DE10139783C1

DE10139783C1 - Zellzusammensetzungen zur Behandlung von Osteoarthrose, sowie Verfahren zu deren Herstellung

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Publication number: DE10139783C1
Application number: DE10139783A
Authority: DE
Inventors: Christian Kaps; Michael Sittinger
Original assignee: TRANSTISSUE TECHNOLOGIES GmbH
Current assignee: TRANSTISSUE TECHNOLOGIES GmbH
Priority date: 2001-08-14
Filing date: 2001-08-14
Publication date: 2003-04-17
Anticipated expiration: 2021-08-15
Also published as: US20040241144A1; WO2003015803A1; EP1418927A1; JP2005503146A

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet des Tissue-Engineering, insbesondere den Ersatz von krankhaftem Gewebe in Gelenken (vorwiegend Knochen und Knorpel) und die Behandlung und Prävention von osteoarthrotischen Krankheitsbildern in Gelenken. Zu diesem Zweck werden Verfahren zur Herstellung von Zellzusammensetzungen offenbart, die die Bereitstellung von mesenchymalen Zellen und Synovialflüssigkeit sowie deren Mischung zum Erhalt einer Zellzusammensetzung umfassen. Es werden Zellzusammensetzungen bereitgestellt, die zur Behandlung von Osteoarthrose und Gelenkerkrankungen bzw. -defekten verwendet werden. Des weiteren werden die Zellzusammensetzungen zur Herstellung von Transplantaten verwendet. Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Behandlung von Gelenkdefekten.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet des Tissue-Engineering, insbeson dere den Ersatz von krankhaftem Gewebe in Gelenken (vorwiegend Knochen und Knorpel) und die Behandlung und Prävention von osteoarthrotischen Krankheits bildern in Gelenken. Zu diesem Zweck werden Verfahren zur Herstellung von Zellzusammensetzungen offenbart, die die Bereitstellung von mesenchymalen Zellen und Synovialflüssigkeit, sowie deren Mischung zum Erhalt einer Zellzu sammensetzung umfassen. Es werden Zellzusammensetzungen bereitgestellt, die zur Behandlung von Osteorathrose und Gelenkerkrankungen bzw. -defekten ver wendet werden. Des weiteren werden die Zellzusammensetzungen zur Herstellung von Transplantaten verwendet. Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung Ver fahren zur Behandlung von Gelenkdefekten.

Die Osteoarthrose ist die häufigste Gelenkerkrankung weltweit, die Mehrzahl aller Menschen im Alter über 65 ist davon betroffen. Daraus ergibt sich zwangsläufig eine sehr hohe klinische, gesundheitspolitische und volkswirtschaftliche Relevanz. Im Verlauf dieser primär degenerativen altersabhängigen Gelenkerkrankung kommt es zu einer schrittweisen fokalen Zerstörung der Gelenkoberfläche und einem reaktiven fehlregulierten regionalen Wachstum des angrenzenden und sub chondralen Knochenstrukturen (Osteophyten). Folge sind Schmerzen und einge schränkte Funktion und Beweglichkeit des betroffenen Gelenks. Systemische Faktoren, die die Entstehung einer Osteoarthrose beeinflussen sind Alter, Ge schlecht, Gewicht, auftretende Osteoporose, eine familiäre Vorbelastung und me chanische Überbeanspruchung. Lokale Faktoren stellen die spezifische Gelenk form, Fehlstellungen, Traumen, sowie auf das Gelenk einwirkende biomechani sche Faktoren dar. Trotz der eigentlichen degenerativen Genese kommt es auch bei der Osteoarthrose zu entzündlichen Veränderungen wie einer Synovitis (Ent zündung der Gelenkinnenhaut), sowie zur Produktion von entzündungsfördernden biologischen Botenstoffen, z. B. von Zytokinen und Wachstumsfaktoren (Rubin, J. Am. Osteopath. Assoc., 101, 2001, S. 2-5; von der Kraan und von den Berg, Curr. Opin. Nut. Metab. Care, 3, 2000, S. 205-211).

Die ablaufenden Veränderungen stellen eine Fehlregulation der Gewebehomö ostase im Bereich der lasttragenden Knorpel- und Knochenstrukturen dar, d. h. es existiert eine Dysbalance zwischen degenerativen und reparativen Prozessen. Die Erkrankung ist dabei Folge von Störungen im Bereich des gesamten Gelenkes einschließlich des Knochens, der Muskulatur und der Gelenkinnervation, was schließlich zu einer mechanischen Überbeanspruchung und biochemisch vermit telten Zerstörung des betroffenen Gelenks führt.

Von Bedeutung ist weiterhin, daß es keine Heilung der Erkrankung Osteoarthrose gibt. Physiotherapeutische Massnahmen und schmerzlindernde, entzündungs hemmende Medikamente (z. B. nicht-steroidale Antirheumatika) stellen häufig nur unzureichende symptomatische Therapien dar. Bekannte (konventionelle) ortho pädische Verfahren wie Debridement, Gelenkshaving, Microfracture und Drilling sind ebenfalls nur unzureichend wirksam (s. Fitzgibbons, T. C., AAOS Instructio nal Course Letters, Vol. 48, 1999, S. 243-248). Bei ausgeprägten degenerativen Veränderungen bleibt häufig als finale Maßnahme nur der operativ-rekonstruktive Eingriff mit endoprothetischem Gelenkersatz, wobei letztgenanntes sicherlich eine sehr drastische und nach Möglichkeit zu vermeidende Maßnahme darstellt.

Vielversprechende neue Technologien bietet das Tissue Engineering durch die Möglichkeit einer Transplantation funktionell aktiver autologer Zellen, ggf. unter Zuhilfenahme formgebenden Biomaterialien. Mit Hilfe derartiger Technologien kann neues Gewebe aktiv aufgebaut bzw. gezüchtet werden (s. Sittinger, M. et al., Biomaterials, 1994, S. 451-456; Redlich, A. et al., J. Mat. Sci. 10, 1999, S. 767- 772).

So kann z. B. neu erzeugtes Gewebe durch Genmanipulation bzw. durch die Ver wendung geeigneter Substrate und Faktoren mit immunsuppressiven Eigenschaf ten ausgestattet werden (s. DE-A 196 32 404), so dass keine Abstoßungsreaktion gegen das Transplantat mehr stattfindet, bzw. diese Reaktion abgeschwächt wird.

