WO2008046665A2 - Verfahren zur identifizierung von urotensin-2-konvertase-inhibitoren - Google Patents

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WO2008046665A2
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convertase
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Hartmut SCHLÜTER
Walter Zidek
Sandra Kurzawski
Maria Trusch
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Charite - Universitätsmedizin Berlin
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    • G01N2333/575—Hormones
    • G01N2333/5751—Corticotropin releasing factor [CRF] (Urotensin)

Definitions

  • the invention relates to a method for the identification of urotensin 2-convertase inhibitors according to the preamble of claim 1.
  • Urotensin-2 (Uli, U-2) is a cardiovascular active neuropeptide found in mammals and fish. Human Urotensin-2 is a cyclic undecapetide. Depending on the species and the site of action or tissue, Uli can act both as a vasoconstrictor and vasodilator. Physiologically, Uli, like most peptide hormones active as tissue hormones, is released from a larger prepropeptide by proteolytic cleavage and activated. The enzymes involved are commonly referred to as "convertases.” In humans, prepropeptides of 124 and 139 amino acids in length are known, both of which produce identical Uli.
  • Urotensin-2 is referred to as the mediator between the mechanisms responsible for the development of hypertension on the one hand and coronary disease on the other hand (Watanabe et al., Hypertens Res. 2006 Jun; 29 (6): 375-87). Given the enormous importance of these two disease complexes, it is clear that pharmaceutical modulation of the activity of urotensin-2 could be of considerable medical benefit. Also contemplated for such a pharmaceutical intervention is the Uli enzyme in its synthesis pathway, UCE, which activates urotensin-2 from the precursor peptide. Inter alia, an inhibitor of urotensin 2-convertase could be used as a candidate for the treatment of hypertension.
  • proteases act in cascades, meaning that a first protease is activated by a physiological signal and autocatalytically cleaves itself, whereupon a released cleavage product activates a second member in the cascade chain by proteolysis, and so on.
  • One such protease cascade is the complement system, which is an important component of so-called innate immunity. It is thus an object of the present invention to provide methods and means for identifying and isolating the physiologically active component urotensin-2 convertase which converts urotensin-2 precursor peptides to urotensin. Furthermore, it is an object of the present invention to find suitable methods for determining activities for the modulation of urotensin 2-convertase (UCE activities).
  • a method by which a protein having urotensin 2-convertase activity can be determined.
  • a protein-containing sample taken from a mammal is separated into several fractions by one or more chromatographic steps.
  • the urotensin 2-convertase activity of each fraction is determined after at least one chromatographic step and a fraction containing urotensin 2-convertase activity is isolated.
  • At least one fraction containing urotensin 2-convertase activity obtained in the purification step is subjected to incomplete proteolytic digestion, the fragments resulting from incomplete proteolytic digestion are analyzed for their amino acid sequence by mass spectrometry and assigned to at least one peptide sequence, and the peptide sequence by database alignment is assigned to a associated with a mammal expressed protein.
  • the purification step involves affinity chromatography in which a protein sample containing urotensin 2-convertase activity is split into fractions by reversible binding to a solid phase to which an inhibitor of urotensin 2-convertase activity is bound, followed by elution becomes.
  • the identification of compounds that can inhibit proteins with urotensin 2-convertase activity is based on the following steps: first a protein with urotensin 2-convertase activity is purified by chromatography, and in a second step, the purified protein is tested for activity in the presence of the compounds to be tested. Whether a compound is an inhibitor of urotensin 2-convertase activity can be determined by comparing the activity in the assay control, standard or otherwise.
  • FIG. 1 A schematic representation of this method is shown in FIG. 1
  • a protein having urotensin 2-convertase activity can be purified by chromatography and its UCE activity verified. Subsequently, the identity of the protein is determined by sequencing, to then produce it in recombinant form and purified in the presence of the compounds to be tested for its activity to test.
  • chemical compounds that regulate the urotenin-2-convertase activity of a protein are identified.
  • chemical compounds are mixed under physiological conditions with complement factor I and the urotensin 2-convertase activity of the mixture is determined.
  • chemical compounds that regulate the urotenin-2-convertase activity of a protein are identified by mixing chemical compounds under complement I and complement H physiological conditions, and urotensin 2-convertase activity of the protein Mixture is determined.
  • Identification of chemical compounds that regulate the urotensin 2-convertase activity of a protein provided in which, in a purification step, a protein having urotensin 2-convertase activity is purified by removing a protein taken from a mammal, protein-containing sample is separated into several fractions by several chromatographic steps, the urotensin-2-convertase activity of the individual fractions is determined after at least one chromatographic step, a fraction containing urotensin-2-convertase activity is isolated, and then these isolated fraction in an activity assay step mixed with a chemical compound under physiological conditions and the urotensin 2-convertase activity of the mixture is determined.
  • the purification step comprises an affinity chromatography in which a protein sample containing urotensin 2-convertase activity is linked by reversible binding to a solid phase to which an inhibitor of urotensin 2-convertase activity is bound, followed by elution into fractions is split.
  • a suitable measuring system for example mass spectrometry-based enzyme screening, is used.
  • chymostatin is the inhibitor of urotensin 2-convertase activity.
  • the starting point for identifying and isolating UCE activity is the study of human blood plasma. Alternatively, other tissues accessible to the person skilled in the art can also be used.
  • Blood plasma can be divided into various so-called Cohn fractions.
  • the Cohn IV fraction was used in the examples of the present invention.
  • the purification by chromatography is carried out by a combination of different chromatographic steps, by combining anion, hydrophobic interaction and cation chromatography with affinity chromatography.
  • a suitable substrate which has an interface for the UCE and two cysteines via a disulfide bridge are connected and can form a cyclic peptide.
  • An example of this is the partial sequence of 21 amino acids of the naturally occurring prepro-Ull (SEQ ID NO 02).
  • the detection system used to analyze UCE activity was the so-called mass spectrometry-assisted enzyme screening (MES) (Schlüter, Anal Bioanal Chem. 2003 Dec; 377 (7-8): 1102-7).
  • MES mass spectrometry-assisted enzyme screening
  • PPS Screening System ", PPS) PPS is a method for the determination of optimal parameters for chromatographic systems, in which a parameter space consisting of eg ionic strength or pH of the mobile phase and various stationary phases is systematically screened for optimal reaction parameter combinations (Thiemann et al., J Chromatogr A. 2004 Ju1 16; 1043 (1): 73-80) (see Example 2).
  • a UCE activity-containing protein preparation is obtained.
  • affinity chromatography step one or more compounds which inhibit the UCE activity of a sample are bound to a solid phase.
  • identification of the purified protein is provided by the subsequent analysis of the purified proteins.
  • this is done by mass spectrometry, in particular by liquid chromatography-coupled electrospray ionization mass spectrometry (LC-ESI MS / MS).
  • chromatographies are performed to purify the plasma fraction for the purpose of the UCE activity assay, a sample-displacement anion exchange chromatography with a stationary aminoethyl phase and a charge buffer of pH 7, a solid-phase chromatography based on the principle of hydrophobic interaction t-butyl MacroPrep gel with a sample application buffer at pH 5, and a cation exchange chromatography with a stationary phase UnosphereS gel at pH 5, followed by affinity chromatography with chymostatin.
  • the pooled fractions with the highest UCE activity are concentrated for the subsequent activity assay via a 10 kDa filter.
  • chymostatin is added to the EAH solid phase.
  • an assay can be carried out with the protein preparation containing UCE activity isolated as described above, which tests the suitability of various chemical compounds for modulation, in particular for inhibition, of UCE activity.
  • a chemical compound is understood to mean low molecular weight compounds, peptides and proteins with or without covalent modifications by groups not forming part of the classical proteins and polymers and mixtures of the abovementioned compounds.
  • AEBSF Aminoethyl) benzenesulfonyl fluoride hydrochloride
  • the protein present in the UCE activity can subsequently be identified (see Example 5).
  • the human complement factor I (EC number: 3.4.21.45) was identified.
  • a protein identified by purification and subsequent characterization can be used in a purified form by another method or in recombinant form as a substrate in a method of identifying inhibitors of UCE activity.
  • a mass spectrometric comparison of the digestion peptide fragments of the respective proteins is first performed, as shown in Example 5 for the complement factor I.
  • Assays for inhibiting the UCE activity of a commercially acquired complement factor I preparation can be used to identify potential UCE modulators (see Example 6).
  • proteins which have at least 60%, preferably at least 70%, more preferably at least 80%, even more preferably at least 90% of the protein sequence deposited with complement factor I or a protein sequence deposited under accession number P05156 in the protein database Swissprot % homologous sequence, as well as a complement factor I homologous activity.
  • Fig. 1 is a schematic representation of the method for the identification of urotensin 2-convertase inhibitors.
  • Fig. 2 Results of the relative molecular weight determination of the UCE by means of centrifugal filters of different exclusion sizes.
  • X axis filtrates and retentates of the filters with different exclusion sizes.
  • Y-axis
  • Fig. 7 MES assay for the detection of the Ull-generating activity of the complement factor I (A) and the purified fraction 1.5B (B) from a human Cohn IV fraction: MALDI spectra of the incubation with UCE-S and the formed Reaction products after immobilization of the commercial preparation of the complement Factor I and the purified fraction 1.5B of a CohnIV fraction from human plasma after an incubation period of 7 h. Uli: 1389.56 Da, R-UII: 1545.66 Da, KR-UII: 1673.75 Da, UCE-S: 2645.3 Da, V: Impurity: 2230.95 Da Fig. 8 Fluorescence assay for detecting proteolytic activity of fraction 1.5B from gel filtration (b ) and a purchased complement factor I fraction (c).
  • FIG. 10 MALDI spectra of the reaction products after incubation with UCE-S and Pefabloc SC after 24h incubation.
  • V impurity: 2230.95 Da.
  • X peptide Lys-Lys-Arg-Ull 1801.8 Da.
  • Fig. 11 MALDI spectra of the reaction products after incubation with UCE-S and aprotinin after 24h incubation. A: immobilized 1.5B fraction. B: immobilized complement factor I preparation. UCE-S: 2645.3 Da.
  • V impurity: 2230.95 Da.
  • X peptide Lys-Lys-Arg-Ull 1801.8 Da.
  • Fig. 12 Coomassie stained 2D PAGE of a commercial CFI fraction. The marked gel areas 1 to 4 were gouged and the contained Proteins identified by mass spectrometric analysis of tryptic peptides.
  • Figure 14 UCE activities of CFI in the absence and presence of complement factor H.
  • Controls glycine-derivatized chromatography particles incubated with UCE-S (K Uli) and glycine-derivatized chromatography particles incubated with UCE-S and FH (K FH Uli).
  • FIG. 16 Result of identification of the proteins labeled according to Example 7.
  • Signal sequence (AS 1 to 18) is marked in gray.
  • the black arrow indicates the end of the N-terminal heavy chain, the gray arrow indicates the beginning of the C-terminal light chain.
  • the gray marks are in the gray
  • the mass spectrometer Reflex III MALDI-TOF from Bruker was used for the MES assay. Aliqouts of the incubation approaches from the MES assay were pipetted onto the MTP AnchorChip 384/400 from Bruker. The immobilization of the samples was carried out on the rollover rotor Rotator Drive STR4 from Stuart Scientific. For substrate incubation, the shaker was used by Fisher Bioblock Scientific. The chromatographies were carried out on the HPLC equipment (Explorer and Purifier) by GE Healthcare. The PPS experiments were carried out with the Genesis Freedom 200 from Tecan.
  • the narrowing of the Protein fractions were run in Amicon Ultra Millipore 1OkDa centrifuge filters and centrifuged with the Heraeus Multifuge 3 SR.
  • the preparation of the samples from the 2nd chromatography was carried out under the sterile bench LaminAir from Holten.
  • the identification of the tryptic peptides was carried out with the chip cube LC-ESI MS / MS from Agilent.
  • Human blood plasma was found to be a suitable source of starting material for UCE-containing protein samples.
  • 2 shows the result of an ultracentrifugation test with filters of different exclusion limits (10 kDa, 30 kDa, 50 kDa and 10 kDa). The resulting filtrates and retentates were assayed for Ull-generating activity by the MES assay. The retentate of the 5OkDa filter shows the highest UCE activity.
  • FIG. 3 shows the results of the MES assay for UCE activity for different human plasma Cohn fractions.
  • the Cohn IV fraction shows the highest UCE activity and was used for further purification of the UCE.
  • UCE-S As a substrate of the assay for the detection of UCE activity, the partial sequence of 21 amino acids of the naturally occurring prepro-Ull is used (SEQ ID NO 02).
  • SEQ ID NO 02 the amino acids of the naturally occurring prepro-Ull is used.
  • an oxidation of the cysteine groups of the peptide took place after the solid phase-coupled synthesis (Wita GmbH, D-14513 Teltow / Berlin).
  • This peptide is referred to below as UCE-S (UCE substrate) and has the sequence Arg-Ile-Trp-Lys-Pro-Tyr-Lys-Lys-Arg-Glu-Thr-Pro-Asp-Cys-Phe-Trp Lys-Tyr-Cys-Val.
  • the MES-UCE assay is based on the covalent immobilization of protein fractions on solid particles.
  • the immobilized proteins are incubated with the UCE-S, after 2h, 5h and 24h samples are taken from the reaction vessel and measured by mass spectrometry.
  • FIG. 4 shows a typical mass spectrum of the reaction products from the incubation of a plasma Cohn IV fraction with UCE-S. It can be the decrease of the UCE-S and the formation of the Uli as a function of time follow. After an incubation period of 5 h, the UCE-S is completely degraded.
  • a partial sequence RIWKPYKKRETPDCFWKYCV with Uli-interface was synthesized (Wita GmbH).
  • the UCE-S peptide was dissolved in 100 mM ammonium acetate; pH 7, adjusted to a concentration of 0.1 mg / ml and incubated for 48h.
  • the solution was then adjusted to 0.1% TFA and applied to a reversed phase column 5RPC 4.1x150.
  • As the mobile phase a 0.1% TFA solution (Buffer A) and 80% ACN (Buffer B) were used.
  • Reversed-phase Chromatography (RPC) was performed at a flow rate of 1 ml / min. The gradient went from 0% B to 50% B in 40 minutes.
  • the immobilization of the protein fractions was carried out on the affinity beads BrCN-activated Sepharose 6MB.
  • an appropriate amount of dry beads was removed from the storage vessel and transferred to an Eppendorf vessel.
  • To swell the beads about 100 times the volume of a 1 mM HCl solution was added and the mixture was incubated on a rollover rotor for about 1 hour. From the beads, the excess HCI solution was removed and washed 3 times with Washed water.
  • For the immobilization of protein fractions each 30 ⁇ l beads were portioned. After the last washing step, the water was removed and the beads were washed once with coupling buffer (10 mM NaHCO 3 , 50 mM NaCl, pH 8.3). This was then removed from the beads.
