Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Nukleinsäure bereit
zu stellen, die eine Expression von Fremdproteinen ermöglicht und
verbessert und für
verschiedene Verwendungen, bei denen eine heterologe Expression
von Proteinen wünschenswert
ist, wie Vakzine-Entwicklung, Produktion von Proteinen, insbesondere
Enzyme, Untersuchungen von Protein-/Proteinwechselwirkungen, Entwicklung
von Transfektionssystemen, effizient eingesetzt werden kann.
Gelöst wir diese
Aufgabe durch den Gegenstand der vorliegenden Erfindung: Isolierte
Nukleinsäure
kodierend für
ein Fusionsprotein, das Virus-ähnliche
Partikel bilden kann, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure
- a) mindestens eine von einem Mycovirus, insbesondere
Totivirus, stammende Nukleinsäuresequenz
und
- b) mindestens eine nicht von einem Mycovirus stammende Nukleinsäuresequenz
aufweist,
wobei die Nukleinsäuresequenzen aus (a) und (b) funktionell
miteinander verbunden sind und ganz oder teilweise für das Fusionsprotein
kodieren.
Der
Ausdruck „isolierte" Nukleinsäure bedeutet
innerhalb der vorliegenden Erfindung, dass die Nukleinsäure von
anderen Nukleinsäuren,
die in der natürlichen
Umgebung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure vorhanden
sind, getrennt ist. Vorzugsweise ist eine „isolierte" Nukleinsäure frei von Sequenzen, welche
die erfindungsgemäße Nukleinsäure natürlicherweise
innerhalb der genomischen DNA des betreffenden Organismus flankieren,
d.h. Sequenzen, die sich am 5'-
oder am 3'-Ende
der Nukleinsäure
befinden. Jedoch können
gewisse flankierende Sequenzen vorhanden sein, z.B. bis zu etwa
5kb, 4kb, 3kb, 2kb, 1kb oder weniger, insbesondere benachbarte oder
innerhalb des selben Gens liegende, aber durch Introns getrennte,
Peptid-kodierende Sequenzen. Darüber
hinaus bedeutet „isoliert", dass die Nukleinsäure, z.B.
ein Transkript/cDNA-Molekül,
im Wesentlichen frei von zellulärem
Material oder Kulturmedium (bei rekombinanter Herstellung) oder
chemischen Vorstufen oder anderen chemischen Substanzen (bei chemischer
Synthese) sein kann. Jedoch kann die erfindungsgemäße Nukleinsäure mit anderen
kodierenden oder regulatorischen Sequenzen fusioniert sein und gilt
dann immer noch als „isoliert". Beispielhaft kommen
für isolierte
Nukleinsäuren
rekombinante DNA-Moleküle innerhalb
eines Vektors, innerhalb heterologer Wirtszellen oder (teilweise)
gereinigte DNA-Moleküle
in Lösung
oder chemisch hergestellte Moleküle
in Frage. Isolierte RNA-Moleküle
umfassen in vivo oder in vitro RNA-Transkripte der erfindungsgemäßen, isolierten DNA-Moleküle.
Unter
einem „Fusionsprotein" versteht der Fachmann üblicherweise
ein Protein, welches aus mindestens zwei verschiedenen Proteinkomponenten
zusammengesetzt ist.
Üblicherweise
wird ein Fusionsprotein hergestellt, indem die für die jeweiligen Komponenten kodierenden
Nukleinsäuren
mittels molekularbiologischer Methoden, die dem Fachmann bekannt
sind, im Leseraster („in
frame") aneinander
ligiert werden, so dass bei der sich anschließenden Transkription/Translation
das gewünschte,
zusammengesetzte Protein entsteht. In der vorliegenden Erfindung
besteht das Fusionsprotein idealerweise aus einem viralen Hüll-/Capsidprotein
oder Teil davon, das mit dem zu exprimierenden Fremdprotein fusioniert
ist und die Bildung Virus-ähnlicher
Partikel ermöglicht (siehe
unten). Fusionsanteile können
aber auch Peptide oder Proteine sein, die einen Nachweis des interessierenden
Proteins ermöglichen,
so genannte Reporterproteine (z.B. GFP) oder Enzyme (z.B. Alkalische
Phosphatase, Luziferase). Des Weiteren kann es sich bei dem Fusionsanteil
um so genannte „tags" handeln, die einen
immunologischen Nachweis des interessierenden Proteins erlauben
(z.B. c-myc, Biotin, FLAG-tag), oder um Peptide/Proteine, die eine Aufreinigung
des interessierenden Proteins ermöglichen (z.B. His-tag, Glutathion-S-Transferase).
Der
Ausdruck „Virus-ähnliche
Partikel" bezeichnet
einen Komplex, der spontan aus Untereinheiten viraler Proteine oder
Peptide (z.B. virale Hüll-/Capsidproteine)
gebildet wird, wenn sie in vivo oder in vitro in räumliche
Nähe zueinander
gebracht werden. Zum Beispiel kann ein solcher Komplex mit der vollständigen Ergänzung der
Hüllproteine
eines bestimmten Virus oder mittels Teilmengen homologer oder heterologer
viraler Hüllproteine
gebildet werden, so lange sie Komplexe bilden, die größer sind
als die einzelnen Hüllproteine
selbst. Jeder spontan gebildete Komplex aus multimeren Untereinheiten
kann unter dieser Definition umfasst sein.
Unter
einem „Mycovirus" wird ein Virus verstanden,
das Pilze und Hefen infiziert. In einer bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich bei dem Mycovirus um ein doppelsträngiges RNA-Virus,
das spezifisch in Saccharomyces cerevisiae Virus-ähnliche
Partikel bildet (ScV). Umfasst sind hierbei insbesondere die natürlicherweise
in dieser Hefe persistierenden, apathogenen und nicht-infektiösen dsRNA-Viren
ScV-L-A, ScV-L-BC und ScV-M (ScV für S.cerevisisae Virus).
Der
Ausdruck „funktionell
miteinander verbunden" bedeutet
im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass die Nukleinsäuresequenzen
gemäß (a) und
(b) üblicherweise,
wie vorher beschrieben, mittels molekularbiologischer Techniken,
z.B. Ligation, nacheinander geschaltet sind, so dass nach Transkription
und Translation das gewünschte
Fusionsprotein entsteht. Es ist dabei unerheblich, ob die Nukleinsäuresequenzen
gemäß (a) und
(b) jeweils ein- oder mehrmals vorliegen. Wie weiter unten beschrieben,
kann „funktionell
miteinander verbunden" auch bedeuten,
dass die Nukleinsäuresequenz
eine regulatorische Sequenz darstellt, deren Anwesenheit die Transkription
und/oder Translation der Nukleinsäuresequenz gemäß (b) beeinflusst.
In
einer weiteren Ausführungsform
ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure dadurch
gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz gemäß (a) ganz
oder teilweise für
mindestens ein Capsidprotein, bevorzugt Gag oder Gag-Pol (siehe
SEQ ID NO: 24), oder eine funktionelle Variante davon, kodiert.
Das „Capsid" bezeichnet üblicherweise
die Proteinhülle
eines Virus. Dementsprechend ist ein Capsidprotein ein so genanntes
Strukturprotein, das zur Bildung der viralen Hülle erforderlich und Bestandteil
der Proteinhülle
ist. „Gag" steht dabei für „group-specific
antigen", und „Pol" für „Polymerase", eine in praktisch
allen Retroviren vorkommende Region. Gag-Vorläuferproteine werden durch virale
Proteasen in die verschiedenen Strukturproteine gespalten, die man
in freigesetzten infektiösen
Viruspartikeln findet. Die sequenzielle Anordnung der Gag-Proteine
im Vorläuferprotein
stimmt bei allen Retroviren überein.
Die viralen Enzyme Protease, Reverse Transkriptase und die Integrase
der Retroviren sind ebenfalls im Gag/Pol-Bereich der Pro-Virus-DNA
kodiert.
Unter
einer „funktionellen
Variante" wird im Rahmen
der vorliegenden Erfindung allgemein ein Fragment oder Derivat der
ursprünglichen
Nukleinsäuresequenz
oder der davon kodierten Aminosäuresequenz
verstanden, dessen Funktionsweise im Vergleich zur ursprünglichen
Nukleinsäure
oder des davon kodierten Proteins im Wesentlichen unverändert ist. „Fragment
oder Derivat" bedeutet,
dass sich die Nukleinsäure-
und/oder Aminosäuresequenz
von der ursprünglichen
Nukleinsäure-
und/oder Aminosäuresequenz
an einer oder mehreren Positionen unterscheidet und einen hohen
Grad an Homologie zu dieser Sequenz aufweist. Homologie bedeutet
dabei eine Sequenzidentität über die
gesamte Länge von
mindestens 70%, vorzugsweise über
80%, besonders bevorzugt über
90% und insbesondere von mindestens 95%. Die Abweichungen zu der
ursprünglichen
Sequenz können
dabei durch Deletion, Addition, Substitution oder Insertion von
Nukleotiden und/oder Aminosäuren
entstanden sein. Ein „Fragment" eines Proteins umfasst üblicherweise
mindestens 8, 10, 12, 14, 16 oder mehr benachbarte Aminosäurereste
der ursprünglichen
Aminosäuresequenz. Derartige
Fragmente können
aufgrund ihrer biologischen Aktivität oder aufgrund einer anderen
Funktion, z.B. Bindung an ein bestimmtes Substrat oder Wirkung als
Immunogen, ausgewählt
werden. Besonders bedeutende Fragmente sind biologisch aktive Fragmente,
Peptide, die etwa 8 oder mehr Aminosäuren lang sind. Ein „Fragment" der Nukleinsäure bedeutet
ferner eine zusammenhängende
Nukleinsäuresquenz
mit mindestens 12 Nukleotiden. Weiterhin kann das Fragment 30, 40,
50, 100, 250 oder 500 oder mehr Nukleotide lang sein. Die Länge des Fragments
richtet sich unter anderem nach seiner beabsichtigten Verwendung.
Beispielsweise kann das Fragment für Epitop-Regionen kodieren
oder als DNA-Sonde oder Primer verwendet werden.
Die
Erfinder haben erkannt, dass es für eine Modifizierung der äußeren Oberfläche des
VLP günstig
sein kann, ein Fremdprotein an bestimmten Stellen innerhalb des
viralen Capsidproteins zu inserieren.
Daher
ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure in einer
weiteren Ausführungsform
dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz gemäß (b) ein-
oder mehrmals an mindestens einer geeigneten Insertionsstelle innerhalb
der für
Gag kodierenden Nukleinsäuresequenz
eingefügt
ist.
Der
Ausdruck „Insertionsstelle" bedeutet im Rahmen
der vorliegenden Erfindung eine Stelle innerhalb der für Gag kodierenden
Nukleinsäuresequenz,
in welche die für
ein anderes als das Gag-Protein kodierende Nukleinsäuresequenz
mittels molekularbiologischer Verfahren, die dem Fachmann bekannt
sind, hinein kloniert ist. In Frage kommen im allgemeinen alle Regionen
innerhalb der für
Gag kodierenden Nukleinsäuresequenz,
vorausgesetzt, die Partikelbildung und die Expression des interessierenden
Fremdproteins werden durch die Wahl der Insertionsstelle nicht wesentlich
beeinträchtigt.
Vorzugsweise
ist die mindestens eine geeignete Insertionsstelle 5'-terminal von der
für Serin
an Position 182 der SEQ ID NO:24 und/oder für Asparaginsäure an Position
262 der SEQ ID NO:24 kodierende Nukleinsäuresequenz lokalisiert.
Oft
ist es wünschenswert,
dass das heterolog exprimierte Fremdprotein nach Expression von seinem
Fusionspartner getrennt wird, um das Protein in reiner Form ohne
Fremdanteile vorliegen zu haben. Daher ist es günstig, wenn die für das Fusionsprotein
kodierende Nukleinsäure
noch eine für
eine Proteaseschnittstelle kodierende Region enthält, so dass
der interessierende Teil nach Expression von dem nicht interessierenden
Teil abgeschnitten werden kann.
