DE1013656B - Verfahren zur Herstellung von Peptiden - Google Patents

Description

DEUTSCHES

Für die Herstellung von Peptiden stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung. Folgende Arbeiten geben einen ins einzelne gehenden Überblick: J. S. Fruton, Advances in Protein Chemistry 5, 1 (1949) und Th. Wieland, Angew. Chemie 63, 7 (1951) und 66, 507 (1954).

Bei den Synthesen, die von Aminosäuren oder niedrigen Peptiden ausgehen, blockiert man gewöhnlich eine der beiden reaktionsfähigen Gruppen des Moleküls, um eindeutige Produkte zu erhalten. Bei diesen Synthesen schützt man häufig die Aminogruppe der ersten Komponente und bringt die Carboxylgruppe in reaktionsfähigere Form, so daß sie mit der freien Aminogruppe der zweiten Komponente, deren Carboxylgruppe vorzugsweise durch Veresterung geschützt ist, in Reaktion treten kann.

Zur zeitweiligen Blockierung der Aminogruppe führt man die Aminosäure oder das Peptid häufig in die Carbobenzyloxyverbindung über, was den Vorteil hat, daß man aus dieser auf mildem Weg, z. B. durch Reduktion, wieder die freie Aminoverbindung darstellen kann. Bei N-acylierten Verbindungen kann man die Aminogruppe nur durch die Wirkung eines hydrolysierenden Mittels freisetzen, wobei darauf zu achten ist, daß keine Peptidbindung aufgespalten wird.

Von den weiterhin bekannten Verfahren zur Bildung einer Peptidverbindung sollen folgende erwähnt werden: Das Verfahren von Curtius, bei dem die Carboxylgruppe der ersten Reaktionskomponente in die Säureazidgruppe übergeführt wird, die mit einer freien Aminogruppe der zweiten Reaktionskomponente reagieren kann. Das Verfahren von G. W. Anderson (J. Am. Chem. Soc. 74 [1952], 5309), bei welchem man Tetraäthylpyrophosphit als Synthesemittel verwendet. Das Verfahren von Emil Fischer, bei dem man die Aminosäure z. B. mit Phosphorpentachlorid oder mit Thionylchlorid in das entsprechende Säurechlorid überführt.

Kürzlich wurde durch J. C. Sheehan und G. P. Hess ein neues Verfahren zur Bildung einer Peptidbindung veröffentlicht (J. Am. Chem. Soc. 77 [1955], 1067). Bei diesem Verfahren verwendet man Dicyclohexylcarbodiimid der Formel C₆H₁₁ — N = C = N- C₆H₁₁, ein Reaktionsmittel, das in vielen Fällen gewissermaßen als sehr starkes wasserentziehendes Mittel wirkt. Es ist in der Lage, eine N-acylierte Aminosäure mit einem Aminosäureester in Reaktion zu bringen. Als Nebenprodukt bildet sich ein Harnstoffderivat folgender Formel: C₆H_n — NH — CO — NH — C₆H₁₁.

Es hat sich nun herausgestellt, daß man auf sehr einfache Art eine ähnliche Peptidbindung mittels eines Acetylenäthers erzeugen kann.

Zu diesem Zweck bringt man eine Aminosäure oder ein Peptid, deren Aminogruppe zeitweilig blockiert ist, mit einer Aminosäure oder einem Peptid, deren Carboxylgruppe blockiert worden ist, in Gegenwart eines Alkoxyacetylens in Reaktion, das durch Addition des bei der Verfahren zur Herstellung von Peptiden

Anmelder:
N. V. Organon, Oss (Niederlande)

Vertreter: Dr.-Ing. F. Wuesthoff, Dipl.-Ing. G. Puls

und Dipl.-Chem. Dr. rer. nat. E. Frhr. von Pechmann, Patentanwälte, München 9, Schweigerstr. 2

Beanspruchte Priorität:
Niederlande vom 29. März 1955

Reaktion gebildeten Wassers in einen Essigsäureester übergeht.

Dieses Verfahren hat den großen Vorteil, daß die Reaktion bereits bei Zimmertemperatur stattfindet und daß die Abtrennung des gebildeten Peptids aus dem Reaktionsgemisch außerordentlich einfach ist. Man braucht nämlich lediglich den flüchtigen Essigester abzudestillieren, um das Peptid in reiner Form zu erhalten. Die Peptidausbeuten sind hierbei gut. Ein besonderer Vorteil des Verfahrens besteht darin, daß die Oxygruppen der Oxyaminosäuren Tyrosin, Serin und Threonin, nicht geschützt zu werden brauchen.

