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Die
Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Proteins,
welches Urotensin-2-Konvertase aufweist,
sowie ein Verfahren zur Identifikation von chemischen Verbindungen,
welche die Urotensin-2-Konvertase-Aktivität eines Proteins regulieren.
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Urotensin-2
(UII, U-2) ist ein kardiovaskulär
aktives Neuropeptid, welches in Säugetieren und Fischen gefunden
wurde. Das humane Urotensin-2 ist ein zyklisches Undekapetid. Je
nach Spezies und Wirkort bzw. -Gewebe kann UII sowohl gefäßverengend
als auch gefäßerweiternd
wirken. Physiologisch wird UII, wie die meisten als Gewebshormone
aktiven Peptidhormone, aus einem größeren Präpropeptid durch proteolytische Spaltung
freigesetzt und aktiviert. Die daran beteiligten Enzyme werden gemeinhin
als „Konvertasen" bezeichnet. Bei
Menschen sind Präpropeptide
von 124 und 139 Aminosäuren
Länge bekannt,
welche beide identisches UII hervorbringen.
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Es
ist bekannt, dass das Präprohormon
Pro-UII Schnittstellen für
die Proteasen Furin und Trypsin enthält. Ebenso wurde in Experimenten
in-vitro gefunden, dass Inhibitoren dieser Proteasen die Bildung
von UII inhibieren (J Pharmacol Exp Ther. 2004 Jul; 310 (1): 209–14); eine
Zuordnung dieser Aktivitäten
zu konkreten Proteinen erfolgte aber nicht. Nach unserem Wissen
ist das oder sind die physiologischen Urotensin-2- konvertierenden Enzyme
(UCE) nicht bekannt. Die Begriffe Urotensin-2-Konvertase und Urotensin-2-konvertierendes Enzym
werden im Rahmen dieser Erfindung synonym verwendet.
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Eine
erhöhte
Expression von UII sowie dem UII-Rezeptor wurde in Tiermodellen
des induzierten Myokardinfarkts und des Herzversagens beobachtet.
In der Klinik wurde bei menschlichen Patienten ebenfalls eine Assoziation
von erhöhter
UII-Expression mit Herzinfarkt, Herzversagen, erhöhtem Blutdruck,
Artherosklerose und diabetischer Nephropathie nachgewiesen (Khan
et al., Int J Cardiol. 2006 Aug 1; Zhu et al., Br J Pharmacol. 2006
Aug; 148 (7): 884–901).
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Die
WO 2004/028 658 A1 offenbart
die Reinigung eines Urotensin-bildenden Enzyms, bei der ein Extrakt
aus Nierengewebe an einem Kationenaustauscher chromatographiert
wird.
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Jankowski
et al. (Anal. Biochem., Vol. 290, 2001, S. 324–329) lehren ein Verfahren
zum Nachweis von Enzymaktivitäten,
bei dem die in einer Fraktion enthaltenen Proteine zunächst kovalent
an Trägerkügelchen gebunden
werden, Danach werden die an die Trägerkügelchen immobilisierten Proteine
mit Substanzen inkubiert, die spezifisch für eine bestimmte Enzymreaktion
sind. Nach der Inkubation werden die gebildeten Reaktionsprodukte
massenspektrometrisch nachgewiesen.
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Die
WO 2004/029 286 A2 offenbart
ein Verfahren zur Isolierung von Enzymaktivitäten wie des Urotensin-bildenden
Enzyms, bei dem mehrere chromatographische Methoden eingesetzt werden
und bei dem die UCE-Aktivität
massenspektrometrisch bestimmt wird.
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Russell
et al. (J. Pharmacol. Exp. Ther., Vol. 310, 2004, S. 209–214) lehren,
daß eine
Trypsin-artige Serin-Protease in Blutplasma ein Vorläufer-Peptid
zu Urotensin 2 spaltet.
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Biemann
(Meth. Enzymol., Vol. 193, 1990, S. 455–479) offenbart die Anwendung
der Massenspektrometrie bei der Aufklärung der Aminosäuresequenz
eines Proteins, wobei das Protein vor der massenspektrometrischen
Analyse mit Proteasen in Peptide gespalten wird.
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Urotensin-2
wird als Mittler zwischen den Mechanismen, welche für die Entstehung
von Bluthochdruck einerseits und Koronarerkrankungen andererseits
verantwortlich sind, bezeichnet (Watanabe et al., Hypertens Res.
2006 Jun; 29 (6): 375–87).
Angesichts der enormen gesundheitsökonomischen Bedeutung dieser
beiden Krankheitskomplexe liegt es auf der Hand, dass eine pharmazeutische
Modulation der Aktivität
des Urotensin-2 von erheblichem medizinischen Nutzen sein könnte. Ebenfalls
in Betracht für
eine solche pharmazeutische Intervention kommt das unmittelbar vor
UII in der Hierarchiekette stehende Enzym, UCE, welches Urotensin-2
aus dem Vorläuferpeptid
aktiviert. Unter anderem könnte
ein Inhibitor für
Urotensin-2-Konvertase als Kandidat zur Behandlung von Bluthochdruck
eingesetzt werden.
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Insofern
sind Verfahren und Mittel wünschenswert,
die es erlauben, Verbindungen zu identifizieren, welche die Aktivität von UCE
verändern.
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Eine
wesentliche Voraussetzung dafür
ist die molekulare Identifikation des vorstehend als UCE bezeichneten
Enzyms, welches im Menschen das Vorläuferpeptid zu aktivem Urotensin-2
umwandelt.
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Eine
große
Zahl von Proteasen ist bekannt. Häufig wirken Proteasen in Kaskaden,
das bedeutet, dass eine erste Protease durch ein physiologisches
Signal aktiviert wird und sich selbst autokatalytisch spaltet, worauf
ein freigesetztes Spaltprodukt ein zweites Glied in der Kaskadenkette
durch Proteolyse aktiviert, und so fort. Eine solche Proteasekaskade
ist das Komplementsystem, das eine wichtige Komponente der sogenannten
angeborenen Immunität
darstellt. Ein Auslöser
der Komplementkaskade ist der Komplementkomplex C1, welcher die
weiteren Komponenten des Komplementsystems aktiviert und sowohl
zur direkten Abwehr gegen Bakterien beitragen, als auch weitere
Teilnehmer des Immunsystems wie Abwehrzellen anlocken und entzündliche
Prozesse modulieren kann.
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Eine
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es somit, Verfahren und Mittel
zur Verfügung
zu stellen, die es ermöglichen,
die physiologisch wirksame Komponente Urotensin-2-Konvertase, welche
Urotensin-2-Vorläuferpeptide
in Urotensin umwandelt, zu identifizieren und zu isolieren. Weiterhin
ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, geeignete Verfahren zur
Ermittlung von Aktivitäten
zur Modulation von Urotensin-2-Konvertase
(UCE-Aktivitäten)
zu finden.
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Gelöst wird
diese Aufgabe durch die Verfahren der Hauptansprüche.
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Ausgangspunkt
der Identifizierung und Isolierung der UCE-Aktivität ist die
Untersuchung von menschlichem Blutplasma. Alternativ können auch
andere, dem Fachmann zugängliche
Gewebe herangezogen werden.
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Blutplasma
kann in verschiedene Fraktionen aufgeteilt werden, man spricht von
Cohn-Fraktionen.
Die in diesem Zusammenhang verwendete Nomenklatur geht auf den amerikanischen
Arzt und Biochemiker Edwin Joseph Cohn zurück. Es wurde in den Beispielen
der vorliegenden Erfindung mit der Cohn-IV-Fraktion gearbeitet.
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Zusammenfassend
beruht die Identifikation von Verbindungen, welche Proteine mit
Urotensin-2-Konvertase-Aktivität
hemmen können,
auf zwei Schritten: zunächst
wird ein Protein mit Urotensin-2-Konvertase-Aktivität durch
Chromatographie aufgereinigt, und in einem zweiten Schritt wird
das gereinigte Protein auf seine Aktivität in Anwesenheit der zu untersuchenden
Verbindungen getestet.
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Eine
schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in 1 dargestellt.
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Die
Aufreinigung durch Chromatographie erfolgt vorzugsweise durch eine
Kombination von verschiedenen Chromatographieschritten. Die bevorzugte
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist eine Kombination von Anionen-, hydrophober
Interaktions- und
Kationenchromatographie. Für
jeden Chromatographieschritt muss eine eigene Optimierung der Parameter
vorgenommen werden, was mit erheblichem experimentellen Aufwand
verbunden ist.
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Die
Identifikation der optimalen Chromatographieparameter wurde mit
de m Proteinreinigungs-Parameter-Suchsystem („Protein Purification Parameter
Screening System",
PPS) durchgeführt.
PPS ist eine Methode zur Bestimmung optimaler Parameter für Chromatographiesysteme,
bei welchem ein Parameterraum, bestehend z. B. aus Ionenstärke oder
pH der mobilen Phase sowie verschiedenen stationären Phasen systematisch nach
optimalen Reaktionsparameterkombinationen abgesucht wird (Thiemann
et al., J Chromatogr A. 2004 Jul 16; 1043 (1): 73–80) (siehe
Beispiel 2).
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Für den Nachweis
einer Enzymaktivität,
welche UII aus einem Vorläufermolekül zu generieren
vermag und welche im weiteren mit UCE-Aktivität bezeichnet wird, musste zuerst
ein geeignetes Substrat gefunden werden, welches zum einen eine
Schnittstelle für
das UCE besitzt und zum anderen zwei Cysteine, die über eine
Disulfidbrücke
verbunden sind und ein zyklisches Peptid bilden können. Ausgehend
vom natürlich
vorkommenden Präpro-UII
wurde eine Teilsequenz mit 21 Aminosäuren synthetisiert (SEQ ID
NO 02) (Fa. Wita GmbH, D-14513 Teltow/Berlin). Zur Herstellung der
intramolekularen Disulfidbrücke
erfolgte nach der Festphasen-gekoppelten Synthese eine Oxidation
der Cysteingruppen des Peptids. Dieses Peptid wird im Weiteren als
UCE-S (UCE-Substrat) bezeichnet und hat die Sequenz Arg-Ile-Trp-Lys-Pro-Tyr-Lys-Lys-Arg-Glu-Thr-Pro-Asp-Cys-Phe-Trp-Lys-Tyr-Cys-Val.