Die
erfindungsgemäße Nukleinsäure ist demnach
in einer weiteren Ausführungsform
dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens eine für eine Proteaseschnittstelle
kodierende Nukleinsäuresquenz
aufweist. Der Begriff „Protease" schließt alle gebräuchlichen
Endo- und Exoproteinasen,
wobei Endoproteinasen (Proteasen, die ein Protein innerhalb der
Aminosäuresequenz
schneiden) bevorzugt sind.
In
der vorliegenden Erfindung sind alle Schnittstellen für Proteasen,
die der Fachmann üblicherweise
für solche
Zwecke, d.h. das Abtrennen von Fusionsanteilen bei der Expression
rekombinanter Fusionsproteine, einsetzt, umfasst. Dazu zählen alle sauren,
neutralen und alkalischen Proteasen, welche zu den Gruppen der Serin-,
Cystein-, Aspartat- oder Metallproteasen gehören. Eine umfangreiche Liste von
Proteasen (auch bekannt als Peptidase), die sich für die erfindungsgemäße Verwendung
eignen, ist auf der ExPASy-Internetseite (Expert Protein Analysis
System) unter http://ca.expasy.org/cgi-bin/enzyme-search-ful?peptidase zu finden.
Die für
diese Verwendung gebräuchlichste
Protease ist die natürlicherweise
in humanem Blut vorkommende Faktor-Xa-Protease, die für die Aktivierung
von Prothrombin zu Thrombin verantwortlich ist. Diese Protease spaltet
im Anschluss an die Aminosäureerkennungssequenz
Ilee-Glu-Gly-Arg.
Daher
handelt es sich bei der Proteaseschnittstelle bevorzugt um die Schnittstelle
für die Faktor-Xa-Protease.
Wie
eingangs erwähnt,
eignet sich die erfindungsgemäße Nukleinsäure unter
anderem zur Herstellung eines Impfstoffes (Vakzine). Zu diesem Zweck
ist es günstig,
wenn die erfindungsgemäße Nukleinsäure für ein Protein
oder ein Peptid kodiert, welches eine Immunantwort, d.h. unter anderem
die Aktivierung von zytotoxischen oder Helfer-T-Lymphozyten oder die Bildung von Antikörpern, auslösen kann.
Zytotoxische T-Lymphozyten
zeichnen sich durch den Oberflächenmarker
CD8, Helfer-T-Lymphozyten durch den Oberflächenmarker CD4 aus. Man spricht
in diesem Zusammenhang von Epitopen.
Demgemäß ist die
erfindungsgemäße Nukleinsäure in einer
weiteren Ausführungsform
dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz gemäß (b) ganz
oder teilweise für
ein immunogenes Epitop kodiert.
Unter
einem (immunogenen) „Epitop" wird die Stelle
eines Moleküls
verstanden, die die Bindung mit einem spezifischen Antikörper eingeht.
Unterschieden werden Sequenzepitope und Konformationsepitope. Man
könnte
daher ein Epitop auch als die Immunreaktion auslösende Oberflächenstruktur eines
Antigens bezeichnen. Epitope können
von unterschiedlicher Länge
sein. Günstigerweise
besitzt das Epitop im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Länge von
mindestens 4, 6, 8, 12, 25, 50 Aminosäuren.
Bevorzugt
umfasst das immunogene Epitop eine CD4- und/oder eine CD8-positive
T-Lymphozyten aktivierende
Region.
Üblicherweise
richten sich Impfstoffe gegen Infektionen mit Mikroorganismen. Stammt
demnach ein Epitop aus dem Protein eines Mikroorganismus, kann mit
dem betreffenden Impfstoff gezielt eine Immunreaktion gegen den
Mikroorganismus hervorgerufen werden.
Die
erfindungsgemäße Nukleinsäure ist
daher in einer weiteren Ausführungsform
dadurch gekennzeichnet, dass das Epitop ein aus einem Mikroorganismus
stammendes Polypeptid ist.
Der
Ausdruck "Mikroorganismus" umfasst kleine einzellige
Organismen in einer Größendimension
jenseits der Sichtbarkeitsgrenze. Im Zusammenhang der vorliegenden
Erfindung bezeichnet "Mikroorganismus" neben Viren Prokaryonten
wie Bakterien, Cyanobakterien, Mollicutes sowie ein- und mehrzellige
Eukaryonten wie z.B. Protozoa und bestimmte Gattungen von Pilzen,
Algen und Parasiten (z.B. Sporozoa). Bevorzugt sind Mikroorganismen,
die als pathogen gelten und demnach Auslöser für bestimmte Krankheiten sind.
Insbesondere
sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung Mikroorganismen umfasst,
die folgende (lediglich beispielhaft ausgewählte) Krankheiten auslösen: AIDS,
Anthrax, Asthma, Borreliose/Lyme-Krankheit, Botulismus, Brucellose,
Campylobacteriose, Chlamydiose, Cholera, Creutzfeldt-Jakob, Dengue-Fieber,
Diphtherie, Ebola, Enterohämorrhagische
E. coli (EHEC) syn. (VTEC), Erythema chronicum migrans, Frühsommer-Meningoenzephalitis (FSME),
Gelbfieber, Gonorrhö,
Grippe, Haemophilus influenzae, Hämolytisch-urämisches
Syndrom (HUS), Hepatitis (Allgemein), Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis
C, HIV, Influenza, Kinderlähmung/Poliomyelitis,
Keuchhusten/Pertussis, Lassa-Fieber, Legionellose, Listeriose, Lyme-Krankheit/Borreliose,
Malaria, Masern, Meningitis, Meningokokkenerkrankungen, Milzbrand,
Mumps, Norwalk-like-Viren, Otitis-Media, Paratyphus, Pertussis/Keuchhusten, Pneumokokken-Erkrankungen,
Pneumonie, Pocken, Poliomyelitis/Kinderlähmung, Röteln, Salmonellose, SARS: Schweres
Akutes Respiratorisches Syndrom, Shigellose, Starrkrampf/Tetanus,
Tollwut, Tripper, Tuberkulose, Typhus, Verotoxin-produzierende E.coli (VTEC)syn.(EHEC),
Virales hämorrhagisches
Fieber (VHF), Vogelgrippe, West-Nil-Virus,
Zeckenenzephalitis, Zytomegalie.
In
einer bevorzugten Ausführungsform
ist der Mikroorganismus ein Virus, bevorzugt humanes CMV (ZytomegalieVirus).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich
bei dem Epitop um das ganze oder einen Teil des immundominanten
Proteins pp65 des humanen ZytomegalieVirus (hCMV) (siehe SEQ ID
NOs:1,3,5 für
die Nukleinsäure
und 2, 4, 6 für
das davon kodierte Protein).
Die
erfindungsgemäße Nukleinsäure kann insbesondere
zur heterologen Expression von Fremdproteinen verwendet werden.
Dies ist insbesondere dann von Vorteil, wenn ein Bedarf an einer größeren Menge
des herzustellenden Proteins besteht. Der Nachweis einer erfolgreichen
Expression kann darin bestehen, dass das Fremdprotein beispielsweise
eine enzymatische Aktivität
aufweist, die durch Umsetzung des entsprechenden Substrats nachgewiesen
werden kann.
Demgemäß ist die
erfindungsgemäße Nukleinsäure in einer
weiteren Ausführungsform
dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz gemäß (b) ganz
oder teilweise für
ein Reporterprotein und/oder ein Enzym, oder eine funktionelle Variante davon,
kodiert.
Der
Ausdruck „funktionelle
Variante" folgt
der weiter oben gegebenen Definition. Darüber hinaus können funktionelle
Varianten auch Derivate umfassen, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren der Aminosäuresequenz
chemisch modifiziert oder markiert sind. Die chemischen Modifizierungen
können beispielsweise
bewirken, dass das zu exprimierende Fremdprotein stabilisiert wird
oder andere, wünschenswerte,
physikalische und biochemische Eigenschaften aufweist. Dem Fachmann
geläufige
Modifizierungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Acetylierung, Acylierung,
ADP-Ribosylierung, Amidierung, kovalentes Anfügen von Flavin, kovalentes
Anfügen
von Nukleotiden oder Nukleotidderivaten, kovalentes Anfügen eines
Lipids oder Lipidderivats, kovalentes Anfügen von Phosphotidylinositol, Kreuzvernetzung,
Zyklisierung, Disulfidbrückenbildung,
Demethylierung, Pyroglutamatbildung, Formylierung, gamma-Carboxylierung, Glykosylierung, GPI-Ankerbildung,
Hydroxylierung, Iodinierung, Methylierung, Myristoylierung, Oxidierung,
proteolytische Prozessierung, Phosphorylierung, Prenylierung, Razemisierung,
Selenoylierung, Sulfatierung, tRNA-vermitteltes Anfügen von Aminosäuren (z.B. Arginylierung
oder Ubiquitinierung). Derartige Modifizierungen sind dem Fachmann
bekannt und detailliert in der einschlägigen Literatur beschrieben
(z.B. Creighton et al., „Proteins – Structure
and Molecular Properties",
2nd Ed., 1993, W.H. Freemann & Company,
New York) In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich
bei dem Enzym um eine Esterase, bevorzugt um eine bakterielle Esterase
EstC.
In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
umfasst die erfindungsgemäße Nukleinsäure eine
Nukleinsäuresequenz
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 11,
13 und 15.
Die
Erfinder haben außerdem
erkannt, dass es für
eine stabile, selektionsfreie Expression von Fremdproteinen in Wirtszellen,
bevorzugt in Hefezellen, günstig
sein kann, wenn die für
das Fremdprotein kodierende Nukleinsäuresequenz von regulatorischen
und cis-prozessiven,
viralen Nukleinsäuresequenzen
flankiert ist, so dass die nach einer Transkription entstandene
rekombinante RNA durch die hefeeigenen ScV-LA-Funktionen
encapsidiert, repliziert und exprimiert wird.
Demnach
betrifft die vorliegende Erfindung in einer weiteren Ausführungsform
eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, bei
der die Nukleinsäuresequenz
gemäß (a) eine
die Replikation, Transkription und/oder Encapsidierung regulierende
Nukleinsäuresequenz
umfasst.
Zu
einer „die
Replikation, Transkription, Encapsidierung regulierenden Sequenz" zählen beispielsweise
Promotor- und/oder Terminatorsequenzen und/oder Sequenzen, die die
Initiation der Transkription positiv beeinflussen. Darüber hinaus
sind Sequenzen umfasst, die das interessierende Transkript gegebenenfalls
prozessieren. Bevorzugt umfasst die die Replikation, Transkription
und/oder Encapsidierung regulierende Nukleinsäuresequenz einen terminalen
Replikationsenhancer („terminal
replication enhancer",
TRE) und/oder eine virale Bindungsstelle („viral binding site", VBS). Die genannten Sequenzen
stammen bevorzugt aus den Hefeviren ScV-LA,
ScV-M1 oder ScV-M28.
In
einer weiteren Ausführungsform
umfasst die erfindungsgemäße Nukleinsäure eine
für ein
Ribozym kodierende Nukleinsäuresequenz.
Unter
einem „Ribozym" wird üblicherweise ein
katalytisches RNA-Fragment verstanden, d.h. selbstspaltende RNA-Moleküle (Phosphodiesterasen).
Wird eine Ribozymsequenz in eine gewünschte mRNA insertiert, so
kann es bei entsprechendem Design diese mRNA in der Regel spalten
und prozessieren. In der vorliegenden Erfindung kann das erfindungsgemäße Ribozym
die interessierende mRNA am 3'-Ende
derart prozessieren, so dass die für die Verpackung (Encapsidierung)
und Replikation essentiellen Sekundärstrukturen freigesetzt werden.
