DE69402961T2

DE69402961T2 - Verfahren zum Nachweis von viralen Komponenten mittels eines Glykoproteins

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Publication number: DE69402961T2
Application number: DE69402961T
Authority: DE
Inventors: Hubert Graafland; Marcel Rucheton; Elie Stefas
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1993-02-09
Filing date: 1994-02-09
Publication date: 1997-08-14
Anticipated expiration: 2014-02-10
Also published as: ES2101508T3; FR2701319B1; FR2701319A1; DE69402961D1; US5650269A; EP0683897A1; EP0683897B1; WO1994018569A1; DK0683897T3; ATE152523T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Bestimmung viraler Substanzen und einen Träger, an den wenigstens ein Glycoprotein gebunden ist.
Erfindungsgemäß versteht man unter viraler Substanz sowohl die einem Virus zugrundeliegenden Substanzen, insbesondere proteinartige Substanzen, als auch virale Teilchen. Virale Teilchen sind entweder vollständige oder unvollständige Virionen oder Teile von Virionen oder Aggregate, die virusbildende Substanzen enthalten, welche gewisse Eigenschaften von Viren oder viralen Substanzen aufweisen; sie werden insbesondere durch bestimmte Antikörper nachgewiesen, die für virale Substanzen spezifisch sind, oder sie könnten mit diesen viralen Substanzen verwandt sein.
Erfindungsgemäß hat man festgestellt, daß bestimmte virale Substanzen spezifisch an ein Glycoprotein binden: das β2'-Glycoprotein I oder eine Proteinzusammensetzung, die das β2'-Glycoprotein I enthält. Das β2'-Glycoprotein I ist das in der FR- A-2 701 263 beschriebene Glycoprotein. Das β2'-Glycoprotein I bindet an die Membran viraler Teilchen genauso wie an bestimmte chemische oder biologische Substanzen oder Oberflächen. Erfindungsgemäß nutzt man diese Eigenschaft, um die viralen Substanzen einzufangen und zu isolieren, wodurch sie sich nachweisen und/oder bestimmen lassen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Bestimmung viraler Substanzen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die viralen Substanzen mit Hilfe des β2'-Glycoproteins I bindet.
Erfindungsgemäß kann das β2'-Glycoprotein I in reiner Form oder in Form einer Proteinzusammensetzung verwendet werden, die insbesondere andere Glycoproteine und gegebenenfalls andere β2- Glycoproteine enthält. Diese Zusammensetzung kann insbesondere diejenige sein, die man durch Elution einer Affinitätssäule mit einem Sulfatgruppen-tragenden Gel, wie in der FR-A-2 701 263 beschrieben, erhält.
Gemäß einer ersten Ausführungsform des Verfahrens bindet man das β2'-Glycoprotein I an einen Träger, bindet dann an das β2'-Glycoprotein I eine virale Substanz, die in einer biologischen Flüssigkeit oder einem Extrakt eines biologischen Gewebes enthalten ist, so daß man diese virale Substanz von Substanzen, die nicht geeignet sind, an das β2'-Glycoprotein I zu binden, abtrennt, und bestimmt und/oder weist die auf dem β2'-Glycoprotein I gebundene virale Substanz durch irgendein Verfahren zum Nachweis und/oder zur Bestimmung dieser viralen Substanz nach.
Gemäß einer zweiten Ausführungsform des Verfahrens bindet man die virale Substanz an einen Träger und weist diese mit dem an einen Marker konjugierten β2'-Glycoprotein I nach. Die virale Substanz kann entweder direkt an den Träger oder indirekt, beispielsweise unter Zwischenschaltung eines Antikörpers, gebunden sein. Der Marker kann vorteilhafterweise ein Enzym oder ein radioaktives Produkt sein.
Das β2'-Glycoprotein I ist das Glycoprotein, das man aus dem Rückstand isoliert, der an die Affinitätschromato-graphiebeschriebenen Verfahren zur Reinigung von Blutplasma-Albumin verwendet wird (werden). Gemäß dieser Druckschrift trennt man das Albumin von anderen Proteinen durch ein Flüssigphasenchromatographie-Verfahren ab, bei dem man eine das Albumin enthaltende wäßrige Lösung über eine "hydrophobe" Chromatographiesäule schickt, die mit einem teilchenförmigen Material gefüllt ist, welches geeignet ist, einen Teil anderer Proteine als Albumin zurückzuhalten; zur vollständigen Trennung wird auch vorgeschlagen, die wäßrige Albuminlösung über wenigstens eine Affinitätschromatographiesäule zu schicken, die einen teilchenförmigen, neutralen oder nahezu neutralen, mit einer polysulfatierten Substanz beladenen Träger enthält. Das durch dieses Verfahren erhaltene Eluat besteht aus einer Lösung gereinigten Albumins, wobei der überwiegende Teil der von Albumin verschiedenen Proteine entweder auf der (den) hydrophobe(n) Chromatographiesäule(n) oder auf der (den) Affinitätschromatographiesäule(n) gebunden ist.
