DE102004033987A1

DE102004033987A1 - Verfahren zum spezifischen Nachweis des Bakteriums Taylorella equigenitalis

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Publication number: DE102004033987A1
Application number: DE200410033987
Authority: DE
Inventors: Susanne Kniezner; Gerhard Driesel; Lothar Prix
Original assignee: BIOFOCUS GES fur BIOLOG ANALY; Biofocus Gesellschaft fur Biologische Analytik Mbh
Current assignee: BIOFOCUS GES fur BIOLOG ANALY; Biofocus Gesellschaft fur Biologische Analytik Mbh
Priority date: 2004-07-14
Filing date: 2004-07-14
Publication date: 2006-02-16
Anticipated expiration: 2024-07-15
Also published as: DE102004033987B4

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum spezifischen Nachweis des Bakteriums Taylorella equigenitalis durch Amplifikation eines Abschnittes der bakteriellen DNA, wobei die Koamplifikation eines internen, artifiziellen Standards besondere Vorteile bietet. In der klinisch-diagnostischen Anwendung ist das Verfahren vor allem deswegen überlegen, weil es gegenüber sehr nahe verwandten Bakterien, wie Taylorella asinigenitalis, zu differenzieren vermag. Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren bestimmte Oligonukleotide, Nukleinsäuren, deren Verwendung und diese enthaltende Zusammensetzungen sowie entsprechende Analysekits.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum spezifischen Nachweis des Bakteriums Taylorella equigenitalis durch Amplifikation eines Abschnittes der bakteriellen DNA, wobei die Koamplifikation eines internen, artifiziellen Standards besondere Vorteile bietet. In der klinisch-diagnostischen Anwendung ist das Verfahren vor allem deswegen überlegen, weil es gegenüber sehr nahe verwandten Bakterien, wie Taylorella asinigenitalis, zu differenzieren vermag. Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren bestimmte Oligonukleotide, Nukleinsäuren, deren Verwendung und diese enthaltende Zusammensetzungen sowie entsprechende Analysekits.
Taylorella equigenitalis ist ein auch als Keim zu bezeichnendes gram-negatives, kokkoides Stäbchenbakterium, welches bei Pferden die kontagiöse equine Metritis (contagious equine metritis, CEM) verursacht. Diese hochansteckende Deckinfektion führt bei Stuten unter anderem zu Vaginitis, Cervizitis und Endometritis.
Die klinischen Anzeichen akuter Infektionen bei Stuten sind schleimiger, teils eitriger Vaginalausfluss, vorübergehende Sterilität sowie Spontanaborte. Bei einem chronischen Verlauf sind die Symptome weniger auffällig und der Vaginalausfluss tritt erst bis zu 80 Tagen nach der Infektion auf. Sogar bei Stuten mit klinisch unauffälligem Trägerstatus sind die Bakterien als Teil der Vaginalflora bereits infektiös!
Als echte Geschlechtskrankheit wird die CEM vorwiegend beim Deckakt übertragen. Iatrogene Übertragungsmöglichkeiten bestehen z.B. beim direkten Kontakt und bei der künstlichen Besamung. Da Hengste bei einer Infektion aber keine Symptome zeigen, besteht ein hohes Risiko einer unbemerkten Übertragung der Erreger.
Die Krankheit hat sich seit ihrem ersten Auftreten 1977 weltweit verbreitet. Um die Verbreitung einzudämmen, ist ein systematisches Screening von Hengsten zu Beginn jeder Züchtungssaison zwingend erforderlich.
Eine serologische Diagnostik ist nur bei akuten Infektionen der Stute erfolgreich, nicht aber bei infizierten, klinisch jedoch gesunden Pferden. Bei Hengsten ist die Serologie gänzlich ohne Aussagekraft, da das Bakterium nur oberflächlich die Genitalien kontaminiert und somit dem Immunsystem nicht zugänglich ist.

Besteht ein Verdacht, ist zu seiner Bestätigung daher eine bakteriologische Untersuchung notwendig. Der Keim wird dazu auf speziellen Selektivnährböden isoliert. Da Taylorella equigenitalis jedoch sehr langsam wächst, beträgt die Isolierungszeit 6 bis 14 Tage oder mehr. In dieser Zeit besteht die Gefahr einer Überwucherung durch Keime der schnellwachsenden Normalflora. Zudem wird die klassische Diagnostik dadurch beeinträchtigt, dass häufig ein phänotypisch von Taylorella equigenitalis nicht zu unterscheidendes Bakterium vorkommt, welches ebenfalls auf dem CEM-Selekitvmedium wächst (Jang SS, Donahue JM, Arata AB, Goris J, Hansen LM, Earley DL, Vandamme PA, Timoney PJ, Hirsh DC. Taylorella asinigenitalis sp. nov., a bacterium isolated from the genital tract of male donkeys (Equus asinus). Int J Syst Evol Microbiol. 2001; 51(Pt 3):971-6). Dieses Bakterium, Taylorella asinigenitalis, ist zwar infektiös, verursacht aber keine Erkrankung.

Für den spezifischen Nachweis von Bakterien mittels PCR werden üblicherweise Sequenzen aus den konservierten Genen der 16S ribosomalen RNA herangezogen. Diese Gene liegen in vielen Kopien im bakteriellen Genom vor und erhöhen somit die Sensitivität des Nachweises. Ähnlichkeiten in diesen Genen zwischen den Bakterienspezies weisen auf eine phylogenetische Verwandtschaft hin.

Einem ersten Bericht über den Nachweis von Taylorella equigenitalis mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) zufolge werden Primer verwendet, deren komplementäre Sequenz in den Genomen von Taylorella equigenitalis und Taylorella asinigenitalis nahezu identisch ist und somit davon ausgegangen werden muss, dass beide Erreger amplifiziert werden (Bleumink-Pluym NM, Werdler ME, Houwers DJ, Parlevliet JM, Colenbrander B, van der Zeijst BA. Development and evaluation of PCR test for detection of Taylorella equigenitalis. J Clin Microbiol. 1994; 32(4):893-6).

Nun wurden kürzlich PCR-Verfahren publiziert, die eine Unterscheidung zwischen Taylorella equigenitalis und Taylorella asinigenitalis erlauben sollen.

Ein solches Verfahren verwendet die wegen des hohen apparativen Aufwandes nachteilige Real-Time-PCR, wobei nur die verwendete Sonde, nicht jedoch die Primer spezifisch für Taylorella equigenitalis sind (Premanandh J, George LV, Wernery U, Sasse J. Evaluation of a newly developed real-time PCR for the detection of Taylorella equigenitalis and discrimination from T. asinigenitalis. Vet Microbiol. 2003; 95(4): 229-37). In einem anderen Verfahren werden Primer verwendet, welche die DNA aus Taylorella asinigenitalis angeblich nicht amplifizieren sollen (Arata AB, Cooke CL, Jang SS, Hirsh DC. Multiplex polymerase chain reaction for distinguishing Taylorella equigenitalis from Taylorella equigenitalis-like organisms. J Vet Diagn Invest. 2001; 13(3):263-4). Im Gegensatz zur Real-Time-PCR erfolgt die Kontrolle der PCR-Amplifikation dabei in einem separaten, eigenen PCR-Ansatz, was ebenfalls mit zusätzlichem Aufwand verbunden ist.

Es war daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, einen einfach durchzuführenden aber spezifischen und sensitiven Nachweis des pathogenen Keims Taylorella equigenitalis zur Verfügung zu stellen, mit dem sich Keime der Normalflora und insbesondere des nicht pathogenen, eng verwandten Bakteriums Taylorella asinigenitalis (falsch-positive Resultate) ausschließen lassen. Ferner war es Aufgabe, auch eine unspezifische Inhibition der dem Nachweis zugrunde liegenden Reaktion (falsch-negative Resultate) ausschließen zu können.

Diese Aufgaben löst das erfindungsgemäße Verfahren durch die Verwendung von wenigstens zwei Oligonukleotiden, die eine bestimmte Nukleotidsequenz umfassen, sowie einer besonderen Ausführungsform des Verfahrens zufolge durch Einsatz einer koamplifizierbaren Nukleinsäure.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein Verfahren zum Nachweis des Bakteriums Taylorella equigenitalis mittels Nukleinsäureamplifikation, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man für die Amplifikation wenigstens zwei Oligonukleotide verwendet, von denen ein erstes Oligonukleotid wenigstens 15 konsekutive Basen aus der Nukleotidsequenz 5'-TTGTCAGGGAAGAAAAGGTTTGTGT-3' (SEQ ID NO:1) umfasst und ein zweites Oligonukleotid wenigstens 15 konsekutive Basen aus der Nukleotidsequenz 5'-GGATTTCACATCTCTCTTTCCGAA-3' (SEQ ID NO:2) umfasst.

