem. Allerdings kann davon ausgegangen werden, dass
sich Mel1 auch zur Verwendung als Signalpeptid in Saccharomyces
cerevisiae und anderen Expressionssystemen eignet.
-
Der
Fachmann ist darüber hinaus ohne weiteres Zutun erfinderischer
Tätigkeit in der Lage, anhand der in der vorliegenden Beschreibung
offenbarten technischen Lehre für Signalpeptide codierende
Nukleinsäuremoleküle auszusuchen – entweder
durch Isolation und Sequenzierung oder durch Literatur – bzw.
Datenbankrecherche –, die unter das erfinderische Prinzip
fallen, d. h. die entweder bereits in ihrer nativen Sequenz eine im
Bereich des 3'-Endes angeordnete Restriktionsschnittstelle aufweisen,
oder in welchen sich durch Einführung einer stillen Punktmutation
eine solche Restriktionsschnittstelle erzeugen läßt.
-
Hier
ist z. B. an andere, in S. pombe oder S. cerevisiae verwendbare
Signalpeptide gedacht, aber auch an andere Kombinationen aus Signalpeptid
und Expressionssystem, so z. B. sekretorische bakterielle Expressionssysteme
oder auch Säuger-(inklusive humaner)Zelllinien, wie sie
vor allem in der Produktion von rekombinanten Proteinpharmazeutika
Verwendung finden.
-
Dabei
kommt dem Fachmann zu Hilfe, dass die codierenden Sequenzen für
eine Vielzahl von Signalpeptiden ebenso aus der Literatur bekannt
bzw. in Datenbanken recherchierbar sind, ebenso wie die Erkennungssequenzen
einer Vielzahl von Restriktionsendonukleasen.
-
Ferner
ist erfindungsgemäß ein Nukleinsäuremolekül
vorgesehen, aufweisend mindestens ein Nukleinsäuremolekül
gemäß der obigen Beschreibung sowie eine für
ein zu exprimierendes Protein codierende Sequenz.
-
Ein
solches Konstrukt aus einer Signalsequenz, einer Restriktionsschnittstelle
und einer für ein zu exprimierendes Protein codierende
Sequenz läßt sich z. B. wie folgt herstellen:
Die
oben bereits beschriebene native Signalsequenz SEQ ID No. 4 wird
durch Einführung der besagten stillen Punktmutation in
die Sequenz SEQ ID NO. 1 überführt. Anschließend
wird mit NcoI geschnitten, dabei wird ein „stickty end"
erzeugt, das wie folgt aussieht:
5'-c^c a t g g-3'
3'-g
g t a c^c-5'
-
Die
cDNA-Sequenz des zu exprimierenden Proteins mit einer Sequenz (y)n wird mit einem Downprimer der folgenden
Sequenz amplifiziert:
5'-c c a t g g x (y)n-3'
-
Hierbei
kann y jedes der vier Nukleotide sein, während x ein notwendiges,
aber beliebiges Nukleotid ist, da ggx immer für G codiert.
-
Weiterhin
ist erfindungsgemäß ein Expressionssystem, insbesondere
eine Wirtszelle, vorgesehen, das bzw. die mit einem erfindungsgemäßen
Nukleinsäuremolekül oder mit einem erfindungsgemäßen
Expressionsvektor transformiert ist.
-
Bevorzugt
ist hier, wie bereits oben erwähnt, vorgesehen, dass das
von dem Nukleinsäuremolekül codierte Signalpeptid
und die Wirtszelle spezifisch zueinander passen. Dies ist insbesondere
häufig dann der Fall, wenn Signalpeptid und Expressionssystem
derselben Spezies zuzuordnen sind. Besonders bevorzugt ist hier
z. B. die Verwendung von Mel1 als Signalpeptid und S. pombe als
Expressionssystem. Für den Fachmann erschließen
sich weitere geeignete Kombinationen aus der einschlägigen
Literatur bzw. öffentlich zugänglichen Datenbanken
unmittelbar und ohne zutun eigener erfinderischer Tätigkeit.