Die DE-C 44 31 598 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines Implantates aus Zellkulturen, das das Aufbringen der Zellen auf eine dreidimensionale Träger struktur und anschließende Perfusion mit einer Nährlösung bis zur mindestens teilweisen Ausbildung der interzellulären Matrix umfasst. Anschließend wird die se Struktur in den Patienten implantiert.

In ähnlicher Weise beschreibt die DE-C 43 06 661 die Herstellung von umman telten formstabilen Trägerstrukturen, die anschließend transplantiert werden.

Schließlich beschreibt die DE-A 199 57 388 implantierbare Substrate zur Knor pelheilung und Knorpelprotektion, die in der Lage sind, ortsständige Zellen zu aktivieren und so die Heilung bzw. das Überwachsen des betroffenen Bereiches mit Zellen zu beschleunigen. Die verwendeten Substrate werden hier nach Auf bohren des Knochens, d. h. nach Schaffung von Verbindungskanälen zwischen Gelenkraum und Knochenmarkraum, bevorzugt in Form einer Paste, auf die be troffene Gelenkfläche aufgebracht.

Nachteilig bei den Verfahren, Zusammensetzungen und Implantaten des Standes der Technik im Hinblick auf die Heilung von Gelenkdefekten ist daher, dass diese häufig die Öffnung des Gelenkes bzw. umfangreiche mechanische Manipulatio nen am oder im Gelenk erfordern. Insbesondere gilt dies, wenn auf Trägerstruktu ren anhaftende (und damit dreidimensionale) Implantate in das Gelenk eingeführt werden müssen. Dies hat zur Folge, dass das Infektionsrisiko steigt und eine Hei lung des betroffenen Gelenkes erschwert bzw. unmöglich gemacht wird. Des weiteren sind die bei der Perfusion eines Implantates vorherrschenden Bedingun gen von den im Gelenk vorhandenen physiologischen Bedingungen verschieden.

Folglich besteht im Stand der Technik ein starkes Bedürfnis, eine möglichst scho nende Möglichkeit zu entwickeln, osteoarthrotische Gelenkdefekte zu behandeln. Des weiteren besteht ein Bedürfnis, Zusammensetzungen zur Behandlung von Osteoarthrose und verwandten Pathologien bereitzustellen, die eine möglichst in vivo-nahe und effiziente Regeneration des betroffenen Gelenks bzw. Gelenkberei ches gestatten. Es besteht weiterhin ein Bedürfnis, Transplantate bereitzustellen, die unter in vivo-nahen Beingungen kultiviert wurden und die eine hohes Maß an Biokompatibilität aufweisen. Schließlich besteht im Stand der Technik auch ein Bedürfnis, Zusammensetzungen bereitzustellen, die die Behandlung des Gelenk defektes möglichst mit gering-invasiven Techniken gestatten.

Demzufolge ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Zusammensetzungen bereitzustellen, die eine schonende, in vivo-nahe und effiziente Behandlung von degenerativen Gelenkerkrankungen, insbesondere von Osteoarthrose, ermögli chen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Bereitstel lung von Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, sowie in der Bereitstellung von Transplantaten, die unter Verwendung der erfin dungsgmäßen Zusammensetzungen hergestellt werden. Schließlich besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung von Behandlungsver fahren für Osteoarthrose und ähnliche degenerative Gelenkerkrankungen.

Diese und weitere Aufgaben werden durch die erfindungsgemäßen Verfahren und Zellzusammensetzungen gelöst.

Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Zellzusammensetzung umfassend die folgenden Schritte:

a) Bereitstellung von mesenchymalen Zellen,
b) Bereitstellung von Synovialflüssigkeit,
c) Mischung von Synovialflüssigkeit und mesenchymalen Zellen zum Erhalt einer Zellzusammensetzung.

Die in Schritt a) beschriebene Bereitstellung der mesenchymalen Zellen umfasst in einer vorteilhaften Ausführungsform die Verwendung von frisch isolierten Zellen z. B. aus Knochenmark, Knorpel oder Blut. Die Zellen können z. B. auch als Gewebe bzw. Knorpel aus einem zunächst unbelasteten Bereich eines Gelenks mittels Knorpelbiopsie entnommen werden. Aus dieser Knorpelbiopsie werden dann anschließend durch enzymatischen Verdau einzelne Knorpelzellen isoliert. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Zellen vor ihrer Bereitstellung in Zellkultur gehalten und vermehrt. Besonders bevorzugt ist hier die Haltung der Zellen in Suspensionskultur, so dass die spätere Mischung, insbesondere die bevorzugte Mischung der mesenchymalen Zellen und der Synovialflüssigkeit in vitro (s. Schritt c), problemlos und ohne Anwendung mechanischer Verfahren erreicht werden kann. Die Bereitstellung der Synovi alflüssigkeit (Schritt b) betrifft in einer vorteilhaften Ausführungsform der vorlie genden Erfindung die Verwendung von eingefrorener Synovialflüssigkeit, die vor der Verwendung aufgetaut wurde. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Synovialflüssigkeit vor dem Mischen (Schritt c) mit den mesenchymalen Zellen aus dem Gelenk entnommen, wobei eine Entnahme der Synovialflüssigkeit un mittelbar vor dem Mischen mit den mesenchymalen Zellen besonders bevorzugt ist. Die Mischung von mesenchymalen Zellen und Synovialflüssigkeit kann in jeder beliebigen Reihenfolge erfolgen. Bezüglich der nach Mischung vorliegenden Zellzahl pro Volumeneinheit (Zelldichte) ist eine Dichte von einer Zelle/mL bis 40 Millionen Zellen/mL (End-Zelldichte) vorteilhaft, bevorzugt ist eine Zelldichte von 2 Millionen bis 30 Millionen Zellen/mL Flüssigkeit, besonders bevorzugt ist eine Zelldichte von 5 Millionen bis 15 Millionen Zellen/mL (End-Zelldichte).