Indem man den Träger der oben erwähnten Affinitätschromatographiesäule(n) einer Elution, vorzugsweise einer Elution durch Erhöhung der Ionenstärke, unterzieht, erhält man eine Proteinzusammensetzung, deren Proteingehalt 5 bis 100 Gew.-% β2'-Glycoprotein I umfaßt.
Das β2'-Glycoprotein I besitzt ein Molekulargewicht von 50000 ± 3000 Dalton, wobei die ersten 20 Aminosäuren der N-terminalen Region des β2'-Glycoproteins I wie folgt lauten: Gly-Arg-Thr-Cys-Pro-Lys-Pro-Asp-Asp-Leu-Pro-Phe-Ser-Thr- Val-Val-Pro-Leu-Lys-Thr; mit folgender Aminosäuresequenz 315 bis 321: Phe-Trp-Lys-Ser-Asp-Ala-Ser.
Die durch das β2'-Glycoprotein I erkennbaren viralen Substanzen können insbesondere von folgenden Viren stammen: vorzugsweise das Hepatitis B-Virus (HBV), das Human Immunodeficiency Virus (HIV&sub1; und HIV&sub2;), ebenfalls das Simian Immunodeficiency Virus (SIV) oder das Herpes Simplex Virus (HSV). Es können auch Teilchen oder Proteine viralen Ursprungs oder verwandte Teilchen oder Proteine sein, die bei bestimmten Leukämien oder Myelomen oder dem Gougerot-Sjögren- Syndrom vorkommen.
Gemäß der ersten Ausführungsform des Verfahrens bindet man erfindungsgemäß zunächst das β2'-Glycoprotein I an einen Träger. Es sei bemerkt, daß, falls man eine das β2'-Glycoprotein I und andere Glycoproteine enthaltende Proteinzusammensetzung verwendet, diese anderen Glycoproteine ebenfalls an den Träger binden können. Vorzugsweise verwendet man einen festen Träger, der insbesondere aus einer Mikrotiterplatte, beispielsweise eine ELISA-Mikroplatte, besteht.
Die Bindung des β2'-Glycoproteins I (und gegebenenfalls anderer Proteine) an den Träger erreicht man durch Reaktion von reaktiven Gruppen des Glycoproteins mit reaktiven Stellen des Trägers. Diese Reaktion wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 0 bis 40ºC durchgeführt, wobei das β2'-Glycoprotein I vorzugsweise in einen Puffer mit einem pH-Wert von 4,5 bis 10,5, vorzugsweise von 5,5 bis 6,5, gegeben wird. Der Puffer kann vom Phosphat- oder Acetattyp sein. Die erhaltene Lösung weist vorteilhafterweise eine Konzentration von 0,01 bis 100 mg/l an β2'-Glycoprotein I auf. Der Träger wird vorteilhafterweise mit dem das β2'-Glycoprotein I enthaltenden Puffer bei einer Temperatur von 0 bis 40ºC und während einer Inkubationszeit von 30 Minuten bis 24 Stunden in Kontakt gehalten.
Nach Inkubation trennt man den Puffer ab, der nicht umgesetztes β2'-Glycoprotein I (und gegebenenfalls andere Glycoproteine) enthält, und wäscht den Träger vorzugsweise mit dem gleichen Puffer, der das β2'-Glycoprotein I enthielt. Es kann notwendig sein, die aktiven Stellen des Trägers zu sättigen, die nicht mit dem β2'-Glycoprotein I (oder anderen Glycoproteinen) reagiert haben. In diesem Fall läßt man an diesen aktiven Stellen andere aktive Gruppen reagieren. Zu diesem Zweck verwendet man vorteilhafterweise eine Rinderserumalbumin- oder Caseinlösung, insbesondere eine 2%-ige Lösung in dem für das β2'-Glycoprotein I verwendeten Puffer. Nach Reaktion wird auch der Träger vorzugsweise gespült und getrocknet.
Der gespülte und getrocknete Träger, an dem wenigstens das β2'-Glycoprotein I gebunden ist, kann vor der Bindung viraler Substanzen gelagert werden. Diese Lagerung wird vorzugsweise bei +4ºC bis -20ºC vorgenommen.
Der Träger, an dem wenigstens das β2'-Glycoprotein I (und gegebenenfalls andere Glycoproteine) gebunden ist (sind), wird dann mit einer biologischen Flüssigkeit in Kontakt gebracht, die virale Substanzen enthalten kann. Diese Flüssigkeit wird entweder aus Organen oder biologischen Flüssigkeiten eines unter einer viralen Erkrankung leidenden Patienten gewonnen, oder stammt aus den Überständen viraler "in vitro" Kulturen. Die biologische Flüssigkeit kann Serum, Urin, Cephalorachidialflüssigkeit, Synovialflüssigkeit, Peritonealflüssigkeit, Pleuralflüssigkeit, Seminalflüssigkeit oder Ascitesflüssigkeit sein. Man verwendet vorzugsweise Blutplasma oder Serum. Vorzugsweise verdünnt man die biologische Flüssigkeit mit Hilfe eines Puffers, der einen pH-Wert von 4,5 bis 10, vorteilhafterweise von 5,6, ergibt. Die Reaktion wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 0ºC bis 42ºC, vorteilhafterweise bei ungefähr 37ºC, während einer Dauer von 30 Minuten bis 24 Stunden durchgeführt. Man trennt dann die biologische Flüssigkeit vom Träger ab, an den das β2'-Glycoprotein I (und gegebenenfalls andere Glycoproteine), mit gegebenenfalls davon gebundener viraler Substanz, gebunden ist (sind) . Gegebenenfalls wäscht man danach mit einer vorzugsweise gepufferten Lösung.