-
Ferner
ist erfindungsgemäß ein Polypeptid Protein, das
durch eines der erwähnten Nukleinsäuremoleküle
codiert wird, vorgesehen, wobei dieses Protein eine Signalpeptid-Aktivität
aufweist. Bevorzugt handelt es sich bei diesem Protein um ein eukaryontisches
Protein, besonders bevorzugt um ein Protein aus einem Pilz, sehr
besonders bevorzugt aus einer Hefe. Ganz besonders bevorzugt handelt
es sich um Mel1-SP aus Schizosaccharomyces pombe.
-
Bevorzugt
weist dieses Polypeptid bzw. Protein eine Aminosäuresequenz
auf, die in SEQ ID No 2 dargestellt ist.
-
Abweichend
davon kann das Polypeptid bzw. Protein eine Aminosäuresequenz
aufweisen, in welcher ein oder mehrere Aminosäurereste
konservativ substituiert sind. In Bezug auf den begriff "konservativ
substituiert" wird auf die obigen Ausführungen verwiesen.
-
Schließlich
ist erfindungsgemäß Verfahren zur Expression eines
Proteins vorgesehen, aufweisend die folgenden Schritte:
- a) Bereitstellen eines Nukleinsäuremoleküls
gemäß obiger Definiton, aufweisend eine codierende
Sequenz für ein Signalpeptid sowie eine im Bereich des
3'-Endes der besagten codierenden Sequenz angeordnete Schnittstelle
für eine Restriktionsendonuklease;
- b) Schneiden des Nukleinsäuremoleküls mit
einer Restriktionsendonuklease an besagter Schnittstelle;
- c) Ligation eines für das zu exprimierende Protein
codierenden Nukleinsäuremoleküls an das 3'-Ende
des erzeugten Schnitts
- d) Transformation eines für das Signalpeptid geeigneten
Expressionssystems mit dem dergestalt erzeugten rekombinanten Nukleinsäuremolekül;
- e) Inkubation des Expressionssystems;
- f) ggf. Spezifische Induktion der Proteinexpression; und
- g) Aufreinigung des exprimierten Proteins.
-
Die
Induktion erfolgt z. B. durch geeignete Promotoren und Induktoren.
Bei Verwendung des nmt1-Promotors von S. pombe, wie er z. B. in
dem Expressionsvektor pMel vorgesehen ist, wird die Genexpression
durch Abwesenheit von Thiamin induziert.
-
Die
Aufreinigung erfolgt im Idealfall unmittelbar aus dem Medium, d.
h. ohne Lyse der Zellen, da das Signalpeptid für einen
Transport in das Endoplasmatischen Reticulum und damit für
eine Ausschleusung aus der Zelle sorgt. Hierzu kann z. B. vorgesehen
sein, dass das exprimierte Protein einen His-Tag trägt.
Weitere, erfindungsgemäß einsetzbare Affinitäts-Tags
sind z. B. Maltose-bindendes Protein (MBP) oder Glutathionyl-S-Transferase
(GST), aber auch das S-Tag, HAT-Tag, Calmodulin-Binde-Peptid, Chitin-Binde-Peptid
und einige Cellulose-Binde-Domänen.
-
Abbildungen und Beispiele
-
Die
vorliegende Erfindung wird durch die im Folgenden gezeigten und
diskutierten Figuren und Beispiele genauer erläutert. Dabei
ist zu beachten, dass die Figuren nur beschreibenden Charakter haben
und nicht dazu gedacht sind, die Erfindung in irgendeiner Form einzuschränken.
-
1 zeigt
die Analyse des Kulturmediums, in welchem mit einem Konstrukt (pMel-CDA)
transformierte Schizosaccharomyces pombe-Zellen kultiviert wurden.
Die Zellen wurden in einem Gesamtvolumen von 11 kultiviert. Das
Kulturmedium wurde 20 h nach Animpfen der Hauptkultur untersucht.
Die Aufreinigung der erfindungsgemäßen Pgt-CDA
aus dem Kulturmedium erfolgte mittels NiNTA-IMAC-Affinitätschromatographie.