Die vorliegende Erfindung betrifft in einer bevorzugten Auführungsform auch ein Verfahren, bei dem die in Schritt a) bereitgestellten mesenchymalen Zellen aus Knochenmark, Fettgewebe, Blut, Spongiosa, Knorpel oder anderen mesenchy malen Geweben isoliert werden. Prinzipiell können hier alle Gewebe verwendet werden, die mesenchymale Zellen enthalten. Die Verfahren zur Isolierung dieser Zellen sind dem Fachmann bekannt (siehe Haynesworth, S. E., Goshima, J., Gold berg, V. M., Caplan, A. I. Bone 13(1) (1992), S. 81-88; Haynesworth, S. E., Baber, M. A., Caplan, A. I. Bone 13 (1992), S. 69-80; Pittenger, M. F., Mackay, A. M., Beck, S. C., Jaiswal, R. K., Douglas, R., Mosca, J. D., Moorman, M. A., Simonetti, D. W., Craig, S., Marshak, D. R., Science 284 (1999), S. 43-147, Burmester, G. R., Menche, D., Merryman, P., Klein, M., Winchester, R., Arthritis Rheum. 26 (1983), S. 1187-1195; Sittinger, M., Bujia, J., Minuth, W. W., Hammer, C., Bur mester, G. R., Biomaterials 15 (1994), S. 451-456; Sittinger, M., Reitzel, D., Dau ner, M., Hierlemann, H., Hammer, C., Kastenbauer, E., Planck, H., Burmester, G. R., Bujia, J., J. Biomed. Mat. Res. 33 (1996), S. 57-63; sowie US-Patentschrift 5,486,359).

Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren, bei dem die in Schritt a) bereitgestellten mesenchymalen Zellen mesenchymale Vorläuferzellen oder me senchymale Stammzellen sind. Die im Stand der Technik beschriebene Isolierung und Kultivierung humaner embryonaler Stammzellen eröffnet prinzipiell die Möglichkeit, unter entsprechenden Kultur- und Entwicklungsbedingungen aus diesen omnipotenten Zellen jede körpereigene Zellform der unterschiedlichsten Zellpopulationen wie zum Beispiel Knorpel-, Knochen-, Haut-, Muskel-, Leber-, Nieren- und neuronale Zellen zu erzeugen. Die hohe Komplexität der für diese gewebespezifische Zellentwicklung relevanten Regelkreise, ethische Beweggrün de, sowie die eingeschränkte Verfügbarkeit dieser Zellen kann jedoch erhebliche Probleme bereiten. Die erfindungsgemäße Verwendung von mesenchymalen Vorläuferzellen zur Heilung von Knochen- und Knorpeldefekten ist vorteilhaft, da derartige Zellen bereits in ihrer Entwicklung fortgeschritten und hinsichtlich ihres Entwicklungspotentials in Bezug auf mesenchymale Zelltypen determiniert sind. Mesenchymale Vorläuferzellen im Sinne der vorliegenden Erfindung umfassen auch mesenchymale Stammzellen. Sowohl mesenchymale Vorläufer- als auch mesenchymale Stammzellen weisen eine hohe Vermehrungskapazität auf (Caplan, A. I., Clin. Plast. Surg., 21, 1994, S. 429-435) und sind unter geeigneten Kulturbe dingungen bzw. nach entsprechender Manipulation, z. B. durch genetische Verän derung, ohne weiteres in der Lage, sich zu Zellen mesenchymaler Gewebe, also zu Knorpel, Knochen, Muskel, Fett- und Bindegewebe, zu entwickeln. Sie können aus dem Blut, Knochenmark und Fettgewebe adulter Spender gewonnen werden (Pittenger, M. F. et al., Science, 1999, S. 143-147), so dass die ethisch umstrittene Verwendung von humanen Embryonen, totipotenten humanen embryonalen Zel len oder humanen embryonalem Gewebe im Rahmen der vorliegenden Erfindung vermieden wird. Dies sichert die medizinisch/pharmazeutische An wendbarkeit und Herstellbarkeit der erfindungsgemäßen Zellzusammensetzungen. Des weiteren basieren die aus dem Stand der Technik vorbekannten Verfahren des Tissue Engineering gewöhnlich auf der Vermehrung autologer Zellen, die an schließend, z. B. in Form eines ausgereiften Tranplantates, wieder in den Patienten implantiert werden. Leider ist das Proliferationspotential derartiger Zellen be grenzt und eine Vermehrung über viele Zellpassagen in vitro reduziert wesentlich die funktionale Qualität der Zellen, was diese wiederum für die Transplantation weniger geeignet macht. Somit ist die erfindungsgemäße Verwendung von me senchymalen Vorläuferzellen, die nicht den genannten Einschränkungen unterlie gen, vorteilhaft.

Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung in einer besonders bevorzugten Ausführungsform ein Verfahren, bei dem die in Schritt a) bereitgestellten mesen chymalen Zellen autolog sind. "Autolog" im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet, dass Zellen verwendet werden, die vor der Transplantation dem Trans teil - ähnlich wie bei einer Eigenblutspende vor einer größeren Operation, dass zur Transplantation bzw. Injektion genetisch und immunologisch (bezügl. der MHC- Histokompatibilität) auf den Empfänger perfekt abgestimmte Zellen bzw. Zellzu sammensetzungen verwendet werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft in einer bevorzugten Ausführungsform ferner Verfahren, bei dem die in Schritt a) bereitgestellten mesenchymalen Zellen hete rolog sind. Sind zur Transplantation keine autologen Zellen erhältlich, so können im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch heterologe Zellen bzw. Zellzusam mensetzungen eingesetzt werden. "Heterolog" bedeutet in diesem Zusammen hang, dass mesenchymale Zellen von einem anderen Individuum als dem Emp fänger der Zellzusammensetzung zur Herstellung derselben verwendet werden.

Des weiteren betrifft die Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform ein Verfahren, bei dem die in Schritt a) bereitgestellten mesenchymalen Zellen in Zellkultur kultiviert werden. Die Kultivierung der mesenchymalen Zellen erfolgt dabei unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Zellkulturtechniken vor der Bereitstellung der Zellen, vorteilhaft ist ein Kulturzeitraum von 5 bis 50 Ta gen, bevorzugt sind 10 bis 40 Tage, besonders bevorzugt ist ein Zeitraum von 20 bis 25 Tagen.

