DE10032254A1 - Nukleotidsequenz kodierend für eine Benzaldehyd-Lyase und Verfahren zur stereoselektiven Synthese von 2-Hydroxyketonen - Google Patents

Nukleotidsequenz kodierend für eine Benzaldehyd-Lyase und Verfahren zur stereoselektiven Synthese von 2-Hydroxyketonen

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nukleotidsequenz, kodierend für eine Benzaldehyd-Lyase sowie deren Einsatz in einem Verfahren zur stereoselektiven Herstellung von 2-Hydroxyketongruppen enthaltenden Verbindungen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur stereoselektiven Synthese von 2-Hydroxyketonen unter Einsatz einer Benzaldehyd-Lyase.
Eine Thiaminpyrophosphat (TPP)-abhängige Benzaldehyd-Lyase sowie genetische Analysen des kodierenden Gens sind bei Vicung et al. (J. Bacteriol., 1989, 171: 2401-2405) und Hinrichsen, P. et al. (Gene, 1994, 144: 137-138) beschrieben. Eine nähere Charakterisierung des Enzyms zeigte, daß diese Benzaldehyd-Lyase ausschließlich eine irreversible Spaltungsaktivität aufweist. So entstehen beispielsweise ausgehend von Benzoin zwei Moleküle Benzaldehyd bzw. Anisoin wird zu zwei Molekülen Anisaldeyd gespalten. Eine Knüpfung von C-C-Verbindungen katalysiert durch eine Benzaldehyd-Lyase wird explizit ausgeschlossen.
Für eine enzymkatalysierte Synthese von 2-Hydroxyketonen kommen insbesondere Decarboxylasen oder Transketolasen in Betracht, die in der Regel ebenfalls eine Abhängigkeit zu Thiaminpyrophosphat (TPP) aufweisen.
Whitesides et al. (J. Org. Chem., 1992, 57: 5889-5907) und Turner et al. (Tetrahedron Asymmetry, 1996, 7: 2185-2188) beschreiben Transketolasen, welche die Spaltung eines 2-Hydroxyketons unter gleichzeitiger Bildung eines anderen 2-Hydroxyketons katalysieren. Wirtschaftliche Produktionsverfahren zur Herstellung von 2- Hydroxyketonen mit Hilfe von Transketolasen sind hier jedoch nicht beschrieben.
Ferner ist die enzymatische Synthese von 2-Hydroxyketonen in Gegenwart einer TPP-abhängigen Pyruvatdecarboxylase beschrieben (DE 195 23 269 und DE 197 36 104). Nachteilig bei den beschriebenen Verfahren ist jedoch, daß die Pyruvatdecarboxylase nur ein stark beschränktes Substratspektrum akzeptiert. Außerdem kann eine spontane Racemisierung der entstehenden Produkte bedingt durch eine auftretende Keto-Enol-Tautomerie mit der Folge einer erniedrigten Enantioselektivität erfolgen.
Wilcocks et al. (Biotech. Bioeng., 1992, 39: 1058-1063 und Appl. Env. Microbiol., 1992, 58: 1699-1704) beschreiben die Synthese von (S)-2-Hydroxy-1-phenyl­ propanon ((S)-2-HPP) mit Hilfe einer Thiaminpyrophosphat-abhängigen Benzoyl­ formiatdecarboxylase ausgehend von Benzoylformiat und Acetaldehyd. Allerdings entsteht auch hier das 2-Hydroxyketon nicht enantiomerenrein, sondern lediglich mit einem Enantiomerenüberschuß von 92%. Nachteilig ist außerdem die Bildung von Benzylalkohol als Nebenprodukt beim Einsatz ganzer Zellen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher, ein verbessertes enzymatisches Verfahren zur Herstellung von 2-Hydroxyketonen zur Verfügung zu stellen, das die zuvor genannten Nachteile nicht mehr aufweist.