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Zur
Analyse der UCE-Aktivität
wurde in der vorliegenden Erfindung ein Nachweissystem etabliert.
Der Nachweis von UCE-Aktivität
kann erfindungsgemäß mit Hilfe
des sog. Massenspektrometrie–gestützten Enzym-Screenings
(MES) (Schlüter,
Anal Bioanal Chem. 2003 Dec; 377 (7–8): 1102–7) erfolgen.
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Im
Verlauf der Arbeit an der vorliegenden Erfindung hat sich menschliches
Blutplasma als geeignete Quelle von Ausgangsmaterial für UCE-haltige
Proteinproben erwiesen. 2 zeigt das Ergebnis eines Ultrazentrifugationsversuches
mit Filtern unterschiedlicher Ausschlussgrenzen (10 kDa, 30 kDa,
50 kDa und 100 kDa). Die erhaltenen Filtrate und Retentate wurden
mit dem MES-Assay auf ihre UII-generierende
Aktivität
untersucht. Im Retentat des 50 kDa-Filters ist die höchste UCE-Aktivität zu finden,
was zeigt, dass das UCE ein Molekulargewicht zwischen 50 und 100
kDa besitzt.
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Nachfolgend
wurden für
eine mögliche
Vorfraktionierung unterschiedliche Cohn-Fraktionen, die alle aus humanem Plasma
fraktioniert wurden, auf eine UCE-Aktivität überprüft. 3 zeigt
die Ergebnisse des MES-Assays auf UCE-Aktivität für unterschiedliche humane Plasma-Cohn-Fraktionen.
Die Cohn-IV-Fraktion zeigt die höchste
UCE-Aktivität
und wurde für
die weitere Reinigung des UCE verwendet.
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Die
Ermittlung der Chromatographiebedingungen erfolgt gemäß einer
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung über
PPS (siehe oben). Es werden zu Beginn einer jeden Chromatographie
Experimente durchgeführt,
mit denen unterschiedliche Parameter auf ihre Eignung für die Reinigung
des UCE überprüft werden können. Ein
Beispiel für
die Durchführung
der Optimierung und ihre Ergebnisse ist Beispiel 2 zu entnehmen. Die
aus den PPS-Experimenten erhaltenen Parametersätze werden anschließend auf
die Säulenchromatographie übertragen.
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Bei
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden zur Reinigung der Plasmafraktion
zum Zwecke des erfinderischen UCE-Aktivitätsassays drei Chromatographien
durchgeführt,
eine Sample-Displacement Anionenaustauschchromatographie mit einer
stationären
Aminoethylphase und einem Ladungspuffer von pH 7, eine auf dem Prinzip
der hydrophoben Interaktion beruhende Chromatographie mit der festen
Phase t-Butyl-MacroPrep-Gel mit einem Probenauftragspuffer bei pH
5, und eine Kationenaustauschchromatographie mit einer stationären Phase
UnosphereS-Gel bei einem pH-Wert von 5. Die zusammengefassten Fraktionen
mit der höchsten
UCE-Aktivität
werden für
den nachfolgenden Aktivitätsassay über einen
10 kDa Filter eingeengt.
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Erfindungsgemäß kann mit
der wie vorstehend beschrieben isolierten UCE-Aktivität enthaltenden
Proteinpräparation
ein Assay durchgeführt
werden, der die Eignung verschiedener chemischer Verbindungen zur Modulation,
insbesondere zur Inhibition, der UCE-Aktivität untersucht. Als chemische
Verbindung im Sinne dieser Erfindung werden niedermolekulare Verbindungen,
Peptide und Proteine mit oder ohne kovalente Modifikationen durch
nicht in den klassischen Proteine bildenden Aminosäuren enthaltene
Gruppen sowie Polymere und Gemische der vorgenannten Verbindungen
verstanden. Zur Illustration dieses Prinzips wird im Beispiel 3 ein
Experiment zur Untersuchung der Verbindungen L-trans-epoxysuccinyl-leucyl
amido(4-guanidino)butan (E64),
Isovaleryl-Val-Val-4-amino-3-hydroxy-6-methylheptanoyl-Ala-4-amino-3-hydroxy-6-methylheptansäure (Pepstatin
A), Ethyldiamintetraessigsäure,
([(2S, 3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl]-L-leucin) (Bestatin),
[(S)-1-Carboxy-2-phenylethyl]-carbamoyl-a-[2-amidohexahydro-4(S)-pyrimidyl]-(S)-glycyl-[A
= Leu; B = Val; oder C = Ile]-phenylalaninal (Chymostatin) und 4-(2-Aminoethyl)benzensulfonylfluorid
hydrochlorid (AEBSF) gezeigt. Die Bestimmung der modulierenden Wirkung
der zu untersuchenden Substanz kann direkt oder durch Vergleich
mit einem Standard erfolgen. Das Ergebnis eines solchen erfindungsgemäßen Verfahrens
ist in 6 dargestellt.
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Weiterhin
ist erfindungsgemäß eine Identifizierung
des gereinigten Proteins durch einen weiteren Affinitätschromatographieschritt
sowie die nachfolgende Analyse der aufgereinigten Proteine vorgesehen.
Vorteilhafterweise erfolgt diese durch Massenspektrometrie, insbesondere
durch Flüssigkeitschromatographie-gekoppelte
Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (LC-ESI MS/MS).
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Dazu
wird Chymostatin an die feste Phase EAH-Sepharose mittels EDC-Linker
kovalent gebunden (siehe Beispiel 4). Das Affinitätsgel wird
anschließend
für die
Säulen-Affinitäts-Chromatographie
eingesetzt. Das Eluat wird durch Größenausschluß-Gelseparation getrennt, tryptisch verdaut
anschließend
mittels LC-ESI-MS/MS identifiziert (siehe Beispiel 5).
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Mit
Hilfe eines bioinformatorischen Datenverarbeitungsprogramms kann
in der Folge das in der UCE-Aktivität enthaltenden Probe vorliegende
Protein identifiziert werden (siehe Beispiel 5). Im vorliegenden Beispiel
wurde der humane Komplement Faktor I (EC-Nummer: 3.4.21.45) identifiziert.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung kann ebenfalls ein durch Reinigung und nachfolgende Charakterisierung
identifiziertes Protein in einer durch ein anderes Verfahren gereinigten
Form oder in rekombinanter Form als Substrat in einem erfindungsgemäßen Verfahren
zur Identifikation von Hemmstoffen der UCE-Aktivität eingesetzt
werden. Zur Verifikation der Identität des aufgereinigten und charakterisierten
Proteins mit der durch ein anderes Verfahren gereinigten oder rekombinanten
Form zur Verfügung
gestellten Form wird zunächst
ein massenspektrometrischer Vergleich der durch Verdau entstehenden
Peptidfragmente der jeweiligen Proteine vorgenommen, so gezeigt
im Beispiel 5 für
den Komplement-Faktor
1.
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Untersuchungen
zur Hemmung der UCE-Aktivität
einer kommerziell erworbenen Komplement-Faktor-1-Präparation
können
erfindungsgemäß zur Identifikation
von potentiellen UCE-Modulatoren (siehe Beispiel 6) eingesetzt werden.
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Die
Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Figuren der
Zeichnungen an mehreren Ausführungsbeispielen
näher erläutert. Es
zeigen:
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1 eine
schematische Darstellung des Verfahrens zur Bestimmung eines Proteins
mit Urotensin-2-Konvertase-Aktivität;
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2 Ergebnisse
der relativen Molekulargewichtsbestimmung des UCE mittels Zentrifugenfilter
unterschiedlicher Ausschlussgrößen. X-Achse:
Filtrate und Retentate der Filter mit den unterschiedlichen Ausschlussgrößen. Y-Achse:
UCE-Aktivität.
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3 Ergebnisse
der Suche nach einer UCE-Aktivität
in unterschiedlichen humanen Plasma-Cohn-Fraktionen. Unterschiedliche
Cohn-Fraktionen aus humanem Plasma wurden an Affinitätsbeads
immobilisiert und mittels MES-Assay
die UCE-Aktivität
bestimmt. X-Achse: unterschiedliche Cohn-Fraktionen aus humanem Plasma. Y-Achse:
UCE-Aktivität.
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4 ein
typisches Massenspektrum der Reaktionsprodukte aus der Inkubation
einer Plasma-Cohn-IV-Fraktion. mit UCE-S: MALDI-Spektren der Inkubationsreihe
mit UCE-Substrat (UCE-S) und den gebildeten Reaktionsprodukten nach
Immobilisierung einer humanen Plasmafraktion (Cohn-IV-Fraktion)
nach unterschiedlichen Inkubationszeitpunkten. UII: 1389.56 Da,
R-UII=Arg-UII: 1545.66 Da, KR-UII=Lys-Arg-UII: 1673.75 Da, UCE-S:
2645.3 Da, V:Verunreinigung: 2230.95 Da
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5 ein
Chromatogramm der Größenausschluss-Chromatographie
der UCE-Aktivität der Fraktion 1.4
aus der Affinitätschromatographie.
Probenvolumen: 200 μl.
Säule:
Superdex 200HR 10/30. Puffer A: 50 mM Phosphatpuffer in 150 mM NaCl;
pH 7. Flußrate:
250 μl/min.
X-Achse: Retentionsvolumen [ml]. Y-Primärachse: Absorption bei 280
nm.
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6 die
Ergebnisse der Inhibitionstests der UCE-aktiven Fraktionen 1.3 aus
der Kationenaustausch-Chromatographie. Probenvolumen: 50 μl. Inhibitorenkonzentrationen:
10 μM E64,
10 μM Pepstatin
A, 1 mM EDTA, 100 μM
Bestatin, 10 μM
Chymostatin und 1 mM AEBSF
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7 MES-Assay
für den
Nachweis der UII-generierenden Aktivität des Komplement Faktor I (A)
und der gereinigten Fraktion 1.5B (B) aus einer humanen Cohn IV-Fraktion:
MALDI-Spektren der Inkubation mit UCE-S und den gebildeten Reaktionsprodukten
nach Immobilisierung der kommerziellen Präparation des Komplement Faktor
I und der gereinigten Fraktion 1.5B einer CohnIV-Fraktion aus humanem
Plasma nach einer Inkubationszeit von 7 h. UII: 1389.56 Da, R-UII:
1545.66 Da, KR-UII: 1673.75 Da, UCE-S: 2645.3 Da, V:Verunreinigung:
2230.95 Da
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8 Fluoreszenzassay
zum Nachweis einer proteolytischen Aktivität der Fraktion 1.5B aus der
Gelfiltration (b) und einer gekauften Komplement Faktor I – Fraktion
(c).