Das erfindungsgemäße Verfahren dient insbesondere zum Nachweis des Bakteriums Taylorella equigenitalis in einer biologischen Probe, wobei man:

– die biologische Probe oder einen Teil davon in einer für die Nukleinsäureamplifikation geeigneten Form bereitstellt;
– wenigstens zwei Oligonukleotide, von denen ein erstes Oligonukleotid wenigstens 15 konsekutive Basen aus der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:1 umfasst und ein zweites Oligonukleotid wenigstens 15 konsekutive Basen aus der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:2 umfasst, auf die Probe oder den Teil davon einwirken lässt; und
– bestimmt, ob Nukleinsäure amplifiziert ist.

Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens setzt man der Probe oder dem Teil davon eine Nukleinsäure zu, welche koamplifizierbar ist. Diese koamplifizierbare Nukleinsäure umfasst eine heterologe Nukleotidsequenz, wodurch das aus der Koamplifikation resultierende Koamplifikat von dem eigentlichen, dem Nachweis des Bakteriums Taylorella equigenitalis dienenden, aus der Amplifikation einer Nukleotidsequenz aus dem Genom von Taylorella equigenitalis resultierenden Amplifikat unterscheidbar ist.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sind insbesondere folgende Vorteile verbunden:
Das Verfahren differenziert eindeutig zwischen Keimen der Species Taylorella equigenitalis einerseits, und Keimen anderer Species andererseits. Insbesondere führt das Vorkommen von Bakterien der Species Taylorella asinigenitalis nicht zu falsch-positiven Resultaten.

Keime der Species Taylorella equigenitalis lassen sich ausgehend von wenigen DNA-Kopien (z.B. 25 fg DNA, was etwa 5 Genomkopien entspricht) des Bakteriums mit hoher Sensitivität nachweisen.

Aufgrund der hohen Sensitivität kann der Nachweis auch direkt aus Abstrichmaterial ohne vorherige Anzucht des Erregers auf Nährböden erfolgen.

Das Verfahren gibt Auskunft über eine eventuelle Anwesenheit von Inhibitoren, welche die Amplifikationsreaktion stören.

Der apparative Aufwand ist vergleichsweise gering.

In den Zeichnungen zeigt

1 ein Sequenz-Alignment von 16s rRNA-Genabschnitten verschiedener Taylorella equigenitalis-Stämme und weiterer Stämme dazu verwandter Bakterienarten (AB069660: Taylorella equigenitalis-Stamm K188; AF297172: Taylorella equigenitalis-Stamm 10783; AF297173: Taylorella equigenitalis-Stamm 96-178; AF408197: Taylorella equigenitalis-Stamm NCTC11184; AF297174: Taylorella asinigenitalis-Stamm UK-1; AF297175: Taylorella asinigenitalis-Stamm UK-2; AF067729: Taylorella asinigenitalis-Stamm UCD-1; AJ251911: Oligella urethralis; AB119535: Pseudomonas aeruginosa; AF390084: Klebsiella pneumoniae; AJ269514: Neisseria weaveri; L04321: Bacteroides ureolyticus), wobei die Pfeile spezielle, erfindungsgemäß geeignete Oligonukleotide angeben;

2 die gelelektrophoretische Auftrennung von PCR-Produkten, die durch (Ko)Amplifikation verschiedener Kontrollproben mit den erfindungsgemäßen Primern Teq_417us (SEQ ID NO:1) und Teq_567ds (SEQ ID NO:2) sowie der erfindungsgemäßen koamplifizierbaren Nukleinsäure (als internem Kontrollstandard) erhalten wurden (Spur 1: T. equigenitalis (2.5 pg DNA); Spur 2: Pasteurella spc. (200 ng DNA); Spur 3: Neisseria spc. (200 ng DNA); Spur 4: E.coli (400 ng DNA); Spur 5: Klebsiella oxytoca (100 ng DNA); Spur 6: Pseudomonas aeroginosa (100 ng DNA); Spur 7–9 T. asinigenitalis (2 pg, 200 pg, 200 ng DNA); Spur 10: H₂O Negativkontrolle), wobei lediglich die T. equigenitalis-Probe eine Bande bei 174 bp zeigt, wohingegen alle Proben ein Signal des internen Kontrollstandards (253 bp) aufweisen;

3 die gelelektrophoretische Auftrennung von PCR-Produkten, die durch (Ko)Amplifikation abnehmender Konzentrationen von T. equigenitalis-Proben sowie der erfindungsgemäßen koamplifizierbaren Nukleinsäure (als internem Kontrollstandard) mit den erfindungsgemäßen Primern Teq_417us (SEQ ID NO:1) und Teq_567ds (SEQ ID NO:2) erhalten wurden (Spur 1: Negativkontrolle (H₂O), Spur 2: Negativkontrolle (T. asinigenitalis), Spur 3–7: T. equigenitalis-DNA (25 pg (Spur 3), 2.5 pg (Spur 4), 250 fg (Spur 5), 25 fg (Spur 6), 2.5 fg (Spur 7));

4 die gelelektrophoretische Auftrennung von PCR-Produkten, die durch Amplifikation von unterschiedlichen Mengen humaner DNA (Zelllinie SW 480; Spur 1+2: 80 ng, Spur 3: 40 ng, Spur 4: 20 ng. Spur 5: Negativkontrolle) mit den Kombi-Primern Te417DR20 (SEQ ID NO:3) und Te567DR200 (SEQ ID NO:4) erhalten wurden;

5 die gelelektrophoretische Auftrennung von PCR-Produkten, die durch erneute Amplifikation serieller log-Verdünnungen der in 4 gezeigten PCR-Produkte mit den erfindungsgemäßen Primern Teq_417us (SEQ ID NO:1) und Teq_567ds (SEQ ID NO:2) (Spur 1 – 4: Verdünnung 10^–6 bis 10^–9, Spur 5: Negativkontrolle) erhalten wurden;

6 die gelelektrophoretische Auftrennung von PCR-Produkten nach Abtrennung der Primer-Dimere aus den in 5 gezeigten PCR-Produkten;

7 die gelelektrophoretische Auftrennung von PCR-Produkten, die durch (Ko)Amplifikation serieller Verdünnungen der gelgereinigten koamplifizierbaren Nukleinsäure (als internem Kontrollstandard) und konstanter DNA-Menge von T. equigenitalis mit den erfindungsgemäßen Primern Teq_417us (SEQ ID NO:1) und Teq_567ds (SEQ ID NO:2) erhalten wurden (Spur 1–8: Standard-Verdünnungen (log-Stufen) 10^–6 bis 10^–13, Spur 9: Negativkontrolle);

8 die gelelektrophoretische Auftrennung von PCR-Produkten, die durch Amplifikation von DNA aus 19 Feldisolaten von T. equigenitalis (Spur 2 – 20) und der gelgereinigten koamplifizierbaren Nukleinsäure (als internem Kontrollstandard) mit den erfindungsgemäßen Primern Teq_417us (SEQ ID NO:1) und Teq_567ds (SEQ ID NO:2) erhalten wurden;

9 konsekutive Abfolgen von 18, 19, 20, 21, 22, 23 und 24 Basen aus der Sequenz SEQ ID NO:1;

10 konsekutive Abfolgen von 18, 19, 20, 21, 22 und 23 Basen aus der Sequenz SEQ ID NO:2.

Dem erfindungsgemäßen Verfahren liegt eine Amplifikation von Nukleinsäure der 16S rRNA Gene zugrunde. Die dazu verwendeten Oligonukleotide dienen als Primer, d.h. bei Anlagerung der Oligonukleotide an einen hinreichend komplementären Sequenzabschnitt einzelsträngiger Nukleinsäure als Startpunkt für die Elongation einer Polymerase.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher auch Primer, d.h. als Primer geeignete Oligonukleotide, welche wenigstens 15 konsekutive Nukleotide entweder aus der Sequenz SEQ ID NO:1 oder aus der SEQ ID NO:2 umfassen, sowie die Verwendung solcher Oligonukleotide als Primer bei der spezifischen Amplifikation eines Sequenzabschnitts aus dem Genom von Taylorella equigenitalis.

Folglich weisen die erfindungsgemäßen Oligonukleotide eine Nukleotidsequenz auf, die es ihnen ermöglicht, mit bestimmten Sequenzabschnitten (Primeranlagerungsstellen) auf Nukleinsäure, vorzugsweise DNA, von Taylorella equigenitalis zu hybridisieren. Dabei sind die den Primerbindungsstellen entsprechenden genomischen Sequenzen von Taylorella equigenitalis so gewählt, dass sie eine möglichst geringe Sequenzidentität mit den entsprechenden genomischen Sequenzen anderer Keimen der Normalflora aufweisen.

Zu den anderen Keimen der Normalflora zählen insbesondere diejenigen, die aus dem Genitaltrakt von Pferden auf CEM-Selektivnährböden isoliert werden können, z.B. E. coli, Pasteurella spec., Klebsiella oxytoca, Neisseria spec, Oligella spec, Pseudomonas spec. sowie T. asinigenitalis.