Der Nachweis und/oder die Bestimmung der viralen, an das β2'-Glycoprotein I gebundenen Substanzen können durch jedes bekannte Mittel vorgenommen werden, wie die Infektiosität oder der Nachweis spezifischer Nukleinsäuren durch die als "Polymerase-Kettenreaktion (PCR)" bezeichnete Technik. Diese Technik ist beispielsweise in dem Artikel von MULLIS K.B. und FALOONA F.A. in Methods Enzymol. 1987 ,155, Seiten 335-350 beschrieben. Der Nachweis und/oder die Bestimmung werden vorzugsweise mit Hilfe eines Antikörpers vorgenommen, der spezifisch Proteine nachzuweisender viraler Substanzen erkennt. Diese Antikörper können in bekannter Weise an einen enzymatischen Marker, beispielsweise an Peroxidase, konjugiert werden. Der Antikörperüberschuß wird durch Waschen entfernt. Man gibt dann auf bekannte Weise ein Substrat zu, welches für das an den Antikörper konjugierte Enzym spezifische ist und unter bestimmten Bedingungen in ein farbiges Produkt übergeht. Die Bildung dieser farbigen Substanz zeigt die Anwesenheit der gesuchten viralen Substanz an und erlaubt eine Bestimmung dieser viralen Substanz.
Gemäß der zweiten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens bindet man die virale Substanz an einen festen Träger, welcher eine Membran, beispielsweise Nitrocellulose, oder eine Mikrotiterplatte, beispielsweise eine ELISA-Mikroplatte, sein kann.
Die Bindung der viralen Substanz an den Träger kann durch Reaktion reaktiver Gruppen der viralen Substanz mit den reaktiven Stellen des Trägers erreicht werden, falls die Bindung direkt erfolgt, oder durch Bindung einer Substanz, beispielsweise eines Antikörpers, an die reaktiven Stellen des Trägers und Bindung der viralen Substanz an die an den Träger gebundene Substanz. Diese Reaktion wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 0 bis 40ºC durchgeführt, wobei die virale Substanz vorzugsweise in einen Puffer mit einem pH-Wert von 4,5 bis 10,5, vorzugsweise von 6,5 bis 7,5, gegeben wird. Der Puffer kann vom Phosphat- oder Acetattyp sein. Der Träger wird vorteilhafterweise mit dem die virale Substanz enthaltenden Puffer bei einer Temperatur von 0 bis 40ºC und während einer Inkubationszeit von 30 Minuten bis 24 Stunden in Kontakt gehalten.
Nach Inkubation trennt man den Puffer, der nicht umgesetzte virale Substanzen enthält, vom Träger ab und wäscht den Träger vorzugsweise mit dem gleichen Puffer, der die virale Substanz enthielt. Es kann notwendig sein, die aktiven Stellen des Trägers zu sättigen, die nicht mit der viralen Substanz reagiert haben. In diesem Fall läßt man an diesen aktiven Stellen andere aktive Gruppen reagieren. Zu diesem Zweck verwendet man vorteilhafterweise eine Rinderserumalbumin- oder Caseinlösung. Nach Reaktion wird auch der Träger vorzugsweise gespült und getrocknet.
Der Träger, an den die virale Substanz gebunden ist, wird dann mit einer Lösung von β2'-Glycoprotein I, welches an einen Marker konjugiert ist, in Kontakt gebracht. Vorzugsweise verdünnt man die das β2'-Glycoprotein I enthaltende Lösung mit Hilfe eines Puffers, der einen pH-Wert von 4,5 bis 10, vorteilhafterweise von 5,6, ergibt. Die Reaktion wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 0ºC bis 42ºC, vorteilhafterweise bei ungefähr 37ºC, während einer Dauer von 30 Minuten bis 24 Stunden durchgeführt. Man trennt dann die Lösung, die nicht umgesetztes β2'-Glycoprotein I enthält, von dem Träger ab, an den die virale Substanz gebunden ist, die gegebenenfalls β2'-Glycoprotein I gebunden hat. Gegebenenfalls wäscht man dann mit einer vorzugsweise gepufferten Lösung.
Der Nachweis und/oder die Bestimmung der durch das β2' Glycoprotein I erkannten, viralen Substanz werden durchgeführt, indem man ein Substrat zugibt, das für den an das β2'-Glycoprotein I konjugierten Marker spezifische ist, falls der Marker ein Enzym ist, oder indem man die Radioaktivität mißt, falls der Marker radioaktiv ist.
Die folgenden veranschaulichenden Beispiele dienen zum besseren Verständnis der Erfindung, ohne sie zu beschränken.

