DE102004021822B3 - Verfahren und Anordnung zur DNA-Amplifikation mittels PCR unter Einsatz von Trockenreagenzien - Google Patents

Verfahren und Anordnung zur DNA-Amplifikation mittels PCR unter Einsatz von Trockenreagenzien Download PDF

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    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Abstract

Bei einem Verfahren zur DNA-Amplifikation durch PCR mit Thermozyklisierung, das die zugehörigen Reagenzien enthält, wobei eine vollständige Integration aller Stoffe und Verfahrensschritte in einer geschlossenen, einmal verwendbaren Einheit (sog. Cartridge), in der die Reagenzien in einer bei Raumtemperatur lagerstabilen Form bevorratet sind, werden die wasserlöslichen Reagenzien durch ein nichtwasserlösliches Medium abgedeckt, die zu amplifizierenden DNA wird zugeführt und das nichtwasserlösliche Medium wird entfernt, so dass die wasserlöslichen Reagenzien gelöst werden, wodurch die PCR gestartet wird. DOLLAR A Bei der zugehörigen Anordnung ist eine Probeneinheit, welche als Einmalprodukt (sog. Cartridge) vorhanden, wobei wenigstens ein Mikrokanal (5) bzw. Mikrokavität (20) zur Aufnahme eines PCR-Reagens vorhanden, in denen die PCR-Reagenzien als trockenbares Gemisch mit vernachlässigbarem Dampfdruck, das bei Raumtemperatur eine lagerstabile Substanz bildet, an den Wandungen des Mikrokanals (5) bzw. der Mikrokavität (20) haftet und einen dünnen Film (25) bildet, welcher mit einem nichtlöslichen Medium (26) abgedeckt ist.

Description

  • Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur DNA-Amplifikation durch PCR mit Thermozyklisierung der die DNA enthaltenden Substanzen einschließlich der zugehörigen Reagenzien. Daneben bezieht sich die Erfindung auch auf eine zugehörige Anordnung zur Durchführung des Verfahrens.
  • Zur Nukleinsäureanalytik z.B. von weißen Blutzellen aus Vollblut zur Beantwortung von humangenomischen Fragestellungen müssen zunächst in einem Probenvorbereitungsschritt die Zellen aufgebrochen und anschließend die dabei freigesetzte DNA isoliert werden. Dabei müssen Blutbestandteile, wie z.B. Hämoglobin, Immunoglobuline und Laktoferrin, die eine nachfolgende PCR inhibieren könnten, entfernt werden.
  • Im Labor werden diese Arbeitsschritte nach bekanntem Stand der Technik durchgeführt. Insbesondere werden zur Isolierung die DNA an sog. Magnet-Beads gebunden. Über externe Magnetfelder können die Magnet-Beads mit der DNA gezielt befördert und an den vorbestimmten Stellen angereichert werden. Die isolierte DNA kann anschließend von den Beads eluiert werden oder zusammen mit den Beads (als DNA-/Bead-Komplex) für die PCR (Polymerase Chain Reaction) eingesetzt werden.
  • Nach bekanntem Stand der Technik wird die isolierte genomische DNA einer PCR-Reagenz-Lösung (Polymerase, Primer, Nukleotide, Puffer, Hilfsstoffe) zugesetzt und der gesamte Ansatz einer für die PCR geeigneten Thermozyklisierung unterworfen.
  • Die Realisierung letzteren Verfahrens ist vom Vorhandensein von Laborgeräten wie PCR-Gerät (Thermocycler), sog. Eppendorf-Reaktionsgefäße, Pipettier-Geräten, Kühlbehälter für Reagenzien abhängig und muss von geschultem Personal unter Ein haltung von Sicherheitsvorschriften, wie Infektionsgefahr, Abfallentsorgung, o. dgl. durchgeführt werden. Mehrere volumetrisch genaue Dosierungen von Reagenzlösungen müssen durch Pipettieren durchgeführt werden. Zusätzlich sind diese Arbeitsschritte zeitaufwendig.