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9 MALDI-Spektren
der Glykoproteincharakterisierung mittels Mannose-Glykoprotein Kit
mit immobilisierten GNA (Schneeglöckchen Lektin) der Fraktion
1.5B und der kommerziellen Komplement Faktor I-Fraktion. A: Eluat
der 1.5B-Fraktion B: Eluat des Komplement Faktor I. C: Überstand
der 1.5B-Fraktion. D: Überstand
des Komplement Faktor I.
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10 MALDI-Spektren
der Reaktionsprodukte nach Inkubation mit UCE-S und Pefabloc SC
nach 24 h Inkubation. A (oben): immobilisierte 1.5B-Fraktion. B
(unten): immobilisierte Komplement Faktor I-Präparation. UCE-S: 2645.3 Da.
V=Verunreinigung: 2230.95 Da. X=Peptid Lys-Lys-Arg-UII 1801.8 Da.
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11 MALDI-Spektren
der Reaktionsprodukte nach Inkubation mit UCE-S und Aprotinin nach
24 h Inkubation. A: immobilisierte 1.56-Fraktion. B: immobilisierte
Komplement Faktor I-Präparation.
UCE-S: 2645.3 Da. V=Verunreinigung: 2230.95 Da. X=Peptid Lys-Lys-Arg-UII
1801.8 Da.
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Beispiele
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Generelle Informationen zu Materialien
und Methoden:
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Verwendete
Chromatographiematerialien: Butyl-650-Gel (), Butyl-Sepharose (GE
Healthcare), DEAE-650M-Gel (Tosoh), EAH-Sepharose (GE Healthcare),
Ether-650- Gel, Fractogel
COO– (Merck),
Fractogel DEAE (Merck), Fractogel SO– 3 (Merck), Fractogel TMAE (Merck), Methyl
MacroPrep-Gel (Biorad), Phenyl-650-Gel (Tosoh), Phenyl-Sepharose
(GE Healthcare), QAE-550C-Gel (Tosoh), Q-Sepharose FF (GE Healthcare),
Sepharose 6MB (GE Healthcare), SP-Sepharose FF (GE Healthcare),
SuperQ-650M-Gel (Tosoh), t-Butyl MacroPrep-Gel (Biorad), Toyopearl
CM-650M-Gel (Tosoh), Unosphere S-Gel (Biorad), Unosphere Q-Gel (Biorad),
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Verwendete Säulengehäuse für die Säulenchromatographien:
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Die
Reinigung des UCE-Substrats wurde mit der 5 RPC-Säule 4.1x150
mit Stahlgehäuse
durchgeführt.
Für die
Hydrophobe Interaktionschromatographie wurde das XK-Säulengehäuse der
Firma GE Healthcare eingesetzt. Für die Kationenaustauschchromatographie
wurde mit der vorgepackten S6-Säule
mit Unosphere S-Gel der Firma Biorad gearbeitet. Für die Affinitätschromatographie
wurde das HR 10/30 Säulengehäuse der
Firma GE Healthcare verwendet und für die Größenausschlußchromatographie mit der Superdex 200HR
10/30 von GE Healthcare chromatographiert.
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Geräte
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Für den MES-Assay
wurde das Massenspektrometer Reflex III MALDI-TOF der Firma Bruker
benutzt. Aliqouts der Inkubationsansätze aus dem MES-Assay wurden
auf den MTP AnchorChip 384/400 von Bruker pipettiert. Die Immobilisierung
der Proben erfolge auf dem Überschlagsrotor
Rotator Drive STR4 von Stuart Scientific. Für die Substratinkubation wurde
der Schüttler
von Fisher Bioblock Scientific verwendet., Die Chromatographien
wurden an den HPLC Anlagen (Explorer und Purifier) von der Firma
GE Healthcare durchgeführt.
Die PPS-Experimente wurden mit dem Genesis Freedom 200 der Firma
Tecan durchgeführt.
Für die
mit dem Dispenser Multidrop DW der Firma Thermo Electron befüllten Pufferplatten
für die
PPS-Experimente wurden 1,2 ml Storage DeepWell Platten der Firma
ABGene verwendet. Für
den MES-Assay wurden 500 μl
Eppendorfgefäße und Microtestplatten
96Well K der Firma Sarstedt benutzt. Die pH-Werte wurden mit der
InLab®422
Combination Semi-micro pH Electrode von METTLER TOLEDO gemessen.
Für die
Proteinbestimmung der Eluate und Überstände aus den PPS-Experimenten
wurde der UV-Reader Genios der Firma Tecan eingesetzt. Alle weiteren
Proteinkonzentrationen wurden mit dem Photometers iEMS Reader MF
von Thermo Labsystems bestimmt. Die Einengung der Proteinfraktionen
wurde in Amicon Ultra Zentrifugenfiltern der Ausschlussgrenze von
10 kDa der Firma Millipore durchgeführt und mit der Multifuge 3
S-R von Heraeus zentrifugiert. Die Vorbereitung der Proben ab der
2. Chromatographie erfolgte unter der Sterilbank LaminAir von Holten.
Die Identifizierung der tryptischen Peptide erfolgte mit der LC-ESI
MS/MS der Firma Agilent und dem Chip XXX
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Beispiel 1: MES-Assay
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Der
MES-UCE-Assay basiert auf der kovalenten Immobilisierung von Proteinfraktionen
an Festkörperpartikel.
Die immobilisierten Proteine werden mit dem UCE-S inkubiert, nach
2 h, 5 h und 24 h werden Proben aus dem Reaktionsgefäß abgenommen
und massenspektrometrisch vermessen. 4 zeigt
ein typisches Massenspektrum der Reaktionsprodukte aus der Inkubation
einer Plasma-Cohn-IV-Fraktion mit UCE-S. Es lässt sich die Abnahme des UCE-S
und die Bildung des UII als Funktion der Zeit verfolgen. Nach einer
Inkubationszeit von 5 h ist das UCE-S vollständig abgebaut. In den Massenspektren
sind zwei weitere Peaks (gekennzeichnet mit KR-UII und R-UII) feststellbar,
welchen anhand der von den Peaks repräsentierten Massen eine molekulare
Struktur zugeordnet werden kann: R-UII besitzt ein zusätzliches
Arginin und KR-UII ein Lysin und ein Arginin am N-Terminus im Vergleich
mit UII. Die Verunreinigung V kann nicht eindeutig einer Peptidsequenz
zugeordnet werden. Es handelt sich hierbei um ein Peptid-Molekül, das wahrscheinlich
während
der Peptidsynthese entstanden ist.
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Ausgehend
vom humanen Präpro-UII
wurde eine Teilsequenz RIWKPYKKRETPDCFWKYCV mit UII-Schnittstelle
synthetisiert (Wita GmbH). Das UCE-S Peptid wurde in 100 mM Ammoniumacetat;
pH 7 aufgenommen, auf eine Konzentration von 0,1 mg/ml eingestellt
und 48 h inkubiert. Die Lösung
wurde anschließend
auf 0,1% TFA eingestellt und auf eine Reversed Phase Säule 5RPC
4.1x150 aufgetragen. Als mobile Phase wurde eine 0,1%ige TFA Lösung (Puffer
A) und 80% ACN (Puffer B) verwendet. Die Reversed-Phase-Chromatgraphie
(RPC) wurde bei einer Flussrate von 1 ml/min durchgeführt. Der
Gradient verlief von 0% B auf 50% B in 40 Minuten. Es wurden Fraktionen
von 10 ml gesammelt. Gewonnene Peptid-Fraktionen der RPC wurden
bei minus 80°C
eingefroren und anschließend
in der Vakuumzentrifuge Savant SPD111V getrocknet. Auf einen MTP
AnchorChip wurde 1 μl
DHB-Matrix-Lösung
(30 mg/ml DHB in 50% ACN) aufgetragen und eingetrocknet. Die getrockneten
Peptide wurden in 1000 μl
destilliertem Wasser gelöst
und 1 μl
dieser Lösungen
auf die eingetrocknete Matrix pipettiert. Nach dem Trocknen der
Proben, wurden diese massenspektrometrisch vermessen. Peptid-Fraktionen
die bei 2645,3 Da ein Signal mit normaler Isotopenverteilung zeigten und
keine Peaks, die auf Verunreinigungen schließen lassen, aufwiesen, wurden
für die
weiteren Experimente verwendet.
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Immobilisierung der Proteinfraktionen
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Die
Immobilisierung der Proteinfraktionen erfolgte an die Affinitätsbeads
BrCN-aktivierte
Sepharose 6MB. Für
die Immobilisierung wurde eine entsprechende Menge an trockenen
Beads aus dem Vorratsgefäß abgenommen
und in ein Eppendorfgefäß überführt. Zum
Quellen der Beads wurde ca. das 100-fache Volumen einer 1 mM HCl-Lösung zugegeben und die Mischung
auf einem Überschlagsrotor
ca. 1 h Stunde inkubiert. Von den Beads wurde die überschüssige HCl-Lösung entfernt
und 3 mal mit Wasser gewaschen. Für die Immobilisierung von Proteinfraktionen
wurden jeweils 30 μl
Beads portioniert. Nach dem letzten Waschschritt wurde das Wasser
entfernt und die Beads einmal mit Kopplungspuffer (100 mM NaHCO3, 500 mM NaCl, pH 8,3) gewaschen. Dieser
wurde anschließend
von den Beads entfernt. Es wurden 30 μl Proteinlösung mit 30 μl Kopplungspuffers
gemischt und zu den Beads pipettiert. Die Kopplung erfolgte 2 h
bei Raumtemperatur oder über
Nacht bei 4°C
auf einem Überschlagsrotor.