Die
erfindungsgemäße Nukleinsäure eignet sich
weiterhin für
die Herstellung eines Transfektionssystems. Die Erfinder haben erkannt,
dass rekombinante Virus-ähnliche Partikel
auf ihrer äußeren Oberfläche eine
negativ geladene Peptidschleife exprimieren können, die als Adapter für Proteine
dient, welche einerseits elektrostatisch über einen polykationischen
Abschnitt an die VLP-assoziierte Peptidschleife binden und andererseits
eine zelltypspezifische Aufnahme fördern.
Die
erfindungsgemäße Nukleinsäure ist demnach
in einer weiteren Ausführungsform
dadurch gekennzeichnet, dass sie eine für ein anionisches Adapterpeptid
kodierende Nukleinsäuresequenz
umfasst.
Unter
einem „anionischen
Adapterpeptid" wird
ein im Wesentlichen negativ geladenes Peptid verstanden, das als
Adapter für
Proteine dienen kann.
In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
ist die erfindungsgemäße Nukleinsäure dadurch
gekennzeichnet, dass sie eine Nukleinsäuresequenz ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NOs: 17, 18, 19, 20, 21 und
22 umfasst.
Zum
Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in eine
Wirtszelle und zur Expression des interessierenden Proteins in einer
Wirtszelle, bzw. wie in der vorliegenden Erfindung zur Bildung Virus-ähnlicher
Partikel, die das interessierende Protein umfassen, ist es zweckmäßig, wenn
die erfindungsgemäße Nukleinsäure in einen
Vektor inseriert ist, der Steuerungselemente enthält, die
eine heterologe Expression bewirken und/oder fördern.
Daher
betrifft die vorliegende Erfindung auch einen Vektor, der eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthält.
Der
Ausdruck „Vektor" bezeichnet ein Vehikel,
bevorzugt eine Nukleinsäure,
welches Nukleinsäuren
transportieren kann. Üblicherweise
ist die zu transportierende Nukleinsäure mit dem Vektor kovalent
verbunden. Die vorliegende Erfindung umfasst Plasmide, einzel- oder doppelsträngige Phagen,
einzel- oder doppelsträngige,
virale DNA- oder RNA-Vektoren,
oder artifizielle Chromosomen (AC) wie BAC (bakteriell), PAC (P1-Phage),
YAC (Hefe; „yeast"), HAC (human) oder
MAC (Säugetier; „mammalian"). Ein Vektor kann
innerhalb der Wirtszelle als extrachromosomales Element repliziert
und vervielfältigt
werden oder in das Wirtschromosom integrieren und zusammen mit der
Wirtszelle vervielfältigt werden.
Die
vorliegende Erfindung umfasst Vektoren zur Vermehrung (Klonierungsvektoren)
oder zur Expression (Expressionsvektoren) der erfindungsgemäßen Nukleinsäure. In
Expressionsvektoren ist die Nukleinsäure daher vorzugsweise in Sinn-Orientierung funktionell
mit regulatorischen Sequenzen verknüpft, die die Transkription
in prokaryontischen und eukaryontischen Zellen oder in vitro in
zellfreien Systemen ermöglichen.
Zu den hier gemeinten regulatorischen Sequenzen zählen unter
anderem transkriptionssteuernde Promotoren (z.B. linker lambda-Phage,
lac, TRP, TAC, SV40, CMV, AdenoVirus, RetroVirus-LTR, SP6, T3, T7
und ähnliche),
vorzugsweise PGK (Phosphoglyceratkinase-Promotor), Repressorbindungsstellen,
Enhancer (z.B. aus SV40, CMV, AdenoVirus), Transkriptionsterminationsstellen,
Ribosomenbindungsstellen, Start- und
Stoppkodons oder Polyadenylierungssignale. Die regulatorischen Sequenzen
bewirken entweder eine konstitutive Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in der Wirtszelle
oder eine Expression, die mittels Temperaturänderung, Nährstoffzusatz- oder – entzug
oder Zusatz/Entzug anderer Substanzen (z.B. Tetracyclin) induziert
wird.
Die
erfindungsgemäße Nukleinsäure kann nach
bekannten Standardverfahren in den Vektor inseriert werden. Im Allgemeinen
wird die interessierende DNA-Sequenz mit einem Vektor verbunden,
indem die DNA-Sequenz und der Vektor mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen
geschnitten und anschließend
miteinander ligiert werden.
Es
kann wünschenswert
sein, die erfindungsgemäße Nukleinsäure als
Fusionsprotein zu exprimieren. Die vorliegende Erfindung umfasst
daher auch Vektoren, die bereits für Fusionsanteile kodierende
Sequenzen enthalten. Derartige Fusionsanteile können die Expression oder Löslichkeit
eines rekombinanten Proteins steigern oder eine Aufreinigung erlauben,
z.B. pGEX (GST-Fusion), pMAL (Maltose-E-Bindungsprotein) oder rRITS
(Protein-A-Fusion).
Idealerweise
wird der erfindungsgemäße Vektor
oder die erfindungsgemäße Nukleinsäure zur Vermehrung
oder Expression in eine Wirtszelle eingebracht. Zum Einbringen der
erfindungsgemäßen Nukleinsäure in eine
Wirtszelle (Transduktion, Transfektion bzw. Transformation) stehen
dem Fachmann zahlreiche Verfahren – abhängig von der gewählten Wirtszelle – zur Verfügung. Die
einfachste Methode für
den Gentransfer ist die Injektion „nackter" Nukleinsäuren in ein Zielgewebe / Zielzellen.
Eine effizientere Methode besteht in der Manipulation einer einzelnen
Zelle durch die sogenannte Mikroinjektion der Nukleinsäure in den
Zellkern. Besonders günstig
ist der Einsatz von Reagenzien und Methoden, die Kalziumchlorid,
Rubidiumchlorid, Litiumchlorid, Kalziumphosphat, DEAE-Dextran, kationische
Lipide, Liposomen, biolistische Partikelbombardierung („gene gun"-Methode), Hitzeschocktransformation
und Elektroporation, sowie beliebige Kombinationen davon umfassen.
Phagen- oder virale Vektoren werden im Allgemeinen als verpackte
oder verkapselte Viren in die Wirtszelle eingebracht.
Zum
Selektieren einer Subpopulation von Wirtszellen, welche den erfindungsgemäßen Vektor enthalten,
ist es zweckmäßig, wenn
der Vektor zusätzlich
mit einem so genannten Selektionsmarker versehen ist. Geeignete
Selektionsmarker umfassen Gene für
Tetracyclin- oder Ampicillinresistenz (Gen für beta-Lactamase) für Bakterien
und Gene für
Dihydrofolatreduktase- oder Neomycinresistenz für eukaryontische Wirtszellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform
enthält
der erfindungsgemäße Vektor
Selektionsmarker zur Expression in Hefezellen, vorzugsweise URA3
(Gen für
Uracil-Synthese) oder LEU2 (Gen für Leucin-Synthese).
In
einer bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich bei dem Vektor um einen Expressionsvektor, bevorzugt
pPGK oder pL* (siehe Beispiele und Material und Methoden).
Die
Erfindung betrifft weiterhin eine Wirtszelle, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder
einen erfindungsgemäßen Vektor
enthält.
Die „Wirtszelle" bezeichnet innerhalb
der vorliegenden Erfindung eine Zelle des Organismus, in welchem
sich das Virus oder das Konstrukt vervielfältigt. Geeignete Wirtszellen
umfassen prokaryontische Zellen (Bakterien), niedere eukaryontische
Zellen (z.B. Hefezellen) oder höhere
eukaryontische Zellen, z.B. Insektenzellen oder Säugetierzellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform
handelt es sich bei der Wirtszelle um eine Hefezelle, bevorzugt
der Gattung Saccharomyces.
In
einer weiteren Ausführungsform
betrifft die Erfindung ein isoliertes Fusionsprotein, das von einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert
ist.
Der
Ausdruck „isoliert" oder „gereinigt" bedeutet innerhalb
der vorliegenden Erfindung, dass das Fusionsprotein im Wesentlichen
frei von zellulärem
Material oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen chemischen
Substanzen ist. Das erfindungsgemäße Fusionsprotein kann bis
zur vollständigen
Homogenität
oder niedrigeren Reinheitsgraden aufgereinigt sein. Der Reinheitsgrad
richtet sich unter anderem nach der beabsichtigten Verwendung. Als kritische
Voraussetzung wird vom Fachmann gesehen, dass die Präparation
die gewünschte
Funktion des Fusionsproteins erlaubt, selbst wenn beträchtliche
Mengen anderer Komponenten in der Präparation vorhanden sind. „Im Wesentlichen
frei von zellulärem
Material" schließt Fusionsproteinpräparationen ein,
welche weniger als 30% (gemessen nach Trockengewicht) andere Proteine
(d.h. kontaminierende Proteine), vorzugsweise weniger als 20%; besonders bevorzugt
weniger als 10% und insbesondere weniger als 5% andere Proteine
aufweisen. Wenn das Fusionsprotein rekombinant hergestellt wird,
kann es auch im Wesentlichen frei von Kulturmedium sein, d.h. das
Kulturmedium beträgt
weniger als 20% des Volumens der Fusionsproteinpräparation. „Im Wesentlichen
frei von chemischen Vorstufen oder anderen chemischen Substanzen" umfasst Fusionsproteinpräparationen,
bei denen das erfindungsgemäße Fusionsprotein
von chemischen Vorstufen oder anderen chemischen Substanzen, die
beispielsweise an der Synthese des erfindungsgemäßen Fusionsproteins beteiligt
sind, abgetrennt ist. Eingeschlossen sind daher Fusionsproteinpräparationen,
welche weniger als 30% (gemessen nach Trockengewicht) chemische
Vorstufen oder andere chemische Substanzen, vorzugsweise weniger
als 20%, besonders bevorzugt weniger als 10% und insbesondere weniger als
5% chemische Vorstufen oder andere chemische Substanzen aufweisen.
Das
isolierte Fusionsprotein kann aus Zellen, welche zur rekombinanten
Produktion des Fusionsproteins befähigt sind, aufgereinigt werden.
Beispielsweise kann eine Nukleinsäure, die für das Fusionsprotein kodiert,
in einen Expressionsvektor inseriert werden, der Expressionsvektor
wird in eine Wirtszelle eingebracht und das Fusionsprotein wird in
der Wirtszelle exprimiert. Das Fusionsprotein kann anschließend mittels
Standardverfahren, die weiter unten genauer beschrieben sind, aus
den Zellen isoliert werden.
In
einer besonders bevorzugten Ausführungsform
ist das Fusionsprotein dadurch gekennzeichnet, dass es eine Aminosäuresequenz
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus den SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12,
14, und 16 umfasst.
Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren
zum Herstellen rekombinanter, Virus-ähnlicher Partikel, wobei das
Verfahren die folgenden Schritte umfasst:
- (a)
Einbringen einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure in Wirtszellen
und
- (b) Kultivieren der Wirtszellen unter Bedingungen, die eine
Bildung der rekombinanten, Virus-ähnlichen Partikel erlauben
und/oder fördern.
Das
Einbringen der Nukleinsäure
in die Wirtszelle kann nach einer der oben beschriebenen oder nach
anderen, dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen. Das Kultivieren
erfolgt üblicherweise
unter selektiven Bedingungen, d.h. beispielsweise in Leucin-freiem
Mangelmedium, um erfolgreich transformierte Wirtszellen, insbesondere
Hefezellen, anzureichern. Das Kultivieren der Hefezellen findet bei
einer Temperatur von etwa 25-35°,
vorzugsweise etwa um 30°C
statt.
Bevorzugt
umfasst das Verfahren zusätzlich das
Aufreinigen der rekombinanten, Virus-ähnlichen Partikel.