  • Aus der EP 0 572 057 A1 ist eine Zusammensetzung für PCR-Reagenzien bekannt, bei dem die Reagenzien mit einem schmelzbaren Material bedeckt werden, um unerwünschte Reaktionen zu verhindern. Weiterhin ist aus der Veröffentlichung in „Nucleic Acids Research, Vol. 20, No. 7, Seiten 1717 bis 1723, im Einzelnen beschrieben, wie vor der eigentlichen PCR Fehlreaktionen vermieden werden können. Daneben ist in www.bioexpress.com die so genannte Hotstart-PCR beschrieben, bei der von einer erhöhten Starttemperatur ausgegangen wird. Die dort beschriebenen Verfahren sind im Prinzip für eine Laboranalyse geeignet. Aus der US 2002/0022261 A1 ist daneben ein System zur miniaturisierten genetischen Analyse und zugehörige Betriebsverfahren bekannt, bei denen eine Cartridge mit wenigstens einem Eingang verwendet wird. Dabei soll in einem Kanal ein Zellaufschluss PCR erfolgen. Davon unabhängig erfolgt eine PCT an den isolierten DNA. Für die PCR werden diesbezügliche Reagenzien bereitgestellt.
    •
  • Von letzterem Stand der Technik ausgehend ist es Aufgabe der Erfindung, die PCR-Reaktion in einer integrierten miniaturisierten Cartridge zu realisieren und dafür eine geeignete Anordnung zu schaffen.
  • Die Aufgabe ist bei einem Verfahren der eingangs genannten Art erfindungsgemäß durch die Maßnahmen des Patentanspruches 1 gelöst. Eine zugehörige Anordnung ist im Patentanspruch 9 angegeben. Weiterbildungen des Verfahrens und der Anordnung sind Gegenstand der Unteransprüche.
  • Die Erfindung geht von der WO 02/0072262 A1 mit der Bezeichnung "Analyseeinrichtung" aus. Dort wird bereits die Ver wendung von trockengelagerten, bei Raumtemperatur stabile Reagenzien in Mikrokanälen bzw. Mikrokavitäten einer "Chipkarte" beschrieben, die durch Zuführen von Wasser, kurz vor Verwendung, in Lösung gebracht werden. Dabei wird bei diesem Stand der Technik darauf abgestellt, die Trockenreagenzien vorportioniert bereitzustellen, so dass sich nach Auflösung ein quantitatives Analysemittel ergibt. Demgegenüber geht es bei vorliegender Erfindung um die PCR zwecks nachfolgender Analyse, wofür vorher ein Zellaufschluss mit Isolierung von DNA insbesondere aus einer Vollblut-Probe durchgeführt werden muss.
  • Mit der Erfindung werden folgende Vorteile im Vergleich zur Labormethode erzielt:
    • – Es erfolgt eine vollständige Integration aller Stoffe und Verfahren in einer geschlossenen einmal verwendbaren Cartridge;
    • – die Bevorratung der Reagenzien erfolgt in einer bei Raumtemperatur lagerstabilen Form;
    • – es sind keine manuellen Arbeitsschritte notwendig, außer Injektion der zu amplifizierenden DNA bzw. der Blutprobe bei Integration von Zellaufschluss und PCR;
    • – es erfolgt kein direkter Kontakt mit gesundheitsgefährdenden Stoffen, indem Blut, Reagenzien und Reagenzien-Abfall in der Cartridge verbleiben;
    • – eine kompakte Cartridge-Geometrie erlaubt eine effiziente und schnelle Thermozyklisierung;
    • – die Cartridge ist kostengünstig herzustellen.
  • Werden PCR-Reagenzien in getrockneter Form vordosiert, so ist auf eine definierte Dosierung von Flüssigkeit hinsichtlich Volumen und Zusammensetzung zu achten, da die Qualität und Quantität der PCR-Reaktion entscheidend von diesen Parametern abhängt. Das Durchströmen von Flüssigkeit durch einen mit Trockenreagenz beschichteten Kanal ohne gründliche Durchmischung könnte zu einer falschen Konzentration der Reagenzien führen.
  • Bei der Erfindung ist es in vorteilhafter Weise möglich, bei in biologischen Behältnissen, beispielsweise Zellen, gebundener DNA vor der PCR-Reaktion einen Aufschluss des Behältnisses mit Isolierung der DNA vorzunehmen. Mit einem Zellaufschluss können nunmehr insbesondere Vollblut-Proben direkt verarbeitet werden. Insbesondere dann wenn z.B. Magnet-Bead gebundene DNA aus einem Vollblut-Zellaufschluss für die PCR eingesetzt werden soll ist es erforderlich PCR inhibierende Stoffe aus der Probe zu entfernen. Dies kann besonders vorteilhaft durch Fixierung der Magnet-Beads in der PCR-Kammer durch ein Magnetfeld und Waschen der Beads erreicht werden. Bei Verwendung von Trocken-PCR-Reagenzien müssen Mittel vorhanden sein, die ein Auflösungen dieser Reagenzien beim Waschvorgang verhindern. Dies wird erfindungsgemäß durch Einführung einer Schutzschicht wie z.B. Paraffin gelöst.