Nach der Kopplung wurde die Lösung
von den Beads entfernt und 100 μl
Blockierungspuffer (100 mM NaHCO3, 500 mM
NaCl, 100 mM Glycin, pH 8,3) zugegeben und 2 h bei Raumtemperatur
oder über
Nacht bei 4°C
auf einem Überschlagsrotor
inkubiert. Nach der Blockierung wurden die immobilisierten Proteine
3 mal mit Wasser gewaschen.
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Inkubation der immobilisierten
Proteinfraktionen mit dem UCE-Substrat
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Von
den Beads mit den immobilisierten Proteinfraktionen wurde das Wasser
vom vorigen Waschschritt entfernt und 30 μl einer 10–5 M
UCE-Substratlösung
zugegeben. Die Inkubation erfolgte auf einem Schüttler. Auf ein MTP AnchorChip
wurde 1 μl
einer DHB-Matrix-Lösung
pipettiert. Nach dem Eintrocknen der Matrix wurden nach definierten
Zeitpunkten 3 × 2 μl Aliquots
der Reaktionsmischung abgenommen und auf den MTP AnchorChip pipettiert.
Nachdem die Proben eingetrocknet waren, wurden Massenspektren der
Proben aufgenommen.
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Semiquantitativer Nachweis der Reaktionsprodukte
mittels MALDI-Massenspektrometrie
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Für den semiquantitativen
Nachweis des Reaktionsproduktes UII wurde für jedes Massenspektrum das
Verhältnis
der Signalintensitäten
von UII bei einem Massensignal von 1389.56 Da zu UCE-S bei einem Massensignal
von 2645.3 Da gebildet. Aufgrund der n = 3-Messung wurde von den
3 Proben jeweils der Mittelwert der Intensitätsverhältnisse gebildet. Die gemittelten
Intensitätsverhältnisse
wurden von allen Zeitpunkten zusammenaddiert und der erhaltene Wert
wurde als UII-generierende
Aktivität
angegeben. Alle Schritte wurden mit einem Visual Basic Skript automatisch
ausgeführt.
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Beispiel 2: Proteinreinigungs-Parameter-Suchsystem
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PPS
hilft, in kurzer Zeit optimale Wege zur chromatographischen Reinigung
definierter Proteine zu finden. 96 und mehr verschiedene Parameter,
wie pH-Werte, stabilisierende Zusätze oder Salzkonzentrationen, können auf
ihre Auswirkung auf die Reinigung von Proteinen untersucht werden.
Das PPS-System ist ein automatisiertes, multiparalleles System,
das auf der Batch-Chromatographie basiert.
-
Das
Verfahren umfasst sechs Schritte:
- 1. Zu Beginn
der PPS-Experimente werden die zu testenden Chromatographie-Gele
in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen eingebracht.
- 2. Die Probenaufgabe-Puffer-Platte, z. B. für PPS-Ionenaustausch- Chromatographie-Experimente, wird hergestellt.
Dazu werden auf der X-Achse einer 96er-Platte pH-Werte, auf der Y-Achse Salzkonzentrationen
variiert. Dann werden die Gele mit individuellen Puffern equilibriert,
indem Kopien der Puffer der Probenaufgabeplatte auf die Gelplatte überführt werden.
- 3. Der Probenauftrag erfolgt. Probe, Probenaufgabepuffer und
Gel werden über
definierte Zeitintervalle in Suspension gehalten. Anschließend sedimentiert
das Gel. Die 96 Überstände werden
abgenommen und quantitativ analysiert.
- 4. Das Gelsediment wird mehrfach gewaschen, um die nicht bindenden
Moleküle
von den ans Gel adsorbierten Proteinen zu entfernen.
- 5. Zur Freisetzung der gebundenen Proteine werden die gewaschenen
Gelsedimente mit einem Elutionspuffer versetzt. Nun erfolgt die
quantitative Analyse der 96 Eluate.
- 6. Die Resultate der Protein-Konzentrationsbestimmungen werden
in einer PPS-Ergebnismatrix
dargestellt, die Angaben zur Gesamt-Protein-Konzentration, zur absoluten
und zur spezifischen Ziel-Protein-Konzentration enthält. Aus
der Ergebnismatrix werden Empfehlungen zur chromatographischen Reinigung
des Zielproteins abgeleitet.
-
Für die Durchführung der
PPS-Experimente mussten insgesamt 5 96-Deepwell-Platten vorbereitet werden.
Insgesamt wurden 8 unterschiedliche Anionenaustauschergele bei 5
verschiedenen pH-Werten getestet. Daraus ergab sich eine Anzahl
von 40 unterschiedlichen Parametern. Die Lösungen und Gele wurden jeweils
beginnend von Position A1 bis H5 der 96-Deepwell-Platte befüllt. Für die Vorbereitung
der Gelplatte wurden 10 ml der Gele Fractogel TMAE, Fractogel DEAE,
SuperQ-650M, DEAE-650M, QAE-550C, Streamline DEAE, Q-Sepharose FF
und Unosphere Q abgenommen und in ein 50 ml Greihner-Röhrchen überführt, mit Wasser
gewaschen und anschließend
mit einer 1M NaCl-Lösung
konditioniert. Danach wurden die Gele 3 mal mit Wasser gewaschen,
in einen Messzylinder überführt und
eine 1:1 Gel-Wasser-Mischung hergestellt. Diese wurde in ein Greihner-Röhrchen überführt. Nachdem
durch mehrmaligen Schwenken eine homogene Suspension entstand, wurden
20 μl der
Suspension in das entsprechende Well pipettiert.
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| A | Fractogel
TMAE | Fractogel
TMAE | Fractogel
TMAE | Fractogel
TMAE | Fractogel
TMAE |
| B | Fractogel
DEAE | Fractogel
DEAE | Fractogel
DEAE | Fractogel
DEAE | Fractogel
DEAE |
| C | SuperQ-650M | SuperQ-650M | SuperQ-650M | SuperQ-650M | SuperQ-650M |
| D | DEAE-650M | DEAE-650M | DEAE-650M | DEAE-650M | DEAE-650M |
| E | QAE-550C | QAE-550C | QAE-550C | QAE-550C | QAE-550C |
| F | Streamline
DEAE | Streamline
DEAE | Streamline
DEAE | Streamline
DEAE | Streamline
DEAE |
| G | Q-Sepharose
FF | Q-Sepharose
FF | Q-Sepharose
FF | Q-Sepharose
FF | Q-Sepharose
FF |
| H | UnosphereQ | UnosphereQ | UnosphereQ | UnosphereQ | UnosphereQ |
Tab.
1: Gelplatte mit jeweils 10 μl
Gelsediment pro well. XY-Achsen zeigen die Positionen der 96-Deepwell-Platte
an
-
Für die Herstellung
der Pufferplatten wurden von jedem Puffer jeweils 50 ml einer 50
mM Lösung
hergestellt und auf die gewünschten
pH-Werte mit NaOH bzw. HCl eingestellt. Mit Hilfe eines Dispensers
wurden automatisch die Probenauftragspufferplatte und die Equilibrierungs/Waschplatte
mit den gewünschten
Puffern befüllt.
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| A | Piperazin
pH6 | Bis-Tris-Propan
pH7 | N-Methyl-diethanolamin pH8 | CHES
pH9 | CAPS
pH10 |
| B | Piperazin
pH6 | Bis-Tris-Propan
pH7 | N-Methyl-diethanolamin pH8 | CHES
pH9 | CAPS
pH10 |
| C | Piperazin
pH6 | Bis-Tris-Propan
pH7 | N-Methyl-diethanolamin pH8 | CHES
pH9 | CAPS
pH10 |
| D | Piperazin
pH6 | Bis-Tris-Propan
pH7 | N-Methyl-diethanolamin pH8 | CHES
pH9 | CAPS
pH10 |
| E | Piperazin
pH6 | Bis-Tris-Propan
pH7 | N-Methyl-diethanolamin pH8 | CHES
pH9 | CAPS
pH10 |
| F | Piperazin
pH6 | Bis-Tris-Propan
pH7 | N-Methyl-diethanolamin pH8 | CHES
pH9 | CAPS
pH10 |
| G | Piperazin
pH6 | Bis-Tris-Propan
pH7 | N-Methyl-diethanolamin pH8 | CHES
pH9 | CAPS
pH10 |
| H | Piperazin
pH6 | Bis-Tris-Propan
pH7 | N-Methyl-diethanolamin pH8 | CHES
pH9 | CAPS
pH10 |
Tab.
2: Probenauftragspufferplatte und Equilibrierungs-& Waschpufferplatte
mit jeweils 500 μl
50 mM individuelle Puffer pro well.
-
Die
Elutionsplatte wurde mit einer 1 M NaCl-Lösung befüllt. In der Probenplatte befand
sich in den Wells A1-D1 jeweils 500 μl einer 1 mg/ml CohnIV-Fraktionslösung. Nach
der Herstellung aller Platten für
die PPS-Experimente wurden diese auf der Pipettierroboterplattform
positioniert und die PPS-Experimente automatisch durchgeführt (siehe
2.2.3). Die Flution erfolgte 4 mal mit 30 μl Elutionspuffer. Die Eluate
wurden dann anschließend
mittels MES-UCE-Assay auf ihre UCE-Aktivität untersucht. 100 μl der Eluate
wurden an 30 μl Sepharosebeads
immobilisiert, inkubiert und die Aliquots massenspektrometrisch
vermessen (siehe Beispiel 1).
-
Reinigung
von UCE mittels Anionenaustausch-Sample Displacement Chromatographie:
600 ml QAE-550C-Gel wurden abgenommen und einmal mit Wasser gewaschen
und anschließend
mit einer 1 M NaCl-Lösung
konditioniert. Das konditionierte Gel wurde dann 3 mal mit Wasser
gewaschen. Das gewaschene Gel wurde mit dem 50 mM bis-Tris-Propan-Puffer
bei pH 7 (Puffer A) equilibriert und anschließend gleichmäßig auf
10 Glasflaschen verteilt. 2 g der Cohn IV-Fraktion wurden in 100
ml Puffer A aufgenommen und mit dem Gel in der ersten Flasche vermischt.