Zu CEM-Selektivnährböden gehören Nährböden, die üblicherweise zur Anzucht von Taylorella equigenitalis verwendet werden, d.h. insbesondere Nährböden mit Kochblut und bestimmten Antibiotika wie Amphotericin B, Streptomycin, Clindamycin, Trimethoprim und Kombinationen davon. Zu nennen sind z.B. Kochblutagar auf C.E.M.O.-, Eugon- oder Columbia-Agarbasis mit L-Cystein/Natriumsulfit-Supplement. Was den Anibiotikazusatz angeht, so kann man z.B. Kochblutagar mit Amphotericin B (nicht selektiv), Kochblutagar mit Amphotericin B und Streptomycin (selektiv); und/oder Kochblutagar – gegebenenfalls unter Zusatz von lysiertem Pferdeblut – mit Amphotericin B, Clindamycin und Trimethoprim (selektiv) verwenden.

Bevorzugt sind demnach Oligonukleotide (Primer), deren Sequenz komplementär zu einem Sequenzabschnitt des 16S rRNA-Gens von Taylorella equigenitalis ist, nicht jedoch zu den homologen Sequenzen der anderen Keime. Fehlpaarungen insbesondere am 3'-Ende der Primer bei Anlagerung an die entsprechende Nukleinsäure der anderen Keime sind erfindungsgemäß von Vorteil.

Diesen Vorgaben entsprechend sind die erfindungsgemäßen Oligonukleotide so gewählt, dass zumindest ein Teil ihrer Sequenz einer konsekutiven Abfolge von wenigstens 15, vorzugsweise wenigstens 18, z.B. wenigstens 19, 20, 21, 22, 23 oder 24 konsekutiven Basen aus der Sequenz SEQ ID NO:1 bzw. SEQ ID NO:2 entspricht. Derartige konsekutive Abfolgen aus der Sequenz SEQ ID NO:1 sind demnach vorzugsweise ausgewählt unter den in 9 gezeigten Sequenzen und konsekutive Abfolgen aus der Sequenz SEQ ID NO:2 sind demnach vorzugsweise ausgewählt unter den in 10 gezeigten Sequenzen. Dabei dient das auf Sequenz SEQ ID NO:1 basierende Oligonukleotid vorzugsweise als Sense-Primer (forward) und das auf Sequenz SEQ ID NO:2 basierende Oligonukleotid vorzugsweise als Antisense-Primer (reverse).

Einer besonderen Ausführungsform zufolge umfassen erfindungsgemäße Oligonukleotide die Sequenz SEQ ID NO:1 bzw. SEQ ID NO:2.

Zusätzlich zu den durch die Sequenzen SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:2 vorgegebenen Basen können erfindungsgemäße Oligonukleotide am 3'-Ende und/oder 5'-Ende weitere Basen aufweisen. Um eine effektive Elongation zu gewährleisten, sollten weitere Basen am 3'-Ende ebenfalls zu den entsprechenden genomischen Sequenzen von Taylorella equigenitalis komplementär sein, während am 5'-Ende eine Komplementarität nicht zwingend ist.

Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide besitzen üblicherweise eine Länge von bis zu 50, vorzugsweise von bis zu 40 und insbesondere von bis zu 30 Basen, z.B. von bis zu 29, 28, 27, 26, oder 25 Basen. Einem anderen Aspekt zufolge besitzen sie üblicherweise eine Länge von mindestens 15, vorzugsweise von mindestens 18 und insbesondere von mindestens 20 Basen, z.B. von mindestens 21, 22 23, 24 oder 25 Basen.

Von den sich aus diesen Grenzwerten ergebenden Bereichen sind insbesondere die Bereiche von 15–30 Basen und vor allem 18–25 Basen als bevorzugte Bereiche zu nennen.

Weiteren Aspekten zufolge ist es bevorzugt, dass die erfindungsgemäßen Oligonukleotide einen G/C-Gehalt im Bereich von 40 bis 60 % aufweisen; keine internen Sekundärstrukturen, z.B. Palindrome, ausbilden; und/oder zueinander nicht komplementär sind, also keine Dimere bilden.

Einer bevorzugten Ausführungsform zufolge, werden die Primer Teq_417us (SEQ ID NO:1) und Teq_567ds (SEQ ID NO:2) verwendet. Verwendet man diese Primer, weist das Amplifikat eine Länge von 174 bp auf. Diese Ausführungsform ist vor allem zum diagnostischen Nachweis von Taylorella equigenitalis geeignet.

Der Begriff "Oligonukleotid" meint ein Oligomer aus Ribonukleinsäure (RNA) oder Desoxyribonukleinsäure (DNA) oder Mimetika davon. Hierzu gehören Oligonukleotide, die aus natürlich vorkommenden Nukleobasen, Zuckern und kovalenten Internukleosid-Verknüpfungen (Rückgrat) bestehen, genauso wie Oligonukleotide mit Strukturen, die in der Natur nicht vorkommen, deren Funktion aber den natürlich vorkommenden ähnlich ist. Derartige Oligonukleotide können erfindungsgemäß insbesondere dann von Vorteil sein, wenn sie eine selektivere Anlagerung an die Target-Nukleinsäuren und/oder eine effektivere Elongation durch Polymerase gewährleisten.

Insbesondere können die Nukleotide Modifizierungen oder Substitutionen an den Nukleobasen (hier auch einfach als "Base" bezeichnet) aufweisen. Zu den nicht modifizierten oder natürlichen Nukleobasen gehören die Purinbasen Adenin (A) und Guanin (G), und die Pyrimidinbasen Thymin (T), Cytosin (C) und Uracil (U). Zu modifizierten Nukleobasen (Mimetika der natürlichen Nukleobasen) gehören synthetische Nukleobasen wie 5-Methylcytosin (5-Me-C), 5-Hydroxymethylcytosin, Xanthin, Hypoxanthin, 2-Aminoadenin, 6-Methyl- und weitere Alkyl-Derivate von Adenin und Guanin, 2-Thiouracil, 2-Thiothymin und 2-Thiocytosin, 5-Halouracil und 5-Halocytosin, 5-Propinyluracil und 5-Propinylcytosin, 6-Azouracil, 6-Azocytosin und 6-Azothymin, 5-Uracil (Pseudouracil), 4-Thiouracil, 8-Halo-, 8-Amino-, 8-Thiol-, 8-Thioalkyl-, 8-Hydroxyl- und weitere 8-substituierte Adenine und Guanine, 5-Halo-, insbesondere 5-Bromo-, 5-Trifluormethyl- und weitere 5-substituierte Uracile und Cytosine, 7-Methylguanin und 7-Methyladenin, 8-Azaguanin und 8-Azaadenin, 7-Deazaguanin und 7-Deazaadenin und 3-Deazaguanin und 3-Deazaadenin. Von diesen Nukleobasen sind bestimmte besonders brauchbar zur Erhöhung der Bindungsaffinität. Hierzu gehören 5-substituierte Pyrimidine, 6-Azapyrimidine und N-2-, N-6- und O-6-substituierte Purine, z.B. 2-Aminopropyladenin, 5-Propinyluracil und 5-Propinylcytosin.

Die Anordnung der Nukleobasen in erfindungsgemäßen Oligonukleotiden wird in der Regel dadurch gewährleistet, dass die Nukleobasen in geeigneter Weise miteinander verknüpft sind. In der Regel ergibt sich ein Oligomer mit einer konsekutiven Abfolge von Nukleobasen (Sequenz), die über ein die Hauptkette bildendes Rückgrat miteinander verknüpft sind. Lineare Oligomere sind bevorzugt.

Bei den Oligonukleotiden handelt es sich in der Regel um miteinander verknüpfte Nukleoside, d.h. Base-Zucker-Kombinationen. Die Nukleoside werden in der Regel durch eine kovalent an den Zuckerteil des Nukleosids gebundene Gruppe miteinander verknüpft. In denjenigen Nukleosiden, die einen Pentofuranosyl-Zucker aufweisen, kann diese Gruppe entweder an die 2'-, 3'- oder 5'-Hydroxylgruppe des Zuckers gebunden sein. In der Regel verknüpfen diese Gruppen kovalent benachbarte Nukleoside miteinander zu einer linearen, oligomeren Verbindung. Innerhalb der Oligonukleotidstruktur bilden die verknüpfenden Gruppen im Allgemeinen das Internukleosid-Rückgrat des Oligonukleotids. Die normale Verknüpfung oder das normale Rückgrat von RNA und DNA sind 3'-5'-Phosphodiester-Verknüpfungen, d.h. die verknüpfenden Gruppen sind Phosphatgruppen.