Vorzugsweise verwendet man einen Acetylenäther, der von einem aliphatischen Alkohol mit niedrigem Molekulargewicht, beispielsweise Methanol, Äthanol, Propanol, Isopropanol, einem Butanol oder Amylalkohol, abstammt. Insbesondere verwendet man Methoxyacetylen, das am flüchtigsten ist (Kp. 22°).

Man führt die Reaktion vorzugsweise zwischen etwa 20 und 60° durch. Als Ausgangsstoffe eignen sich besonders die Aminosäuren oder Peptide, bei denen die Aminogruppe durch die Carbobenzyloxy-Gruppe geschützt ist. Im allgemeinen können nämlich diese Carbobenzyloxy-\^Aerbindungen leicht gebildet werden, und dazu kann die Carbobenzyloxy-Gruppe auf verschiedene Weise, z. B. durch Reduktion, durch Behandlung mit Bromwasserstoff in Eisessig, mit Natrium in flüssigem Ammoniak oder mit Phosphonium] odid, abgespalten werden.

Zum zeitweiligen Blockieren der NH₃-Gruppe eignen sich jedoch auch Acylgruppen, insbesondere die leicht abspaltbaren Acylgruppen, die Wi el and in seiner Über-

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sieht erwähnt, die Sulfonylgruppe, die Phthaloylgruppe glycinäthylester, p-Tolylsulfonyl-L-isoleucin und L-AIa-

und außerdem die Benzylgruppe und die. Triphenyl- ninmethylester, Dibenzylglycin und DL-Serinäthylester,

methylgruppe. N-Carbobenzyloxy-glycüi und Glycinäthylester, N-Carbo-

Die Carboxylgruppe der zweiten Reaktionskomponente benzyloxy-glycin und L-Phenylalanin-benzylester, N-Car-

blockiert man vorzugsweise durch Veresterung mit einem 5 bobenzyloxy-L-nitroarginin (C₆H₅ · CH₀ ■ O ■ CO · NH ·

niedrigen aliphatischen Alkohol, beispielsweise Methanol, CH (CO₂H) · CH₂ · CH₂ ■ NH · C (: NH) · NH · NO₂)

Äthanol oder Butanol oder mit Benzylalkohol. Vor- und L-Alaninmethylester, N-Phthaloyl-L-alanin und

zugsweise verwendet man einen geringen Überschuß an L-ProlinbenzylesterjN-Trityl-DL-alaninundTryptophan-

Acetylenäther. Nach Beendigung der Reaktion kann man methylester.

die blockierte Aminogruppe und die blockierte Carboxyl- ίο Es hat sich ergeben, daß sich das Verfahren gemäß der

gruppe des gebildeten Peptids nach an sich bekannten Erfindung auch zur Darstellung höherer Peptide eignet.

Verfahren freisetzen. Für diesen Zweck spaltet man die N-schützende Gruppe

Als Beispiele von Reaktionskomponenten für diese aus dem sich ergebenden Produkt ab, wobei eine freie

Synthese mögen erwähnt werden: N-Carbobenzyloxy-L- NH₂-Gruppe entsteht, und diese wird wieder beispiels-

leucin und Glycinäthylester, N-Carbobenzyloxy-S-benzyl- 15 weise mit einer neuen N-Acylaminosäure in Gegenwart

cystein und Glycinmethylester, N-Carbobenzyloxy-L- eines Acetylenäthers gemäß dem folgenden Schema in

glutaminsäure-a-äthylester und S-Benzyl-L-cysteinyl- Reaktion gebracht:

R₁ R₂ R₃

R—NH-CH--C00H + H₂N-CH-CO-NH-CH-COOR₁ + HC = C-OR₅ >

R₁ R₂ R₃

R-NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-Ch-COOR₄ + H₃C-COOR₅

R bedeutet hier eine Gruppe, welche die NH₂-Gruppe beispielsweise eine Benzylgruppe durch katalytische Reblockiert, also z. B. eine Carbobenzyloxy-Acyl- oder SuI- duktion oder eine Methoxy- oder Äthoxygruppe durch fonylgruppe. R₁, R₂ und R₃ sind Seitenketten von Amino- 30 sorgfältig vorgenommene alkalische Hydrolyse, und das säuren und R₄ und R₅ beispielsweise eine Alkyl-, Aryl- sich ergebende Produkt mit einem neuen Aminosäureoder Aralkylgruppe. Es ist möglich, zuerst den an der bzw. Peptidester gemäß der folgenden Gleichung reagie-Carboxylgruppe gebundenen Rest (R₄) abzuspalten, also ren zu lassen:

R₁ R₂ R '

Ii r

R—NH-CH-CO—NH-CH-COOH + H₂N-CH-COOR₄ + HC = C-OR₅ >

R₁ R_s R₃

ί I !