-
Dabei
zeigt 1a) die mit Silber gefärbten
PAGE-Gele der wichtigsten Aufreinigungsschritte, 1b)
ein Silbergel der Haupt-Elutionsfraktionen, und 1c)
einen Western-blot der Haupt-Elutionsfraktion (anti-His-tag). Die
Gelbahnen sind wie folgt beschickt:
- R:
- Rohfraktion (konz.
Kulturmedium)
- FT:
- Durchflussfraktion
- W:
- Waschfraktion
- E8–E12:
- Elutionsfraktionen
-
Die
Gesamtvolumina der Fraktionen betrugen:
R: 100 ml (10fach konzentriertes
Kulturmedium)
FT: 100 ml
W: 50 ml
E8–12:
1 ml
-
Die
Bahnen wurden jeweils mit 15 μl Probe beschickt.
-
2 zeigt
die Ergebnisse von Aktivitätstest rekombinanter Pgt-CDA
gegenüber Chitosan-Substraten. Dabei zeigt 2a)
ein Zymogramm (Substrat: Glykol-Chitin, Inkubation: 37°C
in 50 mM BisTris, pH6 über Nacht, Negativfärbung
mit Calcofluor nach Depolimerisation von Chitosan mit salpetriger
Säure).
-
2b) zeigt die Ergebnisse einer Dünnschichtchromatographie
(DC). Dabei wurden Chitohexamere mit einem Acetylierungsgrad von
100% (DP6/DA100) und 42% (DP6/DA42) 27 h lang bei 37°C
unter zwei verschiedenen Pufferbedingungen (50 mM BisTris, pH 6,0
und 50 mM Borat, pH 9,0) mit rekombinanter Pgt-CDA verdaut. Die
Reaktionsprodukte sowie Kontrollansätze ohne Enzym wurden
mittels DC aufgetrennt und anschliessend visualisiert.
-
Die
Markierung „---" entspricht einem Ansatz ohne Enzym, die
Markierung „CDA" entspricht einem Ansatz mit Enzym.
-
3 zeigt
die Plasmidkarte eines beispielhaft verwendeten Expressionsvektors
pMel. Beachte hierbei die Signalpeptidsequenz Mel1, die im Bereich
ihres 3'-Endes eine Schnittstelle für die Restriktionsendonuklease
NcoI aufweist. Diese ist durch Einführung einer stillen
Punktmutation in der nativen Nukleotidsequenz des Nukleinsäuremoleküls
für das Signalpeptid erzeugt worden. Weiterhin weist der
Expressionsvektor eine zweite Schnittstelle für die Restriktionsendonuklease
SalI auf. Die Sequenz der erfindungsgemäßen Chitin-Deacetylase
(CDA) wurde zwischen den beiden Restruktionsschnittstellen einkloniert.
-
Die
Sequenzen bla und ura4 dienen zur Selektion transfomierter Zellen
in prokaryontischen Expressionssystemen (β-Lactamase) bzw.
in eukaryontischen Expressionssystemen (uracildefiziente Medien).
-
Überdies
ist ein His-Tag zur Aufreinigung des exprimierten Proteins vorgesehen.
Für die Expression in Schizosaccharomyces pombe enthält
der Vektor den nmt1-Promotor von S. pombe, der durch die Zugabe von
Thiamin in das Kulturmedium reprimiert werden kann. Die Induktion
findet hingegen durch Entfernung von Thiamin aus dem Medium statt.
-
Es folgt ein
Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25.
Dieses kann von der
amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen
werden.
-
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
-
Diese Liste
der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert
erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information
des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen
Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt
keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Curry et al
(1988), Expression and Secretion of a Cellulomonas fimi Exoglucanase
in Saccharomyces cerevisiae; Appl Environ Microbiol 54(2):476–484 [0012]
- - Goddard et al. (2005), Development of a semi-quantitative
plate-based agalactosidase gene reporter for Schizosaccharomyces
pombe and its use to isolate a constitutively active Mam2; Yeast
2005; 22: 31–41 [0029]