Zu Oligonukleotiden, die ein modifiziertes Rückgrat bzw. nicht natürliche Internukleosid-Verknüpfungen aufweisen, gehören beispielsweise phosphatfreie Analoga oder Phosphatderivate. Insbesondere sind Phosphothioate, partiell oder vollständig sulfuriert, z.B. chirale Phosphothioate, Phosphomonothioate und Phosphodithioate zu nennen. Weitere modifizierte Rückgrate sind Phosphotriester, Alkylphosphotriester, Aminoalkylphosphotriester, Methyl- und weitere Alkylphosphonate, z.B. 3'-Alkylenphosphonate und chirale Phosphonate, Phosphinate, Phosphoramidate, z.B. 3'-Aminophosphoramidate und Aminoalkylphosphoramidate, Thionophosphoramidate, Thionoalkylphosphonate, Thionoalkylphosphotriester und Borphosphate mit normalen 3'-5'-Verknüpfungen, 2'-5'-verknüpfte Analoga davon, und solche mit entgegengesetzter Polarität, wobei die benachbarten Paare von Nukleosid-Einheiten 3'-5' zu 5'-3' oder 2'-5' zu 5'-2' verknüpft sind.

Besondere Oligonukleotid-Rückgrate ohne Phosphoratom werden im Allgemeinen durch kurzkettige Alkyl- oder Cykloalkyl-Internukleosid-Verknüpfungen, die gegebenenfalls auch Heteroatome oder Heterocyklen umfassen können, gebildet. Hierzu gehören diejenigen mit Morpholino-Verknüpfungen (teilweise vom Zuckerteil des Nukleosids gebildet); Siloxan-Rückgrate; Sulfid-, Sulfoxid- und Sulfon-Rückgrate; Formacetyl- und Thioformacetyl-Rückgrate; Methylenformacetyl- und Thioformacetyl-Rückgrate; Alken-enthaltende Rückgrate; Sulfamat-Rückgrate; Methylenimino- und Methylenhydrazino-Rückgrate; Sulfonate- und Sulfonamid-Rückgrate; Amid-Rückgrate; und weitere mit gemischten N-, O-, S- und CH₂-Komponententeilen.

In weiteren besonderen Oligonukleotiden sind sowohl der Zucker als auch die Internukleosid-Verknüpfung, d.h. das Rückgrat natürlicher Nukleotid-Einheiten modifiziert. Eine derartige oligomere Verbindung, d.h. ein Oligonukleotid mit ausgezeichneten Hybridisierungseigenschaften, wird als "Peptide Nucleic Acid" (PNA) bezeichnet. In PNA-Verbindungen ist das Zucker-Rückgrat eines Oligonukleotids durch ein Amid-artiges Rückgrat, insbesondere ein Aminoethylglycin-Rückgrat, ersetzt. Die Nukleobasen sind erhalten und direkt oder indirekt, beispielsweise über einen Methylcarbonyl-Linker, an die Stickstoffatome des Amidteils des Rückgrats gebunden.

Die Oligonukleotide können auch eine oder mehrere substituierte Zuckergruppen enthalten. Neben der Variation der 4'-Position, beispielsweise bei den 4'-Thio- und 4'-Aza-Derivaten, kann vor allem die 2'-Position substituiert sein, z.B. mit OH, F, O-, S- oder N-Alkyl, O-S- oder N-Alkenyl, O-, S- oder N-Alkinyl, oder O-Alkyl-O-Alkyl, worin Alkyl, Alkenyl und Alkinyl beispielsweise substituiertes oder unsubstituiertes C₁-C₁₀-Alkyl oder C₂-C₁₀-Alkenyl bzw. -Alkinyl sind. Insbesondere sind Substituenten, wie O[(CH₂)_nO]_mCH₃, O(CH₂)_nOCH₃, O(CH₂)_nNH₂, O(CH₂)_nCH₃, O(CH₂)_nNH₂ und O(CH₂)_nON[(CH₂)_nCH₃)]₂, worin n und m ganze Zahlen von 1 bis 10 sind. Zu den Modifizierungen gehört eine Alkoxy-Alkoxy-Gruppe, z.B. 2'-Methoxyethoxy (2'-O-CH₂CH₂OCH₃, ebenfalls als 2'-O-(2-Methoxymethyl) oder 2'-MOE bekannt), zu nennen. Eine weitere Modifizierung ist 2'-Dimethylaminooxyethoxy, d.h. eine O(CH₂)₂ON(CH₃)₂-Gruppe, ebenfalls als 2'-DMAOE bekannt.

Zu weiteren Modifizierungen gehören 2'-Methoxy (2'-O-CH₃), 2'-Aminopropoxy (2'-OCH₂CH₂CH₂NH₂) und 2'-Fluoro (2'-F). Ähnliche Modifizierungen können auch an anderen Positionen des Oligonukleotids, insbesondere an der 3'-Position des Zuckers des 3'-terminalen Nukleotids oder in 2'-5'-verknüpften Oligonukleotiden, und an der 5'-Position des 5'-terminalen Nukleotids vorgenommen werden. Ebenfalls können erfindungsgemäße Oligonukleotide Zucker-Mimetika, wie Cyclobutyl-Gruppen anstatt des Pentofuranosyl-Zuckers aufweisen.

Eine weitere Zuckermodifikation ist unter dem Begriff „locked nucleic acid", kurz LNA bekannt. Hierbei sind das C4'-Atom und das C2'-Atom über eine Methylenbrücke miteinander verknüpft, so dass sich ein [2.2.1]-Bicyclo-Nukleosid ergibt.

Auch können die Oligonukleotide eine oder mehrere Molekülgruppen aufweisen, beispielsweise Markierungen, die dem Nachweis von Nukleinsäure dienen, in die ein erfindungsgemäßes Oligonukleotid während der Amplifikation eingebaut wurde.

Dem Fachmann ist eine Vielzahl geeigneter Markierungen samt dazugehöriger Detektionssysteme bekannt. Fluoreszierende und chemi- oder biolumineszierende Markierungen werden aus Gründen der Sensitivität und praktischen Handhabung bevorzugt.

Prinzipiell geeignet sind Markierungssysteme, die sich z.B. spektroskopisch, photochemisch, biochemisch, immunochemisch, elektrisch, optisch oder chemisch erkennen lassen. Dazu gehören sowohl direkte Markierungssysteme, wie radioaktive Marker (z.B. ³²P, ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C), magnetische Marker, Chromophore, beispielsweise UV-, VIS-, oder IR-absorbierende Verbindungen, Fluorophore, chemi- oder biolumineszierende Marker, Übergangsmetalle, die in der Regel chelatgebunden sind, oder Enzyme, z.B. Meerrettich-Peroxidase oder alkalische Phosphatase und die daran gekoppelten Nachweisreaktionen, als auch indirekte Markierungssysteme, beispielsweise Haptene, wie Biotin oder Digoxigenin, die über entsprechende Nachweissysteme erkannt werden können.

Vorteilhafte Chromophore besitzen eine intensive Farbe, die von den umgebenden Molekülen nur geringfügig absorbiert wird. Farbstoffklassen, wie Chinoline, Triarylmethane, Acridine, Alizarine, Phthaleine, Azoverbindungen, Anthrachinone, Cyanine, Phenazathioniumverbindungen oder Phenazoxoniumverbindungen, seien hier stellvertretend für das breite Spektrum erfindungsgemäß geeigneter Chromophore genannt.

Fluoreszierende Markierungen sind von Vorteil. Man erhält starke Signale mit wenig Hintergrund, hoher Auflösung und hoher Sensitivität. Erfindungsgemäß von Bedeutung ist, daß ein und derselbe Fluorophor je nach Anregung und Detektionsprinzip mehrere unterscheidbare Strahlungen emittieren kann.

Fluorophore können allein oder in Kombination mit einem Quencher (z.B. Molecular Beacons) verwendet werden.

Bevorzugte Fluorophore sind beispielsweise Aminomethylcoumarinessigsäure (AMCA, blau), EDANS, BODIPY 493/503; FL; FL Br2; R6G; 530/550; 558/568; TMR 542/574; TR 589/617; 630/650; 650/665, 6-FAM Fluorescein (grün), 6-OREGON green 488, TET, Cy3 (rot), Rhodamine (rot), 6-JOE, VIC, HEX, 5-TAMRA, NED, 6-ROX, TEXAS Red7 (rot), Cy5, Cy5.5, LaJolla Blue, Cy7, Alexa-Fluor-Carbonsäuren, insbesondere des Typs 647 und 532, z.B. als Succinimidylester, und IRD41.

Besonders bevorzugte Fluorophore sind Cy5, 5-Tamra und Cy3 sowie Alexa-Fluor-Carbonsäuren.

Chemilumineszierende oder biolumineszierende Markierungen sind ebenfalls von Vorteil. Bevorzugte Markierungen dieser Art basieren beispielsweise auf Reaktionen der Alkalischen Phosphatase mit Dioxetan-(AMPPD) oder Acridiniumphosphat-Substraten; der Meerrettichperoxidase mit Luminol- oder Acridiniumester-Substraten; von Mikroperoxidasen oder Metallporphirinsystemen mit Luminol; der Glucoseoxidase, der Glucose-6-phosphatdehydrogenase; oder auch Luciferin/Luciferase-Systemen.