Diese Aufgabe wird durch das erfindungsgemäße Verfahren zur stereoselektiven Herstellung von 2-Hydroxyketonen gelöst, wobei eine Benzaldehyd-Lyase eingesetzt wird, die in Anwesenheit wenigstens einer lösungsvermittelnden Verbindung die Umsetzung von zwei Aldehydgruppen enthaltenden Verbindungen, von denen wenigstens eine kein Acetaldehyd ist, oder von einer Aldehydgruppen enthaltenden Verbindung mit einer 2-Hydroxyketongruppen enthaltenden Verbindung unter Beibehaltung der stereochemischen Anordnung der letzteren zu einer weiteren 2- Hydroxyketongruppen enthaltenden Verbindung katalysiert.
In einer Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung zeichnet sich das zuvor genannte Verfahren dadurch aus, daß eine erste Aldehydruppen enthaltende Verbindung der allgemeinen Formel I
wobei R = eine Komponente aus der Gruppe aliphatischer, aromatischer oder heteroaromatischer Kohlenwasserstoffe ist, die in ortho-, meta- oder para-Stellung einfach oder mehrfach substituiert sein kann, wobei die Substituenten Alkyl-, Aryl- oder Aralkyl-Gruppen oder Heteroatome, wie z. B. Cl, F, Br oder S, P, N oder Kombinationen davon sein können und R ≠ -CH3 ist,
mit einer zweiten Verbindung der Formel I zu einer 2-Hydroxyketongruppen enthaltenden Verbindung der allgemeinen Formel II umgesetzt wird,
wobei R1 und R2 gleich oder verschieden sein können und R1 und R2 dieselbe Bedeutung haben wie R in Formel I.
Eine Auswahl an Beispielen für Verbindungen der Formel I und damit für Substrate der erfindungsgemäß eingesetzten Benzaldehyd-Lyase sind nachfolgend aufgeführt:
R = 2-F, 4-F, 2,4-F, 2-Br, 4-Br, 2-Cl, 4-Cl, 2-OCH3, 3-OCH3, 4-OCH3, 2-OH, 2-CH3
In einer bevorzugten Ausführungsvariante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als Verbindung der allgemeinen Formel I Benzaldehyd eingesetzt. Eine bevorzugte Verbindung der allgemeinen Formel II stellt das (R)-Benzoin dar.
In einer weiteren Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung ist die Synthese von zyklischen Verbindungen möglich. Beispielsweise können durch intramolekulare Umsetzungen zweier Aldehydgruppen erfindungsgemäß z. B. steroidale Hydroxyketone entstehen. Zur näheren Erläuterung dieser zyklischen Verbindungen dient nachfolgende allgemeine Formel, wobei R1 und R2 die gleiche Bedeutung haben, wie in Formel II bzw. Formel I.
Als ein Beispiel für eine bevorzugte Verbindung dient die nachfolgende Formel, die jedoch lediglich zur Erläuterung dient und sich nicht limitierend auf die Erfindung auswirkt.
Ferner umfaßt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bei dem Verbindungen der Formel II in Gegenwart von Aldehydgruppen enthaltenden Verbindungen der allgemeinen Formel III
wobei R3 = -CH3 oder eine Komponente aus der Gruppe aliphatischer, aromatischer oder heteroaromatischer Kohlenwasserstoffe ist, die in ortho-, meta- oder para- Stellung einfach oder mehrfach substituiert sein kann, wobei die Substituenten Alkyl-, Aryl- oder Aralkyl-Gruppen oder Heteroatome, wie z. B. Cl, F, Br oder S, P, N oder Kombinationen davon sein können,
zu Verbindungen der Formel IV weiter umgesetzt werden
wobei R3 ≠ R4 und R3 = R3 der Formel III und R4 = R der Formel I.
In einer bevorzugten Ausführungsvariante des vorliegenden Verfahrens wird als Verbindung der allgemeinen Formel III Acetaldehyd eingesetzt.
