CN102409039A - 使用干燥的试剂借助pcr扩增dna的方法及装置 - Google Patents

Abstract

在通过PCR用来进行DNA扩增的方法中，所述PCR借助包含相应试剂的热循环，其中在封闭的、可一次性使用的单位(所谓筒盒)中充分整合所有物质和操作步骤，在该单位中，试剂以在室温下储存稳定的形式被储存，水溶性试剂用非水溶性介质覆盖，将待扩增DNA引入该单位，并去除非水溶性介质，以使水溶性试剂溶解，从而使PCR得以启动。在相应装置中，设有样品单位，所述样品单位作为一次性产品(所谓筒盒)，其中设有至少一个用来容纳PCR试剂的微通道(5)或微空腔(20)，在所述微通道或微空腔中PCR试剂作为蒸汽压力可忽略不计的、在室温下形成储存稳定物质的可干燥混合物附着在微通道(5)或微空腔(20)的壁上，并形成薄膜(25)，所述薄膜用不溶性介质(26)覆盖。

Description

使用干燥的试剂借助PCR扩增DNA的方法及装置

本申请是申请日为2005年4月26日、PCT申请号为“PCT/EP2005/051874”公开号为“WO 2005/106023”，进入国内阶段的申请号为200580013845.3、发明名称为“使用干燥的试剂借助PCR扩增DNA的方法及装置”的发明专利申请的分案申请。

本发明涉及一种借助含DNA物质的热循环通过PCR扩增DNA的方法。所述含DNA物质包括相应试剂。此外，本发明还涉及一种用来实施该方法的相应装置。

为了对例如全血中的白血细胞进行核酸分析，以回答对人类基因组方面提出的问题，必须首先在样品准备步骤中破碎细胞，并接着分离由此释放的DNA。此外，还必须除去可能抑制随后的PCR的血液成分，例如血红蛋白、免疫球蛋白及乳铁蛋白。

在实验室中，这些操作步骤按照已充分为人所知的现有技术来进行。尤其是，为了进行分离，将DNA结合在所谓磁珠上。通过外磁场，磁珠可以与DNA一起有针对性地运送，并在预先确定的位置上积聚。接着，可将已分离的DNA从珠上洗脱，或与珠一起(作为DNA/珠复合物)用于PCR(聚合酶链反应)。

按照现有技术，将分离的基因组DNA加入PCR试剂溶液(聚合酶、引物、核苷酸、缓冲液、助剂)，并对所有配料进行对PCR合适的热循环。

后一种方法的实现取决于现有的实验室设备，例如PCR仪(热循环仪)、所谓的Eppendorf反应器、移液器、试剂冷却容器，而且须由接受过培训的人员在遵守安全规章(传染危险、废弃物清除...)的条件下进行。必须进行试剂溶液的若干容量分析的准确药量分配(用移液管移液)。另外，这些操作步骤还耗费时间。

由EP 0 572 057 A1已知一种用作PCR试剂的组合物，在该组合物中，试剂被一种可融化物质覆盖，以防止不希望的反应。此外，从“Nucleic AcidsResearch”、Vol.20、NO 7、第1717-1723页中的公开，还单独记载了如何能够在真正PCR发生之前避免误反应。同时，在www.bioexpress.com上，还记载了所谓的热启动PCR(Hot-Start-PCR)，在该热启动PCR中以增高的启始温度作为出发点。

上述方法原则上适用于实验室分析。此外，US 2002/0022261 A1中还记载了一种用于进行微型化的遗传分析的系统，以及相应的操作方法，在该系统中使用一种筒盒(Cartridge)，所述筒盒具有至少一个通往通道的入口。与此同时，在通道中为随后的PCR进行细胞分解。为PCR准备相关试剂。

用于DNA分析的装置由WO 02/072262 A1、US 5 550 044 A、US 5 599660 A和US 5 972 386 A已知。此外，用于PCR的方法还描述于PCR Met.Appl.Bd.4，Nr.3，第191-194页和Nucl.Acid Research Res.，Bd.21，第2959-2960页。