Koamplifizierbar im erfindungsgemäßen Sinne meint amplifizierbar unter gleichen Bedingungen, also beispielweise in einem Ansatz. Insbesondere ist eine Nukleinsäure im erfindungsgemäßen Sinne dann koamplifizierbar, wenn bei Bildung eines Amplifikats, d.h. einer Vervielfältigung einer einem Sequenzabschnitt aus Taylorella equigenitalis entsprechenden Nukleinsäure, auch ein Koamplifikat, d.h. viele Kopien der koamplifizierbaren Nukleinsäure, gebildet wird. Ein Koamplifikat wird also dann gebildet, wenn auch Nukleinsäure des Bakteriums Taylorella equigenitalis amplifiziert wird.

Da das erfindungsgemäße Verfahren so ausgelegt ist, dass ein Amplifikat dann gebildet wird, wenn in der zu untersuchenden biologischen Probe oder dem Teil davon Nukleinsäure des Bakteriums Taylorella equigenitalis zugegen ist, bedingt der Zusatz der koamplifizierbaren Nukleinsäure zu der zu untersuchenden biologischen Probe oder dem Teil davon, dass im Zuge der erfindungsgemäßen (Ko)Amplifikationsreaktion regelmäßig ein Koamplifikat gebildet wird. Wird ein solches Koamplifikat nicht gebildet, ist von einer Hemmung der (Ko)Amplifikationsreaktion auszugehen und das Ergebnis des Nachweises zu verwerten.

Um koamplifizierbar zu sein, umfasst die koamplifizierbare Nukleinsäure Sequenzabschnitte, an die sich die verfahrensgemäß zu verwendenden Oligonukleotide anlagern können. Dabei ist es nicht zwingend erforderlich, wohl aber bevorzugt, dass die Sequenzabschnitte der koamplifizierbaren Nukleinsäure, an die sich die Oligonukleotide anlagern, mit den Sequenzabschnitten der Nukleinsäure aus Taylorella equigenitalis, an die sich die Oligonukleotide ebenfalls anlagern, identisch sind.

Dazu ist die koamplifizierbare Nukleinsäure vorzugsweise so aufgebaut, dass die heterologe Nukleotidsequenz zwischen besagten zu den Oligonukleotiden komplementären Sequenzabschnitten angeordnet ist.

Eine heterologe Nukleotidsequenz im erfindungsgemäßen Sinne ist jede Sequenz, die von der zwischen den Oligonukleotid-Anlagerungsstellen der Nukleinsäure aus Taylorella equigenitalis angeordneten Sequenz unterscheidbar ist.

Dementsprechend ist es bevorzugt, die heterologe Nukleotidsequenz so zu wählen, dass sich die Größe des Amplifikats (der amplifizierten Nukleinsäure des Bakteriums Taylorella equigenitalis) von der Größe des Koamplifikats (der koamplifizierten Nukleinsäure) unterscheidet. Dann kann die Unterscheidung beispielsweise anhand einer Fragmentgrößenauftrennung in einem herkömmlichen Agarosegel erfolgen. Gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens unterscheiden sich das Koamplifikat (253 bp) und das Amplifikat (174 bp) deutlich in ihrer Größe.

Vorzugsweise ist die heterologe Nukleotidsequenz eukaryotischen und insbesondere humanen Ursprungs. Beispielsweise kann man eine Sequenz des humanen NLA-DRA-Gens wählen, z.B. einen Abschnitt aus dem humanen HLA-DR-A1-Gen (Alle) DRA*0102, ID HLA 00663). Einer besonderen Ausführungsform zufolge umfasst die heterologe Nukleotidsequenz die Sequenz SEQ ID NO:6.

Einer weiteren besonderen Ausführungsform zufolge umfasst die koamplifizierbare Nukleinsäure die Sequenzen SEQ ID NO:3 und/oder SEQ ID NO:4, wobei es insbesondere bevorzugt ist, diese Sequenzen vom 5'- zum 3'-Ende gesehen in der Reihenfolge SEQ ID NO:3 und SEQ ID NO:4 anzuordnen, beispielweise wie in SEQ ID NO:5.

Die Herstellung der erfindungsgemäßen Oligonukleotide und koamplifizierbaren Nukleinsäuren kann in an sich bekannter Weise erfolgen, beispielweise in Anlehnung an bekannte Verfahren zur Nukleinsäuresynthese.

Zur Synthese der koamplifizierbaren Nukleinsäuren geht man insbesondere so vor, dass man die heterologe Nukleotidsequenz mit denjenigen Nukleotidsequenzen verknüpft, welche die Koamplifizierbarkeit gewährleisten. Insbesondere kann man zu diesem Zweck die heterologe Nukleotidsequenz amplifizieren, wobei man wenigstens zwei Oligonukleotide verwendet, von denen ein erstes Oligonukleotid wenigstens 15 konsekutive Basen aus der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:1 und ein zweites Oligonukleotid wenigstens 15 konsekutive Basen aus der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:2 umfasst. Als Templat für die Amplifikationsreaktion kann man eine beliebige Nukleinsäure verwenden, welche die heterologe Nukleotidsequenz beinhaltet. Um eine effiziente Amplifikation unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Oligonukleotide zu gewährleisten, sollten diese Oligonukleotide zusätzlich zu den Basen aus den Nukleotidsequenzen SEQ ID NO:1 bzw. SEQ ID NO:2 jeweils eine Nukleotidsequenz umfassen, welche zu entsprechenden Sequenzabschnitten der zu amplifizierenden und die heterologe Nukleotidsequenz beinhaltenden Nukleinsäure komplementär sind. Auf diese Art und Weise soll gewährleistet sein, dass sich die Oligonukleotide an die zu amplifizierende heterologe Nukleinsäure auch dann anlagern können, wenn die Basen aus den Nukleotidsequenzen SEQ ID NO:1 bzw. SEQ ID NO:2 zu Sequenzabschnitten der zu amplifizierenden heterologen Nukleinsäure eine für eine effektive Anlagerung ausreichende Komplementarität nicht aufweisen.

Werden besagte Oligonukleotide als Primer für die PCR-gestützte Herstellung der koamplifizierbaren Nukleinsäure verwendet, so bietet es sich insbesondere an, in den als Primern zu verwendenden Oligonukleotiden die Basen aus den Nukleotidsequenzen SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:2 jeweils 5' zu der heterologen Nukleotidsequenz anzuordnen. Damit ist gewährleistet, dass die PCR zu einem Amplifikat führt, in dem die heterologe Nukleotidsequenz zwischen den Nukleotidsequenzen SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:2 angeordnet ist.

Einer besonderen Ausführungsform zufolge setzen sich die für die Herstellung der koamplifizierbaren Nukleinsäure zu verwendenden Oligonukleotide aus der Sequenz SEQ ID NO:1 bzw. SEQ ID NO:2 und jeweils einer passenden, zur heterologen Nukleotidsequenz komplementären Nukleotidsequenz zusammen. Derartige Oligonukleotide sind also dadurch gekennzeichnet, dass sie am 5'-Ende die Sequenz SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2 aufweisen, die in 3'-Richtung von einer zur heterologen Nukleotidsequenz komplementären Nukleotidsequenz fortgesetzt wird.

Beispielsweise kann man zur Herstellung einer koamplifizierbaren Nukleinsäure, die als heterologe Nukleotidsequenz einen Sequenzabschnitt aus dem humanen HLA-DRA-Gen aufweist, die Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NO:3 und SEQ ID NO:4 verwenden und damit humane DNA amplifizieren.

Das auf diese Weise erhaltene Amplifikat kann gewünschtenfalls einer weiteren Aufreinigung unterzogen werden. So hat es sich als zweckmäßig erwiesen, das Amplifikat zunächst zu verdünnen und dann unter Verwendung wenigstens zweier Oligonukleotide, von denen ein erstes Oligonukleotid wenigstens 15 konsekutive Basen aus der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:1 und ein zweites Oligonukleotid wenigstens 15 konsekutive Basen aus der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:2 umfasst, erneut zu amplifizieren. Von Vorteil ist, wenn die hierfür verwendeten Oligonukleotide den für das Nachweisverfahren verwendeten Oligonukleotiden entsprechen. Damit ist sicher gestellt, dass die durch die erneute Amplifikation resultierende Nukleinsäure im Sinne der Erfindung tatsächlich koamplifizierbar ist.

Eine weitere Aufreinigung der koamplifizierbaren Nukleinsäure kann sich erforderlichenfalls anschließen, beispielsweise zur Abtrennung von Nebenprodukten wie Primern oder Primer-Dimeren.

Die koamplifizierbare, eine heterologe Nukleotidsequenz umfassende Nukleinsäure dient als interner Kontrollstandard, der das eventuelle Vorhandensein von Inhibitoren, welche die Amplifikationsreaktion hemmen, anzeigt. Die Verwendung von eukaryotischen und insbesondere humanen, d.h. zu bakteriellen Genomen nichthomologen, d.h. heterologen Standardsequenzen, ist von Vorteil, da bei der Amplifikation keine Interferenz durch Heteroduplexbildung zwischen Standard und der Zielsequenz auftreten kann.