Das
Aufreinigen der Virus-ähnlichen
Partikel aus den Wirtszellen erfordert ein Aufschließen der Wirtszellen,
das nach allen dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen kann. Handelt
es sich bei den Wirtszellen um Hefezellen, wie in einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung, kann der Aufschluss beispielsweise mittels
enzymatischer Lyse (z.B. Zymolyase) und gegebenenfalls unter Zuhilfenahme
mechanischer Aufschlussverfahren mittels Glaskügelchen (Vortex oder „Bead beater") erfolgen. Die anschließende Reinigung
kann Zentrifugationsschritte, z.B. Ultrazentrifugation über ein
Saccharosekissen und anschließende
Fraktionierung über einen
Saccharosedichtegradienten (siehe Beispiele) umfassen.
Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft außerdem rekombinante,
Virus-ähnliche
Partikel, die mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens herstellbar
sind.
Wie
vorstehend bereits erwähnt
wurde, eignet sich die erfindungsgemäße Nukleinsäure zur Herstellung von Vakzinen.
Die
vorliegende Erfindung betrifft demnach weiterhin eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, und/oder
ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein, und/oder
erfindungsgemäße Virus-ähnliche
Partikel zur Verwendung als Arzneimittel, bevorzugt als Impfstoff
optional in Kombination mit einem geeigneten Trägerstoff.
Dabei
ist es unerheblich, ob die erfindungsgemäße Nukleinsäure, und/oder das erfindungsgemäße Fusionsprotein,
und/oder die erfindungsgemäßen Virus-ähnlichen
Partikel alleine oder in Kombination mit anderen aktiven Substanzen
verabreicht werden. Die Verabreichung der aktiven Substanzen kann gleichzeitig
oder nacheinander erfolgen. Die Dosis und/oder Einwirkzeit des Arzneimittels,
bevorzugt Impfstoffs, ist variabel und hängt vom physiologischen Zustand
der zu behandelnden Person ab. Dabei können Alter, Gewicht und Geschlecht
des Patienten eine Rolle spielen. Außerdem kann es von Bedeutung
sein, ob die Krankheit akut, chronisch oder prophylaktisch behandelt
werden muss. Die Herstellung solcher Arzneimittel ist dem Fachmann
bekannt. Für
die Stabilität
und Wirksamkeit des Arzneimittels ist gegebenenfalls die Anwesenheit
von Stabilisatoren und Trägersubstanzen
wie Stärke,
Laktose, Stearinsäure,
Fette, Wachse, Alkohole oder physiologische Kochsalzlösungen oder
andere Additiva wie Konservierungsstoffe, Farbstoffe, Geschmacksstoffe erforderlich.
Arzneimittel in flüssiger
Form lassen sich, falls erforderlich, lyophilisieren.
Die
vorliegende Erfindung betrifft demnach auch ein Arzneimittel, bevorzugt
einen Impfstoff, das/der, optional in Kombination mit weiteren pharmazeutisch
verträglichen
Substanzen und Trägerstoffen,
eine erfindungsgemäße Nukleinsäure, und/oder
ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein, und/oder
erfindungsgemäße Virus-ähnliche
Partikel enthält,
und das zur Behandlung von Infektionskrankheiten geeignet ist.
Die
Verabreichung des Arzneimittels, insbesondere Impfstoffs, kann oral
erfolgen, z.B. in Form von beschichteten oder unbeschichteten Tabletten, Granulaten,
harten oder weichen Gelatinekapseln. Das Arzneimittel kann auch
parenteral – unter
Umgehung des Verdauungsapparates – z.B. subkutan, intramuskulär oder intravenös in Form
von Lösungen für Infusionen
oder Injektionen verabreicht werden. Andere Darreichungsformen betreffen
direkte Applizierungen (z.B. auf die Haut) in Form von Salben, Tinkturen,
Sprays oder transdermalen therapeutischen Mitteln, oder zu inhalierende
Mittel in Form von Nasensprays, Aerosolen, oder in Form von Mikrokapseln,
Implantaten oder Stäbchen.
Die geeignete Darreichungsform hängt
von der Art und der Schwere der Krankheit ab.
Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, und/oder
eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins,
und/oder erfindungsgemäßer Virus-ähnlicher
Partikel zur Behandlung von Infektionskrankheiten.
Das
Arzneimittel/der Impfstoff oder die erfindungsgemäße Verwendung
kann zur Vorbeugung und/oder Behandlung der folgenden, lediglich
beispielhaft aufgezählten,
Erkrankungen verwendet werden: AIDS, Anthrax, Asthma, Borreliose/Lyme-Krankheit,
Botulismus, Brucellose, Campylobacteriose, Chlamydiose, Cholera,
Creutzfeldt-Jakob, Dengue-Fieber, Diphtherie, Ebola, Enterohämorrhagische
E. coli (EHEC) syn. (VTEC), Erythema chronicum migrans, Frühsommer-Meningoenzephalitis (FSME),
Gelbfieber, Gonorrhö,
Grippe, Haemophilus influenzae, Hämolytisch-urämisches
Syndrom (HUS), Hepatitis (Allgemein), Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis
C, Influenza, Kinderlähmung/Poliomyelitis, Keuchhusten/Pertussis,
Lassa-Fieber, Legionellose, Listeriose, Lyme-Krankheit/Borreliose,
Malaria, Masern, Meningitis, Meningokokkenerkrankungen, Milzbrand,
Mumps, Norwalk-like-Viren, Otitis-Media, Paratyphus, Pertussis/Keuchhusten,
Pneumokokken-Erkrankungen, Pneumonie, Pocken, Poliomyelitis/Kinderlähmung, Röteln, Salmonellose,
SARS: Schweres Akutes Respiratorisches Syndrom, Shigellose, Stankrampf/Tetanus,
Tollwut, Tripper, Tuberkulose, Typhus, Verotoxin-produzierende E.coli (VTEC)syn.(EHEC),
Virale hämorrhagische
Fieber (VHF), Vogelgrippe, West-Nil-Virus, Zeckenenzephalitis, Zytomegalie.
Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung
einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, und/oder
eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins,
und/oder erfindungsgemäßer Virus-ähnlicher
Partikel zur heterologen Expression von Proteinen in Hefezellen,
bevorzugt der Gattung Saccharomyces.
Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung
einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, und/oder
eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins,
und/oder erfindungsgemäßer Virus-ähnlicher
Partikel zum Untersuchen von Protein-/Proteinwechselwirkungen.
Ein
weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung
einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, und/oder
eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins,
und/oder erfindungsgemäßer Virus-ähnlicher
Partikel zum Herstellen eines Transfektionsmittels.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG:
1:
Schematische Darstellung der gag-CMV pp65 Fusionsgene a) GCe und
b) GCeSCe sowie entsprechender Partikel nach der Expression und
Assemblierung in Hefe. GCe-VLP exponieren das CMV-pp65-Epitop (Ce)
ausschließlich
auf der inneren Capsidoberfläche
(intraviral), GCeSCe-Partikel zusätzlich auf der äußeren Oberfläche.
2:
Western-Analyse der VLP-Gradienten-Fraktionen 1-17 und des Gradienten-Pellets (Gr.P.) mit
den Hefetransformanten a) S86c × pL*GCe
und b) S86c × pL*GCeSCe.
Der immunologische Nachweis der im Hefestamm S86c konstitutiv exprimierten
Fusionsproteine erfolgte mit einem primären monoklonalen anti-pp65-Antikörper sowie
einem anti-Maus/Alkalische Phosphatase-Konjugat als sekundären Antikörper.
3:
Elektronenmikroskopische Aufnahme rekombinanter GCe-VLP, die aus
der Hefetransformante S86c × pL*GCe
präpariert
und mittels Uranylacetat negativ kontrastiert wurden.
4:
Antigenspezifische Antworten CD4-positiver HTL und CD8-positiver
CTL im Rahmen eines ex vivo Assays mit dem Vollblut einer CMV-seropositiven
Spenderin. Die im Blut durch verschiedene Antigene und costimulatorische
Antikörper
induzierte Aktivierung der Immunzellen wurde nach einer Dreifachfärbung mit
den fluoreszenzmarkierten Antikörpern
anti-CD69, anti-IFN-γ sowie
anti-CD4 bzw. anti-CD8 mit Hilfe einer FACS-Analyse bestimmt. Eine
Aktivierung von mehr als 0,05% der untersuchten T-Zellpopulation
wurde als signifikant eingestuft (gestrichelte Linie).
5:
a) Schematische Darstellung des Hefe-Expressionsvektors pL*G. Das
gag-Gen unterliegt der Transkriptionskontrolle des konstitutiven PGK-Promotors
und enthält
zur in vivo Selektion das LEU2-Gen der Hefe. b) Schematischer Aufbau
der an den Aminosäurepositionen
D262 und S182 modifizierten gag-Fusionen sowie c) der oberflächenmodifizierten
VLP.
6:
Western-Analyse der Gradienten-Fraktionen 1-17 und des Gradienten-Pellets
a) nach der pL*G-getriebenen gag-Expression in dem Virusfreien Hefestamm
S86c und b) nach der Isolierung natürlicher LA-VLP
aus dem Hefestamm MS 300b. Die aus der Hefe extrahierten Partikel
wurden auf einen linearen 20-70%-igen Saccharose-Gradienten aufgetragen
und 12 h bei 100.000 × g
und 4°C zentrifugiert.
Eine Fraktionierung erfolgte von unten nach oben (auf den Blots
von links nach rechts aufgetragen) und lieferte 20 2 ml-Fraktionen.
Das Gradienten-Pellet (GP) wurde in 2 ml PBSE resuspendiert. Der
immunologische Nachweis des Gag-Proteins erfolgte mit einem polyklonalen
anti-Gag-Antikörper. Aufgrund
des natürlichen
Verhältnisses
von Gag zu Gag/Pol von 60 zu 1 lag das Gag/Pol-Fusionsprotein unterhalb
der Nachweisgrenze des eingesetzten anti-Gag-Antikörpers. M: Rainbow-Marker (Amersham); m:
Broad Range Marker (BioRad).
7:
Cryoelektronenmikroskopische Aufnahme selbstassemblierter VLP nach
der pL*G-getriebenen Expression von Gag in dem Virusfreien Hefestamm
S86c. Die VLP wurden aus Gag-haltigen Gradientenfraktionen durch
12 h Zentrifugation bei 100.000 × g und 4°C reisoliert und in PBSE resuspendiert.
Die VLP-Lösung
mit einem Proteingehalt von 0,5 mg/ml wurde zur Vorbereitung der
Cryo-Proben verwendet (Skalierungsstrich, 100 nm).
8:
Western-Analyse der Gradienten-Fraktionen 1-20 und des Gradienten-Pellets
(GP) der VLP-Präparationen
aus den Hefetransformanten A) S86c × pL*G, B) S86c × pL*GS
und C) S86c × pL*GD.
Vor der Dichtegradienten-Zentrifugation wurden die Kissen-Pellets
zur Oberflächendekoration
rekombinanter VLP mit jeweils 4 μg
monoklonalem anti-c-myc-Antikörper behandelt,
der auch zum immunologichen Nachweis c-myc-markierter Fusionsproteine
verwendet wurde (1 : 2.000 verdünnt).
Als Sekundärantikörper diente
ein anti-Maus/Alkalische Phosphatase-Konjugat, das die zur Dekoration
und zur Blot-Entwicklung
eingesetzten anti-c-myc-Antikörper
erkennt. M: „Full
range" Rainbow-Marker (Fa. Amersham).
Bemerkung:
Die Gag-Signale in Blot A) resultieren aus der Kreuzspezifität des anti-c-myc-Immunglobulins.
9:
Elektronenmikroskopische Aufnahme Antikörper behandelter GD-VLP, die
aus der Hefetransformante S86c × pL*GD
präpariert
wurden.