从上述现有技术出发，本发明的任务是，特别地在整合的微型化的筒盒中实现PCR-反应，并为此设立一种合适的装置。

该任务以本说明书起始部分所提及的方式的方法，根据本发明，用权利要求1中的所述措施得以解决。相应装置在权利要求9中作了说明。该方法和装置的优选实施方案是各从属权利要求的主题。

本发明以发明名称为“分析装置”的WO 02/0072262 A1作为出发点。该文献中，已经记载了在“芯片卡”(chipcard)的微通道或微空腔中应用干燥储藏的、室温下稳定的试剂，该试剂在使用前不久通过引入水而使之溶解。就此而言，现有技术提供预先分成份的干燥试剂，从而溶解后得到一种定量分析试剂。相比之下在本发明中，为了进行PCR以进行随后的分析，为此，事先必须进行细胞分解，并尤其是从全血样品中分离DNA。

本发明提供了如下的技术方案：

1.借助含DNA的物质的热循环用PCR法扩增DNA的方法，所述含DNA的物质包含相应试剂，该方法包括下列措施：

-所有材料和操作步骤的充分整合在封闭的分析单位中进行，所述封闭的分析单位带有可一次性使用、并带有微通道或微空腔的筒盒，在所述筒盒中至少储存有室温下稳定存放、为PCR所必需的试剂，

-首先，将水溶性试剂用非水溶性介质覆盖，并

-将待扩增DNA引入水性溶剂中，

-接着消除非水溶性介质的覆盖效果，由此

-水溶性试剂溶于水性溶剂中，

-据此启动PCR-热循环反应。

1’.项1所述的方法，其中，所述PCR试剂附着在筒盒内微通道(5)或微空腔(20)的壁上。

2.项1所述的方法，其中，作为用于PCR的试剂，使用无水、室温下经数月可稳定储存的物质，其在引入水后能进行PCR。

3.项1所述的方法，其中，对于结合在生物结构中的DNA，例如全血样品，将结构的分解，例如白血细胞的细胞分解，与PCR整合在一起。

4.项1所述的方法，其中，使用具有这样的几何形状的分析单位(筒盒)，所述几何形状能使高效而快速的热循环成为可能。

5.前述项中任何一项所述的方法，其中，使用一次性产品作为实施反应的分析单位，所述一次性产品可在批量生产中少量而低成本地制造。

6.前述项中任何一项所述的方法，其中，PCR反应在阵列装置中进行，所述阵列装置任选具有同时用于不同DNA扩增的不同引物。

7.项6所述的方法，其中，针对不同的DNA扩增使用不同组成的PCR试剂。

8.项6所述的方法，其中，在阵列中充满DNA样品，PCR空腔(250_ik)被盖子(210)封闭并隔绝互相流动，使石蜡层(260)融化并同时进行单个的DNA扩增。

9.实施项1的方法或项2至8中任何一项所述方法的装置，其带有分析单位，所述分析单位作为可一次性使用的筒盒来实施，其中设有至少一个用来容纳PCR试剂的微通道(5)及/或微空腔(20)，其中PCR试剂作为在室温下形成稳定物质的混合物被引入、并用水不溶性介质层(26)覆盖。

10.项9所述的装置，其中，所述混合物是无水固体。

11.项9所述的装置，其中，所述固体(25)附着在微通道(5)或微空腔(20)的壁上。

12.项9所述的装置，其中，用成膜剂形成PCR试剂膜。

13.项9所述的装置，其中，所述水不溶性介质是石蜡。

14.项9所述的装置，其中，所述石蜡具有确定的熔点以释放PCR试剂。

15.项9至13中任何一项所述的装置，其中，为了在微空腔(20)或微通道(5)中进行细胞分解，还存在溶胞试剂，所述溶胞试剂例如对白血细胞具有特异性质。

16.项15所述的装置，其中，所述溶胞试剂由可干燥物质组成，所述可干燥物质具有可忽略不计的蒸汽压，所述可干燥物质在室温下是储藏稳定的，并且所述溶胞试剂附着在微通道(5)的壁上，所述微通道(5)预先与PCR空腔(20)接通，其中溶胞物质的通道(5)通入PCR空腔(20)。