BEISPIEL 1 Nachweis des Hepatitis B-Virus

A) Bindung des β2'-Glycoproteins 1 an einen Träger

Der verwendete Träger ist eine von der Firma "DYNATECH" vertriebene Mikro-ELISA-Mikrotiterplatte mit 96 flachbödigen Vertiefungen. Man stellt eine Lösung des β2'-Glycoproteins 1 mit einer Konzentration von 10 Mikrogramm/ml (µg/ml) in einem Acetatpuffer her, der 0,05 Mol/l Essigsäure und Acetat enthält und einen pH von 5,6 ± 0,05 aufweist.
Man gibt 100 µl dieser Lösung auf den Boden jeder Vertiefung der Mikroplatte. Diese wird dann 18 Stunden bei +4Cº inkubiert. Die Flüssigkeit wird danach aus jeder Vertiefung abgesaugt. Man bringt dann 300 bis 400 µl Phosphatpuffer, der 0,01 Mol/l Mono- und Dinatriumphosphat und 0,15 Mol/l Natriumchlorid enthält und einen pH von 7,00 ± 0,05 aufweist, in jede Vertiefung ein. Nach 3-minütigem Kontakt mit dem Träger saugt man den Puffer ab; dieser Waschvorgang wird dreimal vorgenommen.
Um die gegebenenfalls noch aktiven Stellen der Mikroplatte zu sättigen, gibt man eine Lösung von 2 Gew.-% Rinderalbumin in dem oben beschriebenen Phosphatpuffer in jede Vertiefung. Die Mikroplatte wird sodann 90 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die in jeder Vertiefung enthaltene Lösung wird danach abgesaugt. Dann wird gewaschen, indem man 300 bis 400 µl Phosphatpuffer pro Vertiefung einbringt, die Lösung 3 Minuten in Kontakt läßt und schließlich die Lösung absaugt; dieser Waschvorgang wird fünfmal wiederholt. Dann trocknet man die Platte.
Die Platte, an der das β2'-Glycoprotein I gebunden ist, wird sodann bei +4ºC oder -20ºC gelagert.