Eine bevorzugte Verbindung der allgemeinen Formel IV stellt (R)-2-Hydroxy-1- phenyl-propanon ((R)-2-HPP) dar.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung stellt das erfindungsgemäße Verfahren eine Kombination aus den beiden zuvor genannten Varianten dar, wobei in einem ersten Abschnitt die Umsetzung von zwei Aldehydgruppen enthaltenden Verbindungen zu einer 2-Hydroxyketongruppen enthaltenden Verbindung erfolgt und sobald letztere vorliegt, auch die weitere Umsetzung dieser 2-Hydroxyketone zu einer weiteren 2-Hydroxyketongruppen enthaltenen Verbindung erfolgt. Eine Zusammenfassung des Reaktionsablaufs ist nachfolgend schematisch dargestellt.
Ferner umfaßt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren, wobei ausgehend von einem racemischen Gemisch enthaltend Verbindungen der Formel II selektiv das Enantiomer der Formel II unter Beibehaltung der stereochemischen Anordnung zu einer Verbindung der Formel IV weiter umgesetzt wird. Zur Verdeutlichung ist diese Variante nachfolgend schematisiert dargestellt.
Hierbei soll die Anordnung der OH-Gruppe am α-C-Atom zur Ketogruppe über eine geschlängelte Linie das Vorliegen eines racemischen Gemisches einer 2- Hydroxyketongruppen enthaltenen Verbindung der Formel II darstellen. Hierbei kann es sich beispielsweise um ein racemisches Gemisch aus (S)- und (R)-Benzoin handeln.
Die vorliegende Erfindung zeichnet sich somit in vorteilhafter Weise dadurch aus, daß mit ein und demselben Katalysator sowohl eine hocheffiziente enantioselektive Herstellung von (R)-2-Hydroxyketonen möglich ist, als auch bei Vorliegen eines racemischen Gemisches von 2-Hydroxyketongruppen enthaltenden Verbindungen, z. B. der Formel II, eine hocheffiziente Trennung der beiden Enantiomere erfolgt. Beispielsweise kann durch das erfindungsgemäße Verfahren einerseits aus Benzaldehyd nahezu quantitativ (R)-Benzoin hergestellt werden und andererseits aus einem racemischen Gemisch von (S)- und (R)-Benzoin mit einer vergleichbar hohen Effizienz (S)-Benzoin und (R)-2-HPP gewonnen werden. Aufgrund des unterschiedlichen Löslichkeitsverhaltens der beiden zuletzt genannten 2- Hydroxyketongruppen enthaltenden Enantiomere ist eine quantitative Trennung der (S)- und (R)-Form des ursprünglich eingesetzten racemischen Gemisches möglich.
Eine weitere Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens zeichnet sich dadurch aus, daß eine Aldehydgruppen enthaltende Verbindung der allgemeinen Formel I als ein erstes Substrat mit einem Acetaldehyd oder substituierten Acetaldehyd als ein zweites Substrat über eine Verbindung der Formel II als Zwischenstufe zu einer Verbindung der Formel IV umgesetzt wird. Die nachfolgende schematische Darstellung soll dies noch einmal verdeutlichen.
Der Begriff der Stereoselektivität bzw. Enantioselektivität im Sinne der vorliegenden Erfindung ist nachfolgend genauer erläutert. Generell ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren die stereoselektive Herstellung von 2- Hydroxyketongruppen enthaltenden Verbindungen. Von den beiden möglichen Stereoisomeren (Enantiomeren) der gebildeten 2-Hydroxyketone, d. h. von dem (S)- oder (R)-Enantiomer, wird erfindungsgemäß aufgrund der eingesetzten Benzaldehyd-Lyase ausschließlich das (R)-Enantiomer gebildet, d. h. mit einer Enantioselektivität von nahezu 100%. Dieses gebildete (R)-Enatiomer kann dann in einem weiteren Schritt des erfindungsgemäßen Verfahrens als ein weiteres Substrat der Benzaldehyd-Lyase fungieren und zu einer weiteren (R)-2-Hydroxyketongruppen enthaltenden Verbindung umgesetzt werden.