Die Erfindung betrifft in einer bevorzugten Ausführungsform ein Verfahren, bei dem die Synovialflüssigkeit aus einem Gelenk erhalten wird. Die Synovialflüssig keit wird bevorzugt durch Punktion mit einer sterilen Nadel bzw. Spritze direkt aus dem Gelenk erhalten. Das Gelenk kann dabei Bestandteil eines lebenden Säu getiers (einschl. des Menschen) sein. Des weiteren kann die Synovialflüssigkeit aber auch aus toten Säugetieren bzw. Spendern gewonnen werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfin dung ein Verfahren zur Herstellung einer Zellzusammensetzung, bei dem die Sy novialflüssigkeit autolog ist. "Autolog" im Sinne der vorliegenden Erfindung be deutet, dass Synovialflüssigkeit verwendet wird, die vor der Transplantation dem Transplantationspatienten selbst entnommen wurde. Dies bietet - wie bereits oben in Bezug auf die mesenchymalen Zellen erwähnt - den erheblichen Vorteil, dass zur Transplantation bzw. zur Injektion genetisch und immunologisch perfekt auf den Empfänger abgestimmte Zellen bzw. Zellzusammensetzungen verwendet werden können. Dies minimiert das Risiko einer Abstossungsreaktion des Emp fängers, bzw. schließt diese weitgehend aus.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren, bei dem die in Schritt b) bereitge stellte Synovialflüssigkeit synthetisch hergestellt wird. Die synthetische Herstel lung von Synovialflüssigkeit bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass eine der natürlichen Synovialflüssigkeit nachempfundene Lösung hergestellt wird, wobei in einer bevorzugten Ausführungsform diese Lösung zellfrei ist. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die synthetische Synovialflüs sigkeit proteinfrei, wobei eine zell- und proteinfreie synthetische Synovialflüssig keit besonders bevorzugt ist. Letzgenanntes stellt eine Synovialflüssigkeit dar, die, da sie im wesentlichen frei von Immunogenen ist, mit einer Vielzahl von Spen dern kompatibel ist und deshalb universell eingesetzt werden kann.

Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, bei dem die in Schritt b) bereitgestellte Synovialflüssigkeit chemisch, physikalisch oder biolo gisch modifiziert wird. Unter "chemischer Modifikation" soll im Rahmen der vor liegenen Erfindung die Behandlung der Synovialflüssigkeit mittels vorwiegend chemischer Verfahren verstanden wären. Beispielhaft für chemische Modifikatio nen seien hier Ionenaustausch-Chromatographie, Affinitätschromatographie, Aus salzen, Ausschütteln, frakionierte Fällung, Versetzen mit bzw. Zugabe von Che mikalien, Einstellen des pH-Wertes mit Säure oder Base, Dialyse und Umsetzung der Synovialflüssigkeit mit Chemikalien genannt. Unter "physikalischer Modifi kation" soll im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Behandlung der Synovi alflüssigkeit mittels vorwiegend physikalischer Verfahren verstanden wären. Bei spielhaft für physikalische Modifikationen seien hier Zentrifugation, Wärme- /Kältebehandlung, Kochen, Abkühlen etc. genannt. Unter "biologischer Modifi kation" soll im Rahmen der vorliegenen Erfindung die Behandlung der Synovi alflüssigkeit mittels vorwiegend biologischer Verfahren verstanden wären. Bei spielhaft für vorwiegend biologische Modifikationen seien hier die gentechnische Veränderung von Zellen, die Zugabe/Entnahme von Zellen aus der Flüssigkeit und die Behandlung der Flüssigkeit mit Bakterien, Viren, Pilzen oder Mikroorga nismen oder deren Stoffwechselprodukten genannt. Auch die Zugabe von biolo gisch aktiven Substanzen bzw. Molekülen ist als eine biologische Modifikation im Sinne der vorliegenden Erfindung zu verstehen. Besonders bevorzugt ist im Rah men der vorliegenden Erfindung eine Synovialflüssigkeit, bei der das nach Ent nahme vorhandene Protein (z. B. durch Präzipitation und anschl. Zentrifugation) und/oder die nach Entnahme noch vorhandenen Zellen bzw. Zelltrümmer (z. B. durch Zentrifugation) entfernt werden, so dass in Schritt c) die mesenchymalen Zellen mit "geklärter" (d. h. weitgehend zell- und/oder proteinfreier) Synovialflüs sigkeit gemischt werden können.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfin dung ein Verfahren, bei dem die verwendeten mesenchymalen Zellen bipotent oder pluripotent sind. Im Gegensatz zu den bereits o. g. omnipotenten Zellen bzw. Zellinien (Synonym: totipotente Zellen bzw. Zellinien), die in hohem Maße emb ryonalen Charakter aufweisen und die sich in jedes gewünschte Gewebe ausdiffe renzieren können, weisen die im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt verwendeten bipotenten oder pluripotenten Zellen bereits einen gewissen - wenn auch geringen - Differenzierungsgrad auf und können aus adulten Spendern ge wonnen werden. Dies führt zu einer besseren Verfügbarkeit derartiger Zellen und einer problemloseren Entnahme. "Bipotent" im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet, dass die verwendeten mesenchymalen (Vorläufer-)Zellen sich zu zwei verschiedenen Zelltypen ausdifferenzieren können, während "pluripotent" bedeu tet, dass mehr als zwei Zelltypen durch Differenzierung entstehen können. Die gegenwärtig diskutierten ethischen Bedenken bezügl. der Verwendung embryo naler Gewebe (deren Verfügbarkeit ohnehin eingeschränkt ist) bzw. von embryo nalen Zellen in therapeutischen Verfahren bzw. bei der Herstellung von Medika menten, treten bei der Verwendung von bi- oder pluripotenten Zellen zurück. Aus diesem Grunde basiert die vorliegende Erfindung auf der Verwendung von bi- oder pluripotenten mesenchymalen (Vorläufer-)Zellen, die im Sinne der vorlie genden Erfindung bi- oder pluripotente mesenchymalen Stammzellen (s. o.) um fassen, für die Geweberegeneration. Deren Potential zur Proliferation und Diffe renzierung ist prinzipiell ebenfalls nur wenig begrenzt, womit diese Zellart für das Tissue Engineering von Knorpel und Knochen von besonderem Interesse ist.