17.项9至15中任何一项所述的装置，其中，在微通道(5)或微空腔(20)中设有基质，所述基质具有DNA结合性质。

18.项17所述的装置，其中，所述DNA结合的基质是所谓磁珠。

19.项9至19中任何一项所述的装置，其中，所述溶胞试剂和磁珠包含在共同的干燥基质中。

20.项9至19中任何一项所述的装置，其中，设有全血样品输入口(2)。

21.项9至20中任何一项所述的装置，其中，设有用来引入水的机构。

22.项9至21中任何一项所述的装置，其中，设有用来混合血液样品和水或缓冲液的机构。

23.项9至22中任何一项所述的装置，其中，设有这样的机构，所述机构用来使血液、血液/水、或者血液/缓冲液混合物流过覆有溶胞/珠试剂的微通道(5)或微空腔(20)。

24.项9至23中任何一项所述的装置，其中，设有用来产生磁场以使DNA-磁珠复合物固定在PCR空腔(20)中的机构(25)。

25.项9至24中任何一项所述的装置，其中，设有用于热循环的机构。

26.项9至25中任何一项所述的装置，其中，设有使PCR空腔中至少部分压力平衡的机构。

27.项9至26中任何一项所述的装置，其中，设有PCR空腔(210_ik)的阵列。

28.项9至27中任何一项所述的装置，其中，在PCR空腔(250_ik)中储存有不同的PCR试剂(251a、b、...)。

29.项9至28中任何一项所述的装置，其中，设有用于在PCR过程中封闭PCR空腔(250_ik)的盖子(210)。

与实验室方法相比，采用本发明可获得下列优点：

-在封闭的、可一次性使用的筒盒(Cartridge)中，进行所有物质和方法的充分整合；

-试剂的储存以室温下储藏稳定的形式进行；

-除了在整合细胞分解和PCR的时候需要注入待扩增DNA或血样之外，无需手工操作步骤；

-由于血液、试剂和试剂废弃物留在筒盒中，所以不直接接触有害于健康的材料；

-紧凑的筒盒的几何形状允许热循环高效而快速地进行；

-筒盒可成本低廉地制造。

如果PCR试剂以已被干燥的形式被预先分配剂量，则须在体积和组成方面注意液体的剂量分配，因为PCR反应的质与量决定性地取决于这些参数。液体流经被干燥试剂覆盖的通道而不加以彻底搅拌均匀，会导致试剂的错误浓度。

在本发明的情况下，以有利的方式，有可能在PCR反应进行前，对于结合到生物容器(biological container)(例如，细胞)的DNA，进行容器的分解，并分离DNA。借助细胞的分解，从现在起就特别地可直接加工全血样品。尤其是于是当例如为进行PCR而使用由全血细胞分解得到的结合于磁珠的DNA时，则必需从样品中除去PCR抑制性物质。这可以特别有利地通过用磁场将磁珠固定在PCR室中、并洗涤磁珠来实现。应用干燥的PCR试剂时，必须有一种防止这些试剂在洗涤过程中溶解的机构。按照本发明，这通过引入保护层，例如石蜡，来解决。