  • In eigenerfinderischer Weiterbildung können bei der Erfindung zur PCR-Reaktion Array-Anordnungen eingesetzt werden. Damit wird ermöglicht, gleichzeitig Untersuchungen auf verschiedene DNA-Zielsequenzen vorzunehmen, womit eine erhebliche Zeitersparnis verbunden ist.
  • Eine erfindungsgemäße Anordnung weist folgende Merkmale auf:
    • – Es ist mindestens ein Mikrokanal bzw. Mikrokavität vorhanden.
  • Das im Mikrokanal bzw. vorzugsweise in Mikrokavität eingebrachte PCR-Reagenz hat folgende Eigenschaften:
    • – Die trockenbaren Substanzen haben vernachlässigbaren Dampfdruck;
    • – bei den bei Raumtemperatur lagerstabilen Substanzen bleibt die Eigenschaften eine PCR damit ausführen zu können erhalten;
    • – das Substanzgemisch haftet an Mikrokanal- bzw. Mikrokavität-Wandungen;
    • – das Substanzgemisch bildet einen dünnen Film;
    • – das Substanzgemisch ist mit einem nicht wasserlöslichen Medium, insbesondere einer dünnen Paraffin-Schicht, wasserdicht abgedeckt.
  • Speziell bei einer Kombination mit einem Zellaufschluss aus Vollblut ergeben sich für das in die Mikrokavität bzw. vorzugsweise im Mikrokanal eingebrachte Lyse-Reagenz folgende Eigenschaften:
    • – Es liegen Lyseeigenschaften für weiße Blutzellen und/oder andere Zellen Bakterien Viren vor;
    • – Es werden ebenfalls trockenbare Substanzen mit vernachlässigbarem Dampfdruck verwendet;
    • – bei den bei Raumtemperatur stabilen Substanzen bleiben die Zellaufschlusseigenschaften erhalten;
    • – das Substanzgemisch haftet an Mikrokanal-, bzw. Mikrokavität-Wandungen;
    • – der "Lysekanal" mündet in der PCR-Kavität.
  • Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung von Ausführungsbeispielen anhand der Zeichnung in Verbindung mit den Patentansprüchen.
  • Es zeigen:
  • 1 eine Draufsicht auf eine Analyseeinrichtung,
  • 2 bis 5 jeweils im Längsschnitt einen Ausschnitt aus 1 längs der Linie II – II zur Verdeutlichung der PCR-Vorbereitung, wobei die einzelnen Teilfiguren 2 bis 5 jeweils unterschiedliche Funktionsschritte darstellen,
  • 6 eine Draufsicht auf eine Array-Anordnung zur gleichzeitigen Durchführung einer PCR auf unterschiedliche DNA's und
  • 7 bis 9 jeweils einen Längsschnitt durch 6 längs der Linie VII – VII in drei verschiedenen Funktionsschritten.
  • In 1 ist eine Analyseeinrichtung dargestellt, die als zentrale oder dezentrale Messeinrichtung ausgebildet sein kann. Insbesondere ist die Analyseeinrichtung nach Art einer Chipkarte "Lab-on-a-Chip") ausgebildet, die alle Mittel zur Behandlung und Auswertung von Messproben beinhaltet.
  • Beispielsweise besteht die Einrichtung aus einer Karte 1, welche Ein- und Auslässe aufweist. Insbesondere sind ein Einlass (Port) 2 zum Einbringen von Wasser und ein Einlass 3 (Port) zum Einbringen einer Messprobe, beispielsweise Blut, vorhanden. Dabei ist wesentlich, dass über geeignete Fluidik-Einrichtungen 2 bis 10 Messproben einerseits und Lösungsmittel andererseits zusammengeführt und nach Isolierung der in der Messprobe enthaltenen DNA letztere einer PCR-Kammer 20 zugeführt werden.