Nach Sedimentation des Gels wurde der Überstand abgenommen und in die
zweite Flasche überführt und
mit dem Gel vermischt. Dieser Vorgang wurde solange wiederholt bis
alle 10 Gelaliquots mit den Überständen der
vorigen Chromatographie vermischt worden sind. Die 10 Gelaliquots
wurden mit jeweils 50 ml Puffer A 3 mal gewaschen. Gelaliquots von
1 ml wurden abgenommen und es erfolgte eine 3fach Flution von jeweils
1 ml mit einer 1 M NaCl-Lösung
(Puffer B). 100 μl
des Eluats wurden an 50 μl Seharosebeads
immobilisiert und die UII-generierende Aktivität bestimmt (siehe Beispiel
1). Nach Auswertung der Ergebnisse aus der Teilelution der 10 Gele
wurde die gesamte Probe vom Gel der Flasche 1 3 mal mit jeweils
50 ml Puffer B eluiert (bezeichnet als Fraktion 1.1).
-
Suche
nach geeigneten Parametern für
die chromatographische Reinigung von UCE nach einer Sample-Displacement-Chromatographie:
Für die
Durchführung
der PPS-Experimente
mussten insgesamt 5 96-Deepwell-Platten vorbereitet werden. Folgende
Gele wurden verwendet: ein Metallchelatgel (IMAC) mit jeweils 6
unterschiedlichen Metallionen beladen, 8 verschiedene Hydrophobe
Interaktionsgele (Super-Butyl 550, Butyl-650, Buthyl-Sepharose,
t-Butyl MacroPrep-Gel, Methyl MacroPrep-Gel, Phenyl-650-Gel, Phenyl-Sepharose,
Ether-650-Gel). Bei der Hydrophoben Interaktionschromatographie
wurden zusätzlich
zu den unterschiedlichen Gelen auch 5 pH-Werte variiert. Die Lösungen und
Gele wurden jeweils beginnend von Position A1 bis Position F8 der
96-Deepwell-Platte befüllt.
Für die
Vorbereitung der Gelplatte wurden 1 ml der oben aufgeführten Gele
abgenommen und in ein Eppendorfgefäß überführt, mit Wasser gewaschen und
anschliessend mit einer 1 M NaCl-Lösung konditioniert. Danach
wurden die Gele 3 mal mit Wasser gewaschen und eine 1:1 Gel-Wasser-Mischung hergestellt.
Nachdem durch mehrmaligen Schwenken eine homogene Suspension entstanden
war, wurden 20 μl
der Suspension in das entsprechende Well pipettiert.
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| A | Fe-IMAC | Zn-IMAC | Cu-IMAC | Mg-IMAC | Ni-IMAC | Mn-IMAC | | |
| B | Super-Butyl 550 | Butyl-650 | Butyl-Sepharose | t-Butyl MacroPrep | Methyl-MacroPrep | Phenyl-650 | Phenyl- Sepharose | Ether-650 |
| C | Super-Butyl 550 | Butyl-650 | Butyl-Sepharose | t-Butyl MacroPrep | Methyl-MacroPrep | Phenyl-650 | Phenyl Sepharose | Ether-650 |
| D | Super-Butyl 550 | Butyl-650 | Butyl-Sepharose | t-Butyl MacroPrep | Methyl-MacroPrep | Phenyl-650 | Phenyl- Sepharose | Ether-650 |
| E | Super-Butyl 550 | Butyl-650 | Butyl-Sepharose | t-Butyl MacroPrep | Methyl-MacroPrep | Phenyl-650 | Phenyl- Sepharose | Ether-650 |
| F | Super-Butyl 550 | Butyl-650 | Butyl-Sepharose | t-Butyl MacroPrep | Methyl-MacroPrep | Phenyl-650 | Phenyl- Sepharose | Ether-650 |
Tab.
3: Gelplattenbelegung. 10 μl
Gelsediment pro Well. Position A1–6 IMAC-Gel beladen mit entsprechenden Metallion.
Position B1-F8 unterschiedliche HlC-Gele.
-
Die
Pufferplatten wurden durch Mischen der einzelnen Lösungen (Pufferlösungen,
NaCl-Lösung
und Wasser) auf die entsprechende Konzentration (wie in Tab. 4 dargestellt)
eingestellt. Die Befüllung
erfolgte mit Hilfe eines Dispensers. In die Probenplatte wurden
jeweils 500 μl
der Fraktion 1.1 aus der Sample Displacement Chromatographie in
die Positionen A1-D1 pipettiert. Danach erfolgte die automatische
Durchführung
der PPS-Experimente mit dem Pipettierroboter-System. Es wurde 6
mal mit 30 μl
des Elutionspuffers eluiert.
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| A | 50
mM Na-Phosphat;
1M NaCl; pH7 | 50
mM Na-Phosphat;
1M NaCl; pH7 | 50
mM Na-Phosphat;
1M NaCl; pH7 | 50
mM Na-Phosphat;
1M NaCl; pH7 | 50
mM Na-Phosphat;
1M NaCl; pH7 | 50
mM Na-Phosphat;
1M NaCl; pH7 | | |
| B | 50
mM Malonsäure
2M NaCl; pH5 | 50
mM Malonsäure
2M NaCl; pH5 | 50
mM Malonsäure
2M NaCl; pH5 | 50
mM Malonsäure
2M NaCl; pH5 | 50
mM Malonsäure
2M NaCl; pH5 | 50
mM Malonsäure
2M NaCl; pH5 | 50
mM Malonsäure
2M NaCl; pH5 | 50
mM Malonsäure
2M NaCl; pH5 |
| C | 50
mM bis-Tris; 2M
NaCl; pH6 | 50
mM bis-Tris; 2M
NaCl; pH6 | 50
mM bis-Tris; 2M
NaCl; pH6 | 50
mM bis-Tris; 2M
NaCl; pH6 | 50
mM bis-Tris; 2M
NaCl; pH6 | 50
mM bis-Tris; 2M
NaCl; pH6 | 50
mM bis-Tris; 2M
NaCl; pH6 | 50
mM bis-Tris; 2M
NaCl; pH6 |
| D | 50
mM Na-Phosphat;
2M Nacl; pH7 | 50
mM Na-Phosphat;
2M Nacl; pH7 | 50
mM Na-Phosphat;
2M Nacl; pH7 | 50
mM Na-Phosphat;
2M Nacl; pH7 | 50
mM Na-Phosphat;
2M Nacl; pH7 | 50
mM Na-Phosphat;
2M Nacl; pH7 | 50
mM Na-Phosphat;
2M Nacl; pH7 | 50
mM Na-Phosphat;
2M Nacl; pH7 |
| E | 50
mM HEPES; 2M NaCl; pH8 | 50
mM HEPES; 2M NaCl; pH8 | 50
mM HEPES; 2M NaCl; pH8 | 50
mM HEPES; 2M NaCl; pH8 | 50
mM HEPES; 2M NaCl; pH8 | 50
mM HEPES; 2M NaCl; pH8 | 50
mM HEPES; 2M NaCl; pH8 | 50
mM HEPES; 2M NaCl; pH8 |
| F | 50
mM AMPSO; 2M NaCl; pH9 | 50
mM AMPSO; 2M NaCl; pH9 | 50
mM AMPSO; 2M NaCl; pH9 | 50
mM AMPSO; 2M NaCl; pH9 | 50
mM AMPSO; 2M NaCl; pH9 | 50
mM AMPSO; 2M NaCl; pH9 | 50
mM AMPSO; 2M NaCl; pH9 | 50
mM AMPSO; 2M NaCl; pH9 |
Tab.4:
Zusammensetzung der Equilibrierungs/Waschpufferplatte und der Probenauftragspufferplatte.
Pro Well 1 ml des individuellen Puffers.
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| A | 25
mM Na-Phosphat;
1M NaCl; pH4 | 25
mM Na-Phosphat;
1M NaCl; pH4 | 25
mM Na-Phosphat;
1M NaCl; pH4 | 25
mM Na-Phosphat;
1M NaCl; pH4 | 25
mM Na-Phosphat;
1M NaCl; pH4 | 25
mM Na-Phosphat;
1M NaCl; pH4 | | |
| B | 50
mM Na-Phosphat; pH7 | 50
mM Na-Phosphat; pH7 | 50
mM Na-Phosphat; pH7 | 50
mM Na-Phosphat; pH7 | 50
mM Na-Phosphat; pH7 | 50
mM Na-Phosphat; pH7 | 50
mM Na-Phosphat; pH7 | 50
mM Na-Phosphat; pH7 |
| C | 50
mM Na-Phosphat; pH7 | 50
mM Na-Phosphat; pH7 | 50
mM Na-Phosphat; pH7 | 50
mM Na-Phosphat; pH7 | 50
mM Na-Phosphat; pH7 | 50
mM Na-Phosphat; pH7 | 50
mM Na-Phosphat; pH7 | 50
mM Na-Phosphat; pH7 |
| D | 50
mM Na-Phosphat; pH7 | 50
mM Na-Phosphat; pH7 | 50
mM Na-Phosphat; pH7 | 50
mM Na-Phosphat; pH7 | 50
mM Na-Phosphat; pH7 | 50
mM Na-Phosphat; pH7 | 50
mM Na-Phosphat; pH7 | 50
mM Na-Phosphat; pH7 |
| E | 50
mM Na-Phosphat; pH7 | 50
mM Na-Phosphat; pH7 | 50
mM Na-Phosphat; pH7 | 50
mM Na-Phosphat; pH7 | 50
mM Na-Phosphat; pH7 | 50
mM Na-Phosphat; pH7 | 50
mM Na-Phosphat; pH7 | 50
mM Na-Phosphat; pH7 |
| F | 50
mM Na-Phosphat; pH7 | 50
mM Na-Phosphat; pH7 | 50
mM Na-Phosphat; pH7 | 50
mM Na-Phosphat; pH7 | 50
mM Na-Phosphat; pH7 | 50
mM Na-Phosphat; pH7 | 50
mM Na-Phosphat; pH7 | 50
mM Na-Phosphat; pH7 |
Tab.
5: Zusammensetzung der Elutionspufferplatte. Pro Well 1 ml des individuellen
Puffers.