- A) GD-VLP + anti-Gfp (murin) + anti-Maus/5
nm Gold (Kontrolle);
- B) GD-VLP + anti-c-myc (murin) + anti-Maus/5 nm Gold.
Die
Partikel-Lösung
wurde zur Negativkontrastierung mit Uranylacetat-Lösung behandelt
und anschließend
auf Polylysin-beschichtete Träger
pipettiert. Mikroskopische Vergrößerung:
A) 120.000 bzw. B) 150.000 (TECNAI G2 12,
Fa. FEI).
10:
Western-Analyse der Gradienten-Fraktionen 1-17 und des Gradienten-Pellets
(GP) der VLP-Präparationen
aus den Hefetransformanten A) S86c × pL*G8S, B) S86c × pL*G8D,
C) S86c × pL*G16S
und D) S86c × pL*G16D.
Vor der Dichtegradienten-Zentrifugation wurden die Kissen-Pellets zur
Oberflächendekoration
rekombinanter VLP mit jeweils 4 μg
monoklonalem anti-c-myc-Antikörper
behandelt, der auch zum immunologichen Nachweis c-myc-markierter
Fusionsproteine verwendet wurde (1 : 2.000 verdünnt). Als Sekundärantikörper diente ein
anti-Maus/Alkalische Phosphatase-Konjugat,
das die zur Dekoration und zur Blot-Entwicklung eingesetzten anti-c-myc-Antikörper erkennt.
M: „Full
range" Rainbow-Marker
(Fa. Amersham).
11:
Schematische Darstellung der Gag/Gfp-Fusionen GGS, GXGXS, G8G8S
und G8XGX8S. X: Faktor Xa-Schnittstelle; 8x myc: 8x c-myc-Epitop.
12:
Western-Analyse der Gradienten-Fraktionen 1-17 und des Gradienten-Pellets
(GP) der VLP-Präparationen
aus den Hefetransformanten A) S86c × pL*GGS, B) S86cx pL*GXGXS,
C) S86c × pL*G8G8S
und D) SB6c × pL*G8XGX8S (G8XGX8S-VLP mit anti-Gfp
dekoriert). Zum immunologichen Nachweis der Gfp-markierten Fusionsproteine
wurde monoklonaler anti-Gfp-Antikörper verwendet (1 : 2.000 verdünnt). Als
Sekundärantikörper diente
ein anti-Maus/Alkalische Phosphatase-Konjugat, das die zur Dekoration
und zur Blot-Entwicklung eingesetzten anti-Gfp-Antikörper erkennt. M: „Full range" Rainbow-Marker (Fa.
Amersham).
13:
Western-Analyse des Faktor Xa- Verdaus Detergenz-behandelter
(Spur 1) und intakter GXGXS-VLP (Spur 2). Nach der Prozessierung
verbleiben die vier Aminosäuren
der Protease-Schnittstelle am C-terminalen Ende des freigesetzten
Gfp (Gfp-X). Der immunologische Nachweis der Fusionsproteine erfolgte
mit monoklonalem anti-Gfp (1 : 2.000 verdünnt). Die schwachen Signale
oberhalb der Gfp-Bande repräsentieren
die kleine und große Untereinheit
der Xa-Protease (kl. bzw. gr. UE), die von anti-Gfp
unspezifisch gebunden wurden. M: „Full range" Rainbow-Marker (Fa.
Amersham).
14:
Schematischer Aufbau des GTXG-Fusionsproteins und die Bedeutung
seiner einzelnen Domänen.
AC = Affinitätschromatographie.
15:
Western-Analyse der VLP-Gradienten-Fraktionen 1-17 und des Gradienten-Pellets (GP) der
Hefetransformante S86c × pL*GTXG.
Der immunologische Nachweis des im Hefestamm S86c konstitutiv exprimierten
Fusionsproteins erfolgte mit einem monoklonalen anti-T7-Antikörper.
16:
Western-Analyse zum Nachweis des GTXG-Proteins nach der affinitäts-chromatographischen
Aufreinigung. Zum immunologischen Nachweis des Fusionsproteins wurde
ein monoklonaler anti-T7-Antikörper
verwendet. UZF: Ultrazentrifugation.
17:
Western-Analyse des proteolytisch prozessierten GTXG-Fusionsproteins
(10 μg)
nach Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen an Faktor Xa. Positivkontrolle: rGfp (rekombinantes
Gfp).
18:
Schematischer Aufbau des GTXEs-Fusionsproteins und die Bedeutung
seiner einzelnen Domänen.
AC = Affinitätschromatographie.
19:
Elektronenmikroskopische Aufnahme von rekombinanten GTXEs-Partikeln
nach in vivo Assemblierung in Hefe und Isolierung im Saccharose-Dichtegradienten.
Die Negativkontrastierung der VLP erfolgte mit Uranylacetat-Lösung.
20:
A) Mikrotiter-Assay zum Nachweis der katalytischen Aktivität rekombinanter
GTXEs-Partikel (70 ng und 280 ng) über den Zeitraum von 1 h. Als
Negativkontrolle dienten unmodifizierte Gag-VLP (560 ng). Die Esterase-bedingte
Freisetzung von 4-Nitrophenol aus 280 μM 4-Nitrophenylacetat wurde über eine
Absorptionsmessung bei einer Wellenlänge von 405 nm bestimmt. B)
Reaktionskinetik der Hydrolyse von 2 mM 4-Nitrophenylacetat zu 4-Nitrophenol
und Acetat durch die aus E. coli affinitätsgereinigte Esterase (TXEs)
und die aus Hefe präparierten
Gag/Esterase-Partikel (GTXEs-VLP). Die Umsetzungen erfolgten jeweils
bei 25°C
in einem Reaktionsvolumen von 0,1 ml unter neutralen Bedingungen
in PBS50-Puffer pH 7,0.
21:
A) Coomassie-gefärbtes
SDS-Gel und B) Western-Analyse zum Nachweis rekombinanter GTXEs-VLP.
Jeweils 20 μl
Probe wurden untersucht: „RI" repräsentiert
das Reisolat (3 μg),
das zur Reaktion verwendet wurde, „RZ" die nach der Esterhydrolyse rezyklisierten
Partikel und „Ü" den Reaktionsüberstand
nach Ultrazentrifugation. Als Kontrolle dienten 1 μg und 3 μg BSA (64kDa).
Der immunologische Nachweis der 113 kDa großen GTXEs-Fusion erfolgte durch
monoklonales anti-T7. M: „Full
range" Rainbow-Marker
(Fa. Amersham).
22:
Reaktionskinetik der Hydrolyse von 4 mM 4-Nitrophenylacetat zu 4-Nitrophenol
und Acetat durch rekombinante GTXEs-Partikel vor (Reisolat) sowie
nach der Umsetzung und Rezyklisierung (Rezyklisat). Die Umsetzung
erfolgte bei 25°C
in einem Mikrotiter-Assay
(Reaktionsvolumen: 0,1 ml) unter neutralen Bedingungen in PBS50-Puffer pH 7,0.
23:
Schematische Darstellung der Expressionskassette zur Etablierung
rekombinanter Satellitenviren in einer LA-haltigen
Hefe sowie Fließdiagramm
der einzelnen Ereignisse innerhalb der Hefezelle.
24: Schematische Darstellung der hybridisierenden
Bereiche des konstruierten Hairpin-Ribozyms (H : Helix-Regionen).
25:
Darstellung der Assemblierung rekombinanter Satellitenviren in LA-haltigen Hefen. Das entscheidende Ereignis
ist die Ribozym (Rz)-getriebene Freisetzung des VBS/TRE-Bereichs
durch die in vivo erfolgende Abspaltung des RNA-Pol II-generierten
Poly(A)-Traktes der heterologen mRNA.
26: Schematische Darstellung des Verpackungs-
und Replikationszyklus der Ribozym-prozessierten Plasmid-mRNA. Letztere
parasitiert die Capsid-Proteine Gag und Gag/Pol des wirtszelleigenen
LA-Virus und persistiert analog den M-Genomen als
Satelliten-Virus.
27:
Northern-Analyse zur Überprüfung der
Funktionalität
des Hairpin-Ribozyms nach einer in vitro „run off" Transkription. Der Nachweis der RNA-Fragmente
erfolgte über
eine Digoxigenin-markierte Sonde und Chemilumineszenz.
28:
Northern-Analyse von Gesamtzell-RNA zur Überprüfung der Funktionalität des Hairpin-Ribozyms
in einer LA-Virus-haltigen Hefe, die das
Hairpin-Ribozym Plasmid-kodiert
(Vektoren pMGXHP und pMLXHP) transkribiert. Als Negativkontrolle
wurde die Gesamtzell-RNA aus dem untransformierten Hefestamm mitgeführt. Der
Nachweis der RNA-Fragmente erfolgte über eine Digoxigenin-markierte
Sonde und Chemilumineszenz.
29:
Northern-Analyse zum Nachweis VLP-assoziierter RNA aus einer Hefetranformante, die
mit dem VBS/Hairpin-Vektor pMGXHP und dem LA-Proteinen
kodierenden Plasmid pL*AT kotransformiert wurde. Die rekombinanten
Partikel wurden aus der Hefe präpariert
und einer RNA-Extraktion unterzogen. Als Negativkontrolle wurde
VLP-assoziierte RNA aus einer Hefetransformante mitgeführt, die
nur mit pL*AT transformiert wurde. Der Nachweis der RNA-Fragmente
erfolgte über
eine Digoxigenin-markierte
Sonde und Chemilumineszenz.
30:
Struktureller Aufbau des konstruierten Fusionsproteins (a), aus
dem in vivo assemblierte VLP hervorgehen (b), bei denen Geno- und
Phänotyp über nichtkovalente
Bindung eng miteinander gekoppelt sind.
31:
Struktureller Aufbau eines Fusionsproteins (a), aus dem in vivo
VLP hervorgehen (b), die nach Assoziation eines Aufnahme-vermittelnden Proteins
als Gentransfer-Vehikel für
eukaryontische Zellsysteme dienen.
Die
Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert, ohne darauf beschränkt zu sein:
Beispiel 1: Herstellung
einer Vakzine in Form rekombinanter Partikel
Zur
Herstellung einer potentiellen Vakzine in Form rekombinanter Partikel
wurde zunächst
ein verkürztes
Fragment "Ce" des immundominanten
Proteins pp65 des humanen CytomegalieVirus (hCMV) "in frame" an den C-Terminus
des LA-viralen Capsidproteins Gag fusioniert
(GCe-Fusion). Auf dieser GCe-Fusion basierend wurde ein zweites
Konstrukt hergestellt, das den Ce-Bereich zusätzlich innerhalb des Gag-Proteins
vor der Aminosäure-Position
S182 enthält
(GCeSCe-Fusion), die eine Exposition heterologer Peptide auf der äußeren Capsidoberfläche erlaubt. 1 zeigt
den schematischen Aufbau beider Fusionsproteine und der resultierenden
hybriden VLP.
Analog
der Pol-Domäne
des natürlichen Gag/Pol-Proteins
ragt der heterologe Ce-Bereich in das Capsidinnere, wo er vor dem
Abbau durch wirtseigene Proteasen geschützt ist. Das Ce-Protein umfaßt die beschriebenen
Helfer-T-Lymphocyten (HTL)-Epitope p10-I und p6-II (Khattab et al., 1997) sowie die
Cytotoxische T-Lymphocyten (CTL)-Epitope AE42, AE44 und AE45 (Solache
et al., 1999). Das Fusionsgen befindet sich unter der transkriptiven Kontrolle
des konstitutiven Phosphoglyceratkinase-Promotors in dem E. coli/Hefe "shuttle"-Vektor pL*, der
zum selektiven Wachstum neben der Ampicillin-Resistenz das hefeeigene LEU2-Gen beinhaltet.