Der Begriff Amplifikation betrifft die Vervielfältigung von Nukleinsäuren, d.h. die Erzeugung vieler Kopien bestimmter Nukleinsäuren. In der Regel verläuft die Amplifikation wenigstens linear und vorzugsweise exponentiell.

Prinzipiell brauchbar sind die bekannten Amplifikationsverfahren, zu denen die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), mitunter auch als Nested-PCR, Asymmetrische PCR oder Multiplex-PCR durchgeführt, oder alternative Verfahren, wie die Ligase-Kettenreaktion (LCR), Nukleinsäuresequenz-basierende Amplifikation (NASBA), Transkriptions-vermittelte Amplifikation (TMA) und ähnliche, gehören. Bestimmte Versionen dieser Techniken und/oder Kombinationen mit anderen molekularbiologischen Methoden können zweckmäßig sein.

Gemäß einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt das Verfahren zum Nachweis des Bakteriums Taylorella equigenitalis in Anlehnung an die Polymerase-Kettenreaktion (PCR).

Das erfindungsgemäße Nachweisverfahren kann weitere Kontrollen miteinbeziehen. Als Positivkontrolle für die Amplifiationsreaktion kann der Taylorella equigenitalis-Stamm NCTC 11184 von der American Type Culture Collection (ATCC 35865) verwendet werden. Die Bakterienspezies Taylorella asinigenitalis UCD-1 (ATCC 700933), E.coli (ATCC 25922) und Pseudomonas aeroginosa (ATCC 27853) sowie weitere allgemein erhältliche oder auf übliche Art isolierbare Bakterienspezies wie Klebsiella oxytoca, Pasteurella spc und Neisseria spc können als Negativkontrollen dienen. Diese Bakterienstämme können auf geeigneten Nährböden angezüchtet und die DNA aus einer Kolonie in an sich bekannter Weise, z.B. mit dem DNA-Minikit (Qiagen, Deutschland), isoliert werden. Die DNA-Konzentration kann photometrisch (E₂₆₀) bestimmt werden.

Die PCR ist ein allgemein bekanntes und für den Bereich der Nukleinsäureanalytik routinemäßig eingesetztes Verfahren zur Amplifikation von Nukleinsäuren. Die verschiedenen Verfahrensvarianten der PCR sind dem Fachmann genauso geläufig wie die zur Durchführung der Verfahren erforderlichen Reagenzien und Bedingungen. Zur weiteren Erläuterung sei auf das Kapitel 24 in „Bioanalytik/Lottspeich; Zorbas (Hrsg.) – Heidelberg; Berlin: Spektrum, Akademischer Verlag, 1998, Seiten 673-704" verweiesen. Diese Ausführungen in diesem Standardwerk sind Teil der vorliegenden Offenbarung.

Die Festlegung optimaler Amplifikationsbedingungen ist Sache des Fachmanns. Entsprechende Anleitungen finden sich in einschlägigen Manuals und Nachschlagewerken, z.B. in PCR/Gassen, Sachse, Schultz (Hrsg.), Stuttgart, Jena, New York: G. Fischer, 1994.

Gemäß einer speziellen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens amplifiziert man ein Reaktionsgemisch aus 50-500 μM dNTPs, 1-5 mM MgCl₂, 1-100 pmol je Primer, z.B. Teq_417us (SEQ ID NO:1) und Teq_567ds (SEQ ID NO:2), 0,5-2,5 U Polymerase, z.B. Taq-Polymerase (Hotstar, Qiagen) in 50 μl 1 × PCR-Puffer (Qiagen). Geeignete Reaktionszeiten und -temperaturen sind mindestens 2 Minuten bei 94 °C-95 °C, vorzugsweise etwa 15 min bei 94°C (Denaturierung), dann 25-50, vorzugsweise 40 Zyklen bei 94-95 °C, vorzugsweise 94°C (Denaturierung), 60°C (Anlagerung), 72°C (Elongation), jeweils 10-30 sec, vorzugsweise 15 sec, und abschließend 5-15 min, vorzugsweise 7 min bei 72°C.

Das erfindungsgemäße Nachweisverfahren basiert auf folgendem Testprinzip:
In einer biologischen Probe vorhandene Nukleinsäure, insbesondere DNA, des Bakteriums Taylorella equigenitalis wird verfahrensgemäß amplifiziert. Gegebenenfalls wird ein Kontrollstandard (die koamplifzierbare Nukleinsäure) mit denselben Oligonukleotiden koamplifiziert. Proben, welche Nukleinsäure des Bakteriums Taylorella equigenitalis nicht enthalten, z.B. eine Negativkontrolle, zeigen somit ein dem Koamplifikat des Kontrollstandards entsprechendes Signal, es sei denn, die Amplifikationsreaktion ist gestört. Proben, welche Nukleinsäure des Taylorella equigenitalis enthalten, z.B. eine Positivkontrolle, zeigen sowohl ein dem Koamplifikat des Kontrollstandards entsprechendes Signal als auch ein dem Amplifikat der Nukleinsäure des Bakteriums Taylorella equigenitalis entsprechendes Signal.

Die auf dem erfindungsgemäßen Verfahren basierende Auswertung beinhaltet die Bestimmung, ob im Zuge der Amplifikationsreaktion Nukleinsäure amplifiziert und/oder koamplifiziert wurde. Dabei kann die Bildung solcher Amplifikate und/oder Koamplifikate in an sich bekannter Weise nachgewiesen werden, beispielsweise indem man das nach Durchführung der Amplifikationsreaktion erhaltene Verfahrensprodukt, in der Regel ein Nukleinsäuregemisch, untersucht.

Erfindungsgemäß bevorzugt ist es zu bestimmen, ob die entsprechenden Amplifikate bzw. Koamplifikate in dem Nukleinsäuregemisch vorhanden sind. Dazu kann man das Nukleinsäuregemisch, z.B. gelelektrophoretisch, auftrennen und die aufgetrennten Bestandteile detektieren. Dies wiederum gelingt in an sich bekannter Weise, indem man die nach Größe aufgetrennten Nukleinsäuren z.B. sichtbar macht und feststellt, ob eine Nukleinsäure (Amplifikat bzw. Koamplifikat) bestimmter Größe zugegen ist. So können Nukleinsäuren beispielsweise im Gel in an sich bekannter Weise mit einer geeigneten Färbung (z.B. mit Ethidiumbromid) sichtbar gemacht werden, oder die zur (Ko)Amplifikation verwendeten Oligonukleotide weisen bereits eine geeignete Markierung auf, die im Zuge der (Ko)Amplifikation eingebaut wird und die Detektion des entsprechenden (Ko)Amplifikats zulässt (z.B. durch kapillarelektrophoretische Verfahren bei Verwendung von Fluoreszenzmarkierungen, geeignete Blotting-Verfahren oder mittels Hybidisierungstechniken unter Verwendung immobilisierter Fängermoleküle und colorimetrischer, fluorometrischer oder luminometrischer Detektion). Die technische Ausgestaltung solcher Nachweismöglichkeiten ist Sache des Fachmanns. Einzelheiten hierzu finden sich in vielfältiger Weise in einschlägigen Nachschlagewerken, z.B. den Kapiteln 22 und 23 in Bioanalytik/Lottspeich; Zorbas (Hrsg.) – Heidelberg, Berlin: Spektrum, Akademischer Verlag, 1998, Seiten 593-671.

So kann man gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zur Amplifikation wenigstens einen markiertes Oligonukleotid verwenden. Die Markierung dient zum Nachweis eines Amplifikats, in das das markierte Oligonukleotid im Zuge der Amplifikation eingebaut wurde.

Eine Markierung kann im Prinzip auf beliebige Art und Weise in ein nachzuweisendes Amplifikat eingeführt werden, solange sie den Nachweis desselben erlaubt. Grundsätzlich kann man zwischen einer direkten und indirekten Markierung unterscheiden. Bei der direkten Markierung wird die nachweisbare Markierung selbst im Zuge der Amplifikation eingebaut. Bei der indirekten Markierung wird zunächst ein primäres Label eingebaut, welches eine gewisse Affinität für die anschließend zuzugebende nachweisbare Markierung besitzt. Letztere Vorgehensweise ist immer dann von Vorteil, wenn die zu verwendende Markierung den Verlauf der Amplifikation beeinflussen könnte. Insbesondere im Fall von chemi- oder biolumineszierenden Markierungen ist die indirekte Vorgehensweise bevorzugt. Erfindungsgemäß haben sich vor allem Biotin/Streptavidin-Systeme als zweckmäßig erwiesen. Demnach sind die erfindungsgemäß zu verwendenden markierten Primer gemäß einer besonderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung mit Biotin oder Digoxigenin, vorzugsweise am 5'-Ende, markiert.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich im Prinzip beliebige biologische Proben untersuchen. Voraussetzung ist allerdings, dass sich die biologische Probe in einer für die Nukleinsäureamplifikation geeigneten Form bereitstellen lässt. So kann es je nach Art der biologischen Probe zweckmäßig sein, diese zunächst vorbereitenden Maßnahmen zu unterziehen, um insbesondere die in der Probe vorhandene Nukleinsäuren zu isolieren und/oder zu reinigen. Dementsprechend wird dann lediglich ein Teil der ursprünglichen biologischen Probe der (Ko)Amplifikation zugeführt. Die hierfür im Einzelfall zu ergreifenden Maßnahmen sind dem Fachmann geläufig. Insoweit wird beispielsweise auf das Kapitel 21 in „Bioanalytik/Lottspeich; Zorbas (Hrsg.) – Heidelberg; Berlin: Spektrum, Akademischer Verlag, 1998, Seiten 569-592" verwiesen. Darüber hinaus sind geeignete Mittel zur Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren im Handel erhältlich, beispielsweise die von der Firma Qiagen, Deutschland, vertriebenen Nukleinsäure-Extraktionskits.