在本发明的优选实施方案中，可以在本发明中使用阵列装置用于PCR反应。因而有可能同时检验不同的DNA目标序列，从而导致显著节省时间。

根据本发明的装置具有下列特征：

-设有至少一个微通道或微空腔。

引入微通道或优选引入微空腔的PCR试剂具有下列性质：

-所述可干燥物质具有可忽略不计的蒸汽压力；

-在该蒸汽压力下，室温下储存稳定的物质保留了PCR可借以进行的那些特性。

-所述物质混合物附着在微通道或微空腔的壁上；

-所述物质混合物形成薄膜；

-所述物质混合物被非水溶性介质，尤其是薄石蜡层，以不漏水的方式覆盖。

特别在与来自全血细胞分解组合的情况下，引入微空腔或优选引入微通道的溶胞(lyse)试剂具有下列特性：

-对白血细胞及/或其他细胞、细菌、病毒存在溶胞特性；

-同样使用蒸汽压可忽略不计的可干燥物质；

-在此蒸汽压力下，室温下储存稳定的物质保持了细胞分解特性；

-物质混合物附着在微通道或微空腔的壁上；

-所述“溶胞通道”通往PCR空腔。

本发明的其他细节和优点，可参照附图并结合权利要求书由下面对实施例的描述得到。

附图显示：

图1为分析装置的俯视图，

图2至图5各自为沿纵剖面从图1中沿着线II-II的截面，以解释清楚PCR准备情况，其中单独的局部图2至5各自为不同的功能步骤，

图6为阵列装置的俯视图，所述阵列装置用于同时对不同DNA进行PCR，以及

图7至图9各自为三个不同功能步骤的经由图6中沿着线VII-VII的纵剖面。

在图1中为一种分析装置，其可作为集中或者分散式的测量装置而加以形成。尤其是该分析装置形成芯片卡(“芯片上的实验室”)的类型，其包括用于处理与评价待测试样的所有机构(means)。

举例来说，所述装置由卡片1组成，所述卡片具有入口与出口。尤其是，设有用来引入水的入口(端口)2，和用来引入待测样品如血液的入口3(端口)。在此情况下重要的是，经由合适的流动装置2至10，一方面是待测试样，另一方面是溶剂，得以聚集在一起，并且在分离了待测样品中所含的DNA以后，将后者引向PCR室20。

除了已经提及的水端口和样品端口2、3之外，该流动装置还包括两个试剂通道4、4′，以及设有出口6的流通通道5，用于废弃物的接收通道8，和另一个流动通道9。附图标记10表示流通通道5中的中心混合区域，用于样品预加工。

除了用于PCR的机构之外，卡片1(“筒盒”)还包括检测模块30，其设有用于信号处理的相应连接。此外，还设有容纳残留物用的机构。因此，保证了整合，由此没有有害于健康的物质能向外逸散。

全血样品的分解单独地根据申请人同时的、具有相同申请优先权的、发明名称为“用干燥试剂来分离DNA的方法和装置”的专利申请而加以记载。根据图2至图5可明白如何逐个地为DNA扩增进行准备：

设有空腔20，在其中进行PCR反应。PCR(聚合酶链反应)扩增可由现有技术充分悉知。由此按照规定温度程序逐个进行热循环。

图2中，待测样品在细胞分解以后，经由流通通道21抵达PCR空腔20中。在PCR空腔20中，储存了储藏稳定、并且在运行时间内稳定的PCR干燥试剂25。就此而论，储藏稳定的/长时间稳定的固体，是指就此而论在室温下至少放置数月仍保持引起PCR效果的特性的固体。

干燥试剂25是水溶性的，并且必须在真正PCR反应之前，也即在样品预加工和冲洗阶段中，保护其免受，例如分解试剂的溶解和变性。为此，在干燥试剂25上设有非水溶性介质26。为此目的，特别可以使用石蜡层。

借助于凝固的石蜡隔离层隔开两种液体，目的在于通过石蜡的熔化使两种液体汇合，已众所周知。这特别用在所谓的经典“热启动”PCR上。但在本发明的情况下不是液体，而是用石蜡覆盖的固体。

此外，图2中还按功能指明了阀门22、22′和磁体15。其功能将在图3至图5的其他细分步骤中予以阐明：

从图3中可以看出，阀门22、22′开启时，待测溶液连同结合在磁珠12上的DNA一起到达测量空腔20。与此同时，DNA通过磁体效应而集中在相关磁极上。在此阶段，可先进行洗涤流程，而在清洗以后，关闭阀门22、22’。

在相应的图4中，在封闭的PCR空腔20从现在起有试剂25、覆盖层26，和含有浓集DNA的水性溶液24。接着开始真正的PCR反应。在相当于PCR热循环的首次加温时，根据图5所示，石蜡层26被融化，并分离成小球27、27’。与此相反，PCR试剂25则以相宜的剂量分配溶于溶剂或缓冲液24中。在PCR空腔20中，存在作为悬浮液28的浓集的、结合在磁珠13上的DNA。从现在起，可按已知方式，借助热循环程序的多次过程来进行PCR。

图2至图5中作为PCR试剂拟定的固体，涉及选择具有可忽略不计的蒸汽压的、室温下储藏稳定的物质。这些物质可以是材料混合物。重要的是，它们处于预先分配剂量的形式时，能长时间稳定。也就是说，经数月，它们的那些PCR反应借以进行的特性仍可保持。