  • Die Fluidik-Einrichtungen beinhalten im Einzelnen neben den bereits erwähnten Wasser- und Probenports 2, 3 zwei Reagenz- Kanäle 4, 4' sowie einen Strömungskanal 5 mit Auslass 6, einen Aufnahmekanal 8 für Abfall und einem weiteren Fluidik-Kanal 9. Mit 10 ist ein zentraler Mischbereich im Strömungskanal 5 für die Probenaufbereitung bezeichnet.
  • Neben den Mitteln zur PCR enthält die Karte 1 ("Cartridge") weiterhin ein Detektionsmodul 30 mit zugehörigen Anschlüssen für eine Signalverarbeitung. Ferner sind Mittel zur Aufnahme der Rückstände vorhanden. Es wird somit eine Integration gewährleistet, bei dem keine gesundheitsgefährdenden Substanzen nach außen gelangen können.
  • Der Aufschluss einer Vollblutprobe wird im Einzelnen anhand der parallelen Patentanmeldung der Anmelderin mit gleicher Anmeldepriorität mit der Bezeichnung "Verfahren und Anordnung zur DNA-Isolierung mit Trockenreagenzien" beschrieben. Anhand der 2 bis 5 wird verdeutlicht, wie im Einzelnen die Vorbereitungen für eine DNA-Amplifikation durchgeführt werden:
    Es ist eine Kavität 20 vorhanden, in der eine PCR-Reaktion stattfindet. Die PCR(Polymerase Chain Reaction)-Amplifikation ist vom Stand der Technik hinreichend bekannt. Im Einzelnen erfolgt dabei eine Thermozyklierung nach einem vorgegebenen Temperaturprogramm.
  • In 2 gelangt die Messprobe nach dem Zellaufschluss über einen Strömungskanal 21 in die PCR-Kavität 20. In der PCR-Kavität 20 ist ein lagerstabiles und laufzeitstabiles PCR-Trockenreagenz 25 gelagert. Unter lagerstbil/langzeitstabilem Feststoff ist in diesem Zusammenhang zu verstehen, dass der Feststoff in diesem Zusammenhang mindestens mehrere Monate bei Raumtemperatur gelagert wird unter Erhaltung der die PCR bewirkende Eigenschaft.
  • Das Trockenreagenz 25 ist wasserlöslich und muss vor der eigentlichen PCR-Reaktion, d.h. im Stadium der Probenaufberei tung und Spülung, vor dem Auflösen und der Denaturierung z.B. durch die Aufschlussreagenzien geschützt werden. Dazu befindet sich auf dem Trockenreagenz 25 ein nicht wasserlösliches Medium 26. Es kann für diesen Zweck insbesondere eine Paraffinschicht verwendet werden.
  • Das Trennen von zwei Flüssigkeiten mit Hilfe einer erstarrten Paraffin-Trennschicht, mit dem Ziel durch Aufschmelzen des Paraffins die beiden Flüssigkeiten zu vereinigen, ist zwar bereits bekannt. Es wird insbesondere angewandt bei der sog. klassischen "Hot-Start"-PCR. Im vorliegenden Fall wird jedoch keine Flüssigkeit, sondern ein Feststoff mit Paraffin beschichtet.
  • Weiterhin sind in 2 Ventile 22, 22' und ein Magnet 15 funktionsmäßig angedeutet. Deren Funktion wird nachfolgend bei den weiteren Teilschritten der 3 bis 5 erläutert:
    Aus 3 ist ersichtlich, dass bei geöffneten Ventilen 22, 22' die Messlösung mit den über die Magnet-Beads 12 gebundenen DNA in die Messkavität 20 gelangen. Die DNA konzentriert sich dabei über die Magnetwirkung an den diesbezüglichen Magnetpol. In diesem Stadium kann zunächst ein Spülvorgang erfolgen, wobei nach dem Spülen die Ventile 22, 22' geschlossen werden.
  • In der entsprechend 4 abgeschlossenen PCR-Kavität 20 befinden sich nunmehr das Reagenz 25, die Abdeckschicht 26 und die wässrige Lösung 24 mit den aufkonzentrierten DNA. Anschließend beginnt die eigentliche PCR-Reaktion. Beim ersten Erwärmen entsprechend der PCR-Thermozyklierung wird gemäß 5 die Paraffinschicht 26 aufgeschmolzen und in kleinen Kügelchen 27, 27' separiert. Das PCR-Reagenz 25 wird dagegen in geeigneter Dosierung im Lösungsmittel bzw. in der Pufferlösung 24 gelöst. In der PCR-Kavität 20 befindet sich dann die aufkonzentrierte, an die Magnet-Bead 13 gebundene DNA als Suspension 28. Nunmehr kann in bekannter Weise die PCR mit mehrfachem Durchlaufen eines Thermozyklisierungsprogrammes durchgeführt werden.