-
Zweite
Chromatographische Reinigung von UCE mittels Hydrophober Interaktionschromatographie: Ein
XK50-Säulengehäuse wurde
mit 150 ml t-Butyl MacroPrep-Gel gepackt und an das HPLC Explorer
System angeschlossen. Mit einem Fluss von 10 ml/min wurde die Säule solange
mit Puffer A (50 mM Malonsäure;
2 M NaCl; pH 5) equilibriert bis die Leitfähigkeit konstant blieb. Das
Eluat (150 ml) der Sample Displacement Chromatographie bezeichnet
als Fraktion 1.1 wurde mit 150 ml 100 mM Malonsäure vermischt und mit einer NaCl-Lösung auf
2 M eingestellt. Der pH-Wert
wurde mit einer HCl-Lösung
auf einen Wert von 5 gebracht. Die Probe wurde mit einem Fluss von
10 ml/min mit der Sample Pump des Explorers auf die Säule aufgetragen. Die
Säule wurde
anschließend
mit 200 ml Puffer A gewaschen. Der Gradient für die Flution der Probe verlief von
0% auf 100% B (Wasser) in 60 Minuten. Während der Chromatographie wurden
10 ml Fraktionen gesammelt. Nach 60 Minuten wurde 15 Minuten mit
Wasser gespült.
Von den Fraktionen mit einer deutlichen UV-Absorption bei 280 nm wurden 100 μl abgenommen
und an Sepharosebeads immobilisiert, inkubiert und die UCE-Aktivität bestimmt.
-
Suche
nach chromatographischen Parametern für die 3. chromatographische
Reinigung des UCE: Für den
nächsten
Reinigungsschritt wurden 5 Kationenaustauschergele (Toyopearl CM-650M-Gel,
Fractogel SO
– 3 SP-Sepharose FF, Fractogel COO
– und
UnosphereS-Gel) bei 5 verschiedenen pH-Werten getestet. Die Lösungen und
Gele wurden jeweils beginnend von Position A1 bis Position E5 der
96-Deepwell-Platte befüllt.
Für die
Vorbereitung der Gelplatte wurden 1 ml der oben aufgeführten Gele
abgenommen und in Eppendorfgefäße überführt, mit
Wasser gewaschen und anschließend
mit einer 1 M NaCl-Lösung
konditioniert. Danach wurden die Gele 3 mal mit Wasser gewaschen
und eine 1:1 Gel-Wasser-Mischung hergestellt. Nachdem durch mehrmaligen
Schwenken eine homogene Suspension entstanden war, wurden 20 μl der Suspension
in das entsprechende Well pipettiert. Die Elutionspufferplatte enthielt
500 μl einer
1 M NaCl-Lösung
pro Well. Die Befüllung der
Pufferplatten erfolgte mit dem Dispenser. Die Probenplatte enthielt
in Position A1-D1 jeweils 500 μl
der Fraktion 1.2 aus der Hydrophoben Interaktionschromatographie.
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| A | Toyopearl CM-650M | Fractogel
SO– 3 | SP-Sepharose FF | Fractogel
COO– | UnosphereS |
| B | Toyopearl CM-650M | Fractogel
SO– 3 | SP-Sepharose FF | Fractogel
COO– | UnosphereS |
| C | Toyopearl CM-650M | Fractogel
SO– 3 | SP-Sepharose FF | Fractogel
COO– | UnosphereS |
| D | Toyopearl CM-650M | Fractogel
SO– 3 | SP-Sepharose FF | Fractogel
COO– | UnosphereS |
| E | Toyopearl CM-650M | Fractogel
SO– 3 | SP-Sepharose FF | Fractogel
COO– | UnosphereS |
Tab.
6: Gelplattenbelegung. Pro Well 10 μl Gelsediment. Position A1-E5
wurden mit Kationenaustauschergelen befüllt.
| | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| A | 50
mM K2HPO4; pH4 | 50
mM K2HPO4; pH4 | 50
mM K2HPO4; pH4 | 50
mM K2HPO4; pH4 | 50
mM K2HPO4; pH4 |
| B | 50
mM K2HPO4; pH5 | 50
mM K2HPO4; pH5 | 50
mM K2HPO4; pH5 | 50
mM K2HPO4; pH5 | 50
mM K2HPO4; pH5 |
| C | 50
mM MES; pH6 | 50
mM MES; pH6 | 50
mM MES; pH6 | 50
mM MES; pH6 | 50
mM MES; pH6 |
| D | 50
mM MOPS; pH7 | 50
mM MOPS; pH7 | 50
mM MOPS; pH7 | 50
mM MOPS; pH7 | 50
mM MOPS; pH7 |
| E | 50
mM HEPES; pH8 | 50
mM HEPES; pH8 | 50
mM HEPES; pH8 | 50
mM HEPES; pH8 | 50
mM HEPES; pH8 |
Tab.
7: Zusammensetzung der Equilibrierungs/Waschpufferplatte und der
Probenauftragspufferplatte. Pro Well 1 ml des individuellen Puffers.
-
Dritte chromatographische Reinigung des
UCE mittels Kationenaustausch-Chromatographie
-
Eine
kommerzielle Uno S6-Säule
vorgepackt mit dem Unosphere S-Material wurde an die HPLC Anlage
Purifier angeschlossen und bei einem Fluss von 1 ml/min mit Puffer
A (50 mM Phosphatpuffer, pH 5) equilibriert. Das Volumen von 70
ml der 1.2-Fraktion aus der Hydrophoben Interaktionschromatographie
wurde über
10 kDa-Filter auf ein Volumen von 500 μl eingeengt und mit 500 μl Puffer
A gemischt. Die Probe wurde über
eine 1 ml Probenschleife mit einem Fluss von 0,9 ml/min auf die
Säule aufgetragen.
Die Probenelution erfolgte bei einem Gradienten von 0% auf 100%
B (1 M NaCl) in 40 Minuten. Es wurden 1 ml Fraktionen gesammelt.
Fraktionen mit einer signifikanten UV-Absorption bei 280 nm wurden auf UII-generierende
Aktivitäten getestet.
Dabei wurden 100 μl
Aliquots der Fraktionen an 30 μl
Sepharosebeads immobilisiert (siehe 2.2.2.2), mit dem UCE-S inkubiert
(2.2.2.3) und massenspektrometrisch vermessen (2.2.2.4). DieUCE-Fraktionen
bezeichnet mit 1.3 wurden vereinigt und über einen 10 kDa-Filter konzentriert.
-
Beispiel 3: UCE-Aktivitätsassay
-
Folgende
Proteaseinhibitoren wurden verwendet: 10 μM E64, 10 μM Pepstatin A, 1 mM EDTA, 100 μM Bestatin,
10 μM Chymostatin,
1 mM AEBSF (angegeben ist die Endkonzentration). Für den UCE-Aktivitätsassay
wurden 7 × 30 μl Sepharosebeads
(6 Inhibitoren + 1 Kontrolle) portioniert und jeweils 50 μl der Proteinfraktion
1.3 aus dem 3. chromatographischen Reinigungsschritt zugegeben.
E64 und AEBSF als irreversible Inhibitoren wurden 30 Minuten vor
Substratzugabe zu den immobilisierten 1.3 Proteinfraktionen pipettiert
und bei Raumtemperatur geschüttelt.
Nach 30 Minuten wurde zu den Proben, die mit dem irreversiblen Inhibitoren
inkubiert wurden, 27 μl
des UCE-S (10–5
M) gegeben und bei RT geschüttelt.
Von allen anderen Inhibitoren wurden 3 μl jeweils zu 27 μl des UCE-S
gegeben, vermischt und zu den immobilisierten 1.3 Proteinfraktionen
pipettiert und bei Raumtemperatur geschüttelt. Aliquots wurden nach
4 h und 22 h abgenommen und mittels MALDI-MS vermessen (siehe Beispiel
1). Das Ergebnis eines solchen erfindungsgemäßen Verfahrens ist in 6 dargestellt.
-
Beispiel 4: Reinigung des UCE mit einer
Affinitätschromatographie
mit immoblisierten Chymostatin
-
Der
nächste
Reinigungsschritt bestand aus einer Affinitätschromatographie mit dem immobilisierten Inhibitor
Chymostatin. Für
diese Chromatographie wurden 20 ml EAH-Sepharose 3 mal mit einer 500 mM NaCl-Lösung und
anschließend
mit einer mit 100 μM
HCl-Lösung
(pH 4,5) gewaschen. 400 mg des Crosslinkers EDC wurden in 100 μM HCl-Lösung (pH
4,5) gelöst
und zu der EAH-Sepharose pipettiert. Anschließend wurden 100 μl einer 50
mg/ml Chymostatinlösung
gelöst
in DMSO zu der EAH- Sepharose
gegeben und gut vermischt. Die Reaktion erfolgte bei 4°C über Nacht
auf dem Überschlagsrotor.
Die Kontrolle des pH-Werts erfolgte während der ersten 2 h und wurde
mit NaOH auf 4,5 eingestellt. Nach der Reaktion wurde der Überstand
abgenommen und die EAH-Sepharose abwechselnd mit Puffer 1 (0,1 M
Essigsäure,
500 mM NaCl, pH 4) und Puffer 2 (0,1 M Tris, 500 mM NaCl, pH 8)
jeweils 3 mal gewaschen. Zum Abschluss wurde das Gel 3 mal mit Wasser
gewaschen. Für
die Chromatographie wurden 2,7 ml der EAH-Sepharose mit immobilisierten Inhibitor
Chymostatin in ein HR 10/30 Säulengehäuse gefüllt und
an die HPLC-Anlage Purifier angeschlossen. Die Säule wurde mit Puffer A (50
mM HEPES, 500 mM NaCl, pH 8) bei einem Fluss von 0,7 ml/min equilibriert. Die
aufkonzentrierte Probe (500 μl
der Fraktion 1.3 aus der Kationenaustauschchromatographie) wurde
in 500 μl
Puffer A aufgenommen und mit einem Fluss von 0,7 ml/min auf die
Säule aufgetragen.
Die Probenelution erfolgte bei einem Gradienten von 0% auf 75% Puffer
B (50 mM Phosphatpuffer; pH 4) in 30 Minuten und weitere 30 Minuten
auf 100% Puffer B. Während
der Chromatographie wurden Fraktionen von 1 ml gesammelt. Eine signifikante
UV-Absorption bei 280 nm war nur im Durchbruch zu sehen, welcher
dann auf die UII-generierende Aktivität überprüft wurde. Für die Immobilisierung wurden
100 μl des
Durchbruchs an 30 μl
Sepharose immobilisiert (siehe Beispiel 1). Nach Substratinkubation
wurden die Proben massenspektrometrisch vermessen (siehe Beispiel
1).