Weiterhin betrifft die Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform ein Ver fahren, bei dem in Schritt a) bereitgestellten mesenchymalen Zellen mit Wachs tums- und/oder Differenzierungsfaktoren, Zytokinen, extrazellulären Matrixkom ponenten oder chemotaktischen Faktoren behandelt werden. Das Differenzie rungsverhalten der mesenchymalen Vorläuferzellen kann unter Einfluß verschie dener Wachstums- und Differenzierungsfaktoren wie z. B. EGF, PDGF, IGF oder FGF oder Faktoren, die aus der TGF-β Superfamilie stammen, unter definierten Kulturbedingungen oder auch in vivo beeinflusst werden. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung eingesetzten Zytokine umfassen Interleukine, EGF, HGF, PDGF, FGF, sowie die TGF-Familie. Als extrazelluläre Matrixkomponenten seien hier beispielhaft die Kollagene genannt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung können auch chemotaktische Faktoren wie z. B. VEGF, SDF-1, MDC, MIP, "steel factor", GM-CSF und Interleukine zur Behandlung der mesenchymalen Vorläu ferzellen verwendet werden. Die Begriffe "behandeln" bzw. "Behandlung" sollen hier derart verstanden werden, dass die mesenchymalen Zellen den o. g. Substan zen bzw. Faktoren exponiert werden bzw. in Gegenwart derselben für einen ge wissen Zeitraum inkubiert werden oder mit diesen gemischt werden.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, bei dem die in Schritt a) bereitgestell ten mesenchymalen Zellen gentechnisch verändert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform geschieht die gentechnische Veränderung der mesenchymalen Zellen durch Einführung eines Plasmids, das z. B. die Expression eines ge wünschten Enzyms oder Strukturproteins ermöglicht, in die gegebenenfalls in Kultur befindlichen Zellen. Es ist jedoch auch möglich, Zellen zu verwenden, deren Chromosomen modifiziert wurden, beispielsweise durch chemische Agen zien oder Integrationsvektoren. Auf diese Weise lassen sich den Zellen der me senchymalen Zellzusammensetzung vorteilhafte Eigenschaften verleihen, die am Ort der späteren Behandlung (also bevorzugt im erkrankten Gelenk) positive Wir kungen erzeugen. Eine derartige Wirkung kann beispielsweise die Überexpression extrazellulärer Matrixproteine (Kollagene) sein, die zu einer vermehrten und be schleunigten Ansiedlung weiterer Zellen und Zellverbände an der erkrankten bzw. chirurgisch vorbehandelten Gelenkfläche führt.

Die Erfindung betrifft auch eine Zellzusammensetzung, erhältlich nach einem der o. g. Verfahren.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Zellzusammenset zung erhältlich nach einem der o. g. Verfahren zur Behandlung von humanen und tierischen Gelenkdefekten. Als Gelenkdefekte im Sinne der vorliegenden Erfin dung gelten durch Prozesse entzündlicher und nicht-endzündlicher Genese aus gelöste pathologische Veränderungen eines Gelenkes.

Die vorliegende Erfindung beschreibt auch die Verwendung einer Zellzusammen setzung erhältlich nach einem der o. g. Verfahren zur Injektion in den Gelenkspalt. In einer bevorzugten Ausführungsform geht man dabei von autologen mesenchy malen Zellen aus, die in autologer Synovialflüssigkeit als "natürliche Gelenk schmiere" in ein erkranktes Gelenk eingebracht werden. Die Applikation der me senchymalen Zellen in den Gelenkspalt oder direkt in den Defekt ermöglicht die Ansiedelung teilungs- und reifungsfähiger Zellen im Defektbereich unter physio logischen Bedingungen zur Ausbildung und Regeneration von erneuertem Knor pel oder auch Knochen.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung einer Zellzusammensetzung erhält lich nach einem oben genannten Verfahren zur Injektion in den Gelenkdefekt. Neben der Injektion in den Gelenkspalt (s. o.) kann es unter Umständen im Rah men der vorliegenden Erfindung aus topologischen Gründen vorteilhaft sein, die Zellzusammensetzung in den Defekt selbst zu injizieren.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung einer Zellzusammensetzung erhält lich nach einem oben genannten Verfahren zur interoperativen Behandlung von Gelenkdefekten. Der Begriff "interoperative Behandlung" soll im Rahmen der vorliegenden Erfindung derart verstanden werden, dass die zwischen zwei Ge lenkoperationen liegende Zeitspanne zur Behandlung der Gelenkdefekte unter Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen genutzt wird.

Schließlich betrifft die Erfindung die Verwendung einer Zellzusammensetzung erhältlich nach einem der oben genannten Verfahren zur in vitro-Kultivierung von mesenchymalen Gewebetransplantaten. Die in den Schritten a) bis c) erhaltene Zellzusammensetzung wird - neben der direkten Verwendung zu Injektion in Ge lenkdefekte und daraus resultierender in vivo-Behandlung dieser Defekte - in ei ner bevorzugten Ausführungsform zur in vitro-Kultivierung, d. h. zur Herstellung, von Transplantaten, die mesenchymale Zellen umfassen, verwendet. Derartige Transplantate werden in einer besonders bevorzugten Ausführungsform unter Verwendung von dreidimensionalen Unterstützungsstrukturen kultiviert. Man geht dabei von biokompatiblen Materialien wie z. B. Polymervliesen (umfassend z. B. Polyglykole oder Polylactide), Kunststoffträgern oder keramischen bzw. mi neralischen Materialien (z. B. Hydroxyapatit) aus, die als Unterstützungsstruktur dienen und von mesenchymalen. Zellen besiedelt bzw. durchdrungen werden. Dies geschieht bevorzugt in einer Kammer, die die erfindungsgemäße Zellzusammen setzung und die Unterstüzungsstruktur enthält, so dass die Unterstüzungsstruktur von Lösung umgeben ist und die Zellen auf dieser anwachsen können. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind diese Unterstützungsstrukturen resorbierbar, so dass nach Anwachsen der mesenchymalen Zellen auf diesen Strukturen und Implantation in den Gelenkdefekt, die Unterstützungsstruktur suk zessive resorbiert wird. Das Transplantat selbst wird durch Kultivierung der me senchymalen Zellzusammensetzung, die die aus einem Gelenk gewonnene oder synthetische oder modifizierte (s. o.) Synovialflüssigkeit umfasst, in Anwesenheit der Unterstützungsstruktur erhalten. Die Unterstützungsstruktur weist dabei in einer bevorzugten Ausführungsform bereits die Form auf, die das fertige Trans plantat aufweisen soll. Verfahren zur Herstellung derartiger Transplantate aus Zellen und Unterstützungs- bzw. Trägerstrukturen sind dem Fachmann bekannt und werden u. a. in der WO 94/20151 beschrieben. Die Verwendung der erfin dungsgemäßen Zellzusammensetzung umfassend Synovialflüssigkeit (bzw. modi fizierte oder synthetische Synovialflüssigkeit) bietet den Vorteil, dass die Trans plantate in einer Lösung kultiviert werden, die der Situation im Gelenk sehr ähn lich ist, so dass eine in vivo-nahe Kultivierung möglich ist. Letztgenanntes führt zu stabilen Transplantaten mit einem hohen Maß an Verträglichkeit für den Emp fänger.

Die im Zusammenhang mit den vorstehend genannten Verfahren bzw. Verwen dungen gebrauchten Begriffsdefinitionen gelten im Rahmen der vorliegenden Er findung auch für die im folgenden aufgeführten Zellzusammensetzungen und Be handlungsverfahren.