  • the immobilized protein fraction beads were removed from the previous wash and 30 ⁇ l of a 10 "5 M UCE substrate solution was incubated on a shaker, and 1 ⁇ l of a DHB matrix solution was pipetted onto a MTP anchor chip After drying the matrix, 3 ⁇ 2 ⁇ l aliquots of the reaction mixture were taken at defined times and pipetted onto the MTP anchor chip.After the samples had dried, mass spectra of the samples were recorded.
  • PPS helps to find optimal ways for the chromatographic purification of defined proteins in a short time. 96 and more different parameters, such as pH values, stabilizing additives or salt concentrations, can be examined for their effect on the purification of proteins.
  • the PPS system is an automated, multi-parallel system based on batch chromatography.
  • the procedure comprises six steps:
  • the sample application buffer plate e.g. for PPS ion exchange chromatography experiments.
  • pH values are varied on the X-axis of a 96-well plate, and salt concentrations on the Y-axis.
  • the gels are equilibrated with individual buffers by transferring copies of the buffers of the sample application plate to the gel plate.
  • sample is applied. Sample, sample loading buffer and gel are kept in suspension for defined time intervals. Subsequently, the gel sediments. The 96 supernatants are removed and analyzed quantitatively.
  • the gel sediment is washed several times to remove the non-binding molecules from the proteins adsorbed to the gel.
  • the gels were washed 3 times with water, transferred to a measuring cylinder and made a 1: 1 gel-water mixture. This was transferred to a Greiner tube. After a homogeneous suspension was formed by repeated swirling, 20 ⁇ l of the suspension were pipetted into the corresponding well.
  • the buffer plates For the preparation of the buffer plates, in each case 50 ml of a 50 mM solution were prepared from each buffer and adjusted to the desired pH with NaOH or HCl. Using a dispenser, the sample application buffer plate and the equilibration / wash plate were automatically filled with the desired buffers. The following were used: piperazine pH6, bis-tris-propane pH7, N-methyldiethanolamine pH8, CHES pH9, CAPS pH10.
  • the elution plate was filled with a 1 M NaCl solution. 500 ⁇ l of a 1 mg / ml CohnIV fraction solution were in Wells A1-D1 in the sample plate in each case. After preparing all plates for the PPS experiments, they were positioned on the pipetting robot platform and the PPS experiments were performed automatically. The elution was carried out 4 times with 30 ⁇ l elution buffer. The eluates were then subsequently assayed for UCE activity by MES-UCE assay. 100 ⁇ l of the eluates were immobilized on 30 ⁇ l of Sepharose beads, incubated and the aliquots were measured by mass spectrometry (see Example 1).
  • the 10 gel aliquots were washed 3 times with 50 ml buffer A each time. 1 ml gel aliquots were taken and a 3-fold elution of 1 ml each with a 1 M NaCl solution (Buffer B) was performed. 100 ⁇ l of the eluate were immobilized on 50 ⁇ l of Seharosebeads and the Ull-generating activity determined (see Example 1). After evaluating the results from the partial elution of the 10 gels, the entire sample from the gel of the bottle 1 was eluted 3 times with 50 ml each of Buffer B (designated as fraction 1.1).
  • the solutions and gels were each filled starting from position A1 to position F8 of the 96 deepwell plate.
  • 1 ml of the gels listed above were taken and transferred to an Eppendorf tube, washed with water and then conditioned with a 1 M NaCl solution. Thereafter, the gels were washed 3 times with water and made a 1: 1 gel-water mixture. After a homogeneous suspension had formed by repeated pivoting, 20 .mu.l of the suspension were pipetted into the corresponding well.
  • the buffer plates were adjusted by mixing the individual solutions (buffer solutions, NaCl solution and water) to the appropriate concentration (as shown in Tab. 4). The filling took place with the help of a dispenser. In each case, 500 ⁇ l of fraction 1.1 from Sample Displacement Chromatography were pipetted into positions A1-D1 in the sample plate. This was followed by the automatic execution of the PPS experiments with the pipetting robot system. It was eluted 6 times with 30 ⁇ l of the elution buffer. Second Chromatographic Purification of UCE by Hydrophobic Interaction Chromatography: An XK50 column housing was packed with 150 ml of t-butyl MacroPrep gel and connected to the HPLC Explorer system.
  • fraction 1.1 The eluate (150 ml) of Sample Displacement Chromatography, designated fraction 1.1, was mixed with 150 ml of 10 mM of malonic acid and adjusted to 2 M with a NaCl solution. The pH was brought to 5 with an HCl solution. The sample was applied to the column at a flow of 10 ml / min using the Explorers Sample Pump. The column was then washed with 200 ml of buffer A. The gradient for the elution of the sample was from 0% to 100% B (water) in 60 minutes.
  • buffer A 50 mM malonic acid, 2M NaCl, pH 5
  • protease inhibitors 10 ⁇ M E64, 10 ⁇ M pepstatin A, 1 mM EDTA, 100 ⁇ M bestatin, 10 ⁇ M chymostatin, 1 mM AEBSF (the final concentration is indicated).
  • 10 ⁇ M E64, 10 ⁇ M pepstatin A, 1 mM EDTA, 100 ⁇ M bestatin, 10 ⁇ M chymostatin, 1 mM AEBSF the final concentration is indicated.
  • 7x30 ⁇ l of Sepharose beads (6 inhibitors + 1 control) were portioned and 50 ⁇ l each of protein fraction 1.3 from the 3rd chromatographic purification step added.
  • E64 and AEBSF as irreversible inhibitors were pipetted to the immobilized 1.3 protein fractions 30 minutes prior to substrate addition and shaken at room temperature.
  • the next purification step consisted of affinity chromatography with the immobilized inhibitor chymostatin.
  • EAH Sepharose 20 ml of EAH Sepharose were washed 3 times with a 50 mM NaCl solution and then with a 100 mM HCl solution (pH 4.5).
  • 400 mg of the crosslinker EDC were dissolved in 100 ⁇ M HCl solution (pH 4.5) and pipetted to the EAH Sepharose.
  • 100 ⁇ l of a 50 mg / ml chymostatin solution dissolved in DMSO was added to the EAH Sepharose and mixed well. The reaction was carried out at 4 ° C overnight on the rollover rotor.
  • the pH was controlled during the first 2 hours and was adjusted to 4.5 with NaOH. After the reaction, the supernatant was taken out and the EAH Sepharose was alternately washed with Buffer 1 (0.1 M acetic acid, 50 mM NaCl, pH 4) and Buffer 2 (0.1 M Tris, 50 mM NaCl, pH 8) each 3 times. Finally, the gel was washed 3 times with water. For the chromatography, 2.7 ml of the EAH-Sepharose with immobilized inhibitor chymostatin were filled into an HR 10/30 column housing and connected to the Purifier HPLC system.
  • Buffer 1 0.1 M acetic acid, 50 mM NaCl, pH 4
  • Buffer 2 0.1 M Tris, 50 mM NaCl, pH 8
  • the column was equilibrated with buffer A (50 mM HEPES, 50 mM NaCl, pH 8) at a flow of 0.7 ml / min.
  • the concentrated sample (500 ⁇ l of fraction 1.3 from cation exchange chromatography) was taken up in 500 ⁇ l of buffer A and applied to the column at a flow rate of 0.7 ml / min.
  • the sample elution was carried out at a gradient of 0% to 75% buffer B (50 mM phosphate buffer, pH 4) in 30 minutes and another 30 minutes to 100% buffer B. Fractions of 1 ml were collected during the chromatography. Significant UV absorption at 280nm was seen only in the breakthrough, which was then checked for Ull-generating activity.
  • 10 ⁇ l of the breakthrough were immobilized on 30 ⁇ l Sepharose (see Example 1). After substrate incubation, the samples were measured by mass spectrometry (see Example 1).
  • the active fraction from the affinity chromatography designated 1.4, was concentrated via a 10 kDa filter to a volume of 100 ⁇ l.
  • the sample was dissolved in 100 ⁇ l buffer A (50 mM Phosphate buffer, 15 mM NaCl, pH 7).
  • the gel filtration column Superdex 200 HR 10/30 was connected to the HPLC Purifier.
  • the sample was applied at a flow of 250 ⁇ l / min.
  • the chromatography was carried out with buffer A. 1ml fractions were collected. Fractions with a marked UV absorbance at 280 nm were immobilized and tested for UCE activity (result see FIG. 5).
  • a Mascot database query could be made.
  • the database query identified a protease, the human complement factor I (EC number: 3.4.21.45).
  • a total of 9 peptides with the following AS sequences (SEQ ID NO 4-12): VFSLQWGEVK, AQLGDLPWQVAIK, GLETSLAECTFTK, ADSPMDDFFQCVNGK, TMGYQDFADWCYTQK, YQIWTTWDWIHPDLK, EANVACLDLGFQQGADTQR,
  • VANYFDWISYHVGRPFISQYNV, DASGITCGGIYIGGCWILTAAHCLR are identified at a significant score of 392. Sequence coverage for complement factor I was 25%. Three additional tryptic digested fractions 1.5A, 1.5C and 1.5D from size exclusion chromatography ( Figure 16) were analyzed by LC-ESI-MS / MS. In none of these samples could a protease be identified.
  • factor I was searched for a commercial preparation of the complement.
  • a human plasma purified preparation was offered by Sigma. Since this preparation should be used as a positive control for further characterization experiments, it had to be ensured that no further proteases that could falsify the results are present. For this, part of the preparation was tryptically digested and identified with the LC-ESI-MS / MS.
  • the database query revealed that one of Score 998 was the first to identify the human factor I factor.
  • the following peptides have been identified: FSVSLK, TMFICK, IVIEYVDR, VFCQPWQR, SFPTYCQQK, RIVIEYVDR, VFSLQWGEVK, GLETSLAECTFTK, RAQ LG DLPWQVAI K, ADSPMDDFFQCVNGK, TMGYQDFADWCYTQK, YQIWTTWDWIHPDLK, RTMGYQDFADWCYTQK, EANVACLDLGFQQGADTQR, ACDGINDCGDQSDELCCK,
  • complement factor I The sequence coverage for the complement factor I was 34%. In addition to complement factor I, albumin could still be identified in the preparation. Since there was no indication of another protease in the commercial preparation, this preparation could be used as a positive control for characterization experiments.
  • Fig. 8 shows the results of the fluorescence assay.
  • Fraction 1.5B (b) and the complement factor I of the commercial preparation (c) show a conversion of the fluorescence substrate Boc-Asp (Obzl) -Pro-Arg-AMC from an incubation time of 4.5 h and she reaches a plateau after 13h.
  • the fluorescence assay shows that a proteolytic activity is present in the 1st SB fraction as well as in the commercial complement Factor I preparation, which converts the fluorescence substrate Boc-Asp (Obzl) -Pro-Arg-AMC.
  • complement factor I is a mannose-type glycoprotein. Using coupled GNA-lectin filtration columns, it was investigated whether the 1.5B fraction binds to these GNA-lectin columns. As a comparison, the commercial complement factor I preparation was used.
  • complement factor I is a serine protease.
  • the Ull-generating activity in both fractions can be inhibited with the serine protease inhibitor aprotinin.
  • Figure 11 when incubated with aprotinin, shows complete inhibition of UCE activity of the 1st SB fraction and of the commercial complement Factor I preparation. There are no Uli signals and none of possible intermediates (R-UII and KR-Uli). However, a peptide with the mass 1801.8 Da (labeled X in the spectrum) could be found. This mass corresponds to the KKR-UII peptide (Table), which is shortened by 6 amino acids from the N-terminus of UCE-S. This could be due to a proteolytic contamination in the commercial aprotinin preparation, since the aprotinin was purified from the bovine lung and may contain accompanying proteins.
  • Tsiftsoglou et al. was able to show that the complement factor I completely inhibited with Pefabloc SC (also called AEBSF). Previous inhibition experiments (item 3.2.7) have shown that the 1.5B fraction could not be completely inhibited by Pefabloc SC. The reason for this could be the concentration of the inhibitor used. Subsequently, Tsiftsoglou et al. indicated Pefabloc SC concentration used for the inhibition attempt.
  • Fig. 10 shows the results of the inhibition experiment with Pefabloc SC.
  • both fractions in both the 1.5B fraction and the commercial complement Factor I preparation no Ull-generating activity or the generation of further UCE-S products was observed after 24 hours of incubation.
  • 2x30 ⁇ l (0.1 mg / ml) was taken up in 500 ⁇ l each of the corresponding binding buffer.
  • 2x3 ⁇ l (1 mg / ml) were taken from the commercial preparation of the complement factor I and made up to 30 ⁇ l with water and then mixed with 500 ⁇ l of the appropriate binding buffer.
  • the samples taken in buffer were pipetted to the appropriate fraction columns and centrifuged for 2 min at 500 rpm. 100 ⁇ l of the flow was immobilized on 50 ⁇ l sepharose beads and the remainder was discarded.
  • the lectin columns were washed 3 times with the respective binding buffer, centrifuged for 2 min at 500 rpm, and the flow discarded.
  • Characterization experiments of the 1st SB fraction and the commercial complement Factor I preparation with the serine protease inhibitors aprotinin and Pefabloc SC were prepared 4x30 ⁇ l Sepharosebeads. In each case 2x30 ⁇ l of a 0.1 mg / ml 1.5B fraction and the commercial complement factor I preparation were immobilized on Sephaosebeads.
  • the 27 ⁇ l of a 10 "5 M UCE-S solution were each mixed with 3 ⁇ l of a 10 ⁇ m aprotinin solution and 2.5 mM of a Pefabloc SC solution and added to the respective immobilized proteins , 5 h, 3.5 h, 5.5 h and 24 h, after which the removed aliquots were measured by mass spectrometry (see Example 1).
  • the Sigma-Aldrich CFI fraction was analyzed by 2D polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE) (see Figure 12).
  • the Coomassie-stained polyacylamide gel shows two rows of beaded proteins. From each of these rows, each 2 Gel consultancychen were punched out. The proteins in the gel pieces were digested with trypsin. The tryptic peptides were analyzed by a MALDI-TOF measurement. The identification of the proteins was carried out via a combination of a peptide mass fingerprint and a
  • Fig. 16 shows the amino acid sequence of the complement factor I precursor.
  • the arrows mark the end of the N-terminal heavy chain (black) and the beginning of the C-terminal light chain (bold gray).
  • the identified peptides of the analyzed spots 1 to 4 were marked in bold gray.
  • the sequence coverage is approximately 60%.
  • the proteins of spots 1 and 2 are from the heavy chain of CFI, the proteins from spots 3 and 4 from the light chain. These results are consistent with those of 2D PAGE, as the proteins of spots 3 and 4 continued to run on the polyacrylamide gel and thus should be lighter than those of spots 1 and 2.