R-NH-CH-CO-NH-CH-CO-Nh-CH-COOR₄ + H₃C-COOR₃

Bei den mit Hilfe von Acetylenäther durchgeführten Bei der Synthese von Peptiden, ausgehend von Di-

Peptidsynthesen findet keine Racemisierung der optisch 45 aminomonocarbonsäuren, verwendet man beispielsweise

aktiven Reaktionsteilnehmer statt. Dicarbobenzyloxyderivate derselben und verfährt weiter

Man führt das Verfahren gemäß der Erfindung vor- wie oben beschrieben.

zugsweise wie folgt durch: Man stellt ein inniges Gemisch Zur Darstellung von Cysteinpeptiden muß man auch

beispielsweise einer N-Carbobenzyloxy-monoaminornono- die SH-Gruppe des Cysteins schützen, was vorzugsweise

carbonsäure und eines Esters einer Monoaminomono- 50 mittels einer Benzylgruppe vorgenommen wird,

carbonsäure in äquimolekularen Mengen unter Verwen- Als Lösungsmittel, in welchem man die Synthese vor-

dung eines Lösungsmittels oder ohne ein solches her. Zu zugsweise durchführt, nimmt man Äthylacetat, in dem

diesem Zweck kann man ein indifferentes Lösungsmittel, sich viele N-Acyl- oder N-Carbobenzyloxyaminosäuren

wie Äther, Dichlormethan, Äthylacetat, Dioxan oder und derartige Peptide lösen.

Nitromethan, verwenden. Hierzu fügt man einen Über- 55 Darüber hinaus wurde festgestellt, daß man die Synschuß Acetylenäther, und zwar mindestens 1 Mol je thesen gemäß der Erfindung dadurch weitgehend ver-MoI N-Carbobenzyloxy-aminosäure. Die Reaktion findet einfachen kann, daß man von den Hydrochloriden von innerhalb kurzer Zeit unter spontaner Wärmeentwick- Aminosäure- oder Peptidestern als zweiten Reaktionslung statt oder wird durch Erhitzen in einem Wasserbad teilnehmer ausgeht. In diesem Fall löst man äquivalente eingeleitet. Man arbeitet auf, indem man ein Lösungs- 60 Mengen der Aminosäure oder des Peptids, bei denen der mittel zugibt, wäscht mit einer eiskalten Kaliumcarbonat- Stickstoff beispielsweise durch eine Carbobenzyloxylösung aus, um noch vorhandene N-Carbobenzyloxy- Gruppe blockiert worden ist, und des Aminosäure- oder aminosäure zu lösen, anschließend mit eiskalter 0,5 n- Peptidesterhydrochlorids in einem Alkohol, zu dem man Salzsäure, um noch vorhandene Aminosäureester zu ent- einen Überschuß Acetylenäther gibt, und erhitzt das Refernen, und schließlich mit Wasser. Nach dem Trocknen 65 aktionsgemisch 3 Stunden in einem geschlossenen Gefäß über wasserfreiem Natriumsulfat entfernt man das Lö- auf etwa 50 bis 80°. Man führt das Verfahren so durch, sungsmittel durch Verdampfen, wobei der Peptidester daß man den Überschuß an Acetylenäther im Vakuum auskristallisiert. Dieser wird entweder für eine weitere entfernt, ein wenig Lösungsmittel, beispielsweise Äthyl-Synthese gemäß dem oben beschriebenen Verfahren ver- acetat, zugibt und dann hintereinander jeweils zweimal wendet oder in das freie Peptid übergeführt. 70 mit Wasser, 1 η-Salzsäure, Wasser, Kaliumcarbonatlö-