Die Erfindung betrifft des weiteren eine Zellzusammensetzung umfassend mesen chymale Zellen und Synovialflüssigkeit, sowie eine Zellzusammensetzung, bei der die mesenchymalen Vorläuferzellen aus Knochenmark, Fettgewebe, Blut, Spongiosa, Knorpel oder anderen mesenchymalen Geweben isoliert werden.

Weiterhin betrifft die Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform eine Zell zusammensetzung, bei der die mesenchymalen Zellen mesenchymale Vorläufer zellen sind. "Mesenchymale Vorläuferzellen" umfassen im Rahmen der vorlie genden Erfindung auch mesenchymale Stammzellen (s. o.).

Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Zellzusammensetzung, bei der die mesenchymalen Zellen autolog sind, eine Zellzusammensetzung, bei der die me senchymalen Zellen heterolog sind, eine Zellzusammensetzung, bei der die me senchymalen Vorläuferzellen in Zellkultur kultiviert werden, eine Zellzusammen setzung, bei der die Synovialflüssigkeit aus einem Gelenk stammt, eine Zellzu sammensetzung, bei der die Synovialflüssigkeit autolog ist, sowie eine Zellzu sammensetzung, bei der die Synovialflüssigkeit synthetisch hergestellt wird.

Weiterhin betrifft sie eine Zellzusammensetzung, bei der die Synovialflüssigkeit chemisch, physikalisch oder biologisch modifiziert ist, eine Zellzusammenset zung, bei der die mesenchymalen Zellen pluripotent sind, eine Zellzusammenset zung, bei der die mesenchymalen Zellen mit Wachstums- und/oder Differenzie rungsfaktoren, Zytokinen, extrazellulären Matrixkomponenten oder chemotakti schen Faktoren behandelt wurden und eine Zellzusammensetzung, bei der die me senchymalen Vorläuferzellen gentechnisch verändert sind.

Schließlich betrifft die Erfindung ein Transplantat, erhältlich durch die Kultivie rung einer Zellzusammensetzung erhältlich durch eines der o. g. Verfahren, auf einem Trägermaterial. Die bevorzugten Trägermaterialien, die die Träger- bzw. Unterstützungsstruktur (beide Begriffe sind im Rahmen der Erfindung synonym zu verstehen) des Transplantates bilden, wurden bereits oben genannt. Das Trans plantat wird, wie bereits beschrieben, durch Kultivierung der erfindungsgemäßen Zellzusammensetzung in Anwesenheit der Trägerstruktur (also in Lösung bzw. unter Perfusion) hergestellt.

Die in den unten stehend genannten Behandlungsverfahren beschriebenen Schrit te, Stoffe und Zusammensetzungen sind gemäß den bereits oben verwendeten Definitionen und Begriffsbestimmungen auszulegen, sofern nichts anderes defi niert ist.

Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Behandlung von humanen und tierischen Gelenkdefekten, umfassend die folgenden Schritte:

a) Entnahme von Synovialflüssigkeit aus einem Gelenk oder Herstellung von synthetischer Synovialflüssigkeit,
b) Mischen der Synovialflüssigkeit mit mesenchymalen Zel len,
c) Injektion der Mischung aus ii) in das Gelenk.

Die Entnahme von Synovialfüssigkeit in Schritt i) aus einem Gelenk geschieht vorzugsweise zerstörungsfrei unter Verwendung einer sterilen Nadel bzw. Spritze. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die Synovialflüssigkeit entweder von lebenden Spendern stammen, oder aber von toten Säugetieren (einchl. Men schen) entnommen werden. Das Mischen der entnommenen Synovialflüssigkeit mit mesenchymalen Zellen in Schritt ii) kann in beliebiger Reihenfolge erfolgen. Bezüglich der nach Mischung vorliegenden Zellzahl pro Volumeneinheit (Zell dichte) ist eine Dichte von einer Zelle/mL bis 40 Millionen Zellen/mL (End- Zelldichte) vorteilhaft, bevorzugt ist eine Zelldichte von 2 Millionen bis 30 Milli onen Zellen/mL Flüssigkeit, besonders bevorzugt ist eine Zelldichte von 5 Millio nen bis 15 Millionen Zellen/mL (End-Zelldichte). Die Injektion der Mischung (Schritt iii) in das Gelenk des Empfängers sollte möglichst schonend und unter sterilen Bedingungen erfolgen. Der Einsatz von minimal-invasiven Techniken ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezüglich aller Behandlungsschritte und - verfahren bevorzugt.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren, bei dem Schritt i) die Herstellung von synthetischer Synovialflüssigkeit ist.

Die Herstellung von synthetischer Synovialflüssigkeit, sowie deren Vorteile, wurde bereits im Rahmen der vorliegenden Erfindung (s. o.) beschrieben.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren, gekennzeichnet durch eine chemische, physikalische oder biologische Modifikation der Synovialflüssigkeit aus Schritt i) zwischen den Schritten i) und ii).

Die verschiedenen Möglichkeiten der Modifikation der Synovialflüssigkeit wur den bereits oben beschrieben, auf diese wird hiermit vollumfänglich Bezug ge nommen.

Die Erfindung findet Anwendung bei der Behandlung von humanen und tierischen Gelenkdefekten, wobei die mesenchymalen Zellen aus Kno chenmark, Fettgewebe, Blut, Spongiosa, Knorpel oder anderen mesenchymalen Geweben isoliert werden, wobei die mesenchymalen Zellen au tolog sind, wobei die mesenchymalen Zellen heterolog sind, wobei die mesenchymalen Zellen in Zellkultur kultiviert werden, wobei die mesenchymalen Zellen mesenchymale Vorläuferzellen sind, sowie wobei die Synovialflüssigkeit autolog ist.

Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, bei dem die mesen chymalen Zellen bi- oder pluripotent sind, ein Verfahren, bei dem die mesenchy malen Zellen mit Wachstums- und/oder Differenzierungsfaktoren, Zytokinen, extrazellulären Matrixkomponenten oder chemotaktischen Faktoren behandelt werden und ein Verfahren, bei dem die mesenchymalen Zellen gentechnisch ver ändert sind.