  • the appearance of several spots in the 2D gel, where proteins identical amino acid sequence indicates the existence of several CFI protein species. Presumably these are different protein species with different glycosylation. The appearance of this protein species is discussed in detail by Tsiftsoglou et al. (Biochim Biophys Acta, 1764 (2006) 1757-66). On the Coomassie-stained gel, no further protein spots outside the protein species regions of the CFI are recognizable, so that a largely homogeneous protein fraction can be assumed.
  • the reaction products of the incubations were desalted with a reversed-phase chromatography, separated and used to detect the peptides Uli, UCE-S, C3b and C3b-R via a multiple-reaction-monitoring (MRM) analysis with an electrospray ionization ion trap.
  • MRM multiple-reaction-monitoring
  • ESI-IT-MS Mass spectrometer
  • the MRM assay involves the isolation of a parent, its subsequent fragmentation, and the detection of a defined fragment ion.
  • the values for the signal intensities were measured at intervals of two seconds.
  • the signal intensities depend on the number of molecules that make up the detector to reach.
  • the measurement points of the signal intensities recorded as a function of time were extrapolated to a chromatogram. For relative quantification of the measured peptides, the areas of the signals of the chromatograms were integrated.
  • the synthesized peptide Uli (molar mass: 1388.6 Da, amino acid sequence: ETPDCFWKYCV) was dissolved in 0.2% formic acid.
  • a 10 "5 M solution of the peptide was first injected via a Hamilton syringe pump at a flow rate of 3 ⁇ l / min into the mass spectrometer electrospray chamber.
  • a mass-charge ratio of 695 was identified as the signal with the highest signal intensity.
  • the parameters of the mass spectrometric measurement were optimized to this mass-charge ratio.
  • Parameters of the device setting for the measurement of the peptide Uli temperature at the transfer capillary320 0 C; Spray voltage 5 kV
  • the peak of the parent ion (mass window: 4.0 m / z units) was isolated in the ion trap and fragmented to give a collision energy of 50%.
  • the fragmenting signal with the highest signal intensity had a m / z value of 579.7 and was charged twice.
  • the flow rate was constant at 0.3 ml / min.
  • the mass spectrometric MRM analysis of the chromatographic run was done in one segment, taking into account the parameters determined as described above.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Urotensin-2-konvertierenden Enzymaktivitäten sowie von Inhibitoren dieser Enzymaktivitäten. Eine Proteinfraktion wird durch einen oder mehrere Chromatographieschritte, davon mindestens einer eine Affinitätschromatographie, in Fraktionen aufgetrennt. Die Urotensin-2-konvertierenden Enzymaktivitäten der getrennten Fraktionen werden bestimmt, und eine Fraktion mit Urotensin-2-konvertierender Aktivität wird in einem Verfahren zur Identifizierung von Modulatoren von Urotensin-2-konvertierenden Enzymaktivitäten eingesetzt. Bei einem solchen Verfahren wird eine chemische Verbindung einer Proteinzubereitung mit Urotensin-2-konvertierender Aktivität zugesetzt und die resultierende Urotensin-2-konvertierende Aktivität wird gemessen. Insbesondere offenbart die Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von Urotensin-2-konvertierenden Enzymaktivitäten, bei dem Komplementfaktor I oder eine Mischung von Komplementfaktor I und H als Urotensin-2-konvertierendes Enzym eingesetzt wird.

Description

Verfahren zur Identifizierung von Urotensin-2-Konvertase-lnhibitoren
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Urotensin-2-Konvertase- Inhibitoren gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.
Urotensin-2 (Uli, U-2) ist ein kardiovaskulär aktives Neuropeptid, welches in Säugetieren und Fischen gefunden wurde. Das humane Urotensin-2 ist ein zyklisches Undekapetid. Je nach Spezies und Wirkort bzw. -Gewebe kann Uli sowohl gefäßverengend als auch gefäßerweiternd wirken. Physiologisch wird Uli, wie die meisten als Gewebshormone aktiven Peptidhormone, aus einem größeren Präpropeptid durch proteolytische Spaltung freigesetzt und aktiviert. Die daran beteiligten Enzyme werden gemeinhin als „Konvertasen" bezeichnet. Bei Menschen sind Prepropeptide von 124 und 139 Aminosäuren Länge bekannt, welche beide identisches Uli hervorbringen.
Es ist bekannt, dass das Präprohormon Pro-Uli Schnittstellen für die Proteasen Furin und Trypsin enthält. Ebenso wurde in Experimenten in-vitro gefunden, dass Inhibitoren dieser Proteasen die Bildung von Uli inhibieren (J Pharmacol Exp Ther. 2004 Jul;310(1):209-14); eine Zuordnung dieser Aktivitäten zu konkreten Proteinen erfolgte aber nicht. Nach unserem Wissen ist das oder sind die physiologischen Urotensin-2- konvertierenden Enzyme (UCE) nicht bekannt. Die Begriffe Urotensin-2-Konvertase und Urotensin-2-konvertierendes Enzym werden im Rahmen dieser Erfindung synonym verwendet.
Eine erhöhte Expression von Uli sowie dem Uli-Rezeptor wurde in Tiermodellen des induzierten Myokardinfarkts und des Herzversagens beobachtet. In der Klinik wurde bei menschlichen Patienten ebenfalls eine Assoziation von erhöhter Uli-Expression mit Herzinfarkt, Herzversagen, erhöhtem Blutdruck, Artherosklerose und diabetischer Nephropathie nachgewiesen (Khan et al., Int J Cardiol. 2006 Aug 1 ; Zhu et al., Br J Pharmacol. 2006 Aug;148(7):884-901).
Urotensin-2 wird als Mittler zwischen den Mechanismen, welche für die Entstehung von Bluthochdruck einerseits und Koronarerkrankungen andererseits verantwortlich sind, bezeichnet (Watanabe et al., Hypertens Res. 2006 Jun; 29(6):375-87). Angesichts der enormen Bedeutung dieser beiden Krankheitskomplexe liegt es auf der Hand, dass eine pharmazeutische Modulation der Aktivität des Urotensin-2 von erheblichem medizinischen Nutzen sein könnte. Ebenfalls in Betracht für eine solche pharmazeutische Intervention kommt das vor Uli in dessen Syntheseweg stehende Enzym, UCE, welches Urotensin-2 aus dem Vorläuferpeptid aktiviert. Unter anderem könnte ein Inhibitor für Urotensin-2-Konvertase als Kandidat zur Behandlung von Bluthochdruck eingesetzt werden.
Insofern sind Verfahren und Mittel wünschenswert, die es erlauben, Verbindungen zu identifizieren, welche die Aktivität von UCE verändern.
Eine wesentliche Voraussetzung dafür ist die molekulare Identifizierung des vorstehend als UCE bezeichneten Enzyms, welches im Menschen das Vorläuferpeptid zu aktivem Urotensin-2 umwandelt.
Eine große Zahl von Proteasen ist bekannt. Häufig wirken Proteasen in Kaskaden, das bedeutet, dass eine erste Protease durch ein physiologisches Signal aktiviert wird und sich selbst autokatalytisch spaltet, worauf ein freigesetztes Spaltprodukt ein zweites Glied in der Kaskadenkette durch Proteolyse aktiviert, und so fort. Eine solche Proteasekaskade ist das Komplementsystem, das eine wichtige Komponente der sogenannten angeborenen Immunität darstellt. Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es somit, Verfahren und Mittel zur Verfügung zu stellen, die es ermöglichen, die physiologisch wirksame Komponente Urotensin-2-Konvertase, welche Urotensin-2-Vorläuferpeptide in Urotensin umwandelt, zu identifizieren und zu isolieren. Weiterhin ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, geeignete Verfahren zur Ermittlung von Aktivitäten zur Modulation von Urotensin-2- Konvertase (UCE-Aktivitäten) zu finden.
Gelöst wird diese Aufgabe durch die Verfahren der Hauptansprüche.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur Verfügung gestellt, mit dem ein Protein bestimmt werden kann, welches Urotensin-2-Konvertase-Aktivität aufweist. Dabei wird in einem Reinigungsschritt eine aus einem Säugetier entnommene, proteinhaltige Probe durch einen oder mehrere chromatographische Schritte in mehrere Fraktionen aufgetrennt. Die Urotensin-2-Konvertase-Aktivität der einzelnen Fraktionen wird nach mindestens einem chromatographischen Schritt bestimmt und eine Fraktion, welche Urotensin-2-Konvertase-Aktivität enthält, wird isoliert. Anschließend wird mindestens eine im Reinigungsschritt erhaltene Urotensin-2- Konvertase-Aktivität enthaltende Fraktion einem unvollständigen proteolytischen Verdau ausgesetzt, die durch unvollständigen proteolytischen Verdau entstandenen Fragmente werden mittels Massenspektrometrie hinsichtlich ihrer Aminosäuresequenz analysiert und zumindest einer Peptidsequenz zugeordnet, und die Peptidsequenz durch Datenbankabgleich wird einem in einem Säugetier exprimierten Protein zugeordnet.
Der Reinigungsschritt umfasst eine Affinitätschromatographie, bei welcher eine Proteinprobe, welche Urotensin-2-Konvertase-Aktivität enthält, durch reversible Bindung an einer festen Phase, an die ein Inhibitor der Urotensin-2-Konvertase- Aktivität gebunden ist, und anschließende Elution in Fraktionen aufgeteilt wird.
Zusammenfassend beruht die Identifizierung von Verbindungen, welche Proteine mit Urotensin-2-Konvertase-Aktivität hemmen können, gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung auf den folgenden Schritten: zunächst wird ein Protein mit Urotensin-2-Konvertase-Aktivität durch Chromatographie aufgereinigt, und in einem zweiten Schritt wird das gereinigte Protein auf seine Aktivität in Anwesenheit der zu untersuchenden Verbindungen getestet. Ob eine Verbindung ein Inhibitor der Urotensin-2-Konvertase-Aktivität ist, kann durch Vergleich der Aktivität im Assay mit einer Kontrolle, einem Standard oder auf anderem Wege festgestellt werden.
Eine schematische Darstellung dieses Verfahrens ist in Fig. 1 dargestellt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann alternativ zunächst ein Protein mit Urotensin-2-Konvertase-Aktivität durch Chromatographie aufgereinigt und seine UCE-Aktivität verifiziert werden. Anschließend wird die Identität des Proteins durch Sequenzierung festgestellt, um es dann in rekombinanter Form herzustellen und gereinigt in Anwesenheit der zu untersuchenden Verbindungen auf seine Aktivität zu testen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung werden chemische Verbindungen, welche die Urotensin-2-Konvertase-Aktivität eines Proteins regulieren, identifiziert. Dazu werden chemische Verbindungen unter physiologischen Bedingungen mit Komplementfaktor I gemischt und die Urotensin-2-Konvertase-Aktivität der Mischung bestimmt wird.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung werden chemische Verbindungen, welche die Urotensin-2-Konvertase-Aktivität eines Proteins regulieren, identifiziert, indem chemische Verbindungen unter physiologischen Bedingungen mit Komplementfaktor I und Komplementfaktor H gemischt werden, und die Urotensin-2- Konvertase-Aktivität der Mischung bestimmt wird.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur
Identifizierung von chemischen Verbindungen, welche die Urotensin-2-Konvertase- Aktivität eines Proteins regulieren, zur Verfügung gestellt, bei welchem in einem Reinigungsschritt ein Protein, welches Urotensin-2-Konvertase-Aktivität aufweist, aufgereinigt wird, indem eine aus einem Säugetier entnommene, proteinhaltige Probe durch mehrere chromatographische Schritte in mehrere Fraktionen aufgetrennt wird, die Urotensin-2-Konvertase-Aktivität der einzelnen Fraktionen nach mindestens einem chromatographischen Schritt bestimmt wird, eine Fraktion, welche Urotensin-2- Konvertase-Aktivität enthält, isoliert wird, und anschließend diese isolierte Fraktion in einem Aktivitäts-Assay-Schritt mit einer chemischen Verbindung unter physiologischen Bedingungen gemischt und die Urotensin-2-Konvertase-Aktivität der Mischung bestimmt wird. Der Reinigungsschritt umfasst dabei eine Affinitätschromatographie, bei welcher eine Proteinprobe, welche Urotensin-2-Konvertase-Aktivität enthält, durch reversible Bindung an einer festen Phase, an die ein Inhibitor der Urotensin-2-Konvertase- Aktivität gebunden ist, und anschließende Elution in Fraktionen aufgeteilt wird. Zur Bestimmung der Urotensin-2-Konvertase-Aktivität der Fraktionen wird dabei ein geeignetes Messsystem, beispielsweise das Massenspektrometrie-gestützte Enzym- Screening, verwendet.
Bevorzugt ist Chymostatin der Inhibitor der Urotensin-2-Konvertase-Aktivität.
Ausgangspunkt der Identifizierung und Isolierung der UCE-Aktivität ist die Untersuchung von menschlichem Blutplasma. Alternativ können auch andere, dem Fachmann zugängliche Gewebe herangezogen werden.
Blutplasma kann in verschiedene sogenannte Cohn-Fraktionen aufgeteilt werden. Es wurde in den Beispielen der vorliegenden Erfindung mit der Cohn-IV-Fraktion gearbeitet.
Die Aufreinigung durch Chromatographie erfolgt durch eine Kombination von verschiedenen Chromatographieschritten, und zwar durch Kombination von Anionen-, hydrophober Interaktions- und Kationenchromatographie mit Affinitätschromatographie.
Für den Nachweis einer Enzymaktivität, welche Uli aus einem Vorläufermolekül zu generieren vermag und welche im weiteren mit UCE-Aktivität bezeichnet wird, wird ein geeignetes Substrat eingesetzt, welches zum einen eine Schnittstelle für das UCE besitzt und zum anderen zwei Cysteine, die über eine Disulfidbrücke verbunden sind und ein zyklisches Peptid bilden können. Ein Beispiel dafür stellt die Teilsequenz von 21 Aminosäuren des natürlich vorkommenden Präpro-Ull dar (SEQ ID NO 02).
Das zur Analyse der UCE-Aktivität verwendete Nachweissystem war das sog. Massenspektrometrie-gestützte Enzym-Screening (MES) (Schlüter, Anal Bioanal Chem. 2003 Dec; 377(7-8): 1102-7).
Die Identifizierung der optimalen Chromatographieparameter erfolgt vorteilhafterweise mit dem Proteinreinigungs-Parameter-Suchsystem („Protein Purification Parameter
Screening System", PPS). PPS ist eine Methode zur Bestimmung optimaler Parameter für Chromatographiesysteme, bei welchem ein Parameterraum, bestehend z.B. aus lonenstärke oder pH der mobilen Phase sowie verschiedenen stationären Phasen systematisch nach optimalen Reaktionsparameterkombinationen abgesucht wird (Thiemann et al., J Chromatogr A. 2004 Ju1 16;1043(1):73-80) (siehe Beispiel 2).