Das erfindungsgemäße Verfahren dient insbesondere zur Diagnose der kontagiösen equinen Metritis (CEM). Es handelt sich dabei also insbesondere um ein veterinärmedizinisches in vitro Diagnoseverfahren, das bei Einhufern, wie Eseln und insbesondere Pferden, Anwendung findet.

Zur Durchführung des Verfahrens wird den Tieren eine Probe (biologische Probe) entnommen. Hierbei handelt es sich in der Regel um einen Abstrich, insbesondere um einen Genitalabstrich.

Im Anschluss an die Entnahme der biologischen Probe können die darin enthaltenen Keime (Bakterien) zunächst auf geeigneten Nährböden angezüchtet werden. Als zweckmäßig für die Anzucht haben sich beispielsweise Kochblutagar mit Amphotericin B (nicht selektiv), Kochblutagar mit Amphotericin B und Streptomycin (selektiv) und/oder Kochblutagar – gegebenenfalls unter Zusatz von lysiertem Pferdeblut – mit Amphotericin B, Clindamycin und Trimethoprim (selektiv) erwiesen. Die Bebrütung auf diesen Nährböden erfolgt in der Regel 14 Tage bei 5-10 % CO₂ und 37 °C. Ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es allerdings, den Nachweis ohne vorherige Anzüchtung der Keime (Bakterien) führen zu können. Demnach kann die biologische Probe oder ein Teil davon, gegebenenfalls im Anschluss an eine Isolierung und/oder Reinigung von Nukleinsäuren, der (Ko)Amplifikation direkt zugeführt werden.

Auch betrifft die vorliegende Erfindung Analysekits zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Diese enthalten in der Regel wenigstens ein Mittel zum Nachweis des Bakteriums Taylorella equigenitalis mittels Nukleinsäureamplifikation, insbesondere die erfindungsgemäßen, auf den Sequenzen SEQ ID NO:1 und/oder SEQ ID NO:2 basierenden Oligonukleotide. Vorteilhafterweise ist auch eine erfindungsgemäße koamplifizierbare Nukleinsäure enthalten.

Gegebenenfalls können weitere übliche Mittel zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, wie dNTPs, MgCl₂, Puffer und/oder Polymerase enthalten sein.

Weitere besondere Ausführungsformen erfindungsgemäßer Kits ergeben sich aus den Ausführungen zum Verfahren selbst.

Beispiel 1
Herstellung der koamplifizierbaren Nukleinsäure
Man amplifiziert humane DNA der Zelllinie SW480 in einer PCR-Reaktion unter folgenden Bedingungen: 100 μM dNTPs, 2.5 mM MgCl₂, 10 pmol je Primer Te417DR20 (SEQ ID NO:3) und Te567DR200 (SEQ ID NO:4), 80 ng SW480-DNA, 2 U Taq-Polymerase (Hotstar, Qiagen), in 50 μl 1 × PCR-Puffer (Qiagen). Die Reaktionszeiten und -temperaturen betragen 15 min bei 94°C, dann 35 Zyklen bei 94°C, 58°C, 72°C jeweils 30 sec und abschließend 7 min bei 72°C. Dadurch wird ein 253bp-DNA-Fragment generiert, welches an den Enden homologe Bindungsstellen zu den Oligonukleotiden SEQ ID NO:1 bzw. SEQ ID NO:2 (d. h. den diagnostischen Taylorella equigenitalis-Primern), intern aber die Sequenz eines Abschnitts aus dem humanen HLA-DRA-Locus aufweist (4).
Das so erhaltene Produkt wird in log-Stufen seriell von 10^–6 bis 10^–9 verdünnt. Die Verdünnungen werden dann mit den Oligonukleotiden SEQ ID NO:1 bzw. SEQ ID NO:2 (d. h. den diagnostischen Taylorella equigenitalis-Primern) erneut unter folgenden Bedingungen amplifiziert: 100 μM dNTPs, 2.5 mM MgCl₂, 10 pmol je Primer Teq_417us (SEQ ID NO:1) und Teq_567ds (SEQ ID NO:2), 2 U Taq-Polymerase (Hotstar, Qiagen) in 50 μl 1 × PCR-Puffer (Qiagen). Die Reaktionszeiten und -temperaturen betragen 15 min bei 94°C, dann 30 Zyklen bei 94°C, 60°C, 72°C jeweils 15 sec und abschließend 7 min bei 72°C. Bei allen Verdünnungsstufen ist eine erneute Amplifikation mit mehr oder weniger starker Primer-Dimer-Bildung möglich (5).
Um die störenden Primer-Dimere abzutrennen, werden je 15 μl der vier PCR-Produkte auf ein 2 % Agarosegel aufgetragen, die Banden bei 253 by mit einem Skalpell ausgeschnitten und je 2 Gelblöcke à ~200 mg in zwei Eppendorfgefäße überführt. Die DNA wird mit dem QiaEx-Kit (Qiagen, Detschland) nach Herstellerangaben aus den Agaraose-Blöcken extrahiert und zur Kontrolle anschließend auf ein Gel geladen (6). Die Dimer-freie koamplifizierbare Nukleinsäure wird dann zusammen mit einer konstanten Menge an Taylorella equigenitalis-DNA in PCR-Reaktionen austitriert. Die optimale Verdünnung des koamplifizierbaren Nukleinsäure ist die Stufe 10^–8 (7 ). Die koamplifizierbare Nukleinsäure wird in dieser Verdünnungsstufe jeder PCR-Reaktion zugesetzt.
Tabelle 1: Diagnostische Primer zur Verwendung im Nachweisverfahren und Kombi-Primer zur Herstellung des internen Standards.
Erläuterung zum Kombi-Primer (Kleingedruckt = Homologie zum NLA-DRA-Gen. Großdruck = Homologie zum Taylorella equigenitalis 16S rRNA Gen)
Beispiel 2
Allgemeine Anleitung zur Durchführung des PCR-gestützten Nachweises von Nukleinsäure des Bakteriums Taylorella equigenitalis aus biologischem Probenmaterial.
1. DNA-Isolierung
DNA wird aus dem Untersuchungsmaterial, z.B. Abstriche oder Agarplatten, mit einem geeigneten DNA-Isolierungsverfahren isoliert. Hierfür bieten sich handelsübliche Kits an, z.B. Qiamp DNA-Mini-Kit (Qiagen, Deutschland).
2. Kontrollen
Bei jeder Probenserie wird empfohlen, Kontrollansätze mitzuführen:

– Negativkontrolle (nur H₂O, Leerwert)
– Taylorella equigenitalis-Positivkontrolle (DNA aus Taylorella equigenitalis).