B) Bindung viraler Substanzen

Man verwendet von Patienten, die am Hepatitis B-Virus erkrankt sind, 48 Proben Blutserum, welches das Antigen des Virus HBV (AgHBS) enthält, und zum Vergleich 48 Proben Blutserum aus gesunden Spendern. Jede Serumprobe wird 100-fach verdünnt. Die Verdünnung wird mit Hilfe eines Puffers (Essigsäure/Natriumacetat) mit einer Acetat- und Essigsäurekonzentration von 0,05 Mol/l und einem pH von 5,6 ± 0,05 vorgenommen. Man gibt 100 µl Lösung auf den Boden jeder Vertiefung der gemäß A hergestellten und gelagerten Platte. Die Platte wird 90 Minuten bei +37ºC inkubiert. Nach dieser Inkubation wäscht man, indem man 300 µl Phosphatpuffer in jede Vertiefung gibt, 2 Minuten in Kontakt läßt und die Pufferlösung absaugt; man wiederholt diesen Waschvorgang dreimal.

C) Nachweis viraler Verbindungen

Pro Vertiefung gibt man 100 µl einer Lösung monoklonaler, gegenüber AgHBS des Hepatitis B-Virus spezifischer, Peroxidasekonjugierter Antikörper zu. Man inkubiert die Platte 60 Minuten bei 37ºC. Im Anschluß an diese Inkubation wird der Inhalt der Plattenvertiefungen abgesaugt. Man bringt 300 µl Phosphatpuffer in jede Vertiefung ein und nach einer 2-minütigen Kontaktzeit saugt man den Puffer ab; dieser Waschvorgang wird dreimal wiederholt.
Pro Vertiefung gibt man 100 µl einer Lösung von o-Phenylendiamin 2HCl in einem Natriumcitratpuffer zu. Man inkubiert 30 Minuten bei Normaltemperatur, und stoppt dann die Reaktion, indem man in jede Vertiefung 50 µl H&sub2;SO&sub4;(2N) zugibt. Man mißt die am Ende der Reaktion erhaltene Extinktion bei 492 nm mit Hilfe eines Plattenleseautomaten.
Die für jeden Patienten oder Spender erhaltenen Extinktionsmittelwerte sind in Tabelle I in UDO x 100 aufgeführt. Die Proben A1 bis D12 entsprechen den 48 Seren aus Patienten und die Proben E1 bis H12 den Spenderseren.
Diese Resultate zeigen, daß im Rahmen des erfindungsgemäßen Tests:
1) alle Seren aus gesunden Spendern tatsächlich als negativ erkannt wurden und
2) 77,1% der Seren aus erkrankten Patienten positiv und nur 22,9% als negativ erkannt wurden. TABELLE I