Es werden zu Beginn einer jeden Chromatographie Experimente durchgeführt, mit denen unterschiedliche Parameter auf ihre Eignung für die Reinigung des UCE überprüft werden können. Ein Beispiel für die Durchführung der Optimierung und ihre Ergebnisse ist Beispiel 2 zu entnehmen. Die aus den PPS-Experimenten erhaltenen Parametersätze werden anschließend auf die Säulenchromatographie übertragen.
Durch drei Flüssigkeitschromatographische Schritte sowie einen weiteren Affinitätschromatographieschritt wird eine UCE-Aktivität enthaltende Proteinpräparation erhalten. Für den Schritt der Affinitätschromatographie wird eine oder mehrere Verbindungen, welche die UCE-Aktivität einer Probe inhibieren, an eine feste Phase gebunden.
Weiterhin ist eine Identifizierung des gereinigten Proteins durch die nachfolgende Analyse der aufgereinigten Proteine vorgesehen. Vorteilhafterweise erfolgt diese durch Massenspektrometrie, insbesondere durch Flüssigkeitschromatographie-gekoppelte Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (LC-ESI MS/MS).
Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden zur Reinigung der Plasmafraktion zum Zwecke des UCE-Aktivitätsassays vier Chromatographien durchgeführt, eine Sample-Displacement Anionenaustauschchromatographie mit einer stationären Aminoethylphase und einem Ladungspuffer von pH 7, eine auf dem Prinzip der hydrophoben Interaktion beruhende Chromatographie mit der festen Phase t-Butyl-MacroPrep-Gel mit einem Probenauftragspuffer bei pH 5, und eine Kationenaustauschchromatographie mit einer stationären Phase UnosphereS-Gel bei einem pH-Wert von 5, sowie eine anschließende Affinitätschromatographie mit Chymostatin. Die zusammengefassten Fraktionen mit der höchsten UCE-Aktivität werden für den nachfolgenden Aktivitätsassay über einen 10 kDa Filter eingeengt.
Für die folgende Affinitätschromatographie wird Chymostatin an die feste Phase EAH-
Sepharose mittels EDC-Linker kovalent gebunden (siehe Beispiel 4). Das Affinitätsgel wird anschließend für die Säulen-Affinitäts-Chromatographie eingesetzt. Das Eluat wird durch Größenausschluß-Gelseparation getrennt, tryptisch verdaut anschließend mittels LC-ESI-MS/MS identifiziert (siehe Beispiel 5).
Es kann mit der wie vorstehend beschrieben isolierten UCE-Aktivität enthaltenden Proteinpräparation ein Assay durchgeführt werden, der die Eignung verschiedener chemischer Verbindungen zur Modulation, insbesondere zur Inhibition, der UCE- Aktivität untersucht. Als chemische Verbindung im Sinne dieser Erfindung werden niedermolekulare Verbindungen, Peptide und Proteine mit oder ohne kovalente Modifikationen durch nicht in den klassischen Proteine bildenden Aminosäuren enthaltene Gruppen sowie Polymere und Gemische der vorgenannten Verbindungen verstanden. Zur Illustration dieses Prinzips wird im Beispiel 3 ein Experiment zur Untersuchung der Verbindungen L-trans-epoxysuccinyl-leucyl amido(4- guanidino)butan (E64), lsovaleryl-Val-Val-4-amino-3-hydroxy-6-methylheptanoyl-Ala-4- amino-3-hydroxy-6-methylheptansäure (Pepstatin A), Ethyldiamintetraessigsäure, ([(2S, 3R)-3-Amino-2-hydroxy-4-phenylbutanoyl]-L-leucin) (Bestatin), [(S)-I -Carboxy-2- phenylethyl]-carbamoyl-a-[2-amidohexahydro-4(S)-pyrimidyl]-(S)-glycyl-[A = Leu; B = VaI; oder C = lle]-phenylalaninal (Chymostatin) und 4-(2-
Aminoethyl) benzensulfonylfluorid hydrochlorid (AEBSF) gezeigt. Die Bestimmung der modulierenden Wirkung der zu untersuchenden Substanz kann direkt oder durch Vergleich mit einem Standard erfolgen. Das Ergebnis eines solchen Verfahrens ist in Fig. 6 dargestellt.
Mit Hilfe eines bioinformatorischen Datenverarbeitungsprogramms kann in der Folge das in der UCE-Aktivität enthaltenden Probe vorliegende Protein identifiziert werden (siehe Beispiel 5). Im vorliegenden Beispiel wurde der humane Komplement Faktor I (EC-Nummer: 3.4.21.45) identifiziert.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ebenfalls ein durch Reinigung und nachfolgende Charakterisierung identifiziertes Protein in einer durch ein anderes Verfahren gereinigten Form oder in rekombinanter Form als Substrat in einem Verfahren zur Identifizierung von Hemmstoffen der UCE-Aktivität eingesetzt werden. Zur Verifikation der Identität des aufgereinigten und charakterisierten Proteins mit der durch ein anderes Verfahren gereinigten oder rekombinanten Form zur Verfügung gestellten Form wird zunächst ein massenspektrometrischer Vergleich der durch Verdau entstehenden Peptidfragmente der jeweiligen Proteine vorgenommen, so gezeigt im Beispiel 5 für den Komplement-Faktor I. Untersuchungen zur Hemmung der UCE-Aktivität einer kommerziell erworbenen Komplement-Faktor-I-Präparation können zur Identifizierung von potentiellen UCE- Modulatoren (siehe Beispiel 6) eingesetzt werden. Ebenso sind Proteine einsetzbar, die eine mit Komplement-Faktor I oder einer mit der unter der Zugangsnummer P05156 in der Proteindatenbank Swissprot abgelegten Proteinsequenz zu mindestens 60%, vorzugsweise zu mindestens 70%, weiter bevorzugt zu mindestens 80%, noch weiter bevorzugt zu mindestens 90% homologe Sequenz, sowie eine dem Komplementfaktor I homologe Aktivität aufweisen.
Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Figuren der Zeichnungen an mehreren Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 eine schematische Darstellung des Verfahrens zur Identifizierung von Urotensin-2-Konvertase-lnhibitoren.
Fig. 2 Ergebnisse der relativen Molekulargewichtsbestimmung des UCE mittels Zentrifugenfilter unterschiedlicher Ausschlussgrößen. X-Achse: Filtrate und Retentate der Filter mit den unterschiedlichen Ausschlussgrößen. Y-Achse:
UCE-Aktivität.
Fig. 3 Ergebnisse der Suche nach einer UCE-Aktivität in unterschiedlichen humanen Plasma-Cohn-Fraktionen. Unterschiedliche Cohn-Fraktionen aus humanem Plasma wurden an Affinitätsbeads immobilisiert und mittels MES- Assay die UCE-Aktivität bestimmt. X-Achse: unterschiedliche Cohn-
Fraktionen aus humanem Plasma. Y-Achse: UCE-Aktivität.
Fig. 4 ein typisches Massenspektrum der Reaktionsprodukte aus der Inkubation einer Plasma-Cohn-IV-Fraktion mit UCE-S: MALDI-Spektren der Inkubationsreihe mit UCE-Substrat (UCE-S) und den gebildeten Reaktionsprodukten nach Immobilisierung einer humanen Plasmafraktion
(Cohn-IV-Fraktion) nach unterschiedlichen Inkubationszeitpunkten. Uli: 1389.56 Da, R-UII=Arg-UII: 1545.66 Da, KR-UII=Lys-Arg-UII: 1673.75 Da, UCE-S: 2645.3 Da, NΛVerunreinigung: 2230.95 Da
Fig. 5 ein Chromatogramm der Größenausschluss-Chromatographie der UCE- Aktivität der Fraktion 1.4 aus der Affinitätschromatographie.
Probenvolumen: 200μl. Säule: Superdex 200HR 10/30. Puffer A: 5OmM Phosphatpuffer in 15OmM NaCI; pH 7. Flußrate: 250μl/min. X-Achse: Retentionsvolumen [ml]. Y-Primärachse: Absorption bei 280nm.
Fig. 6 die Ergebnisse der Inhibitionstests der UCE-aktiven Fraktionen 1.3 aus der Kationenaustausch-Chromatographie. Probenvolumen: 50μl. Inhibitorenkonzentrationen: 10μM E64, 10μM Pepstatin A, 1mM EDTA,
100μM Bestatin, 10μM Chymostatin und 1mM AEBSF
Fig. 7 MES-Assay für den Nachweis der Ull-generierenden Aktivität des Komplement Faktor I (A) und der gereinigten Fraktion 1.5B (B) aus einer humanen Cohn IV-Fraktion: MALDI-Spektren der Inkubation mit UCE-S und den gebildeten Reaktionsprodukten nach Immobilisierung der kommerziellen Präparation des Komplement Faktor I und der gereinigten Fraktion 1.5B einer CohnIV-Fraktion aus humanem Plasma nach einer Inkubationszeit von 7h. Uli: 1389.56 Da, R-UII: 1545.66 Da, KR-UII: 1673.75 Da, UCE-S: 2645.3 Da, V: Verunreinigung: 2230.95 Da Fig. 8 Fluoreszenzassay zum Nachweis einer proteolytischen Aktivität der Fraktion 1.5B aus der Gelfiltration (b) und einer gekauften Komplement Faktor I - Fraktion (c).
Fig. 9 MALDI-Spektren der Glykoproteincharakterisierung mittels Mannose- Glykoprotein Kit mit immobilisierten GNA (Schneeglöckchen Lektin) der Fraktion 1.5B und der kommerziellen Komplement Faktor I-Fraktion. A:
Eluat der 1.5B-Fraktion B: Eluat des Komplement Faktor I. C: Überstand der 1. SB-Fraktion. D: Überstand des Komplement Faktor I.
Fig. 10 MALDI-Spektren der der Reaktionsprodukte nach Inkubation mit UCE-S und Pefabloc SC nach 24h Inkubation. A (oben): immobilisierte 1.5B-Fraktion. B (unten): immobilisierte Komplement Faktor I-Präparation. UCE-S: 2645.3
Da. V=Verunreinigung: 2230.95 Da. X=Peptid Lys-Lys-Arg-Ull 1801.8 Da. Fig. 11 MALDI-Spektren der Reaktionsprodukte nach Inkubation mit UCE-S und Aprotinin nach 24h Inkubation. A: immobilisierte 1.5B-Fraktion. B: immobilisierte Komplement Faktor I-Präparation. UCE-S: 2645.3 Da. V=Verunreinigung: 2230.95 Da. X=Peptid Lys-Lys-Arg-Ull 1801.8 Da.
Fig. 12 Coomassie-gefärbte 2D-PAGE einer kommerziellen CFI-Fraktion. Die markierten Gelbereiche 1 bis 4 wurden ausgestochen und die enthaltenen Proteine über eine massenspektrometrische Analyse der tryptischen Peptide identifiziert.
Fig. 13 UCE-Aktivität einer CFI-Präparation: Relative Intensitäten des MRM-Signals des Hydrolyseprodukts Uli in Abhängigkeit der Zeit nach Inkubation von immobilisiertem CFI mit einer 10"4 M UCE-S-Lösung. Kontrolle: Glycin- derivatisierte Chromatographiepartikel.
Fig. 14 UCE Aktivitäten von CFI in Ab- und Anwesenheit vom Komplementfaktor H. MRM-Signalintensitäten von Uli in Abhängigkeit der Zeit nach Inkubation von immobilisiertem CFI mit einer 10"4 M UCE-S-Lösung (CFI Uli), einer 10" 4 M C3b-Lösung und 5 μg FH (CFI FH Uli), Kontrollen: Glycin-derivatisierte Chromatographiepartikel inkubiert mit UCE-S (K Uli) und Glycin- derivatisierte Chromatographiepartikel inkubiert mit UCE-S und FH (K FH Uli).
Fig. 15 eine MALDI-MES-Analyse der Reaktionsprodukte der Inkubation der gereinigten Fraktion 5 (A) und der kommerziellen Komplement Faktor I-
Präparation (B) mit U2S in Gegenwart des Serinprotease-Inhibitors Pefabloc SC nach 24h Inkubation. UCE-S: 2645.3 Da. V=Verunreinigung:
2230.9 Da. X=Peptid Lys-Lys-Arg-Ull 1801.8 Da.
Fig. 16 Ergebnis der Identifizierung der gemäß Beispiel 7 markierten Proteine. Die
Signalsequenz (AS 1 bis 18) ist grau markiert. Der schwarze Pfeil zeigt das Ende der N-terminalen schweren Kette, der graue Pfeil den Anfang der C- terminalen leichten Kette an. Fett grau markiert sind die im
Datenbankabgleich identifizierten Peptide der Spots 1 bis 4.
Beispiele
Generelle Informationen zu Materialien und Methoden:
Verwendete Chromatographiematerialien: Butyl-650-Gel, Buthyl-Sepharose (GE Healthcare), DEAE-650M-Gel (Tosoh), EAH-Sepharose (GE Healthcare), Ether-650- Gel, Fractogel COO" (Merck), Fractogel DEΞAE (Merck), Fractogel SO 3 (Merck), Fractogel TMAE (Merck), Methyl MacroPrep-Gel (Biorad), Phenyl-650-Gel (Tosoh), Phenyl-Sepharose (GE Healthcare), QAE-550C-Gel (Tosoh), Q-Sepharose FF (GE Healthcare), Sepharose 6MB (GE Healthcare), SP-Sepharose FF (GE Healthcare), SuperQ-650M-Gel (Tosoh), t-Butyl MacroPrep-Gel (Biorad), Toyopearl CM-650M-Gel (Tosoh), Unosphere S-GeI (Biorad), Unosphere Q-GeI (Biorad),
Verwendete Säulengehäuse für die Säulenchromatographien
Die Reinigung des UCE-Substrats wurde mit der 5 RPC-Säule 4.1x150 mit Stahlgehäuse durchgeführt. Für die Hydrophobe Interaktionschromatographie wurde mit das XK-Säulengehäuse der Firma GE Healthcare eingesetzt. Für die Kationenaustauschchromatographie wurde mit der vorgepackten S6-Säule mit Unosphere S-GeI der Firma Biorad gearbeitet. Für die Affinitätschromatographie wurde das HR 10/30 Säulengehäuse der Firma GE Healthcare verwendet und für die Größenausschlußchromatographie mit der Superdex 200HR 10/30 von GE Healthcare chromatographiert.