-
Reinigung
des UCE mit einer Größenausschluss-Chromatographie:
Die aktive Fraktion aus der Affinitätschromatographie, bezeichnet
mit 1.4, wurde über
einen 10 kDa-Filter auf ein Volumen von 100 μl eingeengt. Die Probe wurde
in 100 μl
Puffer A (50 mM Phosphatpuffer, 150 mM NaCl, pH 7) aufgenommen.
Die Gelfiltrationssäule
Superdex 200 HR 10/30 wurde an die HPLC-Anlage Purifier angeschlossen.
Die Probe wurde mit einem Fluss von 250 μl/min aufgetragen. Die Chromatographie
wurde mit Puffer A durchgeführt.
Es wurden 1 ml Fraktionen gesammelt. Fraktionen mit einer deutlichen
UV-Absorption bei 280 nm wurden immobilisiert und auf eine UCE-Aktivität getestet
(Ergebnis siehe 5).
-
Beispiel 5: Identifizierung eines UCE-aktiven
Proteins
-
Tryptischer Verdau der UCE-aktiven Fraktionen
aus der Größenausschluss-Chromatographie
-
Eine
hohe UCE-Aktivität
konnte in den Fraktionen 1.5A-D (siehe Chromatogramm der Größenausschluss-Chromatographie, 5)
gefunden werden. Jeweils 800 μl
der Fraktionen 1.5A-D wurden in Eppendorfgefäße überführt und eingefroren. Die gefrorenen
Fraktionen wurden anschließend
in der Vakuumzentrifuge getrocknet. Die Pellets wurden in 50 μl 6 M Harnstoff
aufgenommen und 5 μl
einer 200 mM DTT-Lösung, 100
mM NaHCO3 (pH 8,3) zugegeben und 1 h bei
Raumtemperatur auf einem Schüttler
inkubiert.
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Zu
dem Inkubationsansatz wurden 10 μl
einer 200 mM Iodacetamid-Lösung,
100 mM NaHCO3 (pH 8,3) pipettiert und 1
h auf dem Schüttler
bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 10 μl einer 200 mM
DTT-Lösung,
100 mM NaHCO3 (pH 8,3) zu dem Ansatz pipettiert
und wieder 1 h auf dem Schüttler
bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurden 425 μl einer 100
mM NaHCO3-Lösung (pH 8,3) zugegeben und
der Reaktionsansatz in ein Glasvial überführt. In das Glasvial wurden
5 μl einer
0,25 μg/μl Trypsin-Lösung pipettiert
und 24 h bei Raumtemperatur auf dem Schüttler inkubiert. Zum Abstoppen
der Reaktion wurde die Lösung
mit Ameisensäure
auf 0,1% eingestellt.
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Identifizierung
der tryptisch verdauten Peptide der UCE-aktiven Fraktionen der Größenausschluss-Chromatographie
mittels LC-ESI MS/MS: Es wurden jeweils 20 μl der verdauten Fraktionen 1.5A-D
in eine 96-Well-PCR-Platte überführt und
in den Autosampler des LC-ESI MS/MS gestellt. Der Autosampler injizierte
jeweils 8 μl
Probe auf ein Chip-System der Firma Agilent. Die Probe wurde auf
eine Trapping C18-Säule (40
nl ZORBAX 300SB C18), die sich auf den Chip befand, mit einem Fluss
von 4 μl/min
10 Minuten mit 100% Puffer A (3% ACN, 0,1% Ameisensäure) aufgetragen.
Als Trennsäule
(Analytische Säule),
die sich ebenfalls auf dem Chip befand, wurde eine C18-Säule mit
einem (C18-Säule
150 mm × 75 μm ZORBAX
300SB) verwendet. Es wurde 45 Minuten ein Gradient von 0% auf 40%
B (80% ACN, 0,1% Ameisensäure)
gefahren und für
3 Minuten auf 97% B. Anschließend
wurde 2 Minuten bei 97% B und dann auf 3% B gespült. Zur Auswertung der generierten
ESI-Daten wurde die Software DataAnalysis und Mascot verwendet.
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Mit
dem Data Analysis Programm von Agilent konnten die generierten MS
Spektren automatisch in Aminosäuresequenzen übersetzt
werden. Mit Hilfe des Mascot generic file (mgf) konnte eine Mascot-Datenbankabfrage
erfolgen. Mit Hilfe der Datenbankabfrage konnte eine Protease, der
humane Komplement Faktor I (EC-Nummer:
3.4.21.45) identifiziert werden. Insgesamt konnten 9 Peptide mit
folgenden AS-Sequenzen (SEQ ID NO 4–12): VFSLQWGEVK, AQLGDLPWQVAIK,
GLETSLAECTFTK, ADSPMDDFFQCVNGK, TMGYQDFADVVCYTQK, YQIWTTVVDWIHPDLK,
EANVACLDLGFQQGADTQR, VANYFDWISYHVGRPFISQYNV, DASGITCGGIYIGGCWILTAAHCLR
bei einem signifikanten Score von 392 identifiziert werden. Die
Sequenzabdeckung für
den Komplement Faktor I betrug 25%. Drei weitere tryptisch verdaute
Proben Fraktion 1.5A, 1.5C und 1.5D aus der Größenausschluss-Chromatographie
(16) wurden mittels LC-ESI-MS/MS analysiert.
In keiner dieser Proben konnte eine Protease identifiziert werden.
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Nach
Identifizierung des Komplement Faktor I in der 1.513 Fraktion wurde
nach einer kommerziellen Präparation
des Komplement Faktor I gesucht. Eine aus humanem Plasma aufgereinigte
Präparation
wurde von Sigma angeboten. Da für
weitere Charakterisierungsversuche diese Präparation als Positivkontrolle
eingesetzt werden sollte, musste sichergestellt sein, dass keine
weiteren Proteasen, die die Ergebnisse verfälschen könnten, vorhanden sind. Dafür wurde
ein Teil der Präparation
tryptisch verdaut und mit der LC-ESI-MS/MS identifiziert.
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Die
Datenbankabfrage ergab, dass mit einem von Score 998 an erster Stelle
der humane Komplement Faktor I identifiziert werden konnte. Folgende
Peptide (SEQ ID NO 13–28)
wurden identifiziert: FSVSLK, TMFICK, IVIEYVDR, VFCQPWQR, SFPTYCQQK,
RIVIEYVDR, VFSLQWGEVK, GLETSLAECTFTK, RAQLGDLPWQVAIK, ADSPMDDFFQCVNGK,
TMGYQDFADVVCYTQK, YQIWTTVVDWIHPDLK, RTMGYQDFADVVCYTQK, EANVACLDLGFQQGADTQR,
ACDGINDCGDQSDELCCK, IIFHENYNAGTYQNDIALIEMK. Die Sequenzabdeckung
für den
Komplement Faktor I betrug 34%. Außer dem Komplement Faktor I
konnte in der Präparation
noch Albumin identifiziert werden. Da es keinen Hinweis auf eine
weitere Protease in der kommerziellen Präparation gab, konnte diese
Präparation
als Positivkontrolle für
Charakterisierungversuche eingesetzt werden.
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Vergleich der AS-Sequenzen der tryptischen
Peptide der kommerziellen Präparation
des humanen Komplement Faktor I und der 1.5B-Fraktion:
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In
der tryptisch verdauten Probe der kommerziellen Präparation
des Komplement Faktor I konnten 16 Peptide, in der 1.5B Fraktion
10 Peptide dem Komplement Faktor I zugeordnet werden. Insgesamt
wurden in beiden Fraktionen 7 Peptide gefunden, die identische AS-Sequenzen
besitzen.
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Nachweis
einer UII-generierenden Aktivität
der 1.5B-Fraktion und des Komplement Faktor I mit dem MES-Assay:
Um sicherzustellen, dass der Komplement Faktor I eine UCE-Aktivität besitzt,
wurden die 1.5B-Fraktion und die kommerzielle Komplement Faktor
1-Präparation
mit Hilfe des MES-UCE-Assay auf die UCE-Aktivität untersucht. 7 zeigt
die Ergebnisse des Nachweises einer Bestimmung der UCE-Aktivität der kommerziellen
Komplement Faktor 1-Präparation
zum Vergleich mit der gereinigten Fraktion 1.5B. Beide Fraktionen
zeigen einen Abbau des UCE-S zum UII. Die MALDI-Spektren zeigen auch die Generierung
der zwei Zwischenstufen (KR-UII und R-UII) des UII in der gereinigten
Fraktion 1.56 und der kommerziellen Präparation des Komplement Faktor
I. Die Ergebnisse zeigen, dass der Komplement Factor I eine UCE-Aktivität besitzt.
-
Nachweis
einer identischen proteolytischen Aktivität der 1.5B Fraktion und der
kommerziellen Komplement Faktor 1-Präparation mittels Fluoreszenzassay:
Tsiftsoglou et al. konnte zeigen, dass der Komplement Faktor I das
Fluoreszenzsubstrat Boc-Asp(Obzl)-Pro-Arg-AMC
umsetzen kann. Für
den Nachweis, dass die 1.5B-Fraktion wie der Komplement Faktor I
das Substrat umsetzt, wurde ein Fluoreszenzassay durchgeführt. Die
kommerzielle Komplement Faktor 1-Präparation diente als Positiv-Kontrolle.
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8 zeigt
die Ergebnisse des Fluoreszenzassays. Fraktion 1.5B (b) und der
Komplement Faktor I der kommerziellen Präparation (c) zeigen eine Umsetzung
des Fluoreszenzsubstrates Boc-Asp(Obzl)-Pro-Arg-AMC ab einer Inkubationszeit
von 4,5 h und sie erreicht ein Plateau nach 13 h. Der Fluoreszenzassay
zeigt, dass in der 1.5B-Fraktion
als auch in der kommerziellen Komplement Faktor I-Präparation
eine proteolytische Aktivität
vorhanden ist, die das Fluoreszenz-Substrat Boc-Asp(Obzl)-Pro-Arg-AMC umsetzt.