Die vorliegende Erfindung soll auch anhand der folgenden Ausführungsbeispiele erläutert werden. Die Ausführungsbeispiele sind nicht als limitierend anzusehen, sondern dienen der näheren Beschreibung der Erfindung.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1

Um eine Zellzusammensetzung zur Behandlung einer arthrotisch deformierten Gelenkoberfläche bereitzustellen, werden zunächst aus dem Knochenmark auto loge mesenchymale Vorläuferzellen isoliert (siehe Haynesworth, S. E., Goshima, J., Goldberg, V. M., Caplan, A. I. Bone 13(1) (1992), S. 81-88; Haynesworth, S. E., Baber, M. A., Caplan, A. I. Bone 13 (1992), S. 69-80; Pittenger, M. F., Mackay, A. M., Beck, S. C., Jaiswal, R. K., Douglas, R., Mosca, J. D., Moorman, M. A., Si monetti, D. W., Craig, S., Marshak, D. R., Science 284 (1999), S. 43-147, sowie US-Patentschrift 5,486,359). Die Vorläuferzellen werden über 24 Tage unter Zellkulturbedingungen mit DME-Medium (Biochrom KG, Berlin) supplementiert mit 10% autologem Serum (DME-autologS) kultiviert.

Dem erkrankten oder einem gesunden Gelenk wird mittels einer Aspirationsnadel 5-10 mL Synovialflüssigkeit entnommen, welche anschließend mit mesenchyma len Vorläuferzellen vermischt wird, so daß eine Zellkonzentration von 5 Millionen Zellen/mL erzielt wird. Hierzu werden die Vorläuferzellen mittels Trypsin von der Kulturoberfläche gelöst und mit dem zweifachen Volumen DME-autologS ver setzt und gezählt. Zum Erzielen einer Zellkonzentration von 5 Millionen Zellen pro ml Synovialflüssigkeit wird das entsprechende Volumen der Vorläuferzell- Suspension in ein Zentrifugen-Röhrchen (15 mL) überführt und bei 300 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Zellpellet mittels einer serologischen Pipette (5 mL) in der entsprechenden Menge an Synovialflüssigkeit vorsichtig durch Auf- und Abpipettieren gemischt. Die so erhaltene Zellzusammensetzung wird direkt per Injektion in den Gelenk spalt injiziert. Die Applikation erfolgt durch mehrmalige Gabe der Zellzusam mensetzung im Abstand von 2-3 Wochen.

Beispiel 2

Um eine Zellzusammensetzung zur Behandlung eines umschriebenen Defektes auf einer Gelenkoberfläche zu erhalten, werden zunächst aus dem Knochenmark autologe mesenchymale Vorläuferzellen isoliert (siehe Haynesworth, S. E., Gos hima, J., Goldberg, V. M., Caplan, A. I. Bone 13(1) (1992), S. 81-88; Haynes worth, S. E., Baber, M. A., Caplan, A. I. Bone 13 (1992), S. 69-80; Pittenger, M. F., Mackay, A. M., Beck, S. C., Jaiswal, R. K., Douglas, R., Mosca, J. D., Moorman, M. A., Simonetti, D. W., Craig, S., Marshak, D. R., Science 284 (1999), S. 43-147, sowie US-Patentschrift 5,486,359). Die Vorläuferzellen werden über 24 Tage un ter Zellkulturbedingungen mit DME-Medium supplementiert mit 10% autologem Serum (DME-autologS) kultiviert.

Dem erkrankten oder einem gesunden Gelenk wird mittels einer Aspirationsnadel 5-10 mL Synovialflüssigkeit entnommen, welche mit mesenchymalen Vorläufer zellen vermischt wird, so daß eine Zellkonzentration von 5 Millionen Zellen/ml erzielt wird. Hierzu werden die Vorläuferzellen mittels Trypsin von der Kultur oberfläche gelöst und mit dem zweifachen Volumen DME-autologS versetzt und gezählt. Zum Erzielen einer Zellkonzentration von 5 Millionen Zellen pro mL Synovialflüssigkeit wird das entsprechende Volumen der Vorläuferzell- Suspension in ein Zentrifugen-Röhrchen (15 mL) überführt und bei 300 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wird verworfen und das Zellpellet wird mittels einer serologischen Pipette (5 mL) vorsichtig durch Auf- und Abpipettieren mit der entsprechenden Menge an Synovialflüssigkeit gemischt. Die so erhaltene Zellzusammensetzung wird anschließend direkt in den Defekt injiziert.

Beispiel 3

Zum Erhalt einer Zellzusammensetzung zur Behandlung eines osteochondralen Defektes in einem Gelenk werden zunächst aus dem Knochenmark autologe me senchymale Vorläuferzellen (siehe Haynesworth, S. E., Goshima, J., Goldberg, V. M., Caplan, A. I. Bone 13(1) (1992), S. 81-88; Haynesworth, S. E., Baber, M. A., Caplan, A. I. Bone 13 (1992), S. 69-80; Pittenger, M. F., Mackay, A. M., Beck, S. C., Jaiswal, R. K., Douglas, R., Mosca, J. D., Moorman, M. A., Simonetti, D. W., Craig, S., Marshak, D. R., Science 284 (1999), S. 43-147, sowie US-Patentschrift 5,486,359). Die Vorläuferzellen werden über 24 Tage unter Zellkulturbedingun gen mit DME-Medium supplementiert und mit 10% autologem Serum (DME- autologS) kultiviert.

Dem erkrankten oder einem gesunden Gelenk wird mittels einer Aspirationsnadel 5-10 mL Synovialflüssigkeit entnommen und diese mit mesenchymalen Vorläu ferzellen vermischt, so dass eine Zellkonzentration von 10 Millionen Zellen/mL erzielt wird. Hierzu werden die Vorläuferzellen mittels Trypsin von der Kultur oberfläche gelöst und mit dem zweifachen Volumen DME-autologS versetzt und anschließend gezählt. Zum Erzielen einer Zellkonzentration von 5 Millionen Zel len pro mL Synovialflüssigkeit wird das entsprechende Volumen der Vorläufer zell-Suspension in ein 15 mL fassendes Zentrifugen-Röhrchen überführt und bei 300 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wird ver worfen, um das Zellpellet mittels einer serologischen Pipette (5 mL) in der ent sprechenden Menge an Synovialflüssigkeit vorsichtig durch Auf- und Abpipettie ren gemischt. Die so erhaltene Zellzusammensetzung wird mit knocheninduzie renden Wachstumsfaktoren der Fibroblast Growth Factor Superfamilie oder dem Transforming Growth Factor-β (10 ng/ml Endkonzentration) vermischt und in den knöchernen Defekt injiziert. Nach Konsolidierung des knöchernen Defektes wird zur vollständigen Ausheilung des Knorpeldefektes eine Zellzusammensetzung umfassend mesenchymale Vorläuferzellen, wie in Ausführungsbeispiel 1 be schrieben, in den Gelenkspalt injiziert.