Geräte
Für den MES-Assay wurde das Massenspektrometer Reflex III MALDI-TOF der Firma Bruker benutzt. Aliqouts der Inkubationsansätze aus dem MES-Assay wurden auf den MTP AnchorChip 384/400 von Bruker pipettiert. Die Immobilisierung der Proben erfolge auf dem Überschlagsrotor Rotator Drive STR4 von Stuart Scientific. Für die Substratinkubation wurde der Schüttler von Fisher Bioblock Scientific verwendet. Die Chromatographien wurden an den HPLC Anlagen (Explorer und Purifier) von der Firma GE Healthcare durchgeführt. Die PPS-Experimente wurden mit dem Genesis Freedom 200 der Firma Tecan durchgeführt. Für die mit dem Dispenser Multidrop DW der Firma Thermo Electron befüllten Pufferplatten für die PPS-Experimente wurden 1 ,2 ml Storage DeepWell Platten der Firma ABGene verwendet. Für den MES-Assay wurden 500μl Eppendorfgefäße und Microtestplatten 96WeII K der Firma Sarstedt benutzt. Die pH-Werte wurden mit der lnLab®422 Combination Semi-micro pH Electrode von METTLER TOLEDO gemessen. Für die Proteinbestimmung der Eluate und Überstände aus den PPS-Experimenten wurde der UV-Reader Genios der Firma Tecan eingesetzt. Alle weiteren Proteinkonzentrationen wurden mit dem Photometers iEMS Reader MF von Thermo Labsystems bestimmt. Die Einengung der Proteinfraktionen wurde in Amicon Ultra Zentrifugenfiltern der Ausschlussgrenze von 1OkDa der Firma Millipore durchgeführt und mit der Multifuge 3 S-R von Heraeus zentrifugiert. Die Vorbereitung der Proben ab der 2. Chromatographie erfolgte unter der Sterilbank LaminAir von Holten. Die Identifizierung der tryptischen Peptide erfolgte mit dem Chip-Cube-LC-ESI MS/MS der Firma Agilent.
Menschliches Blutplasma wurde als geeignete Quelle von Ausgangsmaterial für UCE- haltige Proteinproben gefunden. Fig. 2 zeigt das Ergebnis eines Ultrazentrifugationsversuches mit Filtern unterschiedlicher Ausschlussgrenzen (1OkDa, 3OkDa, 5OkDa und 10OkDa). Die erhaltenen Filtrate und Retentate wurden mit dem MES-Assay auf ihre Ull-generierende Aktivität untersucht. Im Retentat des 5OkDa- Filters ist die höchste UCE-Aktivität zu finden.
Nachfolgend wurden für eine mögliche Vorfraktionierung unterschiedliche Cohn- Fraktionen, die alle aus humanem Plasma fraktioniert wurden, auf eine UCE-Aktivität überprüft. Fig. 3 zeigt die Ergebnisse des MES-Assays auf UCE-Aktivität für unterschiedliche humane Plasma-Cohn-Fraktionen. Die Cohn-IV-Fraktion zeigt die höchste UCE-Aktivität und wurde für die weitere Reinigung des UCE verwendet.
Als Substrat des Assays zum Nachweis der UCE-Aktivität wird die Teilsequenz von 21 Aminosäuren des natürlich vorkommenden Präpro-Ull dar (SEQ ID NO 02) eingesetzt. Zur Herstellung der intramolekularen Disulfidbrücke erfolgte nach der Festphasen- gekoppelten Synthese eine Oxidation der Cysteingruppen des Peptids (Fa. Wita GmbH, D-14513 Teltow/Berlin). Dieses Peptid wird im Weiteren als UCE-S (UCE- Substrat) bezeichnet und hat die Sequenz Arg-Ile-Trp-Lys-Pro-Tyr-Lys-Lys-Arg-Glu- Thr-Pro-Asp-Cys-Phe-Trp-Lys-Tyr-Cys-Val.
Beispiel 1 : MES-Assay
Der MES-UCE-Assay basiert auf der kovalenten Immobilisierung von Proteinfraktionen an Festkörperpartikel. Die immobilisierten Proteine werden mit dem UCE-S inkubiert, nach 2h, 5h und 24h werden Proben aus dem Reaktionsgefäß abgenommen und massenspektrometrisch vermessen. Fig.4 zeigt ein typisches Massenspektrum der Reaktionsprodukte aus der Inkubation einer Plasma-Cohn-IV-Fraktion mit UCE-S. Es lässt sich die Abnahme des UCE-S und die Bildung des Uli als Funktion der Zeit verfolgen. Nach einer Inkubationszeit von 5h ist das UCE-S vollständig abgebaut. In den Massenspektren sind zwei weitere Peaks (gekennzeichnet mit KR-UII und R-UII) feststellbar, welchen anhand der von den Peaks repräsentierten Massen eine molekulare Struktur zugeordnet werden kann: R-UII besitzt ein zusätzliches Arginin und KR-UII ein Lysin und ein Arginin am N-Terminus im Vergleich mit Uli. Die Verunreinigung V kann nicht eindeutig einer Peptidsequenz zugeordnet werden. Es handelt sich hierbei um ein Peptid-Molekül, dass wahrscheinlich während der Peptidsynthese entstanden ist.
Ausgehend vom humanen Präpro-Ull wurde eine Teilsequenz RIWKPYKKRETPDCFWKYCV mit Uli- Schnittstelle synthetisiert (Wita GmbH). Das UCE-S Peptid wurde in 100 mM Ammoniumacetat; pH 7 aufgenommen, auf eine Konzentration von 0,1 mg/ml eingestellt und 48h inkubiert. Die Lösung wurde anschließend auf 0,1% TFA eingestellt und auf eine Reversed Phase Säule 5RPC 4.1x150 aufgetragen. Als mobile Phase wurde eine 0,1%ige TFA Lösung (Puffer A) und 80% ACN (Puffer B) verwendet. Die Reversed-Phase-Chromatgraphie (RPC) wurde bei einer Flussrate von 1 ml/min durchgeführt. Der Gradient verlief von 0% B auf 50% B in 40 Minuten. Es wurden Fraktionen von 10ml gesammelt. Gewonnene Peptid-Fraktionen der RPC wurden bei minus 8O0C eingefroren und anschließend in der Vakuumzentrifuge Savant SPD111V getrocknet. Auf einen MTP AnchorChip wurde 1 μl DHB-Matrix-Lösung (30mg/ml DHB in 50% ACN) aufgetragen und eingetrocknet. Die getrockneten Peptide wurden in 1000 μl destilliertem Wasser gelöst und 1 μl dieser Lösungen auf die eingetrocknete Matrix pipettiert. Nach dem Trocknen der Proben, wurden diese massenspektrometrisch vermessen. Peptid-Fraktionen die bei 2645,3 Da ein Signal mit normaler Isotopenverteilung zeigten und keine Peaks, die auf Verunreinigungen schließen lassen, aufwiesen, wurden für die weiteren Experimente verwendet.
Immobilisierung der Proteinfraktionen
Die Immobilisierung der Proteinfraktionen erfolgte an die Affinitätsbeads BrCN- aktivierte Sepharose 6MB. Für die Immobilisierung wurde eine entsprechende Menge an trockenen Beads aus dem Vorratsgefäß abgenommen und in ein Eppendorfgefäß überführt. Zum Quellen der Beads wurde ca. das 100-fache Volumen einer 1mM HCI- Lösung zugegeben und die Mischung auf einem Überschlagsrotor ca. 1h Stunde inkubiert. Von den Beads wurde die überschüssige HCI-Lösung entfernt und 3mal mit Wasser gewaschen. Für die Immobilisierung von Proteinfraktionen wurden jeweils 30μl Beads portioniert. Nach dem letzten Waschschritt wurde das Wasser entfernt und die Beads einmal mit Kopplungspuffer (10OmM NaHCO3, 50OmM NaCI, pH8,3) gewaschen. Dieser wurde anschließend von den Beads entfernt. Es wurden 30μl Proteinlösung mit 30μl Kopplungspuffers gemischt und zu den Beads pipettiert. Die Kopplung erfolgte 2h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4CC auf einem Überschlagsrotor. Nach der Kopplung wurde die Lösung von den Beads entfernt und 100μl Blockierungspuffer (10OmM NaHCO3, 50OmM NaCI, 10OmM Glycin, pH 8,3) zugegeben und 2h bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 40C auf einem Überschlagsrotor inkubiert. Nach der Blockierung wurden die immobilisierten Proteine 3mal mit Wasser gewaschen.
Inkubation der immobilisierten Proteinfraktionen mit dem UCE-Substrat
Von den Beads mit den immobilisierten Proteinfraktionen wurde das Wasser vom vorigen Waschschritt entfernt und 30μl einer 10"5M UCE-Substratlösung zugegeben. Die Inkubation erfolgte auf einem Schüttler. Auf ein MTP AnchorChip wurde 1 μl einer DHB-Matrix-Lösung pipettiert. Nach dem Eintrocknen der Matrix wurden nach definierten Zeitpunkten 3x2μl Aliquots der Reaktionsmischung abgenommen und auf den MTP AnchorChip pipettiert. Nachdem die Proben eingetrocknet waren, wurden Massenspektren der Proben aufgenommen.
Semiquantitativer Nachweis der Reaktionsprodukte mittels MALDI- Massenspektrometrie
Für den semiquantitativen Nachweis des Reaktionsproduktes Uli wurde für jedes Massenspektrum das Verhältnis der Signalintensitäten von Uli bei einem Massensignal von 1389.56 Da zu UCE-S bei einem Massensignal von 2645.3 Da gebildet. Aufgrund der n=3-Messung wurde von den 3 Proben jeweils der Mittelwert der Intensitätsverhältnisse gebildet. Die gemittelten Intensitätsverhältnisse wurden von allen Zeitpunkten zusammenaddiert und der erhaltene Wert wurde als UII- generierende Aktivität angegeben. Alle Schritte wurden mit einem Visual Basic Skript automatisch ausgeführt. Beispiel 2: Proteinreinigungs-Parameter-Suchsystem
PPS hilft, in kurzer Zeit optimale Wege zur chromatographischen Reinigung definierter Proteine zu finden. 96 und mehr verschiedene Parameter, wie pH-Werte, stabilisierende Zusätze oder Salzkonzentrationen, können auf ihre Auswirkung auf die Reinigung von Proteinen untersucht werden. Das PPS-System ist ein automatisiertes, multiparalleles System, das auf der Batch-Chromatographie basiert.
Das Verfahren umfasst sechs Schritte:
1. Zu Beginn der PPS-Experimente werden die zu testenden Chromatographie-Gele in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen eingebracht.
2. Die Probenaufgabe-Puffer-Platte, z.B. für PPS-lonenaustausch- Chromatographie- Experimente, wird hergestellt. Dazu werden auf der X-Achse einer 96er- Platte pH- Werte, auf der Y-Achse Salzkonzentrationen variiert. Dann werden die Gele mit individuellen Puffern equilibriert, indem Kopien der Puffer der Probenaufgabeplatte auf die Gelplatte überführt werden.
3. Der Probenauftrag erfolgt. Probe, Probenaufgabepuffer und Gel werden über definierte Zeitintervalle in Suspension gehalten. Anschließend sedimentiert das Gel. Die 96 Überstände werden abgenommen und quantitativ analysiert.
4. Das Gelsediment wird mehrfach gewaschen, um die nicht bindenden Moleküle von den ans Gel adsorbierten Proteinen zu entfernen.
5. Zur Freisetzung der gebundenen Proteine werden die gewaschenen Gelsedimente mit einem Elutionspuffer versetzt. Nun erfolgt die quantitative Analyse der 96 Eluate.
6. Die Resultate der Protein-Konzentrationsbestimmungen werden in einer PPS-
Ergebnismatrix dargestellt, die Angaben zur Gesamt-Protein-Konzentration, zur absoluten und zur spezifischen Ziel-Protein-Konzentration enthält. Aus der
Ergebnismatrix werden Empfehlungen zur chromatographischen Reinigung des
Zielproteins abgeleitet.
Für die Durchführung der PPS-Experimente mussten insgesamt 5 96-Deepwell-Platten vorbereitet werden. Insgesamt wurden 8 unterschiedliche Anionenaustauschergele bei 5 verschiedenen pH-Werten getestet. Daraus ergab sich eine Anzahl von 40 unterschiedlichen Parametern. Die Lösungen und Gele wurden jeweils beginnend von Position A1 bis H5 der 96-Deepwell-Platte befüllt. Für die Vorbereitung der Gelplatte wurden 10 ml der Gele Fractogel TMAE, Fractogel DEAE, SuperQ-650M, DEAE-650M, QAE-550C, Streamline DEAE1 Q-Sepharose FF und Unosphere Q abgenommen und in ein 50ml Greiner-Röhrchen überführt, mit Wasser gewaschen und anschließend mit einer 1M NaCI-Lösung konditioniert. Danach wurden die Gele 3mal mit Wasser gewaschen, in einen Messzylinder überführt und eine 1 :1 Gel-Wasser-Mischung hergestellt. Diese wurde in ein Greiner-Röhrchen überführt. Nachdem durch mehrmaligen Schwenken eine homogene Suspension entstand, wurden 20μl der Suspension in das entsprechende Well pipettiert.
Für die Herstellung der Pufferplatten wurden von jedem Puffer jeweils 50ml einer 5OmM Lösung hergestellt und auf die gewünschten pH-Werte mit NaOH bzw. HCl eingestellt. Mit Hilfe eines Dispensers wurden automatisch die Probenauftragspufferplatte und die Equilibrierungs/Waschplatte mit den gewünschten Puffern befüllt. Es kam zur Anwendung: Piperazin pH6, Bis-Tris-Propan pH7, N-Methyl- diethanolamin pH8, CHES pH9, CAPS pH10.
Die Elutionsplatte wurde mit einer 1 M NaCI-Lösung befüllt. In der Probenplatte befand sich in den Wells A1-D1 jeweils 500μl einer 1 mg/ml CohnIV-Fraktionslösung. Nach der Herstellung aller Platten für die PPS-Experimente wurden diese auf der Pipettierroboterplattform positioniert und die PPS-Experimente automatisch durchgeführt. Die Elution erfolgte 4mal mit 30μl Elutionspuffer. Die Eluate wurden dann anschließend mittels MES-UCE-Assay auf ihre UCE-Aktivität untersucht. 100μl der Eluate wurden an 30μl Sepharosebeads immobilisiert, inkubiert und die Aliquots massenspektrometrisch vermessen (siehe Beispiel 1).