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sung und Wasser wäscht. Schließlich trocknet man die gelbe Niederschlag wird abfiltriert und mit kalter Na-Lösung und verdampft sie, wobei der Peptidester aus- triumcarbonatlösung gerührt. Dann wird er mit Wasser kristallisiert. Dieses Verfahren bietet einen großen Vor- gewaschen und aus Alkohol umkristallisiert. Die Austeil, da es nun nicht notwendig ist, den freien Amino- beute beträgt 60%· F. 158 bis 159°. säure- oder Peptidester aus den Hydrochloriden darzu- 5 Beispiel 5 stellen, was zeitraubend wäre und zuweilen schwierig ist. ._ „_x/ __. _., , , „ ^_x Als Beispiele von Hydrochloriden von Aminosäure- oder ^N"(^N · ^N -BAenzylglycyl^DL-serin Peptidestern, die man als zweiten Reaktionsteilnehmer Man erhitzt eine Lösung äquimolekularer Mengen von verwenden kann, seien folgende erwähnt: Die Hydro- N, N-Dibenzylglycin und DL-Serinäthylester in Dimechloride von Glycinäthylester, Glycinmethylester, S-Ben- io thylformamid mit 1,5 Mol Methoxyacetylen 3 Stunden. zyl-L-cysteinyl-glycinäthylester, L-Alaninmethylester, Dann entfernt man das Lösungsmittel im Vakuum, löst D-Leucinmethylester, DL-Serinäthylester, L-Phenylala- den erhaltenen Rückstand in Äthanol und fügt alkohoninbenzylester, L-Alaninäthylester, L-Leucinäthylester, lisches Alkali zu der Lösung (1 Äquivalent je Mol Serin-L-Prolinbenzylester und Tryptophanmethylester. äthylester). Nach 10 Minuten dauerndem Kochen wird Vorzugsweise führt man die Reaktion durch, indem 15 das Gemisch im Vakuum verdampft und der Rückstand man in Essigsäureäthylester unter Rückfluß erhitzt. in Wasser aufgenommen, wonach man die Lösung fil-Beispiel 1 triert und mit Essigsäure ansäuert. Es fällt eine ölige -_T „ , , , _x , , , . -, , , Substanz aus, die man in Chloroform aufnimmt. Durch N-Carbobenzyloxy-L-leucyl-glycmathylester Ausziehen der Chloroformlösung mit heißer Salzsäure und

Äquimolekulare Mengen von Glycinäthylester und N- 20 nachfolgendes Abkühlen der sich ergebenden Lösung er-

Carbobenzyloxy-L-leucin vermischt man mit Methoxy- hält man einen kristallinen Niederschlag des Hydrochlo-

acetylen (1,3 Mol je Mol Glycinester). Man erhitzt das rids der gewünschten Substanz. Ausbeute beträgt 60%.

Gemisch 3 Stunden in einem Wasserbad von 50° unter F. 165° (Zersetzung).

Rückfluß. Es bildet sich eine homogene Lösung. Diese Beismel 6

wird abgekühlt, Äther wird zugegeben und das Gemisch 25 ^_x ^ . , ^_x , , , , ,

nacheinander mit eiskalter Kaliumcarbonatlösung, Was- N-Tntyl-DL-alanyl-tryptophanmethylester

ser, eiskalter 0,5 η-Salzsäure und Wasser gewaschen und Zu einem äquimolekularen Gemisch von N-Trityl-DL-

die Lösung über Natriumsulfat getrocknet. Man ver- alanin und Tryptophanmethylester fügt man eine äqui-

dampft den Äther langsam, wobei das Peptid auskristalli- molekulare Menge von Äthoxyacetylen. Nach kurzem

siert. Man saugt die Kristalle ab und wäscht sie mit etwas 3° Erhitzen des Gemisches auf 50° ist die Reaktion beendet,

eiskaltem Äther. F. des Peptidesters = 102 bis 104°. Das sich ergebende Peptid kristallisiert man aus Benzol

Ausbeute 95%. um. Die Ausbeute beträgt 80%. F. 211 bis 213°.

Beispiel 2 Beispiel 7

N-Carbobenzyloxy-S-benzyl-cystein-grycinäthylester „. N-Carbobenzyloxy-glycyl-l-phenylalaninbenzylester

Man löst ein Gemisch von N-Carbobenzyloxy-S-benzyl- Man erhitzt ein Gemisch von äquimolekularen Mengen cystein, Glycinäthylester und Äthoxyacetylen im Mol- von N-Carbobenzyloxy-glycin und L-Phenylalaninbenverhältnis 1:1:2 in Äthylacetat und erhitzt 3 Stunden zylester mit 1,3 Mol Methoxyacetylen und etwas Äthylauf 60°. Dann wäscht man das Reaktionsgemisch nach- acetat auf 60°. Nach 1 Stunde gibt man noch etwas einander mit 2 η-Salzsäure, Wasser, 2 n-Natriumcarbo- 40 Äthylacetat zu, kühlt das sich ergebende Gemisch und natlösung und nochmals mit Wasser. Das Gemisch track- wäscht es nacheinander mit Natriumcarbonatlösung, net man über Natriumsulfat und destilliert das Lösungs- Wasser, 1 η-Salzsäure und Wasser. Nach dem Trocknen mittel unter vermindertem Druck ab. Den Rückstand über Natriumsulfat wird die Lösung verdampft. Das sich kristallisiert man aus Äthylacetat-Petroläther um. Aus- ergebende Öl kristallisiert man aus Äthylacetat. Ausbeute 90%. F. des Peptids = 98°. («) f = —26,5° (in 45 beute an Kristallen beträgt 90%. F. 74°. Eisessig, e = 6). Beispiel 8