在图6中，形成作为阵列进行PCR的装置。这意味着，取代单个的PCR空腔，例如图1至图5中的空腔20，从现在开始在封闭的容积200中设有单个的PCR空腔201_ik，其中下标意即：i＝1至m，k＝1至n。室200具有入口205和出口206，分别供溶剂流入或流出之用。

图6中的室200由基体210构成，其具有作为阵列分配的空腔201_ik，由此在图7中可见一行n。此外还设有盖子220，借助该盖子可将单个PCR空腔201_ik各自彼此隔绝封闭。

这些单个PCR空腔201_ik原则上按照图2至图5所示装满。这可由图7至图9清晰看出，这些图以剖面描述了一系列单独的测量空腔。在此重要的是，在这些测量空腔中，相应于行，引入第一种固体250a，b、c，...，其中这种固体作为干燥试剂各自特异于确定的DNA。在固体250a、b、c，...上面有密封性的介质260。通过入口205，待检验DNA混合物270在溶液中或作为悬浮液供给。

图8中显示，在向单个测量空腔201_ik供给溶剂以后，将盖子220关闭，从而从现在起单个PCR空腔被分开。当从现在开始按照图9关闭盖子进行热循环时，在单个PCR空腔中，与样品DNA一起，存在各自不同的、用于扩增的、对目标DNA特异的试剂。因此，可以对许多待分析DNA同时且同时进行(parallel)多个PCR反应。

相应于图6的PCR阵列可以结合到相应于图1的分析单元中。每个PCR空腔可以额外配备有检测PCR产物用的传感装置，例如用于电检测的贵金属电极。此外，电极还可配备杂交探针，或者也可配备PCR引物。因此，提供改善的应用可能性，例如分析复杂的DNA混合物，这种分析借助复合PCR在单独的PCR器中是不可能实现的。

在前面所描叙的方法和相应装置中，下列措施或特征是重要的：

-在微通道或微空腔中，引入具有DNA结合特性的基质，例如结合DNA的磁珠；

-溶胞试剂和磁珠可同时包括在一种单独的基质中；

-设有全血样品输入端口；

-设有供水的机构，例如入口端口，用来连接外部供水源；

-在微通道或者微空腔中用干燥的缓冲物质在供水后控制确定的离子强度；

-设有用来混合全血样品和水或缓冲溶液的机构；

-设有使血液、或血液/水混合物，或血液/缓冲液混合物流过覆盖有溶胞试剂/珠试剂的微通道或微空腔的机构。

-设有用来产生磁场以将DNA/磁珠-复合物固定在PCR空腔中的机构；

-设有用来封闭PCR空腔的机构；

-对于PCR，设有用于热循环的机构；

-所述PCR空腔具有用于至少部分均压(pressure balance)的机构。

该装置和方法的主要优点是：

-制造筒盒时已进行了PCR试剂的精确剂量分配；

-使用中，在充满或者流过PCR空腔时，保持PCR试剂精确的量和组成。因此，不存在试剂标定浓度的改变，特别不存在稀释效应；

-PCR空腔的容积在充满时是恒定并已知的；

-在石蜡隔离层熔化以后，干燥的PCR试剂与溶剂，尤其是水或低盐含量的水合并，并可通过对流产生确定的PCR试剂溶液；

-在与DNA结合到珠上(珠技术)相结合时，DNA必须不额外地在PCR空腔外被洗脱。

因此，保证了包括样品准备在内的全部分析过程均在形成一次性筒盒的封闭系统内进行。

Claims (29)

1.借助含DNA的物质的热循环用PCR法扩增DNA的方法，所述含DNA的物质包含相应试剂，该方法包括下列措施：

-所有材料和操作步骤的充分整合在封闭的分析单位中进行，所述封闭的分析单位带有可一次性使用、并带有微通道或微空腔的筒盒，其中在所述筒盒中储存有至少在室温下稳定存放的、为PCR所必需的试剂，