Die resultierenden Vektoren pL*GCe bzw. pL*GCeSCe wurden in den
Virusfreien Leucin-auxotrophen Hefestamm S. cerevisiae S86c (eigene
Hefe-Stammsammlung) eingeschleust. Transformanten wurden in Leucin-freiem SC-Medium
bis zu einer Zellzahl von 4-6 × 107 Zellen/ml kultiviert und mittels Zymolyase
20T und Glasperlen aufgeschlossen. Die hybriden VLP wurden aus dem
Extraktüberstand
via Ultrazentrifugation über
ein 45%-iges Saccharosekissen und anschließend über einen 20-70%-igen Saccharosegradienten
gereinigt. Die darauf folgende Fraktionierung lieferte 20 Fraktionen
(je 2 ml), wovon die ersten 17 und das in 2 ml PBSE resuspendierte Gradienten-Pellet
in einer Western-Analyse überprüft wurden.
Die GCe- und GCeSCe-Fusionsproteine wurden
mit Hilfe eines monoklonalen anti-pp65-Antikörpers immunologisch nachgewiesen.
Die Fusionsproteine GCe und GCeSCe zeigen auf den Blots (2)
ein ähnliches
Verteilungsmuster wie das Gag-Protein (6), so dass
eine in vivo Assemblierung beider Proteine zu chimären VLP
zugrundegelegt wird. Im Falle des GCe-Fusionsproteins konnte die
Assemblierung in Hefe zu viralen Partikeln anhand elektronenmikroskopischer
Aufnahmen bestätigt
werden (3).
Fusionsprotein-haltige
Fraktionen wurden vereint, die hybriden Partikel durch eine erneute
Ultrazentrifugation reisoliert und in PBSE-Puffer resuspendiert.
Die Antigenität
der Partikel wurde in einem ex vivo Assay mit Vollblut einer CMV-seropositiven Spenderin überprüft. Hierbei
wurden dem Vollblut Antigen sowie kostimulatorische Antikörper zugesetzt
und eine dadurch vermittelte Aktivierung CD4-positiver HTL sowie
CD8-positiver CTL über eine
FACS-Analyse untersucht (Breinig et al., 2003), wobei eine verstärkte Expression
von γ-Interferon (IFN-γ) und CD69
als Aktivierungsmarker dienten. Eine Aktivierung von mehr als 0,05%
der untersuchten T-Zellpopulation wurde als signifikant eingestuft. Neben
den Partikel-Proben GCe und GCeSCe wurden folgende Kontrollen mitgeführt: kostimulatorische
Antikörper
anti-CD28/anti-CD49d ohne Antigen; PBSE-Puffer; Lysat nicht- und
CMV-infizierter Fibroblasten sowie Gag-VLP.
In 4 sind
die antigenspezifischen Antworten der CD4- und CD8-positiven Lymphocyten dargestellt.
Die Zellen wurden durch das als Positivkontrolle eingesetzte Lysat
CMV-infizierter Fibroblasten, durch GCe-Partikel (5 und 11 μg) sowie
durch 0,1 μg
GCeSCe-VLP signifikant aktiviert. Unmodifizierte Gag-VLP (5 μg) und der
zur Partikel-Präparation
verwendete PBSE-Puffer bewirkten ebenso wie das Lysat nichtinfizierter
Fibroblasten keine signifikante Antwort. Im Kontext einer Antwort
CD8-positiver CTL wirkten GCe-Partikel dosisabhängig aktivierend, wohingegen
GCeSCe- und Gag-VLP einen nichtsignifikanten Effekt zeigten.
Zusammenfassend
kann den GCe-VLP in den eingesetzten Konzentrationen eine immunaktivierende
Wirkung hinsichtlich CD8-positiver CTL zugeordnet werden. Vorherige
Antigenitätsstudien
mit GCe-Partikeln aus dem Pellet nach der Kissen-Zentrifugation bestätigen diese Beobachtung (Daten nicht
gezeigt). Zudem bewirken sie eine Aktivierung CD4-positiver HTL,
wobei 5 μg
GCe-VLP stärker
aktivierend waren als 11 μg
Partikel. GCeSCe-VLP riefen in deutlich geringeren Konzentrationen
(0,1 μg) eine
nahezu gleichstarke CD4-Antwort hervor wie 5 μg GCe-Partikel. Jedoch induzierten
sie keine signifikante Aktivierung CD8-positiver Zellen, wobei in
diesem Kontext jedoch neben der unterschiedlichen Capsidzusammensetzung
auch ein Effekt der Mengendifferenz im Vergleich zu den GCe-Partikeln
nicht ausgeschlossen werden kann. Der Vollblut-Assay zeigt darüberhinaus,
dass das Gag-Protein als nicht bzw. nur schwach immunaktivierender
Antigen-Träger
fungiert und somit ausschließlich
das künstlich eingefügte Ce-Epitop
für die
gewünschte,
signifikante Antigenität
verantwortlich ist.
Beispiel 2: Präsentation
oberflächenezponierter
Epitope mittels rekombinanter L-A-Partikel
Die
Bildung von LA-Virionen in der Hefe S. cerevisiae
setzt eine korrekte Assemblierung der Capsidproteine Gag und Gag/Pol
voraus. Fujimura et al. (1992) konnten zeigen, dass Gag allein dafür verantwortlich
ist, da bereits die Plasmidgetriebene Expression von gag in der
Bäckerhefe
zur Bildung nukleinsäurefreier
VLP führt.
Im Vergleich mit den natürlichen
LA-Partikeln lassen sich jene Gag-VLP elektronenmikroskopisch
nicht unterscheiden und weisen ein ähnliches Sedimentationsverhalten
im Dichtegradienten auf.
Die
unten dargestellten Ergebnisse basieren auf einem gag-Konstrukt,
das sich im C-terminalen Bereich durch das Einführen einer Sac I-Schnittstelle von
dem Wildtyp-Capsidprotein
geringfügig
unterscheidet. Das gag-Gen befindet sich unter der transkriptiven
Kontrolle des konstitutiven Phosphoglyceratkinase-Promotors in dem
E. coli/Hefe "shuttle"-Vektor pL*, der
zum selektiven Wachstum der Wirtsorganismen neben der Ampicillin-Resistenz
das hefeeigene LEU2-Gen beinhaltet. Der resultierende Vektor pL*G
(5a) wurde in den Virusfreien, Leucin-auxotrophen
Hefestamm S. cerevisiae S86c (eigene Hefe-Stammsammlung) eingeschleust.
Transformanten wurden in Leucin-freiem
SC-Medium bis zu einer Zellzahl von 4-6 × 107 Zellen/ml
kultiviert und mittels Zymolyase 20T und Glasperlen aufgeschlossen.
Die hybriden VLP wurden aus dem Extraktüberstand via Ultrazentrifugation über ein
45%-iges Saccharosekissen und anschließend über einen linearen 20-70%-igen
Saccharosegradienten gereinigt. Die darauf folgende Fraktionierung
lieferte 20 Fraktionen (je 2 ml), wovon die ersten 17 und das in
2 ml PBSE resuspendierte Gradienten-Pellet in einer Western-Analyse überprüft wurden.
Zum Vergleich wurden natürliche
LA-Virionen mitgeführt, die aus dem Hefestamm
S. cerevisiae MS300b isoliert wurden. 6 belegt,
dass die rekombinanten Gag-VLP aus der pL*G-getriebenen Expression
im Dichtegadienten das gleiche Sedimentationsverhalten wie die natürlichen
dsRNA-haltigen LA-Partikel zeigen (6, Fraktionen
8-14). Zudem weisen sie in kryoelektronenmikroskopischen Aufnahmen
eine identische icosaedrische Capsidstuktur auf (7).
Zur
Modifikation der äußeren Capsidoberfläche wurden
innerhalb des Gag-Proteins zwei Positionen (Aspartat D262 und Serin
S182) ausgewählt,
um das 10 Aminosäuren
große
c-myc-Epitop als 1-, 8- bzw. 16-fache Kopie zu inserieren (5b). Die entsprechenden Konstrukte werden
mit pL*GS(D), pL*G8S(D) bzw. pL*16S(D) bezeichnet. Als Expressionswirt
wurde der Virusfreie Hefestamm S86c eingesetzt. Das nach der Ultrazentrifugation
des Extraktes Konstrukt-exprimierender Hefen erhaltene Kissen-Pellet
wurde resuspendiert und mit 2-4 μg
eines monoklonalen murinen anti-c-myc-Antikörpers versetzt, der an potentiell
capsidoberflächenexponierten c-myc-Epitopen
bindet. Die Suspensionen aus Partikeln mit Antikörper wurden auf ein Saccharose-Gradienten
aufgetragen. Die aus der Dichtegradienten-Zentrifugation erhaltenen
Fraktionen sowie das Gradienten-Pellet (GP) wurden einer SDS-PAGE
unter reduzierenden Bedingungen und einer Western-Analyse unterzogen,
wobei der anti-c-myc-Antikörper
und ein anti-Maus/Alkalische
Phosphatase-Konjugat zum immunologischen Nachweis der Fusionsproteine
verwendet wurden. Als Negativkontrolle wurde die Hefetransformante
S86c × pL*G
eingesetzt, die unmodifizierte Gag-Partikel liefert. Werden letztere
mit anti-c-myc behandelt
und nach einer Dichtegradienten-Zentrifugation fraktioniert, so
zeigt sich, dass unter den gewählten
Bindungsbedingungen keine Antikörper
an die aus unmodifizierten Gag-Proteinen assemblierten Partikel
binden (8A): Die Gag-spezifischen Signale
(76 kDa), die aus der Kreuzreaktivität der zum immunologischen Nachweis
eingesetzten Antikörper
resultieren, befinden sich in den Fraktionen 10-13, wohingegen die anti-c-myc-spezifischen
Signale (leichte Kette: 27 kDa; schwere Kette: 54 kDa) erst ab Fraktion
17 auftreten.
Werden
c-myc-markierte gag-Fusionen in vivo exprimiert, Partikel-Aufreinigungen
und Antikörper-Behandlungen
der Kissen-Pellets durchgeführt, liefern
die resultierenden Gradienten-Fraktionen im Rahmen einer Western-Analyse
die in 8B und 8C dargestellten
Ergebnisse. Anhand der charakteristischen Signalverteilung auf den
Western-Blots wird
angenommen, dass aus den Ansätzen
S86c × pL*GS
und S86c × pL*GD
chimäre
VLP hervorgehen, die die Fähigkeit
zur Selbst-Assemblierung beibehalten haben. Die Signale im Gradienten-Pellet werden
vermutlich durch Fusionsprotein-Aggregate undefinierter Symmetrie
verursacht, die den Dichtegradienten vollständig passieren.
Im
Gegensatz zu dem Gag-VLP-Ansatz (8A)
komigrieren die anti-c-myc-Antikörper
mit den Epitop-markierten GS- und GD-VLP (8B und
C) in den Saccharose-Gradienten,
so dass von exponierten Positionen der eingeführten c-myc-Epitope an den
Integrationsstellen D262 und S182 auf der äußeren Capsidoberfläche ausgegangen
wird, die für
Antikörper
zugänglich
sind. Letzteres konnte mit Hilfe einer Immunogold-Elektronenmikroskopie bestätigt werden
(9). Hierbei wurden präparierte GD-VLP mit murinem
anti-Gfp (Kontrolle) bzw. anti-c-myc und anschließend mit
anti-Maus/5 nm Gold versetzt. Die elektronenmikroskopische Aufnahme
in 9A zeigt GD-Partikel, die ein identisches
Aussehen aufweisen wie natürliche
LA-Virionen, die von Oliver et al. (1977)
nach Kontrastierung mit Uranylacetat beschrieben wurden: Isometrische Viruspartikel,
die sich durch einen dunklen Kern sowie einen hellen Randbereich
auszeichnen. Die schwarzen Punkte zwischen den VLP stammen von Gold-Konjugaten, welche
statistisch verteilt vorliegen. Werden GD-Partikel mit anti-c-myc
dekoriert und anschließend
mit Immunogold behandelt, so erscheint die VLP-Oberfläche durch
die Assoziation mit dem Primärantikörper diffus.