Beispiel 4

Zur Behandlung eines chondralen Defektes des Gelenks wird zunächst aus dem unbelasteten Bereich des Gelenks eine Knorpelbiopsie entnommen. Aus der Knorpelbiopsie werden durch enzymatischen Verdau Knorpelzellen isoliert (siehe Burmester, G. R., Menche, D., Merryman, P., Klein, M., Winchester, R., Arthritis Rheum. 26 (1983), S. 1187-1195; Sittinger, M., Bujia, J., Minuth, W. W., Ham mer, C., Burmester, G. R., Biomaterials 15 (1994), S. 451-456; Sittinger, M., Reit zel, D., Dauner, M., Hierlemann, H., Hammer, C., Kastenbauer, E., Planck, H., Burmester, G. R., Bujia, J., J. Biomed. Mat. Res. 33 (1996), S. 57-63), in RPMI- Medium (Biochrom KG, Berlin) supplementiert und mit 10% autologem Serum (RPMI-autologS) in der Zellkultur vermehrt. Einem gesunden Gelenk wird mittels einer Aspirationsnadel 5-10 mL autologe Synovialflüssigkeit entnommen, welche durch Zentrifugation bei 300 g für 10 Minuten bei Raumtemperatur von Zellen befreit wird. Der Überstand wird mit Knorpelzellen vermischt, so daß eine Zell konzentration von 10 Millionen Zellen/mL erzielt wird. Hierzu werden die Knor pelzellen mittels Trypsin von der Kulturoberfläche gelöst und mit dem zweifachen Volumen RPMI-autologS versetzt und gezählt. Zum Erzielen einer Zellkonzent ration von 10 Millionen Zellen pro ml Synovialflüssigkeit wird das entsprechende Volumen der Knorpelzell-Suspension in ein 15 mL Zentrifugen-Röhrchen über führt und bei 300 g für 10 Minuten bei RT zentrifugiert. Der Überstand wird ver worfen und das Zellpellet mittels einer serologischen Pipette (5 mL) in der ent sprechenden Menge an Synovialflüssigkeit vorsichtig durch Auf- und Abpipettie ren gemischt. Die so erhaltene Zellzusammensetzung wird im Sinne einer ACT (Autologe Chondrozyten-Transplantation) in den mit einem autologen Periostlap pen übernähten Defekt injiziert.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer Zellzusammensetzung umfassend die fol genden Schritte:

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die in Schritt a) bereitgestellten mesenchymalen Zellen aus Knochenmark, Fettgewebe, Blut, Spongiosa, Knorpel oder anderen mesenchymalen Geweben isoliert werden.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, bei dem die in Schritt a) bereitge stellten mesenchymalen Zellen mesenchymale Voläuferzellen sind.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem die in Schritt a) bereitgestellten mesenchymalen Zellen autolog sind.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die in Schritt a) bereitgestellten mesenchymalen Zellen heterolog sind.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die in Schritt a) bereitgestellten mesenchymalen Zellen in Zellkultur kultiviert werden.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem die Synovialflüs sigkeit aus einem Gelenk erhalten wird.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem die Synovialflüs sigkeit autolog ist.

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem die in Schritt b) bereitgestellte Synovialflüssigkeit synthetisch hergestellt wird.

10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem in Schritt b) be reitgestellte Synovialflüssigkeit chemisch, physikalisch oder biologisch modifiziert wird.

11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem die mesenchy malen Vorläuferzellen bipotent oder pluripotent sind.

12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, bei dem in Schritt a) be reitgestellten mesenchymalen Vorläuferzellen mit Wachstums- und/oder Differenzierungsfaktoren, Zytokinen, extrazellulären Matrixkomponenten oder chemotaktischen Faktoren behandelt werden.

13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, bei dem in Schritt a) be reitgestellten mesenchymalen Vorläuferzellen gentechnisch verändert wer den.

14. Verwendung einer Zellzusammensetzung erhältlich nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Behandlung von humanen und tierischen Gelenkdefekten.

15. Verwendung einer Zellzusammensetzung erhältlich nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Injektion in den Gelenkspalt.

16. Verwendung einer Zellzusammensetzung erhältlich nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Injektion in den Gelenkdefekt.

17. Verwendung einer Zellzusammensetzung erhältlich nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 zur interoperativen Behandlung von Gelenkdefekten.

18. Verwendung einer Zellzusammensetzung erhältlich nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 zur in-vitro Kultivierung von mesen chymalen Gewebetransplantaten.

19. Zellzusammensetzung umfassend mesenchymale Zellen und Synovialflüs sigkeit.

20. Zellzusammensetzung gemäß Anspruch 19, bei der die mesenchymalen Zellen aus Knochenmark, Fettgewebe, Blut, Spongiosa, Knorpel oder an deren mesenchymalen Geweben isoliert werden.

21. Zellzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 19 oder 20, bei der die mesenchymalen Zellen mesenchymale Vorläuferzellen sind.

22. Zellzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 19 bis 21, bei der die mesenchymalen Zellen autolog sind.

23. Zellzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 19 bis 22, bei der die mesenchymalen Zellen heterolog sind.

24. Zellzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 19 bis 23, bei der die mesenchymalen Zellen in Zellkultur kultiviert werden.

25. Zellzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 19 bis 24, bei der die Synovialflüssigkeit aus einem Gelenk stammt.

26. Zellzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 19 bis 25, bei der die Synovialflüssigkeit autolog ist.

27. Zellzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 19 bis 26, bei der die Synovialflüssigkeit synthetisch hergestellt wird.

28. Zellzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 19 bis 27, bei der die Synovialflüssigkeit chemisch, physikalisch oder biologisch modifiziert ist.

29. Zellzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 19 bis 28, bei der die mesenchymalen Zellen bipotent oder pluripotent sind.

30. Zellzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 19 bis 29, bei der die mesenchymalen Zellen mit Wachstums- und/oder Differenzierungsfakto ren, Zytokinen, extrazellulären Matrixkomponenten oder chemotaktischen Faktoren behandelt werden.

31. Zellzusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 19 bis 30, bei der die mesenchymalen Zellen gentechnisch verändert sind.

32. Transplantat erhältlich durch die Kultivierung einer Zellzusammensetzung erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13 auf ei nem Trägermaterial.