BEISPIEL 2 Nachweis von HIV&sub1;-Virus

Der verwendete Träger ist eine von der Firma "DYNATECH" vertriebene Mikro-ELISA-Mikrotiterplatte mit 96 flachbödigen Vertiefungen. Man stellt eine Lösung des β2'-Glycoproteins I mit einer Konzentration von 10 Mikrogramm/ml (µg/ml) in einem Acetatpuffer her, der 0,05 Mol/l Essigsäure und Acetat enthält und einen pH von 5,6 ± 0,05 aufweist.
Man gibt 100 µl dieser Lösung auf den Boden jeder Vertiefung der Mikroplatte. Diese wird dann 18 Stunden bei +4Cº inkubiert. Die Flüssigkeit wird danach aus jeder Vertiefung abgesaugt. Man bringt dann 300 bis 400 µl Phosphatpuffer, der 0,01 Mol/l Mono- und Dinatriumphosphat und 0,15 Mol/l Natriumchlorid enthält und einen pH von 7,00 ± 0,05 aufweist, in jede Vertiefung ein. Nach 3-minütigem Kontakt mit dem Träger saugt man den Puffer ab; dieser Waschvorgang wird dreimal vorgenommen.
Um die gegebenenfalls noch aktiven Stellen der Mikroplatte zu sättigen, gibt man eine Lösung von 2 Gew.-% Rinderalbumin in dem oben beschriebenen Phosphatpuffer in jede Vertiefung. Die Mikroplatte wird sodann 90 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die in jeder Vertiefung enthaltene Lösung wird danach abgesaugt. Dann wird gewaschen, indem man 300 bis 400 µl Phosphatpuffer pro Vertiefung einbringt, die Lösung 3 Minuten in Kontakt läßt und schließlich die Lösung absaugt; dieser Waschvorgang wird fünfmal wiederholt. Dann trocknet man die Platte.
Man verwendet 17 Proben Serum aus gesunden Spendern und 17 Proben Serum aus HIV&sub1;-infizierten Patienten. Die Serumprobe wird 100-fach in dem oben beschriebenen Acetatpuffer verdünnt. Man gibt 100 µl Lösung auf den Boden jeder Vertiefung der in der oben beschriebenen Weise hergestellten Platte. Die Platte wird dann 90 Minuten bei +37ºC inkubiert. Nach dieser Inkubation wäscht man, indem man 300 µl Phosphatpuffer in jede Vertiefung einbringt, 2 Minuten in Kontakt läßt und die Pufferlösung absaugt; man wiederholt diesen Waschvorgang fünfmal.
Dann gibt man pro Vertiefung 100 µl einer Lösung humaner polyklonaler, gegenüber HIV&sub1; spezifischer, an Peroxidase konjugierter Antikörper, die vom Institut Pasteur-SANOFI vertrieben werden, zu. Die Platte wird 60 Minuten bei +37ºC inkubiert. Im Anschluß an diese Inkubation wird der Inhalt jeder Plattenvertiefung abgesaugt. Man bringt 300 µl Phosphatpuffer in jede Vertiefung ein und nach einer 2-minütigen Kontaktzeit saugt man den Puffer ab; dieser Waschvorgang wird dreimal wiederholt.
Pro Vertiefung gibt man 100 µl einer Lösung von o-Phenylendiamin -2HCl in Natriumcitratpuffer zu. Man inkubiert 30 Minuten bei Raumtemperatur, und stoppt dann die Reaktion, indem man in jede Vertiefung 50 µl H&sub2;SO&sub4;(2N) zugibt. Man mißt die am Ende der Reaktion erhaltene Extinktion bei 492 nm mit Hilfe eines Plattenleseautomats.
Die erhaltenen Resultate sind in der nachfolgenden Tabelle II aufgeführt:
Man erkennt, daß
- für alle Seren aus gesunden Spendern die Extinktion geringer als 0,1 ist;
- von den Seren aus erkrankten Patienten
- 12 eine Extinktion von mehr als 0,2 UDO (d.h 70%) aufweisen;
- 4 eine Extinktion von 0,1 bis 0,2 UDO (d.h. 23,5%) aufweisen;
- (infolgedessen 93,5% als positiv betrachtet werden können);
- 1 mit einer Extinktion von weniger als 0,1 als negativ (6,5%) betrachtet wird.