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Untersuchung auf N-glykosidisch gebundene
Oligosaccharide des Mannose-Typs im Komplement Faktor I a) der kommerziellen
Präparation
und b) der 1.5B-Fraktion mit Hilfe des GNA-Lektin Glykoprotein Kit:
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Es
ist bekannt, dass der Komplement Faktor I ein Glykoprotein vom Mannose-Typ
ist. Mit Hilfe von Filtrationssäulen
mit gekoppelten GNA-Lektin sollte untersucht werden, ob die 1.5B-Fraktion
sich an diese GNA-Lektin-Säulen
binden lässt.
Als Vergleich wurde die kommerzielle Komplement Faktor 1-Präparation
eingesetzt.
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Anhand
der MALDI-Spektren A und C (9) konnte
eine UCE-Aktivität
in den Eluaten der 1.5B-Fraktion und der Komplement Faktor 1-Präparation
gefunden werden. Dies ist ein Beweis dafür, dass beide Fraktionen an
den GNA-Lektin-Säulen
gebunden haben und von ihnen eluiert werden konnten. Beide Fraktionen besitzen
wie erwartet, N-glykosidisch
gebundene Ologosaccharide mit Mannose-Strukturen. Auch in den Überständen der
beiden Fraktionen ist eine UCE-Aktivität wiederzufinden (MALDI-Spektren B und D).
Dies könnte
auf das Überschreiten
der Bindungskapazität
der Lektinsäulen
zurückzuführen sein,
sodass nicht alle Komplement Faktor I-Moleküle binden konnten.
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Charakterisierungsversuche der 1.5B-Fraktion
und der kommerziellen Komplement Faktor 1-Präparation mit dem Serinproteaseinhibitor
Aprotinin
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Es
ist bekannt, dass der Komplement Faktor I eine Serinprotease ist.
Für die
weitere Charakterisierung der 1.5B-Fraktion im Vergleich mit der
kommerziellen Komplement Faktor I-Präparation wurden untersucht,
ob sich die UII-generierende Aktivität in beiden Fraktionen mit
dem Serinprotease-Inhibitor Aprotinin hemmen lassen.
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11 zeigt
bei Inkubation mit Aprotinin eine vollständige Hemmung der UCE-Aktivität der 1.5B-Fraktion
und der kommerziellen Komplement Faktor I-Präparation. Es gibt keine UII
Signale und keine von möglichen
Zwischenprodukten (R-UII und KR-UII)
Es konnte jedoch ein Peptid mit der Masse 1801.8 Da (im Spektrum
mit X bezeichnet) gefunden werden. Diese Masse entspricht dem KKR-UII
Peptid (Tabelle), welches um 6 Aminosäuren vom N-Terminus des UCE-S
verkürzt
ist. Dafür verantwortlich
könnte
eine proteolytische Verunreinigung in der kommerziellen Aprotinin-Präparation
sein, da das Aprotinin aus der Rinderlunge aufgereinigt wurde und
begleitende Proteine enthalten kann.
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Charakterisierungsversuche der 1.5B-Fraktion
und der kommerziellen Komplement Faktor I-Präparation mit dem Serinproteaseinhibitor
Pefabloc SC
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Tsiftsoglou
et al. konnte zeigen, das sich der Komplement Faktor I vollständig mit
Pefabloc SC (auch als AEBSF bezeichnet) inhibieren ließ. Vorangegangene
Inhibitionsversuche (Punkt 3.2.7) haben gezeigt, dass die 1.5B-Fraktion
nicht vollständig
von Pefabloc SC inhibiert werden konnte. Grund dafür könnte die
eingesetzte Konzentration des Inhibitors sein. Daraufhin wurde die
von Tsiftsoglou et al. angegebene Pefabloc SC-Konzentration für den Inhibitionsversuch
eingesetzt.
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10 zeigt
die Ergebnisse des Inhibitionsversuchs mit Pefabloc SC. In beiden
Fraktionen sowohl in der 1.56-Fraktion als auch der kommerziellen
Komplement Faktor 1-Präparation
konnte nach 24 h Inkubation keine UII-generierende Aktivität oder die
Entstehung von weiteren UCE-S-Produkten beobachtet werden. Der Inhibitionsversuch
hat gezeigt, dass mit einer Konzentration von 2,5 mM Pefabloc SC
eine vollständige
Hemmung der UCE-Aktivität
erreicht werden konnte.
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Beispiel 6: UCE-Aktivitätsassay
mit humanem Komplement Faktor 1
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Nachweis
einer UCE-Aktivität
der 1.5B-Fraktion und des Complement Faktor I mittels MES: Es wurden 10 μl einer käuflich erworbenen
1 mg/ml Complement Faktor I-Lösung
und 20 μl
der 1.5B-Fraktion aus der Größenausschluss-Chromatographie
an 30 μl
Sepharose immobilisiert und die UCE-Aktivität getestet (siehe Beispiel
1). Aliquots der Inkubationsansätze
wurden nach 2 h, 4 h, 7 h und 24 h abgenommen.
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Nachweis
einer identischen proteolytischen Aktivität der 1.5B Fraktion aus der
Größenausschluss-Chromatographie
und des Complement Faktor I mittels Fluoreszenzassay: In eine schwarze 96-Well-Mikrotiter-Platte
wurde in Position A1 die Negativ-Kontrolle mit 50 μl 25 mM Boc-Asp(Obzl)-Pro-Arg-AMC-Fluoreszenzsubstrat aufgenommen
in 150 μl
Puffer 1 (25 mM Bicine-Puffer, 150 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, pH 8.25)
pipettiert. In das Well A2 wurden 50 μl einer 25 μM Boc-Asp(Obzl)-Pro-Arg-AMC-Substrat-Lösung und
10 μl der
Fraktion 1.5B aus der Größenausschluss-Chromatographie aufgenommen
in 140 μl
Puffer 1 pipettiert. In das Well A3 wurden 50 μl einer 25 μM Boc-Asp(Obzl)-Pro-Arg-AMC-Substrat-Lösung und
5 μl (entsprach
5 μg) einer
kommerziellen Präparation
des humanen Complement Faktor I aufgenommen in 145 μl Puffer
1 pipettiert. Die Platte wurde bei 37°C 12h inkubiert und bei einer
Anregungswellenlänge
von 350 nm und einer Emissionswellenlänge von 465 nm alle 30 min
vermessen. Der Fluoreszenzassay wurde nach der Vorschrift von S.
A. Tsiftsoglou und R. B. Sim durchgeführt ("Human complement factor I does not require
cofactors for cleavage of synthetic substrates." J Immunol 173 (1): 367–75).
-
Versuche
zur Glykoproteincharakterisierung der 1.5B-Fraktion und der kommerziellen
Complement Faktor I-Präparation:
Für die
Durchführung
der Charakterisierung wurden ein Mannose Glykoprotein Kit mit gekoppelten
GNA-Lektin und ein O-Glykan Glykoprotein Kit mit gekoppelten PNA-Lektin
der Firma Qiagen verwendet. Die Vorgehensweise erfolgte nach Vorschrift
von Qiagen. Alle Puffer und Lösungen
waren in dem Kit enthalten. Zu Beginn wurden die Fraktionssäulen in
2 ml Eppendorfgefäße platziert
und anschließend
500 μl des
jeweiligen Bindungspuffers zugegeben und 2 min bei 500 rpm zentrifugiert
und der Durchfluss verworfen. Für
die Vergleichbarkeit der Ergebnisse wurden adäquate Proteinmengen der Fraktion
1.56 und der kommerziellen Präparation
des Complement Faktor I eingesetzt. Von der Fraktion 1.5B wurden
2 × 30 μl (0,1 mg/ml) in
jeweils 500 μl
des entsprechenden Bindungspuffers aufgenommen. Von der kommerziellen
Präparation
des Complement Faktor I wurden jeweils 2 × 3 μl (1 mg/ml) abgenommen und mit
Wasser auf 30 μl
aufgefüllt
und anschließend
mit 500 μl
des entsprechenden Bindungspuffers vermischt. Die in Puffer aufgenommen
Proben wurden zu den entsprechenden Fraktionssäulen pipettiert und 2 min bei
500 rpm zentrifugiert. 100 μl
des Durchfluss wurden an 50 μl
Sepharosebeads immobilisiert und der Rest verworfen. Die Lektinsäulen wurden 3
mal mit dem jeweiligen Bindungspuffer gewaschen, für 2 min
bei 500 rpm zentrifugiert und der Durchfluss verworfen. Für die Flution
der Proteine von den Lektinsäulen
wurden 300 μl
Elutionspuffer zu den Lektinsäulen pipettiert
und 1 min inkubiert. Anschließend
wurde 5 min bei 500 rpm zentrifugiert und 100 μl des Eluats an 50 μl Sepharosebeads
immobilisiert. Die Abnahmen der Aliquots der Überstände erfolgte nach 1,5 h; 3,5
h; 5,5 h und 24 h und die Abnahmen der Eluate nach 1,5 h; 3,5 h
und 24 h. Die Proben wurden dann massenspektrometrisch vermessen
(siehe Beispiel 1).
-
Charakterisierungsversuche
der 1.5B-Fraktion und der kommerziellen Complement Faktor 1-Präparation
mit den Serinproteaseinhibitoren Aprotinin und Pefabloc SC: Für die Charakterisierungsversuche
wurden 4 × 30 μl Sepharosebeads
vorbereitet. Jeweils 2 × 30 μl einer 0,1
mg/ml 1.5B-Fraktion und der kommerziellen Complement Faktor I-Präparation
wurden an Sephaosebeads immobilisiert. Für die Inkubation wurden jeweils die
27 μl einer
10
–5 M
UCE-S-Lösung
mit jeweils 3 μl
einer 10 μl
Aprotinin-Lösung und
2,5 mM einer Pefabloc SC-Lösung
vermischt und zu den jeweiligen immobilisierten Proteinen gegeben.
Die Abnahmen der Aliquots erfolgte nach 1,5 h; 3,5 h; 5,5 h und
24 h. Anschließend
wurden die abgenommenen Aliquots massenspektrometrisch vermessen
(siehe Beispiel 1). SEQUENCE
LISTING