Zudem befinden sich im Vergleich zur Kontrolle verstärkt Gold-Konjugate
an der Capsidoberfläche,
was auf deren Bindung an anti-c-myc zurückzuführen ist. Die Ergebnisse der
Immunogold-Elektronenmikroskopie sowie jene der Western-Analysen (8)
belegen die Exposition der an Gag-S182 und Gag-D262 eingeführten c-myc-Epitope
auf der äußeren Capsidoberfläche in Hefe
assemblierter GS- und GD-Partikel.
Nach
der erfolgreichen Präsentation
des zehn Aminosäuren
großen
c-myc-Epitops auf der äußeren Capsidoberfläche rekombinanter
Partikel wurde eine Vergrößerung des
Fremdpeptids vorgenommen, um die Insertionskapazität an den
Gag-Aminosäurepositionen
S182 und D262 zu bestimmen. Hierzu wurde das c-myc-Peptid innerhalb
der gag-Konstrukte vervielfältigt,
resultierende Fusionen in dem Virusfreien Hefestamm S86c exprimiert
und auf die Assemblierungsfähigkeit
der Fusionsproteine in vivo zu rekombinanten VLP getestet. Hierbei
konnten das 8x und 16x c-myc-Epitop (11,3 bzw. 22,2 kDa) in das Capsidprotein
integriert werden (G8S[D]- und G16S[D]-Fusionen), die nach Expression
in vivo rekombinante Partikel liefern (10). In
nachfolgenden Studien wurde das Grün fluoreszierende Protein (Gfp,
26,8 kDa) anstelle des poly-c-myc-Epitops vor Gag-S182 integriert (11)
und die Auswirkung der Integration auf das Assemblierungsvermögen resultierender
Partikel nach Expression in der per se Virusfreien Hefe S86c untersucht.
Wird Gfp allein inseriert (GGS-Fusion), so verläuft die Assemblierung zu rekombinanten
VLP in vivo ineffizient, da die fraktionsspezifischen Signale im
Gegensatz zu jenem des Gradienten-Pellets sehr schwach sind (12 A). Letzteres
wird vermutlich durch in der Hefezelle gebildete Fusionsproteine
hervorgerufen, die sich zu Aggregaten unspezifischer Struktur zusammenlagern
und im Zentrifugalfeld aufgrund ihrer hohen molekularen Masse den
Saccharose-Dichtegradienten vollständig passieren. Jedoch ist
es durch den Einbau von zusätzlichen
Gfp-flankierenden Peptidsequenzen gelungen, die Assemblierungseffizienz
entsprechender Fusionsproteine zu intakten VLP wieder zu erhöhen (12B/C/D). Die in diesem Kontext verwendeten flexiblen
Linker sind die Faktor Xa-Schnittstelle
mit der Aminosäure-Sequenz
IEGR („X") und das 8x c-myc-Epitop
(„8"). Hinsichtlich der G8XGX8S-Fusion
beträgt
die Integrationskapazität an
Gag-S182 53 kDa, wobei der Fremdanteil Gfp im Rahmen einer VLP-Dekoration
für anti-Gfp
zugänglich
ist. Darüber
hinaus sind die Protease-Schnittstellen
auf der äußeren Capsidoberfläche intakter GXGXS-Partikel
für den
Faktor Xa zugänglich,
mit dessen Hilfe Gfp freigesetzt werden kann (13). Zusammenfassend
erlauben die hier beschriebenen chimären Gab Partikel unter Verwendung
flexibler Linker die Oberflächen-Präsentation
von Proteinen mit einer molekularen Masse von knapp 27 kDa.
Beispiel 3: Expression
und Aufreinigung von Fremdproteinen mittels rekombinanter ScV-L-A-Partikel
Hybride
Virus-Parikel, deren Capsidproteine mit einem Fremdprotein fusioniert
sind, stellen eine interessante Alternative zu den konventionellen
Expressionssytemen dar, weil sie aufgrund ihrer hohen molaren Masse
durch Ultrazentrifugation aus einem Zellextrakt einfach isoliert
werden können.
In diesem Zusammenhang verwendeten Burns et al. (1990) das p1-Protein
des Ty-Retrotransposons aus der Hefe Saccharomyces cerevisiae zur
Produktion und Aufreinigung des SIV-p27-Proteins. Fusionsproteine
aus p1 und C-terminal
angefügtem
Fremdprotein assemblieren in der Bäckerhefe über den p1-Anteil zu hybriden
Ty-Partikeln, die das heterologe Polypeptid auf ihrer äußeren Oberfläche exponieren.
Eine dem Fremdprotein N-terminal eingefügte Protease-Schnittstelle
ermöglicht
seine Freisetzung vom Träger-Capsid
sowie finale Aufreinigungsschritte.
Zur
Expression und Aufreinigung von Fremdproteinen werden die in den
Beispielen 1 und 2 beschriebenen Integrationsstellen des LA-viralen Hauptcapsidproteins Gag ausgenutzt.
Zur Herstellung hybrider VLP wurde zunächst das Grün fluoreszierende Protein (Gfp)
C-terminal an Gag fusioniert, wobei ein T7-Epitop und eine Faktor
Xa Proteaseschnittstelle N-terminal der
GFP-Sequenz eingefügt
wurden (14). Die GTXG-Fusion wurde in
den Expressionsvektor pL* (5) einkloniert,
so dass das resultierende Plasmid pL*GTXG eine konstitutive Expression
des Fusionsproteins in der Virusfreien Hefe S. cerevisiae S86c (eigene
Hefe-Stammsammlung) erlaubt. Im Rahmen einer Partikel-Isolierung aus GTXG-Fusionsprotein-produzierenden
Hefezellen und einer nachfolgenden Western-Analyse der Gradienten-Fraktionen
1-17 und des Gradienten-Pellets (GP) wurde eine VLP-typische Signalverteilung
auf den Blot-Membranen festgestellt, die auf eine in vivo Assemblierung
der Fusionsproteine zu hybriden Partikeln hinweist (15).
Nach einer Reisolierung aus dem Saccharose-Gradienten wurden die
chimären VLP
mit Hilfe eines Detergenz-haltigen Puffers zerborsten und einer
affinitätschromatographischen
Aufreinigung über
eine anti-T7-Matrix unterzogen (16). Die
Eluate wurden anschließend
mit Faktor Xa verdaut, wobei verschiedene
Protease/Fusionsprotein- Verhältnisse
gewählt
wurden. Die Western-Analyse in 17 zeigt
einerseits die Protease-getriebene Abspaltung des Gfp-Abschnitts
von dem GTXG-Fusionsprotein und andererseits die Abhängigkeit
der Gfp-Freisetzung von der eingesetzten Enzym-Menge.
Alternativ
zur GTXG-Fusion wurde eine Gag-Variante konstruiert, in der das
von Faktor Xa Schnittstellen flankierte
Gfp-Protein vor der Aminosäure
S182 integriert vorliegt (Beispiel 2, 11). Die
Expression dieser 105 kDa großen
GXGXS-Fusion in Hefe liefert rekombinante Partikel, die ein für VLP charakteristisches
Wanderungsverhalten im Dichtegradienten zeigen (Beispiel 2, 12B). Nach einer Reisolierung aus dem
Saccharose-Gradienten wurden intakte VLP sowie durch Detergenz-Behandlung
der Partikel erhaltene GXGXS-Monomere mit Faktor Xa verdaut.
In beiden Fällen
konnte neben dem Volllängen-Fusionsprotein
und einer einfach prozessierten Variante freigesetztes Gfp immunologisch
nachgewiesen werden (Beispiel 2, 13). Dieses
Ergebnis belegt die Zugänglichkeit
der Gfp-flankierenden Protease-Schnittstellen für Faktor Xa.
Desweiteren
umfasst die Erfindung Enzym-Fusionen des ScV-LA-Capsidproteins
und daraus hervorgehende rekombinante Partikel als rezyklisierbare
Biokatalysatoren. Unter diesem Aspekt wurde die GFP-Sequenz der
oben beschriebenen GTXG-Fusion gegen jene der Esterase EstC aus dem
Bakterium Burkholderia gladioli (Reiter et al., 2000) ausgetauscht
(18). Wird das entsprechende GTXEs-Konstrukt in
Hefe exprimiert, assemblieren die Fusionsproteine zu intakten VLP
(19). Letztere zeigen im Mikrotiter-Assay Ester-spaltende Aktivität, wobei
unmodifizierte Gag-Partikel als Negativkontrolle dienten (20A). Zum Vergleich spezifischer Aktivitäten wurde
als Kontrolle eine Esterase-Fusion (TXEs) in E. coli synthetisiert,
der im Gegensatz zum GTXEs-Konstrukt die Gag-Domäne fehlt. Nach Aufschluss induzierter
Bakterienzellen wurde das lösliche
TXEs-Enzym affinitätschromatographisch über eine
anti-T7-Matrix gereinigt und neben GTXEs-VLP aus S. cerevisiae zur
Bestimmung der katalytischen Aktivität in einem Mikrotiter-Assay eingesetzt
(20B). Unter Verwendung von 2 mM 4-Nitrophenylacetat
als Substrat erzielten rekombinante GTXEs-Partikel aus Hefe spezifische
Enzymaktivitäten
von bis zu 12,8 Units pro mg Fusionsprotein, wobei 1 Unit als die
Enzymmenge definiert wird, die unter Testbedingungen 1 μmol Alkoho/min
freisetzt. Das entspricht einer Aktivität von 38,9 Units pro mg Protein
für den
37,2 kDa großen
TXEs-Anteil von 32,9% innerhalb der GTXEs-Fusion (113 kDa), wohingegen
die bakteriell exprimierte TXEs-Esterase mit 72,6 Units pro mg Protein
bei gleichen Substratkonzentrationen eine 1,9-fach höhere Aktivität aufweist.
Dieser Unterschied basiert auf der Lokalisation der Esterase-Domäne im Capsidinneren
der GTXEs-VLP, wobei die Virushülle
aus assembliertem Gag-Protein eine Diffusionsbarriere darstellt.
Hierdurch wird die Zugänglichkeit
des aktiven Zentrums für
die Substrate reduziert und ein rasches Hinausdiffundieren der Produkte
aus den Capsiden unterbunden, was im Vergleich zum „nackten" TXEs-Enzym in einer
geringeren spezifischen Aktivität
mündet.
Im
Rahmen einer Enzym-Rezyklisierung wurden rekombinante Gag/Esterase-Partikel
aus einem Reaktionsansatz mittels Ultrazentrifugation reisoliert
und hinsichtlich ihrer Quantität
und katalytischen Qualität überprüft. Das
in 21A dargestellte Coomassiegefärbte SDS-Gel
zeigt, dass circa ein Drittel der ursprünglich eingesetzten Esterase-Partikel durch Ultrazentrifugation
des Reaktionsansatzes wiedergewonnen werden können. Der Rest muss im Reaktionsüberstand
enthalten sein, der jedoch weder in der Coomassienoch in der Western-Analyse (21B) aufgrund der hohen Verdünnung GTXEs-spezifische Signale
liefert. Unter Verwendung von 4 mM 4-Nitrophenylacetat hydrolysieren
die rezyklisierten Partikel nachwievor das Ester-Substrat (22)
und weisen vergleichbare spezifische Aktivitäten von 20,2 Units pro mg Fusionsprotein
auf wie VLP, die für
die erste Ester-Spaltung eingesetzt wurden (20,8 Units pro mg Fusionsprotein).