BEISPIEL 3

Unterschiedliche Mengen (300 ng, 30 ng, 3 ng und 0 ng) an rekombinantem p26-HIV&sub2;-ROD-Protein, gelöst in einem wäßrigem Gemisch aus Ethanolamin (12 g/l) und Glycin (24 g/l), werden über eine Nitrocellulosemembran (BA 83, Schleicher & Schuell) filtriert, indem man in unterschiedlichen Bereichen von wenigen mm³ (1 bis 3) absaugt, so daß auf der Membran wenigstens ein Teil des rekombinanten Proteins zurückgehalten wird. Die Membran wird dann durch Inkubation in Gegenwart einer 1 Gew.-%igen Lösung von Polyvinylpyrrolidon mit einem Molekuargewicht von nahezu 10 000 kD in dem gleichen obigen Gemisch aus Ethanolamin und Glycin gesättigt. Dann spült man mit einer Pufferlösung, die 5 mM NaH&sub2;PO&sub4;, 5 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 125 mM NaCl und 0,05 Gew.-% "TWEEN 20" enthält.
Man läßt etwa 40 ng an alkalische Phosphatase gekoppeltes β2'-Glycoprotein I, das in 200 µl des oben beschriebenen Phosphatpuffers gelöst ist, 1 Stunde bei 37ºC auf der Membran reagieren. Dann spült man dreimal mit der obigen Lösung aus Ethanolamin und Glycin. Man ermittelt die Aktivität der alkalischen Phosphatase in Gegenwart von Nitrotetrazoliumblau (NBT) und 4-Brom-4-chlor-3-indolylphosphat (BCIP) in einer Lösung von Tris(hydroxymethyl)aminomethan (50 mM) mit pH 8 und NaCl (0,1 M). Auf der Membran erkennt man, daß das β2'-Glycoprotein I die Erkennung rekombinanten p26-HIV&sub2;-Proteins in den Bereichen, wo es vorhanden ist, gestattet, wobei die Membran in diesen Bereichen mehr oder weniger gefärbt ist. Der Kontrollbereich ist unverändert.
Unter denselben Bedingungen findet mit der alkalischen Phosphatase alleine keine Reaktion statt.

BEISPIEL 4

Indem man die Inkubation in Gegenwart von 2000-fach verdünntem fötalem Kälberserum anstatt von Polyvinylpyrrolidon durchführte, hat man unter ansonst zu Beispiel 3 identischen Bedingungen eine Reaktion mit dem rekombinanten gp 160- HIV&sub1;, LAI-Protein in den mit dem rekombinanten Protein imprägnierten Bereichen beobachtet.

Claims

1. Verfahren zum Nachweis und/oder zur Bestimmung viraler Substanzen, dadurch gekennzeichnet, daß man die viralen Substanzen mit Hilfe des β2'-Glycoproteins I bindet, welches bei einer Aufbereitung zur Reinigung von Blutplasmaalbumin über ein Flüssigkeitsphasenchromatographie-Verfahren erhältlich ist, bei dem man die Albumin enthaltende wäßrige Lösung durch wenigstens eine Hydrophobchromatographiesäule schickt, die mit einem teuchenförmigen Material gefüllt ist, welches geeignet ist, einen Teil der von Albumin verschiedenen Proteine zurückzuhalten, dann die Albuminlösung durch wenigstens eine Affinitätschromatographiesäule schickt, die einen teilchenförmigen neutralen oder nahezu neutralen, mit einer polysulfatierten Substanz beladenen Träger enthält, und man den Träger der vorbezeichneten Aff initätschromatographiesäule (n) einer Elution unterzieht, so daß eine Proteinzusammensetzung erhalten wird, die das β2'-Glycoprotein I enthält, dessen 20 erste Aminosäuren der N-terminalen Region Gly-Arg-Thr-Cys-Pro- Lys-Pro-Asp-Asp-Leu-Pro-Phe-Ser-Thr-Val-Val-Pro-Leu-Lys- Thr sind und dessen Molekulargewicht 50000 ± 3000 Dalton beträgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das β2'-Glycoprotein I in reiner Form oder in Form einer Proteinzusammensetzung im Gemisch mit anderen Glycoproteinen verwendet.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine in einer biologischen Flüssigkeit oder einem Extrakt eines biologischen Gewebes enthaltene virale Substanz an das β2'-Glycoprotein I bindet, so daß man diese virale Substanz von Substanzen abtrennt, die nicht an das β2'- Glycoprotein I binden können, und man die an das β2'- Glycoprotein I gebundene virale Substanz durch ein für den Nachweis dieser viralen Substanz bekanntes Verfahren nachweist und/oder bestimmt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die virale Substanz an einen Träger bindet und sie mit dem an einen Marker gekoppelten β2'- Glycoprotein I anzeigt.