Reinigung von UCE mittels Anionenaustausch-Sample Displacement Chromatographie: 600ml QAE-550C-Gel wurden abgenommen und einmal mit Wasser gewaschen und anschließend mit einer 1M NaCI-Lösung konditioniert. Das konditionierte Gel wurde dann 3mal mit Wasser gewaschen. Das gewaschene Gel wurde mit dem 5OmM bis-Tris-Propan-Puffer bei pH7 (Puffer A) equilibriert und anschließend gleichmäßig auf 10 Glasflaschen verteilt. 2g der Cohn IV-Fraktion wurden in 100ml Puffer A aufgenommen und mit dem Gel in der ersten Flasche vermischt. Nach Sedimentation des Gels wurde der Überstand abgenommen und in die zweite Flasche überführt und mit dem Gel vermischt. Dieser Vorgang wurde solange wiederholt bis alle 10 Gelaliquots mit den Überständen der vorigen Chromatographie vermischt worden sind. Die 10 Gelaliquots wurden mit jeweils 50ml Puffer A 3mal gewaschen. Gelaliquots von 1 ml wurden abgenommen und es erfolgte eine 3fach Elution von jeweils 1 ml mit einer 1 M NaCI-Lösung (Puffer B). 100μl des Eluats wurden an 50μl Seharosebeads immobilisiert und die Ull-generierende Aktivität bestimmt (siehe Beispiel 1). Nach Auswertung der Ergebnisse aus der Teilelution der 10 Gele wurde die gesamte Probe vom Gel der Flasche 1 3mal mit jeweils 50ml Puffer B eluiert (bezeichnet als Fraktion 1.1).
Suche nach geeigneten Parametern für die chromatographische Reinigung von UCE nach einer Sample-Displacement-Chromatographie: Für die Durchführung der PPS- Experimente mussten insgesamt 5 96-Deepwell-Platten vorbereitet werden. Folgende Gele wurden verwendet: ein Metallchelatgel (IMAC) mit jeweils 6 unterschiedlichen Metallionen beladen (Fe1. Zn, Cu1 Mg, Ni, Mn), 8 verschiedene Hydrophobe Interaktionsgele (Super-Butyl 550, Butyl-650, Buthyl-Sepharose, t-Butyl MacroPrep- GeI, Methyl MacroPrep-Gel, Phenyl-650-Gel, Phenyl-Sepharose, Ether-650-Gel). Bei der Hydrophoben Interaktionschromatographie wurden zusätzlich zu den unterschiedlichen Gelen auch 5 pH-Werte variiert. Die Lösungen und Gele wurden jeweils beginnend von Position A1 bis Position F8 der 96-Deepwell-Platte befüllt. Für die Vorbereitung der Gelplatte wurden 1 ml der oben aufgeführten Gele abgenommen und in ein Eppendorfgefäß überführt, mit Wasser gewaschen und anschliessend mit einer 1 M NaCI-Lösung konditioniert. Danach wurden die Gele 3mal mit Wasser gewaschen und eine 1 :1 Gel-Wasser-Mischung hergestellt. Nachdem durch mehrmaligen Schwenken eine homogene Suspension entstanden war, wurden 20μl der Suspension in das entsprechende Well pipettiert.
Die Pufferplatten wurden durch Mischen der einzelnen Lösungen (Pufferlösungen, NaCI-Lösung und Wasser) auf die entsprechende Konzentration (wie in Tab. 4 dargestellt) eingestellt. Die Befüllung erfolgte mit Hilfe eines Dispensers. In die Probenplatte wurden jeweils 500μl der Fraktion 1.1 aus der Sample Displacement Chromatographie in die Positionen A1-D1 pipettiert. Danach erfolgte die automatische Durchführung der PPS-Experimente mit dem Pipettierroboter-System. Es wurde 6mal mit 30μl des Elutionspuffers eluiert. Zweite Chromatographische Reinigung von UCE mittels Hydrophober Interaktionschromatographie: Ein XK50-Säulengehäuse wurde mit 150ml t-Butyl MacroPrep-Gel gepackt und an das HPLC Explorer System angeschlossen. Mit einem Fluss von 10ml/min wurde die Säule solange mit Puffer A (5OmM Malonsäure; 2M NaCI; pH5) equilibriert, bis die Leitfähigkeit konstant blieb. Das Eluat (150ml) der Sample Displacement Chromatographie bezeichnet als Fraktion 1.1 wurde mit 150ml 10OmM Malonsäure vermischt und mit einer NaCI-Lösung auf 2M eingestellt. Der pH- Wert wurde mit einer HCI-Lösung auf einen Wert von 5 gebracht. Die Probe wurde mit einem Fluss von 10ml/min mit der Sample Pump des Explorers auf die Säule aufgetragen. Die Säule wurde anschließend mit 200ml Puffer A gewaschen. Der Gradient für die Elution der Probe verlief von 0% auf 100% B (Wasser) in 60 Minuten. Während der Chromatographie wurden 10 ml Fraktionen gesammelt. Nach 60 Minuten wurde 15 Minuten mit Wasser gespült. Von den Fraktionen mit einer deutlichen UV- Absorption bei 280nm wurden 100μl abgenommen und an Sepharosebeads immobilisiert, inkubiert und die UCE-Aktivität bestimmt.
Suche nach chromatographischen Parametern für die 3. chromatographische Reinigung des UCE: Für den nächsten Reinigungsschritt wurden 5 Kationenaustauschergele (Toyopearl CM-650M-Gel, Fractogel SO" 3, SP-Sepharose FF, Fractogel COO' und UnosphereS-Gel) bei 5 verschiedenen pH-Werten getestet. Die Lösungen und Gele wurden jeweils beginnend von Position A1 bis Position E5 der 96-Deepwell-Platte befüllt. Für die Vorbereitung der Gelplatte wurden 1ml der oben aufgeführten Gele abgenommen und in Eppendorfgefäße überführt, mit Wasser gewaschen und anschließend mit einer 1M NaCI-Lösung konditioniert. Danach wurden die Gele 3mal mit Wasser gewaschen und eine 1 :1 Gel-Wasser-Mischung hergestellt. Nachdem durch mehrmaligen Schwenken eine homogene Suspension entstanden war, wurden 20μl der Suspension in das entsprechende Well pipettiert. Die Elutionspufferplatte enthielt 500μl einer 1 M NaCI-Lösung pro Well. Die Befüllung der Pufferplatten erfolgte mit dem Dispenser. Die Probenplatte enthielt in Position A1-D1 jeweils 500μl der Fraktion 1.2 aus der Hydrophoben Interaktionschromatographie.
Dritte chromatographische Reinigung des UCE mittels Kationenaustausch- Chromatographie Eine kommerzielle Uno S6-Säule vorgepackt mit dem Unosphere S-Material wurde an die HPLC Anlage Purifier angeschlossen und bei einem Fluss von 1 ml/min mit Puffer A (5OmM Phosphatpuffer, pH5) equilibriert. Das Volumen von 70ml der 1.2- Fraktion aus der Hydrophoben Interaktionschromatographie wurde über 10kDa-Filter auf ein Volumen von 500μl eingeengt und mit 500μl Puffer A gemischt. Die Probe wurde über eine 1ml Probenschleife mit einem Fluss von 0,9ml/min auf die Säule aufgetragen. Die Probenelution erfolgte bei einem Gradienten von 0% auf 100% B (1M NaCI) in 40 Minuten. Es wurden 1 ml Fraktionen gesammelt. Fraktionen mit einer signifikanten UV- Absorption bei 280nm wurden auf Ull-generierende Aktivitäten getestet. Dabei wurden 100μl Aliquots der Fraktionen an 30μl Sepharosebeads immobilisiert (siehe 2.2.2.2), mit dem UCE-S inkubiert (2.2.2.3) und massenspektrometrisch vermessen (2.2.2.4). DieUCE- Fraktionen bezeichnet mit 1.3 wurden vereinigt und über einen 10kDa-Filter konzentriert.
Beispiel 3: UCE-Aktivitätsassay
Folgende Proteaseinhibitoren wurden verwendet: 10μM E64, 10μM Pepstatin A, 1 mM EDTA, 100μM Bestatin, 10μM Chymostatin, 1mM AEBSF (angegeben ist die Endkonzentration). Für den UCE-Aktivitätsassay wurden 7x30μl Sepharosebeads (6 Inhibitoren + 1 Kontrolle) portioniert und jeweils 50μl der Proteinfraktion 1.3 aus dem 3. chromatographischen Reinigungsschritt zugegeben. E64 und AEBSF als irreversible Inhibitoren wurden 30 Minuten vor Substratzugabe zu den immobilisierten 1.3 Proteinfraktionen pipettiert und bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach 30 Minuten wurde zu den Proben, die mit dem irreversiblen Inhibitoren inkubiert wurden, 27μl des UCE-S (10-5 M) gegeben und bei RT geschüttelt. Von allen anderen Inhibitoren wurden 3μl jeweils zu 27μl des UCE-S gegeben, vermischt und zu den immobilisierten 1.3 Proteinfraktionen pipettiert und bei Raumtemperatur geschüttelt. Aliquots wurden nach 4h und 22h abgenommen und mittels MALDI-MS vermessen (siehe Beispiel 1). Das Ergebnis eines solchen Verfahrens ist in Fig. 6 dargestellt. Beispiel 4: Reinigung des UCE mit einer Affinitätschromatographie mit immoblisierten Chymostatin
Der nächste Reinigungsschritt bestand aus einer Affinitätschromatographie mit dem immobilisierten Inhibitor Chymostatin. Für diese Chromatographie wurden 20ml EAH- Sepharose 3mal mit einer 50OmM NaCI-Lösung und anschließend mit einer mit 100μM HCI-Lösung (pH 4,5) gewaschen. 400mg des Crosslinkers EDC wurden in 100μM HCI-Lösung (pH 4,5) gelöst und zu der EAH-Sepharose pipettiert. Anschließend wurden 100μl einer 50mg/ml Chymostatinlösung gelöst in DMSO zu der EAH- Sepharose gegeben und gut vermischt. Die Reaktion erfolgte bei 4°C über Nacht auf dem Überschlagsrotor. Die Kontrolle des pH-Werts erfolgte während der ersten 2h und wurde mit NaOH auf 4,5 eingestellt. Nach der Reaktion wurde der Überstand abgenommen und die EAH-Sepharose abwechselnd mit Puffer 1 (0,1 M Essigsäure, 50OmM NaCI, pH 4) und Puffer 2 (0,1 M Tris, 50OmM NaCI, pH 8) jeweils 3mal gewaschen. Zum Abschluss wurde das Gel 3mal mit Wasser gewaschen. Für die Chromatographie wurden 2,7ml der EAH-Sepharose mit immobilisierten Inhibitor Chymostatin in ein HR 10/30 Säulengehäuse gefüllt und an die HPLC-Anlage Purifier angeschlossen. Die Säule wurde mit Puffer A (5OmM HEPES, 50OmM NaCI, pH 8) bei einem Fluss von 0,7ml/min equilibriert. Die aufkonzentrierte Probe (500μl der Fraktion 1.3 aus der Kationenaustauschchromatographie) wurde in 500μl Puffer A aufgenommen und mit einem Fluss von 0,7ml/min auf die Säule aufgetragen. Die Probenelution erfolgte bei einem Gradienten von 0% auf 75% Puffer B (5OmM Phosphatpuffer; pH 4) in 30 Minuten und weitere 30 Minuten auf 100% Puffer B. Während der Chromatographie wurden Fraktionen von 1ml gesammelt. Eine signifikante UV-Absorption bei 280nm war nur im Durchbruch zu sehen, welcher dann auf die Ull-generierende Aktivität überprüft wurde. Für die Immobilisierung wurden 10Oμl des Durchbruchs an 30μl Sepharose immobilisiert (siehe Beispiel 1). Nach Substratinkubation wurden die Proben massenspektrometrisch vermessen (siehe Beispiel 1).
Reinigung des UCE mit einer Größenausschluss-Chromatographie: Die aktive Fraktion aus der Affinitätschromatographie, bezeichnet mit 1.4, wurde über einen 10kDa-Filter auf ein Volumen von 100μl eingeengt. Die Probe wurde in 100μl Puffer A (5OmM Phosphatpuffer, 15OmM NaCI, pH 7) aufgenommen. Die Gelfiltrationssäule Superdex 200 HR 10/30 wurde an die HPLC-Anlage Purifier angeschlossen. Die Probe wurde mit einem Fluss von 250 μl/min aufgetragen. Die Chromatographie wurde mit Puffer A durchgeführt. Es wurden 1ml Fraktionen gesammelt. Fraktionen mit einer deutlichen UV-Absorption bei 280nm wurden immobilisiert und auf eine UCE-Aktivität getestet (Ergebnis siehe Fig. 5).
Beispiel 5: Identifizierung eines UCE-aktiven Proteins
Tryptischer Verdau der UCE-aktiven Fraktionen aus der Größenausschluss- Chromatographie
Eine hohe UCE-Aktivität konnte in den Fraktionen 1.5A-D (siehe Chromatogramm der Größenausschluss-Chromatographie, Fig. 5) gefunden werden. Jeweils 800μl der Fraktionen 1.5A-D wurden in Eppendorfgefäße überführt und eingefroren. Die gefrorenen Fraktionen wurden anschließend in der Vakuumzentrifuge getrocknet. Die Pellets wurden in 50μl 6M Harnstoff aufgenommen und 5μl einer 20OmM DTT-Lösung, 10OmM NaHCO3 (pH 8,3) zugegeben und 1h bei Raumtemperatur auf einem Schüttler inkubiert.
Zu dem Inkubationsansatz wurden 10μl einer 20OmM lodacetamid-Lόsung, 10OmM NaHCO3 (pH 8,3) pipettiert und 1h auf dem Schüttler bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 10μl einer 20OmM DTT-Lösung, 10OmM NaHCO3 (pH 8,3) zu dem Ansatz pipettiert und wieder 1 h auf dem Schüttler bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurden 425μl einer 10OmM NaHCO3-Lösung (pH 8,3) zugegeben und der Reaktionsansatz in ein Glasvial überführt. In das Glasvial wurden 5μl einer 0,25μg/μl Trypsin-Lösung pipettiert und 24h bei Raumtemperatur auf dem Schüttler inkubiert. Zum Abstoppen der Reaktion wurde die Lösung mit Ameisensäure auf 0,1% eingestellt.
Identifizierung der tryptisch verdauten Peptide der UCE-aktiven Fraktionen der Größenausschluss-Chromatographie mittels LC-ESI MS/MS: Es wurden jeweils 20μl der verdauten Fraktionen 1.5A-D in eine 96-Well-PCR-Platte überführt und in den Autosampier des LC-ESI MS/MS gestellt. Der Autosampier injizierte jeweils 8μl Probe auf ein Chip-System der Firma Agilent. Die Probe wurde auf eine Trapping C18-Säule (4OnI ZORBAX 300SB C18), die sich auf den Chip befand, mit einem Fluss von 4μl/min 10 Minuten mit 100% Puffer A (3% ACN, 0,1% Ameisensäure) aufgetragen. Als Trennsäule (Analytische Säule), die sich ebenfalls auf dem Chip befand, wurde eine C18-Säule mit einem (C18-Säule 150mm x 75μm ZORBAX 300SB) verwendet. Es wurde 45 Minuten ein Gradient von 0% auf 40% B (80% ACN, 0,1% Ameisensäure) gefahren und für 3 Minuten auf 97% B. Anschließend wurde 2 Minuten bei 97% B und dann auf 3% B gespült. Zur Auswertung der generierten ESI-Daten wurde die Software DataAnalysis und Mascot verwendet.