Beispiel 4: Selektionsfreie
Expression von Fremdproteinen in vivo mittels rekombinanter Viruspartikel
in der Bäckerhefe
Die
Expression eines Fremdgens in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae
erfolgt nach deren Transformation mit einem DNA-Konstrukt (YEp, YRp,
YCp, YIp, YAC), das neben der Expressionskassette noch Gene für die Replikation
bzw. Selektion des Vektors enthält.
Daher müssen
Hefe-Transformanten zur Aufrechterhaltung derartiger Konstrukte
in definierten und kostspieligen Mangelmedien kultiviert werden,
wobei ihr Wachstum im Vergleich zu jenem in Vollmedien vermindert
ist und häufig
zu geringeren Zelldichten sowie suboptimalen Proteinausbeuten führt.
Zudem
zeigen Vektor-Systeme für
die Hefe unterschiedliche genetische Stabilität. So werden beispielsweise
YRp-Plasmide nicht vollständig
auf Tochterzellen segregiert, so dass letztlich nur 5-10% der unter
Selektionsdruck gewachsenen Hefe-Transformanten das Plasmid enthalten,
wobei eine verringerte Produktion des Fremdproteins einhergeht (Current
Protocols of Molecular Biology, Einheit 13.4).
In
der vorliegenden Erfindung wurde eine Expressionskassette konstruiert,
die eine stabile Expression heterologer Gene in einem LA-Virus-haltigem
Hefestamm ermöglichen
soll. Hierbei wird die Fremdgensequenz von regulatorischen und cis-prozessiven
Elementen flankiert, so dass die nach einer Transkription entstandene
rekombinante RNA durch die hefeeigenen LA-Funktionen
encapsidiert, repliziert und exprimiert wird (23).
Die Bereiche pPGK und tPGK stellen Promotor- respektive Terminator-Sequenzen
aus einem Hefe/E. coli "shuttle"-Plasmid dar, in
dem die Expressionskassette einkloniert ist, um in vivo eine konstitutive
Transkription zu ermöglichen.
Als Reportergene dienen das homologe LEU2- und das heterologe yEGFP3-Gen,
die einen einfachen phänotypischen
Nachweis der in vivo Expression erlauben: Wachstum auf Leucin-d/o-Medium
bzw. Nachweis von Gfp durch Fluoreszenz-Mikroskopie. Dem jeweiligen
Reportergen wurden die ersten 12 Basen des 5'-Endes der M28-(+)RNA vorgeschaltet,
da sie als 5'TRE
die Initiation der Transkription positiv beeinflussen (Schmitt und
Breinig, 2002). Das von der hefeeigenen RNA-Polymerase II gebildete
Transkript erhält
eine 5'-Kappe sowie
einen Poly(A)-Trakt am 3'-terminalen
Ende. Die am 3'-Ende eingefügte Ribozym
(Rz)-Sequenz (24) soll das Transkript
in cis derart prozessieren, dass die Reportergen-kodierende Sequenz
samt 3'VBS/TRE-Bereich
verbleibt. Der VBS/TRE-Trakt ("viral
binding site/terminal replication enhancer") enthält virale 3'-Sequenzen (alternativ aus LA, M1 und M28), die zur cytoplasmatischen
Replikation und Transkription der prozessierten RNA sowie zu deren
Verpackung in VLP ("Virus-like
particles") notwendig
sind. Replikation, Transkription als auch Encapsidierung sollen über das
Gag/Pol-Fusionsprotein des natürlich
vorkommenden LA-Virus der Wirtshefe erfolgen,
wobei nach einer Assemblierung über
LA-Gag-Proteine VLP resultieren, die die
prozessierte heterologe mRNA enthalten. In viro soll die Pol-Aktivität den Einzelstrang
zu einem Doppelstrang komplettieren und letzteren als Matrize zur
Transkription akzeptieren. Partikel mit heterologer dsRNA sollen
in der Zelle mit natürlichen
LA-VLP koexistieren und wie solche cytoplasmatisch
auf Tochterzellen vererbt werden, um eine stabile Expression des
Fremdgens in Vollmedien (unter nicht-selektiven Bedingungen) zu
gewährleisten.
Letzteres würde
gerade im Rahmen von industriellen Kultivierungen rekombinanter
Hefen eine deutliche Vergünstigung
der eingesetzten Nährmedien
ermöglichen.
Die 25 und 26 illustrieren schematisch die Vorgänge innerhalb
einer LA-haltigen Hefezelle, die mit einer
wie oben dargestellten Expressionskassette transformiert wurde.
Die
Etablierung eines heterologen RNA-Satelliten beginnt mit der Transkription
der DNA-Kassette
im Hefe-Zellkern, die zur Bildung von positiv orientierter Einzelstrang-RNA
((+)ssRNA) führt.
Nach dem Export ins Cytoplasma der Zelle wird die (+)ssRNA translatiert,
wobei das Reporterprotein hergestellt wird, beispielsweise Gfp,
das durch Fluoreszenz-Mikroskopie nachweisbar ist (25).
Ein Teil der heterologen RNA wird durch die Aktivität des Ribozyms am
3'-Ende prozessiert,
so dass die für
Verpackung und Replikation essentiellen Sekundärstrukturen freigesetzt werden.
Nach der Encapsidierung der prozessierten (+)ssRNA in LA-Partikel
der Wirtshefe erfolgt im Rahmen der Replikation eine in viro (-)-Strangsynthese
(26). Die resultierende dsRNA wird
durch die Pol-Aktivität
transkribiert, wodurch wieder heterologe (+)ssRNA entsteht, die
als virale RNA im Unterschied zum Transkript der nukleären RNA-Polymerase
weder eine 5'-Kappe noch einen Poly(A)-Trakt
am 3'-terminalen
Ende aufweist und somit für
einen neuen Verpackungs- und Replikationszyklus zur Verfügung steht.
Die 27 und 28 dokumentieren
die in vitro und in vivo Aktivität
des verwendeten Hairpin-Ribozyms. Im Rahmen der Encapsidierung Plasmidgetriebener
mRNA in LA-VLP wurde der Virusfreie Hefestamm
S86c mit den Vektoren pL*AT und pMGXHP kotransformiert: pL*AT kodiert
für die
LA-Proteine Gag und Gag/Pol, pMGXHP für ein GFP-VBS/TRE-Hairpin-Konstrukt,
dessen mRNA über
die VBS-Struktur durch Gag/Pol erkannt und in Partikel verpackt
werden soll. Das Hairpin-Ribozym dient zur Prozessierung des Transkriptes,
um in vivo ein authentisches Replikationssignal zu generieren. Die
Northern-Analyse in 29 belegt die Encapsidierung
der pMGXHP-getriebenen
Einzelstrang-RNA in LA-Partikel.
Beispiel 5: Untersuchung
von Protein/Protein-Wechselwirkungen auf der Basis oberflächenmodifizierter, RNA-encapsidierender
LA-Viruspartikel
Ein
häufiges
Ziel molekularbiologischer Forschung ist die Identifikation von
Protein/Protein-Interaktionspartnern, z. B. im Rahmen der Signaltransduktion.
Das allgemeine Prinzip gängiger
Methoden wie „ribosomal
display" oder „two hybrid
system" beruht auf
der Anwesenheit eines der Wechselwirkungspartner (des sogenannten
Köders,
entweder auf einer Oberfläche
immobilisiert und/oder in einer Fusion mit einem Reporterprotein
vorliegend), so dass Proteine aus der Expression einer cDNA-Bank mit
dem Köder
in vitro bzw. in in vivo interagieren können. Die kodierende Sequenz
korrekter Bindungspartner (Beute) kann nach der Selektion mittels verschiedener
Verfahren isoliert und kloniert werden (Fields and Song, 1989; Hanes
and Pluckthun, 2000).
Nukleinsäurehaltige,
chimäre „Virus-like
particles" (VLP)
könnten
zu den bisherigen Techniken eine Alternative darstellen. Capside,
die Fusionen aus einer assemblierenden und einer ssRNA-bindenden
Proteindomäne
enthalten, könnten
ihre eigene Plasmidkodierte Konstrukt-mRNA verpacken, in denen die
Transkripte effektiv vor einem Abbau durch RNasen geschützt sind.
Werden zusätzlich
noch auf der äußeren VLP-Oberfläche heterologe
Peptide exprimiert, sollten im Rahmen eines Screenings auch Ligandenbindungsstudien
möglich
sein, wobei positiv selektierte VLP die genetische Information des
Peptids bereitstellen und somit eine direkte Klonierung ermöglichen.
Fujimura
et al. (1990) konnten bereits in der Hefe Saccharomyces cerevisiae
die Encapsidierung Plasmidkodierter RNA in LA-Virionen
nachweisen. Das hierbei eingesetzte 725 Basen große Transkript enthielt
die „viral
binding site" (VBS)-Struktur
der X-RNA, einer natürlichen
Deletionsmutante von LA. Trotz der Anwesenheit
der RNA-Polymerase II-assoziierten Modifikationen (5'-Kappe und 3'-Poly(A)-Trakt) wurde
das Transkript über
die VBS-Struktur vom Gag/Pol-Fusionsprotein des natürlichen
LA-Systems der Wirtshefe erkannt und in
Viruspartikel verpackt. Anhand dieser Daten und der in Beispiel
2 dargestellten Optionen zur Oberflächenmodifikation von LA-Capsiden sollte die Herstellung rekombinanter
Partikel möglich
sein, die (i) heterologe Peptidsequenzen auf der äußeren Oberfläche exponieren,
welche für
Wechselwirkungspartner zugänglich
sind, und die (ii) ihre vektorkodierte mRNA encapsidieren (30).
Beispiel 6: Transfektionssystem
auf der Basis oberflächenmodifizierter,
RNA-encapsidierender
LA-Viruspartikel
Die
Mehrzahl der Vektorsysteme, die gegenwärtig zur Gentherapie eingesetzt
werden, sind Derivate von Retro-, Adeno- und Adeno-assoziierten
Viren. Ihre Capside, in denen die zu transformierende Nukleinsäure verpackt
wird, besitzen per se keinen Zelltyp-Tropismus (Robbins et al.,
1998). Um genetische Informationen selektiv in Gewebe eines bestimmten
Zelltyps einzuschleusen, muß die äußere Oberfläche des
Viruscapsids mit Peptid-Sequenzen modifiziert
werden, die eine gerichtete Aufnahme in die jeweilige Zielzelle
vermitteln.
Unter
diesem Aspekt verwendeten Stubenrauch et al. (2001) eine Variante
des polyomaviralen VP1-Capsidproteins, die in vitro in Anwesenheit
von Calcium-Ionen spontan zu "Virus-like
particles" (VLP) assemblieren.
Die rekombinanten Partikel exponieren auf ihrer äußeren Oberfläche eine
negativ geladene Peptid-Schleife, die als Adapter für Proteine dient,
welche einerseits elektrostatisch über einen polykationischen
Abschnitt an die VLP-assoziierte Peptid-Schleife binden und andererseits
eine zelltypspezifische Aufnahme forcieren. Auf diese Art mit tumorspezifischen
Antikörper-Fragmenten behaftete VLP
zeigten im Vergleich zur Negativkontrolle für Zellen entsprechender Tumorzelllinien
einen signifikanten Tropismus.
Anhand
dieser Daten und der Ergebnisse von Fujimura et al. (1990) sowie
jener über
die Modifizierbarkeit von LA-Capsiden in
Beispiel 1 sollten rekombinante LA-Partikel
hergestellt werden können, die
zur Bindung von Proteinen mit einem polykationischen Abschnitt einen
polyanionischen Bereich auf ihrer äußeren Oberfläche exponieren
und heterologe Einzel- oder Doppelstrang-RNA im Capsidinneren verpacken
(31). Werden diese Partikel mit Proteinen "dekoriert", die eine zelltypspezifische
Aufnahme vermitteln, so könnten
letztere als alternative Gentransfer-Vehikel eingesetzt werden.