  • Bei dem in den 2 bis 5 als PCR-Reagenz vorgesehenen Feststoff geht es darum, eine Substanz mit vernachlässigbarem Dampfdruck auszuwählen, die bei Raumtemperatur lagerstabil ist. Die Substanz kann ein Stoffgemisch sein. Wesentlich ist, dass sie in vordosierter Form langzeitstabil ist. D.h. über mehrere Monate, ihre Eigenschaften die PCR-Reaktion damit ausführen zu können beibehält.
  • In der 6 ist eine Anordnung zur Durchführung der PCR als Array ausgebildet. Dies bedeutet, dass statt einer einzigen PCR-Kavität, beispielsweise die Kavität 20 in den 1 bis 5, nunmehr in einem abgeschlossenen Volumen 200 einzelne PCR-Kavitäten 201ik vorhanden sind, wobei für die Indices gilt: i = 1 bis m und k = 1 bis n. Die Kammer 200 hat einen Einlass 205 und einen Auslass 206, welcher als Zufluss bzw. Abfluss für Lösungsmittel dienen.
  • Die Kammer 200 aus 6 besteht aus einem Grundkörper 210 mit als Array verteilten Kavitäten 201ik , von dem in 7 eine Zeile n verdeutlicht ist. Es ist weiterhin ein Deckel 220 vorhanden, mit dem die einzelnen PCR-Kavitäten 201ik jeweils voneinander getrennt abgeschlossen werden können.
  • Die einzelnen PCR-Kavitäten 201ik werden im Prinzip entsprechend den 2 bis 5 befüllt. Dies wird aus den 7 bis 9 deutlich, die als Schnitt eine Reihe einzelner Messkavitäten wiedergibt. Wesentlich ist hier, dass in den Messkavitäten entsprechend einer Zeile ein erster Feststoff 250a, b, c, ... m eingebracht ist, wobei dieser Feststoff als Trockenreagenz jeweils spezifisch für eine bestimmte DNA ist. Auf den Feststoffen 250a, b, c, ... m befindet sich ein abdichtendes Medium 260. Über den Zufluss 205 wird ein zu untersuchendes DNA-Gemisch 270 in Lösung oder als Suspension zugeführt.
  • In der 8 ist gezeigt, dass nach dem Zuführen des Lösungsmittels zu den einzelnen Messkavitäten 201ik der Deckel 220 geschlossen wird, so dass nunmehr die einzelnen PCR-Kavitäten separiert sind. Wenn nunmehr eine Thermozyklisierung bei geschlossenem Deckel gem. 9 durchgeführt wird, befinden sich in den einzelnen PCR-Kavitäten jeweils unterschiedliche, für die Amplifikation einer Ziel-DNA spezifische Reagenzien zusammen mit der Proben-DNA. Es können somit gleichzeitig und parallel mehrere PCR-Reaktionen für eine Vielzahl von zu analysierender DNA durchgeführt werden.
  • Ein PCR-Array entsprechend der 6 kann in eine Analyseneinheit entsprechend 1 integriert werden. Jede PCR-Kavität kann zusätzlich mit einer Sensor-Einrichtung zur Detektion des PCR-Produkts, z.B. mit einer Edelmetallelektrode zur elektrischen Detektion ausgestattet sein. Die Elektroden können außerdem mit Hybridisierungs-Sonden oder auch mit PCR-Primern ausgestattet sein. Es ergeben sich somit verbesserte Anwendungsmöglichkeiten, wie z.B. die Analyse von komplexen DNA-Gemischen, die mit Multiplex-PCR in einem einzigen PCR-Gefäß nicht realisierbar sind.