5C Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die durch das β2'-Glycoprotein I gebundenen viralen Substanzen vom Hepatitis B-Virus (HBV) und vom humanen Immundefekt-Virus (HIV&sub1; und HIV&sub2;) herrühren.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die durch das β2'-Glycoprotein I gebundenen viralen Substanzen vom Affen-Immundefekt-Virus (SIV) oder vom Herpes simplex-Virus (HSV) herrühren.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die durch das β2'-Glycoprotein I gebundenen viralen Substanzen Teilchen oder Proteine viralen Ursprungs oder vewandte Teilchen oder Proteine sind, die bei Leukämien oder Myelomen oder bei dem Gougerot-Sjögren-Syndrom auftreten.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger, an den man das β2'-Glycoprotein I oder die virale Substanz bindet, ein fester Träger ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der feste Träger eine ELISA-Mikroplatte ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 5 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß vor der Reaktion zur Bindung des β2'- Glycoproteins I an den Träger das β2'-Glycoprotein I in einem Puffer mit einem pH-Wert von 4,5 bis 10,5 in Lösung gebracht wird.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer vom Phosphat- oder Acetattyp ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß das β2'-Glycoprotein I in dem Puffer in einer Konzentration von 0,01 bis 100 mg/l vorliegt.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß inan die Reaktion zur Bindung des β2'- Glycoproteins I an den Träger durchführt, indem man den das β2'-Glycoprotein I enthaltenen Puffer mit dem Träger bei einer Temperatur von 0 bis 40ºC während einer Inkubationszeit von 30 Minuten bis 24 Stunden in Kontakt bringt.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß man von dem Träger die Lösung abtrennt, die das β2'-Glycoprotein I enthält, welches nicht mit dem Träger reagiert hat, und man den Träger wäscht.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man den Träger mit dem gleichen Puffer wäscht, den man verwendet hat, um das β2'-Glycoprotein I in Lösung zu bringen.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder 5 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man nach Bindung des β2'- Glycoproteins I die aktiven Zentren des Trägers, die nicht mit dem β2'-Glycoprotein I reagiert haben, sättigt.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zentren mit Hilfe einer Rinderserumalbumin- oder Caseinlösung sättigt.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 5 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger, an dem zumindest das β2'-Glycoprotein I gebunden ist, vor der Bindung viraler Substanzen gelagert wird.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 5 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Flüssigkeit ein Serum, ein Plasma, Urin, Cephalorachidialflüssigkeit, Synovialflüssigkeit, Peritonealflüssigkeit, Pleuralflüssigkeit, Seminalflüssigkeit, Ascitesflüssigkeit oder der überstand viraler Kulturen "in vitro" oder ein zellulärer Extrakt ist.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 5 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Flüssigkeit mit Hilfe eines Puffers verdünnt wird, wobei sich ein pH-Wert von 4,5 bis 10,0 ergibt.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 5 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion zur viralen Bindung bei einer Temperatur von 0 bis 42ºC während einer Dauer von 30 Minuten bis 24 Stunden durchgeführt wird.

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß man nach der viralen Bindung die biologische Flüssigkeit vom Träger abtrennt und den Träger wäscht.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 5 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß man den Nachweis und/oder die Bestimmung der unter Zwischenschaltung des β2'-Glycoproteins I an den Träger gebundenen viralen Substanz mit Hilfe eines Antikörpers vornimmt.

24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper an einen enzymatischen Marker gekoppelt ist.

25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Substrat zugibt, für welchen das an den Antikörper gekoppelte Enzym spezifisch ist.

26. Träger, an den zumindest das im Hinblick auf die Ausführung des Verfahrens gemäß Anspruch 18 hergestellte β2'- Glycoprotein I gebunden ist.