Mit dem Data Analysis Programm von Agilent konnten die generierten MS Spektren automatisch in Aminosäuresequenzen übersetzt werden. Mit Hilfe des Mascot generic file (mgf) konnte eine Mascot-Datenbankabfrage erfolgen. Mit Hilfe der Datenbankabfrage konnte eine Protease, der humane Komplement Faktor I (EC- Nummer: 3.4.21.45) identifiziert werden. Insgesamt konnten 9 Peptide mit folgenden AS-Sequenzen (SEQ ID NO 4-12): VFSLQWGEVK, AQLGDLPWQVAIK, GLETSLAECTFTK, ADSPMDDFFQCVNGK, TMGYQDFADWCYTQK, YQIWTTWDWIHPDLK, EANVACLDLGFQQGADTQR,
VANYFDWISYHVGRPFISQYNV, DASGITCGGIYIGGCWILTAAHCLR bei einem signifikanten Score von 392 identifiziert werden. Die Sequenzabdeckung für den Komplement Faktor I betrug 25%. Drei weitere tryptisch verdaute Proben Fraktion 1.5A, 1.5C und 1.5D aus der Größenausschluss-Chromatographie (Abbildung 16) wurden mittels LC-ESI-MS/MS analysiert. In keiner dieser Proben konnte eine Protease identifiziert werden.
Nach Identifizierung des Komplement Faktor I in der 1.5B Fraktion wurde nach einer kommerziellen Präparation des Komplement Faktor I gesucht. Eine aus humanem Plasma aufgereinigte Präparation wurde von Sigma angeboten. Da für weitere Charakterisierungsversuche diese Präparation als Positivkontrolle eingesetzt werden sollte, musste sichergestellt sein, dass keine weiteren Proteasen, die die Ergebnisse verfälschen könnten, vorhanden sind. Dafür wurde ein Teil der Präparation tryptisch verdaut und mit der LC-ESI-MS/MS identifiziert.
Die Datenbankabfrage ergab, dass mit einem von Score 998 an erster Stelle der humane Komplement Faktor I identifiziert werden konnte. Folgende Peptide wurden identifiziert: FSVSLK, TMFICK, IVIEYVDR, VFCQPWQR, SFPTYCQQK, RIVIEYVDR, VFSLQWGEVK, GLETSLAECTFTK, RAQ LG DLPWQVAI K, ADSPMDDFFQCVNGK, TMGYQDFADWCYTQK, YQIWTTWDWIHPDLK, RTMGYQDFADWCYTQK, EANVACLDLGFQQGADTQR, ACDGINDCGDQSDELCCK,
IIFHENYNAGTYQNDIALIEMK. Die Sequenzabdeckung für den Komplement Faktor I betrug 34 %. Außer dem Komplement Faktor I konnte in der Präparation noch Albumin identifiziert werden. Da es keinen Hinweis auf eine weitere Protease in der kommerziellen Präparation gab, konnte diese Präparation als Positivkontrolle für Charakterisierungversuche eingesetzt werden.
Vergleich der AS-Sequenzen der tryptischen Peptide der kommerziellen Präparation des humanen Komplement Faktor I und der 1.5 B-Fraktion:
In der tryptisch verdauten Probe der kommerziellen Präparation des Komplement Faktor I konnten 16 Peptide, in der 1.5B Fraktion 10 Peptide dem Komplement Faktor I zugeordnet werden. Insgesamt wurden in beiden Fraktionen 7 Peptide gefunden, die identische AS-Sequenzen besitzen.
Nachweis einer Ull-generierenden Aktivität der 1.5 B-Fraktion und des Komplement Faktor I mit dem MES-Assay: Um sicherzustellen, dass der Komplement Faktor I eine UCE-Aktivität besitzt, wurden die 1. SB-Fraktion und die kommerzielle Komplement Faktor I-Präparation mit Hilfe des MES-UCE-Assay auf die UCE-Aktivität untersucht. Fig. 7 zeigt die Ergebnisse des Nachweises einer Bestimmung der UCE-Aktivität der kommerziellen Komplement Faktor I-Präparation zum Vergleich mit der gereinigten Fraktion 1.5B. Beide Fraktionen zeigen einen Abbau des UCE-S zum Uli. Die MALDI- Spektren zeigen auch die Generierung der zwei Zwischenstufen (KR-UII und R-UII) des Uli in der gereinigten Fraktion 1.5B und der kommerziellen Präparation des Komplement Faktor I. Die Ergebnisse zeigen, dass der Komplement Factor I eine UCE-Aktivität besitzt. Nachweis einer identischen proteolytischen Aktivität der 1.5B Fraktion und der kommerziellen Komplement Faktor I-Präparation mittels Fluoreszenzassay: Tsiftsoglou et al. konnte zeigen, dass der Komplement Faktor I das Fluoreszenzsubstrat Boc- Asp(Obzl)-Pro-Arg-AMC umsetzen kann. Für den Nachweis, dass die 1. SB-Fraktion wie der Komplement Faktor I das Substrat umsetzt, wurde ein Fluoreszenzassay durchgeführt. Die kommerzielle Komplement Faktor I-Präparation diente als Positiv- Kontrolle.
Fig. 8 zeigt die Ergebnisse des Fluoreszenzassays. Fraktion 1.5B (b) und der Komplement Faktor I der kommerziellen Präparation (c) zeigen eine Umsetzung des Fluoreszenzsubstrates Boc-Asp(Obzl)-Pro-Arg-AMC ab einer Inkubationszeit von 4,5h und sie erreicht ein Plateau nach 13h. Der Fluoreszenzassay zeigt, dass in der 1. SB- Fraktion als auch in der kommerziellen Komplement Faktor I-Präparation eine proteolytische Aktivität vorhanden ist, die das Fluoreszenz-Substrat Boc-Asp(Obzl)- Pro-Arg-AMC umsetzt.
Untersuchung auf N-glykosidisch gebundene Oligosaccharide des Mannose-Typs im Komplement Faktor I a) der kommerziellen Präparation und b) der 1.5B-Fraktion mit Hilfe des GNA-Lektin Glykoprotein Kit:
Es ist bekannt, dass der Komplement Faktor I ein Glykoprotein vom Mannose-Typ ist. Mit Hilfe von Filtrationssäulen mit gekoppelten GNA-Lektin sollte untersucht werden, ob die 1.5B-Fraktion sich an diese GNA-Lektin-Säulen binden lässt. Als Vergleich wurde die kommerzielle Komplement Faktor I-Präparation eingesetzt.
Anhand der MALDI-Spektren A und C (Fig. 9) konnte eine UCE-Aktivität in den Eluaten der 1.5B-Fraktion und der Komplement Faktor I-Präparation gefunden werden. Dies ist ein Beweis dafür, dass beide Fraktionen an den GNA-Lektin-Säulen gebunden haben und von ihnen eluiert werden konnten. Beide Fraktionen besitzen wie erwartet, N- glykosidisch gebundene Ologosaccharide mit Mannose-Strukturen. Auch in den Überständen der beiden Fraktionen ist eine UCE-Aktivität wiederzufinden (MALDI- Spektren B und D). Dies könnte auf das Überschreiten der Bindungskapazität der Lektinsäulen zurückzuführen sein, sodass nicht alle Komplement Faktor I-Moleküle binden konnten.
Charakterisierungsversuche der 1.5B-Fraktion und der kommerziellen Komplement Faktor I-Präparation mit dem Serinproteaseinhibitor Aprotinin
Es ist bekannt, dass der Komplement Faktor I eine Serinprotease ist. Für die weitere Charakterisierung der 1. SB-Fraktion im Vergleich mit der kommerziellen Komplement Faktor I-Präparation wurden untersucht, ob sich die Ull-generierende Aktivität in beiden Fraktionen mit dem Serinprotease-Inhibitor Aprotinin hemmen lassen.
Fig. 11 zeigt bei Inkubation mit Aprotinin eine vollständige Hemmung der UCE- Aktivität der 1. SB-Fraktion und der kommerziellen Komplement Faktor I-Präparation. Es gibt keine Uli Signale und keine von möglichen Zwischenprodukten (R-UII und KR- Uli) Es konnte jedoch ein Peptid mit der Masse 1801.8 Da (im Spektrum mit X bezeichnet) gefunden werden. Diese Masse entspricht dem KKR-UII Peptid (Tabelle), welches um 6 Aminosäuren vom N-Terminus des UCE-S verkürzt ist. Dafür verantwortlich könnte eine proteolytische Verunreinigung in der kommerziellen Aprotinin-Präparation sein, da das Aprotinin aus der Rinderlunge aufgereinigt wurde und begleitende Proteine enthalten kann.
Charakterisierungsversuche der 1.5B-Fraktion und der kommerziellen Komplement Faktor I-Präparation mit dem Serinproteaseinhibitor Pefabloc SC
Tsiftsoglou et al. konnte zeigen, das sich der Komplement Faktor I vollständig mit Pefabloc SC (auch als AEBSF bezeichnet) inhibieren ließ. Vorangegangene Inhibitionsversuche (Punkt 3.2.7) haben gezeigt, dass die 1.5B-Fraktion nicht vollständig von Pefabloc SC inhibiert werden konnte. Grund dafür könnte die eingesetzte Konzentration des Inhibitors sein. Daraufhin wurde die von Tsiftsoglou et al. angegebene Pefabloc SC-Konzentration für den Inhibitionsversuch eingesetzt.
Fig. 10 zeigt die Ergebnisse des Inhibitionsversuchs mit Pefabloc SC. In beiden Fraktionen sowohl in der 1.5B-Fraktion als auch der kommerziellen Komplement Faktor I-Präparation konnte nach 24h Inkubation keine Ull-generierende Aktivität oder die Entstehung von weiteren UCE-S-Produkten beobachtet werden. Der
Inhibitionsversuch hat gezeigt, dass mit einer Konzentration von 2,5mM Pefabloc SC eine vollständige Hemmung der UCE-Aktivität erreicht werden konnte.
Beispiel 6: UCE-Aktivitätsassay mit humanem Komplement Faktor I
Nachweis einer UCE-Aktivität der 1.5 B-Fraktion und des Complement Faktor I mittels MES: Es wurden 10μl einer käuflich erworbenen 1 mg/ml Complement Faktor I-Lösung und 20μl der 1.5B-Fraktion aus der Größenausschluss-Chromatographie an 30μl Sepharose immobilisiert und die UCE-Aktivität getestet (siehe Beispiel 1). Aliquots der Inkubationsansätze wurden nach 2h, 4h, 7h und 24h abgenommen. Nachweis einer identischen proteolytischen Aktivität der 1.5B Fraktion aus der Größenausschluss-Chromatographie und des Complement Faktor I mittels Fluoreszenzassay: In eine schwarze 96-Well-Mikrotiter-Platte wurde in Position A1 die Negativ-Kontrolle mit 50μl 25mM Boc-Asp(Obzl)-Pro-Arg-AMC-Fluoreszenzsubstrat aufgenommen in 150μl Puffer 1 (25mM Bicine-Puffer, 15OmM NaCI, 0,5mM EDTA, pH 8.25) pipettiert. In das Well A2 wurden 50μl einer 25μM Boc-Asp(Obzl)-Pro-Arg-AMC- Substrat-Lösung und 10μl der Fraktion 1.5B aus der Größenausschluss- Chromatographie aufgenommen in 140μl Puffer 1 pipettiert. In das Well A3 wurden 50μl einer 25μM Boc-Asp(Obzl)-Pro-Arg-AMC-Substrat-Lösung und 5 μl (entsprach 5 μg) einer kommerziellen Präparation des humanen Complement Faktor I aufgenommen in 145μl Puffer 1 pipettiert. Die Platte wurde bei 370C 12h inkubiert und bei einer Anregungswellenlänge von 350nm und einer Emissionswellenlämge von 465nm alle 30min vermessen. Der Fluoreszenzassay wurde nach der Vorschrift von S. A. Tsiftsoglou und R.B. Sim durchgeführt ("Human complement factor I does not require cofactors for cleavage of synthetic Substrates." J Immunol 173(1): 367-75)
Versuche zur Glykoproteincharakterisierung der 1. SB-Fraktion und der kommerziellen Complement Faktor I-Präparation: Für die Durchführung der Charakterisierung wurden ein Mannose Glykoprotein Kit mit gekoppelten GNA-Lektin und ein O-Glykan Glykoprotein Kit mit gekoppelten PNA-Lektin der Firma Qiagen verwendet. Die Vorgehensweise erfolgte nach Vorschrift von Qiagen. Alle Puffer und Lösungen waren in dem Kit enthalten. Zu Beginn wurden die Fraktionssäulen in 2ml Eppendorfgefäße platziert und anschließend 500μl des jeweiligen Bindungspuffers zugegeben und 2min bei 500rpm zentrifugiert und der Durchfluss verworfen. Für die Vergleichbarkeit der Ergebnisse wurden adäquate Proteinmengen der Fraktion 1.5B und der kommerziellen Präparation des Complement Faktor I eingesetzt. Von der Fraktion 1.5B wurden 2x30μl (0,1 mg/ml) in jeweils 500μl des entsprechenden Bindungspuffers aufgenommen. Von der kommerziellen Präparation des Complement Faktor I wurden jeweils 2x3μl (1 mg/ml) abgenommen und mit Wasser auf 30μl aufgefüllt und anschließend mit 500μl des entsprechenden Bindungspuffers vermischt. Die in Puffer aufgenommen Proben wurden zu den entsprechenden Fraktionssäulen pipettiert und 2min bei 500rpm zentrifugiert. 100μl des Durchfluss wurden an 50μl Sepharosebeads immobilisiert und der Rest verworfen. Die Lektinsäulen wurden 3mal mit dem jeweiligen Bindungspuffer gewaschen, für 2min bei 500rpm zentrifugiert und der Durchfluss verworfen. Für die Elution der Proteine von den Lektinsäulen wurden 300μl Elutionspuffer zu den Lektinsäulen pipettiert und 1min inkubiert. Anschließend wurde 5min bei 500rpm zentrifugiert und 100μl des Eluats an 50μl Sepharosebeads immobilisiert. Die Abnahmen der Aliquots der Überstände erfolgte nach 1 ,5h; 3,5h; 5,5h und 24h und die Abnahmen der Eluate nach 1 ,5h; 3,5h und 24h. Die Proben wurden dann massenspektrometrisch vermessen (siehe Beispiel 1).