  • Bei dem vorstehend beschriebenen Verfahren und der zugehörigen Anordnungen sind folgende Maßnahmen bzw. Merkmale wesentlich:
    • – im Mikrokanal bzw. Mikrokavität sind Substrate mit DNA-bindenden Eigenschaften eingebracht, z.B. DNA-bindende Magnet-Beads;
    • – die Lyse-Reagenzien und Magnet-Beads können zusammen in einer einzigen Matrix enthalten sein;
    • – es ist Eingabe-Port für Vollblut-Probe vorhanden;
    • – es sind Mittel zur Zufuhr von Wasser, z.B. ein Zufluss-Port, zum Anschluss an externe Wasserzufuhr vorhanden;
    • – im Mikrokanal bzw. Mikrokavität mit den trockenen Puffersubstanzen herrscht nach Wasserzufuhr definierte Ionenstärke;
    • – es sind Mittel zum Mischen von Vollblutprobe und Wasser bzw. Puffer-Lösung vorhanden;
    • – es sind Mittel zum Durchströmen des mit Lyse/Bead-Reagenz beschichteten Mikrokanals, bzw. Mikrokavität mit Blut, bzw. Blut/Wasser-, Blut/Puffer-Gemisches vorhanden;
    • – es sind Mittel zum Generieren eines Magnetfeldes zum Fixieren des DNA/Magnet-Bead-Komplexes in der PCR-Kavität vorhanden;
    • – es sind Mittel zum Verschließen der PCR-Kavität vorhanden;
    • – für die PCR sind Mittel zur Thermozyklisierung vorhanden;
    • – die PCR-Kavität hat Mittel zum mindestens partiellen Druckausgleich.
  • Wesentliche Vorteile der Anordnung und des Verfahrens sind:
    • – es erfolgt bereits bei Herstellung der Cartridges eine präzise Dosierung des PCR-Reagenz;
    • – im Betrieb wird eine präzise Menge und Zusammensetzung des PCR-Reagenz beim Befüllen, bzw. Durchströmen der PCR-Kavität erhalten. Somit liegen keine Veränderungen der Reagenzien-Soll-Konzentration insbesondere Verdünnungs-Effekte vor;
    • – das Volumen der PCR-Kavität ist beim Befüllen konstant und bekannt;
    • – nach Aufschmelzen der Paraffin-Trennschicht wird trockenes PCR-Reagenz mit dem Lösungsmittel, insbes. Wasser oder Wasser mit niedrigem Salzgehalt, vereinigt und es kann durch Konvektion eine definierte PCR-Reagenzlösung entstehen;
    • – bei Kombination mit der Bindung von DNA an Beads (Bead-Technik) muss die DNA nicht extra außerhalb der PCR-Kavität eluiert werden.
  • Somit ist gewährleistet, dass der gesamte Analysevorgang einschließlich der Probenbereitstellung im abgeschlossenen System, das eine Einmal-Cartridge bildet, erfolgt.

Claims (29)

  1. Verfahren zur DNA-Amplifikation durch PCR mit Thermozyklisierung der die DNA enthaltenden Substanzen einschließlich der zugehörigen Reagenzien, mit folgenden Maßnahmen: – Es erfolgt eine vollständige Integration aller Stoffe und Verfahrensschritte in einer geschlossenen Analyseneinheit mit einer einmal verwendbaren Cartridge mit Mikrokanälen oder Mikrokavitäten, in denen zumindest die für die PCR erforderlichen Reagenzien in einer bei Raumtemperatur lagerstabilen Form bevorratet sind, wobei – zunächst die wasserlöslichen Reagenzien durch ein nichtwasserlösliches Medium abgedeckt werden und – die zu amplifizierende DNA in einem wässrigen Lösungsmittel zugeführt wird, – anschließend wird die abdeckende Wirkung des nicht wasserlöslichen Mediums aufgehoben, wodurch – die wasserlöslichen Reagenzien im wässrigen Lösungsmittel gelöst werden, – wonach die PCR-Thermozyklisierungsreaktionen gestartet werden.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Reagenzien für die PCR wasserfreie, über mehrere Monate bei Raumtemperatur lagerbare Substanzen verwendet werden, die nach Wasserzufuhr die Durchführung einer PCR ermöglichen.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass bei in biologischen Behältnissen gebundener DNA, beispielsweise einer Vollblutprobe, eine Integration des Aufschlusses der Behältnisse, beispielsweise des Zellaufschlusses von weißen Blutzellen, mit der PCR erfolgt.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass eine Analyseneinheit mit solcher Geometrie verwendet wird, die eine effiziente und schnelle Thermozyklisierung ermöglicht.
  5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass als Analyseneinheit zur Ausführung der Reaktionen ein Einmalprodukt verwendet wird.
  6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die PCR-Reaktionen in einer Array-Anordnung mit gegebenenfalls "verschiedenen Primern parallel für unterschiedliche DNA-Amplifikationen durchgeführt wird.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass für die unterschiedlichen DNA-Amplifikationen unterschiedliche zusammengesetzte PCR-Reagenzien verwendet werden.