Beispiel 3 N-Phthaloyl-L-alanyl-L-prolinbenzylester

(N-Carbobenzyloxy-y-L-glutaminyD-S-Benzyl-L- Äquimolekulare Mengen von N-Phthalovl-L-alanin und

cystemyl-glycmdiäthylester (== N-Carbobenzyloxy- _{50 L}._{Prolinbenzylester we} ⁶ _rden 3 stunden auf dem Wasser-

S-benzyl-glutathiondiathylester) bad ,(Badtemperatur 50°) in etwas Methylenchlorid mit

Man erhitzt ein Gemisch äquimolekularer Mengen 1,5 Äquivalenten Methoxyacetylen erwärmt. Man ver-

S - Benzyl - L - cysteinyl - glycinäthylester und N-Carbo- dampft das Reaktionsgemisch im Vakuum. Den Rück-

benzyloxy-L-glutaminsäure-a-ätlrylester in einem großen stand nimmt man in Äthylacetat auf, wäscht mit ver-

überschuß von Methoxyacetylen unter Rückfluß. Nach 55 dünnter Natriumcarbonatlösung und dann mit verdünn-

2 Stunden kühlt man das Gemisch ab und verdünnt es ter Salzsäure. Die sich ergebende Lösung trocknet man

mit Äthylacetat. über Natriumsulfat und verdampft sie dann langsam.

Man wäscht es nacheinander mit 2 η-Salzsäure, Wasser, Die sich ergebenden Kristalle kristallisiert man aus Äthyleiner gesättigten Natriumbicarbonatlösung und wieder acetat-Petroläther um. F. 100 bis 102°. Ausbeute 90%. mit Wasser. Dann trocknet man die Lösung über Na- 60 Beispiel 9 triumsulfat und verdampft sie bis auf kleines Volumen. . Durch Zugabe von etwas Petroläther beschleunigt man N-Carbobenzyloxy-glycyl-glycmäthylester die Kristallisation des Tripeptide. Man kristallisiert es Man löst äquimolekulare Mengen N-Carbobenzyloxyaus verdünntem Alkohol um. Ausbeute 70%. F. 105°. glycin und Hydrochlorid von Glycinäthylester in Äthyl-Beisüiel4 ^6s ^ohol. Hierzu fügt man einen Überschuß an Methoxy- _,.,. ,_.,,,. ,, acetylen. Das Gemisch erhitzt man 3 Stunden in einem

p-Toluolsulfonyl-L-isoleucyl-glycmäthylester geschlossenen Gefäß auf 50°. In der Folge entfernt man

1,45 g p-Toluolsulfonyl-L-isoleucin (F. 135°), 2,2 g GIy- den Überschuß an Methoxyacetylen im Vakuum, gibt cinäthylester und 2 cm³ Methoxyacetylen werden unter etwas Äthylacetat zu dem Rückstand und wäscht das Rückfluß 5 Stunden mit 10 cm³ Äther gekocht. Der hell- 70 Gemisch nacheinander gründlich mit Wasser, 1 n-Salz-

säure (2mal), wieder mit Wasser (2mal), einer Lösung von Kaliumcarbonat (2mal) und schließlich wieder mit Wasser (2mal). Dann trocknet man das Gemisch über Natriumsulfat und verdampft es. Der N-Carbobenzyloxy-glycylglycinäthylester kristallisiert aus. F. 79 bis 80°.

Claims (9)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Peptiden, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Aminosäure oder ein Peptid mit einer freien Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit einer freien Aminogruppe mittels eines Acetylenäthers umsetzt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion zwischen etwa 50 und 80° durchführt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion in Äthylacetat durchführt.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man einen geringen Überschuß an Acetylenäther verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Methoxyacetylen als Kondensationsmittel verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man eine N-Carbobenzyloxyaminosäure oder ein N-Carbobenzyloxypeptid mit einem Aminosäure- oder einem Peptidester umsetzt.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Aminosäure oder ein Peptid mit einer freien Carboxylgruppe mit dem Hydrochlorid eines Aminosäure- oder eines Peptidesters umsetzt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion in dem Alkohol durchführt, von dem der Aminosäure- oder der Peptidester abstammt.

9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man eine N-Carbobenzyloxyaminosäure oder ein N-Carbobenzyloxypeptid mit dem Hydrochlorid eines Aminosäure- oder eines Peptidesters in alkoholischer Lösung umsetzt.

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