-首先，将水溶性试剂用非水溶性介质薄层覆盖，并

-将待扩增DNA引入水性溶剂中，

-接着消除非水溶性介质的覆盖效果，由此

-水溶性试剂溶于水性溶剂中，

-据此启动PCR-热循环反应。

2.权利要求1所述的方法，其中，作为用于PCR的试剂，使用无水、室温下经数月可稳定储存的物质，其在引入水后能进行PCR。

3.权利要求1所述的方法，其中，对于结合在生物结构中的DNA，例如全血样品，将结构的分解，例如白血细胞的细胞分解，与PCR整合在一起。

4.权利要求1所述的方法，其中，使用具有几何形状的分析单位(筒盒)，所述几何形状能使高效而快速的热循环成为可能。

5.前述权利要求中任何一项所述的方法，其中，使用一次性产品作为实施反应的分析单位，所述一次性产品小且成本低从而可批量制造。

6.前述权利要求中任何一项所述的方法，其中，PCR反应在阵列装置中对于不同DNA扩增同时进行，所述阵列装置任选具有不同引物。

7.权利要求6所述的方法，其中，针对不同的DNA扩增使用不同组成的PCR试剂。

8.权利要求6所述的方法，其中，在阵列中充满DNA样品，PCR空腔(250_ik)被盖子(210)封闭并隔绝互相流动，使石蜡层(260)融化并同时进行单个的DNA扩增。

9.实施权利要求1的方法或权利要求2至8中任何一项所述方法的装置，其带有作为可一次性使用的筒盒来实施的分析单位，至少一个用来容纳PCR试剂的微通道(5)及/或微空腔(20)，其中，PCR试剂作为在室温下形成稳定物质的混合物被引入、并用水不溶性介质层(26)覆盖。

10.权利要求9所述的装置，其特征在于，所述混合物是无水固体。

11.权利要求9所述的装置，其中，所述固体(25)附着在微通道(5)或微空腔(20)的壁上。

12.权利要求9所述的装置，其中，用成膜剂形成PCR试剂膜。

13.权利要求9所述的装置，其中，所述水不溶性介质是石蜡。

14.权利要求9所述的装置，其中，所述石蜡具有确定的熔点以释放PCR试剂。

15.权利要求9至13中任何一项所述的装置，其中，为了在微空腔(20)或微通道(5)中进行细胞分解，还存在溶胞试剂，所述溶胞试剂例如对白血细胞具有特异性质。

16.权利要求15所述的装置，其中，所述溶胞试剂由可干燥物质组成，所述可干燥物质具有可忽略不计的蒸汽压，所述可干燥物质在室温下是储藏稳定的，并且所述溶胞试剂附着在微通道(5)的壁上，所述微通道(5)位于PCR空腔(20)上游，其中溶胞物质的通道(5)通入PCR空腔(20)。

17.权利要求9至15中任何一项所述的装置，其中，在微通道(5)或微空腔(20)中设有基质，所述基质具有DNA结合性质。

18.权利要求17所述的装置，其中，所述DNA结合的基质是所谓磁珠。

19.权利要求9至18中任何一项所述的装置，其中，所述溶胞试剂和磁珠包含在共同的干燥基质中。

20.权利要求9至19中任何一项所述的装置，其中，设有全血样品输入口(2)。

21.权利要求9至20中任何一项所述的装置，其中，设有用来引入水的机构。

22.权利要求9至21中任何一项所述的装置，其中，设有用来混合血液样品和水或缓冲液的机构。

23.权利要求9至22中任何一项所述的装置，其中，设有这样的机构，所述机构用来使血液、血液/水或者血液/缓冲液混合物流过覆有溶胞/珠试剂的微通道(5)或微空腔(20)。

24.权利要求9至23中任何一项所述的装置，其中，设有用来产生磁场以使DNA-磁珠复合物固定在PCR空腔(20)中的机构(25)。

25.权利要求9至24中任何一项所述的装置，其中，设有用于热循环的机构。

26.权利要求9至25中任何一项所述的装置，其中，设有使PCR空腔中至少部分压力平衡的机构。

27.权利要求9至26中任何一项所述的装置，其中，设有PCR空腔(210_ik)的阵列。

28.权利要求9至27中任何一项所述的装置，其中，在PCR空腔(250_ik)中储存有不同的PCR试剂(251a、b、...)。

29.权利要求9至28中任何一项所述的装置，其中，设有用于在PCR过程中封闭PCR空腔(250_ik)的盖子(210)。

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