Charakterisierungsversuche der 1. SB-Fraktion und der kommerziellen Complement Faktor I-Präparation mit den Serinproteaseinhibitoren Aprotinin und Pefabloc SC: Für die Charakterisierungsversuche wurden 4x30μl Sepharosebeads vorbereitet. Jeweils 2x30μl einer 0,1 mg/ml 1.5B-Fraktion und der kommerziellen Complement Faktor I- Präparation wurden an Sephaosebeads immobilisiert. Für die Inkubation wurden jeweils die 27μl einer 10"5M UCE-S-Lösung mit jeweils 3μl einer 10μM Aprotinin- Lösung und 2,5mM einer Pefabloc SC-Lösung vermischt und zu den jeweiligen immobilisierten Proteinen gegeben. Die Abnahmen der Aliquots erfolgte nach 1 ,5h; 3,5h; 5,5h und 24h. Anschließend wurden die abgenommenen Aliquots massenspektrometrisch vermessen (siehe Beispiel 1).
Beispiel 7: Nachweis der Identität von kommerziell bezogenem CFI
Die CFI-Fraktion der Firma Sigma-Aldrich wurde mit einer 2D-Polyacrylamid- Gelelektrophorese (2D-PAGE) analysiert (siehe Fig. 12). Das Coomassie-gefärbte Polyacylamidgel zeigt zwei Reihen von perlenschnurartig angeordneten Proteinen. Aus jeder dieser Reihen wurden jeweils 2 Gelstückchen ausgestanzt. Die Proteine in den Gelstückchen wurden mit Trypsin verdaut. Die tryptischen Peptide wurden mit einer MALDI-TOF-Messung analysiert. Die Identifizierung der Proteine erfolgte über eine Kombination einer Peptidmassen-Fingerabdruck- und einer
Tandemmassenspektrometrie-Datenbankanalyse. Von allen 4 Proteinen wurden Teilsequenzen vom CFI identifiziert (siehe Fig. 16).
Fig. 16 zeigt die Aminosäure-Sequenz des Komplementfaktor I-Vorläufers. Die Pfeile markieren das Ende der N-terminalen schweren Kette (schwarz) sowie den Beginn der C-terminalen leichten Kette (fett grau). In dieser Sequenz wurden die identifizierten Peptide der analysierten Spots 1 bis 4 fett grau markiert. Die Sequenzabdeckung liegt jeweils bei ca. 60 %.
Die Proteine der Spots 1 und 2 stammen von der schweren Kette des CFI, die Proteine der Spots 3 und 4 von der leichten Kette. Diese Ergebnisse decken sich mit denen der 2D-PAGE, da die Proteine der Spots 3 und 4 auf dem Polyacrylamidgel weiter gelaufen sind und somit leichter sein sollten als die der Spots 1 und 2. Das Auftreten mehrerer Spots im 2D-GeI, in denen Proteine gleicher Aminosäuresequenz identifiziert werden konnten, deutet auf die Existenz mehrerer Proteinspezies von CFI hin. Vermutlich handelt es sich dabei um verschiedene Protein-Spezies mit unterschiedlicher Glykosylierung. Das Auftreten dieser Proteinspezies ist eingehend von Tsiftsoglou et al. (Biochim Biophys Acta. 1764 (2006) 1757-66) beschrieben. Auf dem Coomassie-gefärbten Gel sind keine weiteren Proteinspots außerhalb der Proteinspezies Bereiche des CFIs erkennbar, so dass von einer weitgehend homogenen Proteinfraktion ausgegangen werden kann.
Beispiel 8: Messung des Einflusses des Komplementfaktors H auf die Enzymaktivitäten des CFI
Für die Inkubation des immobilisierten CFI mit Substanzen wie zum Beispiel Komplementfaktor H wurden jeweils 40 μl der derivatisierten Chromatographiepartikel der CFI- und der Kontrollfraktion mit 7 μl Komplementfaktor H-haltiger Lösung (Konzentration: 1 mg/ml) und einer 10"4 M Lösung des Peptidsubstrats in PBS (Endvolumen 50 μl) inkubiert. Die Abnahme von Aliquots (siehe „Quantifizierung von Peptiden über LC-MS-MRM") und die MRM-Messung („Versuche zur Bestimmung der Enzymaktivitäten immobilisierter Proteine") erfolgte wie unten beschrieben.
a) Versuche zur Bestimmung der Enzymaktivitäten immobilisierter Proteine (z.B. CFI)
Zur Messung der Enzymaktivitäten immobilisierter Proteinfraktionen wurden diese jeweils mit einer 10"4 M Lösung eines Peptidsubstrats in 50 μl PBS (9 mM CaCI2, 26,8 mM KCl, 14,7 mM KH2PO4, 4,92 mM MgCI2, 137 mM NaCI, 80,57 mM Na2HPO4) auf dem Überkopfrotor inkubiert. Nach definierten Zeiten erfolgte die Abnahme von Aliquots (Volumen: 5 μl), diese wurden mit 45 μl 0,2% FA vermischt. Die Proben wurden sofort bei -20 0C eingefroren und bis zur MRM-Messung bei dieser Temperatur gelagert.
b) Quantifizierung von Peptiden über LC-MS-MRM
Die Reaktionsprodukte der Inkubationen wurden mit einer Reversed-Phase- Chromatographie entsalzt, getrennt und zum Nachweis der Peptide Uli, UCE-S, C3b und C3b-R über eine Multiple-Reaction-Monitoring (MRM) Analyse mit einem Elektrospray-Ionisations-Ionenfallen-Massenspektrometer (ESI-IT-MS) analysiert. Der MRM-Assay beinhaltet die Isolierung eines Elternions, seine anschließende Fragmentierung sowie die Detektion eines definierten Fragmentions. Die Werte für die Signalintensitäten wurden in Intervallen von zwei Sekunden gemessen. Die Signalintensitäten richteten sich nach der Anzahl der Moleküle, die den Detektor erreichen. Die in Abhängigkeit der Zeit erfassten Messpunkte der Signalintensitäten wurden zu einem Chromatogramm extrapoliert. Zur relativen Quantifizierung der gemessenen Peptide wurden die Flächen der Signale der Chromatogramme integriert.
c) Bestimmung der massenspektrometrischen Parameter zur Quantifizierung von Uli mit der MRM-Methode
Das synthetisierte Peptid Uli (Molare Masse: 1388,6 Da, Aminosäuresequenz: ETPDCFWKYCV) wurde in 0,2 % Ameisensäure gelöst. Für die Etablierung des Nachweises des Peptids mittels ESI-IT-MS wurde zunächst eine 10"5 M Lösung des Peptids über eine Hamilton-Spritzenpumpe mit einem Fluss von 3 μl/min in die Elektrospraykammer des Massenspektrometers injiziert. Im Massenspektrum der ESI- MS-Messung wurde das Signal des zweifach geladenen Ions von Uli bei einem Masse- Ladungsverhältnis von 695 als das Signal mit der höchsten Signalintensität identifiziert. Die Parameter der massenspektrometrischen Messung wurden auf dieses Masse- Ladungsverhältnis optimiert.
Parameter der Geräteeinstellung für die Messung des Peptid Uli: Temperatur an der Transferkapillare320 0C; Sprayspannung 5 kV
Der Peak des Elternions (Massenfenster: 4,0 m/z-Einheiten) wurde in der lonenfalle isoliert und unter Zufuhr einer Kollisionsenergie von 50 % fragmentiert. Das Fragmention mit der höchsten Signalintensität hatte einen m/z-Wert von 579,7 und war zweifach geladen.
d) Bestimmung der Chromatographieparameter für die Quantifizierung von Uli Die Reaktionslösung der Inkubate wurden über die Reversed-Phase-Säule PLRP-S 100Ä 5μm; 2.1 mm x 100 mm der Firma Varian entsalzt und getrennt. Für die Optimierung der Chromatographieparameter wurde Uli in einer Konzentration von 0,2 % Ameisensäure gelöst. Die Probe wurde durch einen Autosampier in das HPLC- System (SpectraSystem, Thermo Finnigan) injiziert. Als Lösungsmittel wurden 0,2 % Ameisensäure in HPLC-Wasser (Lösungsmittel A) und 100 % Acetonitril (Lösungsmittel B) genutzt. Für die optimale Elution des Peptids von der Säule wurde der folgende Gradient gefunden:
Zeit [min] H2O [%] ACN [%]
0 97 3
6 40 60
6,5 40 60
6,6 97 3
13 97 3
Die Flussrate lag konstant bei 0,3 ml/min. Die massenspektrometrische MRM-Analyse des Chromatographielaufs erfolgte in einem Segment unter Berücksichtigung der in wie vorstehend beschrieben bestimmten Parameter.
* * * * *

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Identifizierung einer chemischen Verbindung, welche die Urotensin-2-Konvertase-Aktivität eines Proteins regulieren kann, wobei
- in einem Reinigungsschritt ein Protein, welches Urotensin-2-Konvertase-Aktivität aufweist, aufgereinigt wird, indem eine proteinhaltige Probe durch einen oder mehrere chromatographische Schritte in mehrere Fraktionen aufgetrennt wird,
- die Urotensin-2-Konvertase-Aktivität der einzelnen Fraktionen bestimmt wird,
- eine Fraktion, welche Urotensin-2-Konvertase-Aktivität enthält, isoliert wird, und anschließend diese isolierte Fraktion
- in einem Aktivitäts-Assay-Schritt mit der chemischen Verbindung gemischt und die Urotensin-2-Konvertase-Aktivität der Mischung bestimmt wird,
dadurch gekennzeichnet, dass
der Reinigungsschritt eine Affinitätschromatographie umfasst, bei welchem eine Proteinprobe, welche Urotensin-2-Konvertase-Aktivität enthält, durch reversible Bindung an einer festen Phase, an die ein Inhibitor der Urotensin-2-Konvertase- Aktivität gebunden ist, und anschließende Elution in Fraktionen aufgeteilt wird, und nachfolgend die Urotensin-2-Konvertase-Aktivität der Fraktionen bestimmt wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Urotensin-2- Konvertase-Aktivität in dem Aktivitäts-Assay-Schritt unter physiologischen Bedingungen bestimmt wird.
3. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die proteinhaltige Probe aus einem Säugetier entnommenen wurde.
4. Verfahren gemäß mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor der Urotensin-2-Konvertase-Aktivität Chymostatin ist.
5. Verfahren gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die mehreren chromatographischen Schritte eine Anionenaustauschchromatographie, eine hydrophobe Interaktionschromatographie und / oder eine Kationenaustauschchromatographie umfassen.
6. Verfahren gemäß mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Anionenaustauschchromatographie mit einer stationären Aminoethylphase und einer mobilen wässrigen Phase mit pH 7, und / oder die Kationenaustauschchromatographie mit einer Sulfonsäuregruppen enthaltenen stationären Phase und einer mobilen wässrigen Phase mit pH 5 durchgeführt werden.
7. Verfahren gemäß mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die aus einem Säugetier entnommene, proteinhaltige Probe Blutplasma umfasst.
8. Verfahren gemäß mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die aus einem Säugetier entnommene, proteinhaltige Probe die Cohn-IV-Fraktion aus menschlichem Blutplasma umfasst.
9. Verfahren zur Identifizierung von chemischen Verbindungen, welche die Urotensin-2-Konvertase-Aktivität eines Proteins regulieren, wobei ein Protein, welches die Aminosäuresequenz des Complementfaktor I oder/und die SEQID1 umfasst, in einem Aktivitäts-Assay-Schritt mit einer chemischen Verbindung gemischt und die Urotensin-2-Konvertase-Aktivität der Mischung bestimmt wird.
10. Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Urotensin-2- Konvertase-Aktivität in dem Aktivitäts-Assay-Schritt unter physiologischen Bedingungen bestimmt wird.
11. Verfahren gemäß mindestens einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass beim Aktivitäts-Assay-Schritt zusätzlich Komplementfaktor H anwesend ist.
12. Verfahren zur Bestimmung eines Proteins, welches Urotensin-2-Konvertase- Aktivität aufweist, wobei
- in einem Reinigungsschritt eine aus einem Säugetier entnommene, proteinhaltige Probe durch mehrere chromatographische Schritte in mehrere Fraktionen aufgetrennt wird, die Urotensin-2-Konvertase-Aktivität der einzelnen Fraktionen nach mindestens einem chromatographischen Schritt bestimmt wird und eine Fraktion, welche Urotensin-2-Konvertase-Aktivität enthält, isoliert wird,
- mindestens eine im Reinigungsschritt erhaltene Urotensin-2-Konvertase-Aktivität enthaltende Fraktion einem unvollständigen proteolytischen Verdau ausgesetzt wird,
- die durch unvollständigen proteolytischen Verdau entstandenen Fragmente mittels Massenspektrometrie hinsichtlich ihrer Aminosäuresequenz analysiert und zumindest einer Peptidsequenz zugeordnet werden, und die zumindest eine Peptidsequenz durch Datenbankabgleich zumindest einem in einem Säugetier exprimierten Protein zugeordnet wird,
dadurch gekennzeichnet, dass
der Reinigungsschritt eine Affinitätschromatographie umfasst, bei welchem eine Proteinprobe, welche Urotensin-2-Konvertase-Aktivität enthält, durch reversible Bindung an einer festen Phase, an die ein Inhibitor der Urotensin-2-Konvertase- Aktivität gebunden ist, und anschließende Elution in Fraktionen aufgeteilt wird, und nachfolgend die Urotensin-2-Konvertase-Aktivität der Fraktionen bestimmt wird.
13. Verfahren zur Bestimmung eines Proteins, welche Urotensin-2-Konvertase- Aktivität aufweist, gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Inhibitor der Urotensin-2-Konvertase-Aktivität Chymostatin ist.
14. Verfahren zur Bestimmung eines Proteins, welche Urotensin-2-Konvertase- Aktivität aufweist, gemäß mindestens einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Reinigungsschritt eine Anionenaustausch- Chromatographie, eine hydrophobe Interaktionschromatographie und / oder eine Kationenaustauschchromatographie umfassen.
15. Verfahren zur Bestimmung eines Proteins, welche Urotensin-2-Konvertase- Aktivität aufweist, gemäß mindestens einem der vorstehenden Ansprüche 12 bis
14, dadurch gekennzeichnet, dass die Anionenaustauschchromatographie mit einer stationären Aminoethylphase und einer mobilen wässrigen Phase mit pH 7, und / oder die Kationenaustauschchromatographie mit einer Sulfonsäuregruppen enthaltenen stationären Phase und einer mobilen wässrigen Phase mit pH 5 eingesetzt wird.
16. Verfahren zur Bestimmung eines Proteins, welche Urotensin-2-Konvertase- Aktivität aufweist, gemäß mindestens einem der vorstehenden Ansprüche 12 bis
15, dadurch gekennzeichnet, dass die aus einem Säugetier entnommene, proteinhaltige Probe Blutplasma umfasst.
17. Verfahren zur Bestimmung eines Proteins, welche Urotensin-2-Konvertase- Aktivität aufweist, gemäß mindestens einem der vorstehenden Ansprüche 12 bis
16, dadurch gekennzeichnet, dass die aus einem Säugetier entnommene, proteinhaltige Probe die Cohn-IV-Fraktion aus menschlichem Blutplasma umfasst.
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