3. Herstellung des Reaktionsmixes
Zweckmäßigerweise wird ein Prämix bereitgestellt, der erfindungsgemäße Primer (z.B. die Oligonukleotide mit den Nukleotidsequenzen SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:2), dNTPs, MgCl₂, Reaktionspuffer und gegebenenfalls die koamplifizierbare Nukleinsäure (als internen Kontrollstandard; z.B. die gemäß Beispiel 1 erhältliche Nukleinsäure) enthält. Zu diesem Prämix gibt man dann die Polymerase, beispielsweise Taq-Polymerase, die ebenfalls im Handel erhältlich ist. Dieser Reaktionsmix wird anschließend mit der isolierten DNA, meist ein DNA-Extrakt, oder mit den Kontrollen versetzt und in einen Thermocycler gestellt.
Beispielsweise kann man einen Prämix verwenden, der optimierte Mengen dNTPs, MgCl₂, Primer sowie die koamplifizierbare Nukleinsäure gemäß Beispiel 1 in 1xPCR-Puffer (Qiagen GmbH, Deutschland) enthält, zu 45,6 μl des Prämix, 0,4 μl Taq-Polymerase (Qiagen HotStar; 5 U/μl; erhältlich von Qiagen, Deutschland) geben, zu 46 μl dieses Reaktionsmixes 4 μl DNA-Extrakt bzw. Kontrollprobe geben und die Ansätze in einen Thermocycler stellen.
4. Inkubation im Thermocycler
Als zweckmäßig haben sich beispielsweise 15 min bei 95 °C gefolgt von 40 Zyklen aus 15 sec bei 94 °C, 15 sec bei 60 °C und 15 sec bei 72 °C, sowie abschließende 7 min bei 72 °C erwiesen.
5. Auswertung
5 μl eines jeden Ansatzes werden auf ein 2 %iges Agarosegel aufgetragen. Die Bedingungen der Elektrophorese werden so eingestellt, dass Banden von 140 und 253 bp voneinander getrennt werden. 25 min bei ca. 7 V/cm haben sich als zweckmäßig erwiesen. Anschließend wird das Gel in an sich bekannter Weise mit Ethidiumbromid angefärbt.
Zeigt eine einem bestimmten Ansatz entsprechende Spur des Agarosegels eine Bande bei etwa 174 bp, so enthält der betreffende Ansatz DNA aus Taylorella equigenitalis.
Zeigt eine einem bestimmten Ansatz entsprechende Spur des Agarosegels keine Bande bei etwa 174 bp, so enthält der betreffende Ansatz keine DNA aus Taylorella equigenitalis, sofern keine unspezifische Hemmung der Amplifikation vorliegt.
Eine unspezifische Hemmung der Amplifikation liegt dann nicht vor, wenn für die betreffende Spur eine Bande bei 253 bp sichtbar ist. Es ist anzumerken, dass mit zunehmender Konzentration von DNA aus Taylorella equigenitalis die Intensität der Bande bei etwa 253 bp abnimmt.
Bespiel 3
Spezifität und Sensitivität des Nachweisverfahrens
Geht man wie in Beispiel 2 beschrieben vor, so ergibt die gelelektrophoretische Auftrennung von PCR-Produkten, die durch (Ko)Amplifikation verschiedener Kontrollproben mit den erfindungsgemäßen Primern Teq_417us (SEQ ID NO:1) und Teq_567ds (SEQ ID NO:2) sowie der erfindungsgemäßen koamplifizierbaren Nukleinsäure (als internem Kontrollstandard) erhalten wurden (Spur 1: T. equigenitalis (2.5 pg DNA); Spur 2: Pasteurella spc. (200 ng DNA); Spur 3: Neisseria spc. (200 ng DNA); Spur 4: E.coli (400 ng DNA); Spur 5: Klebsiella oxytoca (100 ng DNA); Spur 6: Pseudomonas aeroginosa (100 ng DNA); Spur 7 – 9 T. asinigenitalis (2 pg, 200 pg, 200 ng DNA); Spur 10: H₂O Negativkontrolle) das in 2 gezeigte Bild. Lediglich die T. equigenitalis-Probe zeigt eine Bande bei 174 bp, wohingegen alle Proben ein Signal des internen Kontrollstandards (253 bp) aufweisen.
Ferner ergibt die gelelektrophoretische Auftrennung von PCR-Produkten, die durch Amplifikation von unterschiedlichen Mengen humaner DNA (Zelllinie SW 480; Spur 1+2: 80 ng, Spur 3: 40 ng, Spur 4: 20 ng. Spur 5: Negativkontrolle) mit den Kombi-Primern Te417DR20 (SEQ ID NO:3) und Te567DR200 (SEQ ID NO:4) erhalten wurden, das in 3 gezeigte Bild.
Es ist daher festzustellen, dass unter den verwendeten Bedingungen die Negativkontrollen nicht amplifiziert werden. Selbst hohe DNA-Konzentrationen von E. coli (400 ng) und P. aeroginosa (100 ng) führen zu keinem falsch-positiven Ergebnis. Die analytische Sensitivität des Verfahrens beträgt ca. 25 fg DNA des Bakteriums Taylorella equigenitalis.
Der Nachweis von Taylorella equigenitalis war auch erfolgreich bei einem ~ 2000-fachen Überschuss von E. coli-DNA.
Beispiel 4
Nachweis von Taylorella equigenitalis in Feldisolaten
Die in Beispiel 2 beschriebene PCR wurde mit 19 Feldisolaten von Taylorella equigenitalis durchgeführt. Die Feldstämme wurden aus Pferden isoliert und auf C.E.M.O.-Selektivmedium (Mast Diagnostika GmbH, Deutschland) bei 5 % CO₂ und 37 °C angezüchtet. Die isolierte DNA von einer Bakterienkolonie wurde in 50 μl H2O aufgenommen, 10^–5 verdünnt und 4 μl der Verdünnung für einen PCR-Ansatz verwendet. Alle Feldisolate konnten mit dem Verfahren erfolgreich detektiert werden. Im Gegensatz zur Positivkontrolle (Spur 1) wurde aufgrund der hohen eingesetzten DNA-Konzentrationen die Amplifikation der internen Kontrolle bei den Feldisolaten (Spuren 2 – 20) zumeist kompetitiv inhibiert und es traten sehr intensive Taylorella equigenitalis-spezifische Banden auf (8).
Beispiel 5
Analytischer Testkit
1. Bestandteile des Testkits
Der Prämix enthält Primer, dNTPs, MgCl₂, koamplifizierbare Nukleinsäure (als interner Kontrollstandard) sowie Reaktionspuffer. Die Positivkontrolle ist DNA des Bakteriums Taylorella equigenitalis (Stamm NCTC 11184 (ATCC 35865)).
2. Lagerung der Kit-Bestandteile
Der Prämix sowie die Positivkontrolle können für den laufenden Gebrauch über eine Woche bei 4 °C gelagert werden. Für eine längerfristige Lagerung ist es empfehlenswert, die Reagenzien bei –20 °C einzufrieren.
3. Verwendungszweck
Der Taylorella equigenitalis-DNA-Amplifikationskit dient dem in vitro Nachweis von Nukleinsäure des Bakteriums Taylorella equigenitalis aus biologischem Probematerial.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Verfahren zum Nachweis des Bakteriums Taylorella equigenitalis mittels Nukleinsäureamplifikation, dadurch gekennzeichnet, dass man für die Amplifikation wenigstens zwei Oligonukleotide verwendet, von denen ein erstes Oligonukleotid wenigstens 15 konsekutive Basen aus der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:1 und ein zweites Oligonukleotid wenigstens 15 konsekutive Basen aus der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:2 umfasst.
Verfahren zum Nachweis des Bakteriums Taylorella equigenitalis in einer biologischen Probe, wobei man: – die biologische Probe oder einen Teil davon in einer für die Nukleinsäureamplifikation geeigneten Form bereitstellt; – wenigstens zwei Oligonukleotide, von denen ein erstes Oligonukleotid wenigstens 15 konsekutive Basen aus der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:1 und ein zweites Oligonukleotid wenigstens 15 konsekutive Basen aus der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:2 umfasst, auf die Probe oder den Teil davon einwirken lässt; und – bestimmt, ob Nukleinsäure amplifiziert ist.
Verfahren nach einem der Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Oligonukleotid die Nukleotidsequenz SEQ ID NO:1 und das zweite Oligonukleotid die Nukleotidsequenz SEQ ID NO:2 umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass man der Probe oder dem Teil davon eine Nukleinsäure zusetzt, welche koamplifizierbar ist und eine heterologe Nukleotidsequenz umfasst, wodurch Koamplifikat von Amplifikat unterscheidbar ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei sich die Größe des Amplifikats von der Größe des Koamplifikats unterscheidet.
Verfahren nach Anspruch 4 oder 5, wobei die heterologe Nukleotidsequenz eine Sequenz des humanen HLA-DRA-Gens ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation durch Polymerase-Kettenreaktion erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Bestimmung gelelektrophoretisch erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe ein Genitalabstrich von Einhufern ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Diagnose der kontagiösen equinen Metritis (CEM).
Oligonukleotid, umfassend wenigstens 15 konsekutive Basen aus der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:1.
Oligonukleotid, umfassend wenigstens 15 konsekutive Basen aus der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:2.
Nukleinsäure, umfassend die Nukleotidsequenz SEQ ID NO:3 und/oder SEQ ID NO:4.
Nukleinsäure, umfassend die Nukleotidsequenz SEQ ID NO:5.
Zusammensetzung, enthaltend das Oligonukleotid nach Anspruch 11 und/oder das Oligonukleotid nach Anspruch 12.
Kit zur Amplifikation einer Nukleinsäure des Bakteriums Taylorella equigenitalis, enthaltend ein Oligonukleotid nach Anspruch 11 und ein Oligonukleotid nach Anspruch 12.
Kit nach Anspruch 16, wobei der Kit des weiteren eine Nukleinsäure nach Anspruch 13 oder 14 enthält.
Kit nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Kit des weiteren dNTPs, Mg²⁺-ionenhaltigen Puffer und gegebenenfalls Polymerase enthält.