  8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Array mit einer DNA-Probe befüllt wird, der Deckel (210) die PCR-Kavitäten (250ik ) abschließt und voneinander fluidisch isoliert, die Paraffinschichten (260) aufgeschmolzen werden und individuelle DNA-Amplifikationen parallel durchgeführt werden.
  9. Anordnung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 oder einem der Ansprüche 2 bis 8, mit einer Analyseneinheit, welche als einmal verwendbare Cartridge ausgeführt ist, wobei wenigstens ein Mikrokanal (5) und/oder Mikrokavität (20) zur Aufnahme eines PCR-Reagens vorhanden ist, worin die PCR-Reagenzien als Gemisch, das bei Raumtemperatur eine stabile Substanz bildet, eingebracht sind, und mit einer Schicht (26) eines wasserunlöslichen Mediums abgedeckt sind.
  10. Anordnung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Gemisch ein wasserfreier Feststoff ist.
  11. Anordnung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Feststoff (25) an den Wandungen des Mikrokanals (5) und/oder der Mikrokavität (20) haftet.
  12. Anordnung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass mittels eines Filmbildners ein PCR-Reagenz-Film gebildet ist
  13. Anordnung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das wasserunlösliche Medium Paraffin ist.
  14. Anordnung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Paraffin zur Freigabe der PCR-Reagenzien einen definierter Schmelzpunkt hat.
  15. Anordnung nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass zur Durchführung eines Zellaufschlusses in der Mikrokavität (20) und/oder im Mikrokanal (5) weiterhin ein Lyse-Reagenz vorhanden ist, welches spezifische Eigenschaften z.B. für weiße Blutzellen hat.
  16. Anordnung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass das Lyse-Reagenz aus trockenbaren Substanzen mit vernachlässigbarem Dampfdruck besteht, die bei Raumtemperatur lagerstabil sind und das Lyse-Reagenz an den Wandungen des der PCR-Kavität (20) vorgeschalteten Mikrokanals (5) haftet, wobei der Kanal (5) für die Lyse-Substanz in die PCR-Kavität (20) mündet.
  17. Anordnung nach einem der Ansprüche 9 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass im Mikrokanal (5) und/oder in der Mikrokavität (20) Substrate vorhanden sind, die DNA bindende Eigenschaften haben.
  18. Anordnung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Substrate DNA-bindende so genannte Magnet-Beads sind.
  19. Anordnung nach einem der Ansprüche 9 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Lyse-Reagenzien und die Magnet-Beads in einer gemeinsamen Trockenmatrix enthalten sind.
  20. Anordnung nach einem der Ansprüche 9 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass ein Eingabeport (2) für Vollblut-Proben vorhanden ist.
  21. Anordnung nach einem der Ansprüche 9 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zur Zufuhr von Wasser vorhanden sind.
  22. Anordnung nach einem der Ansprüche 9 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zum Mischen von Blutprobe und Wasser oder einer Pufferlösung, vorhanden sind.
  23. Anordnung nach einem der Ansprüche 9 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zum Durchströmen des mit Lyse/Bead-Reagenz beschichteten Mikrokanals (5) und/oder Mikrokavität (20) mit Blut, Blut/Wasser- oder Blut/Puffer-Gemische vorhanden sind.
  24. Anordnung nach einem der Ansprüche 9 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel (25) zum Generieren eines Magnetfeldes zwecks Fixieren eines DNA-Magnet-Bead-Komplexes in der PCR-Kavität (20) vorhanden sind.
  25. Anordnung nach einem der Ansprüche 9 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zur Thermozyklisierung vorhanden sind.
  26. Anordnung nach einem der Ansprüche 9 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass Mittel zum zumindest eines partiellen Druckausgleiches in der PCR-Kavität vorhanden sind.
  27. Anordnung nach einem der Ansprüche 9 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass ein Array von PCR-Kavitäten (210ik ) vorhanden ist.
  28. Anordnung nach einem der Ansprüche 9 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass in den PCR-Kavitäten (250ik ) unterschiedliche PCR-Reagenzien (250a–m) bevorratet sind.
  29. Anordnung nach einem der Ansprüche 9 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass ein Deckel (210) zum Abschluss der PCR-Kavitäten (250ik ) während der PCR vorhanden ist.
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