Dabei ist unter einem (R)-Enantiomer erfindungsgemäß eine Verbindung zu verstehen, bei der die OH-Gruppe am α-C-Atom zur Ketogruppe aus der Papierebene hervortritt, während die Kohlenstoffatome des Carbonyl-Grundgerüsts und die Reste R1 und R2 (in Formel II) bzw. R3 und R4 (in Formel IV) in der Papierebene liegen. Diese erfindungsgemäße Definition eines (R)-Enationmers erfolgt dabei ohne Berücksichtigung der Priorität der Reste R1/R2 bzw. R3/R4, sondern ausschließlich in Abhängigkeit von der Positionierung der Hydroxylgruppe am α-C-Atom zur Ketogruppe. Folglich ist es möglich, daß die erfindungsgemäße (R)-Konfiguration nicht mit der gängigen Nomenklatur der stereoisomeren Verbindungen identisch ist.
Das zuvor gesagte ist im folgenden beispielhaft an einer Verbindung der Formel II erläutert:
Laut gängiger Nomenklatur handelt es sich um die Verbindung (S)-2-Hydroxy-1- phenyl-2-thiophen-2-yl-ethanon. Erfindungsgemäß liegt hier jedoch das (R)- Enantiomer vor, da die OH-Gruppe aus der Papierebene herausragt, während die beiden Kohlenstoffatome der Ketongruppe und die Reste R1 und R2 in der Papierebene liegen.
Unter dem Begriff "Beibehaltung der stereochemischen Anordnung" ist erfindungsgemäß zu verstehen, daß die Konfiguration der OH-Gruppe am α-C-Atom zur Ketogruppe unverändert aus der enzymkatalysierten Reaktion hervorgeht, also erhalten bleibt.
Überraschender Weise verläuft das Enzym-katalysierte erfindungsgemäße Verfahren unter Einsatz einer lösungsvermittelnden Verbindung ausgehend von Aldehydgruppen enthaltenden Verbindungen der Formel I nahezu quantitativ in Richtung einer 2-Hydroxyketongruppen enthaltenden Verbindung der Formel II. Das zuvor Gesagte betrifft auch die Verfahrensvariante, bei der die in einem ersten Verfahrensabschnitt synthetisierten Verbindungen der Formel II weiter zu Verbindungen der Formel IV umgesetzt werden.
Erfindungsgemäß werden in einem der zuvor genannten erfindungsgemäßen Verfahren dem Reaktionsansatz oder dem Kulturmedium wenigstens 0,5-40%, bevorzugt 5-20%, besonders bevorzugt 7-12% und höchst bevorzugt 10% wenigstens einer lösungsvermittelnden Verbindung zugesetzt. Hierbei kann erfindungsgemäß als lösungsvermittelnde Verbindung ein mit Wasser mischbares und/oder wasserlösliches organisches Lösungsmittel und/oder eine lösungsmittelfreie Verbindung zugesetzt werden. Beispielhaft für mit Wasser mischbare und/oder wasserlösliche organische Lösungsmittel sind hier Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylformamid oder Ethanol zu nennen. Als ein Beispiel für eine erfindungsgemäß einsetzbare lösungsmittelfreie Verbindung sind Cyclodextrine, beispielsweise β-Cyclodextrine (Cycloheptaamylose) zu nennen.
Ferner zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren dadurch aus, daß ein Enantiomerenüberschuß (ee) an Verbindung der Formel II im Bereich von ≧ 96%, bevorzugt von ≧ 97% besonders bevorzugt von ≧ 99% und insbesondere von 99,9% vorliegt.
Erfindungsgemäß ist das vorliegende Verfahren ferner dadurch gekennzeichnet, daß eine Enantiomerenüberschuß (ee) an Verbindung der Formel IV von wenigstens 50 bis 60%, bevorzugt 60 bis 90%, besonders bevorzugt von 92 bis 97% und höchst bevorzugt 97 bis ≧ 99,9% erreicht wird.
Der Enantiomerenüberschuß (ee) ist das Maß für die Selektivität eines stereospezifischen Herstellungsverfahrens und kann durch folgende Formel dargestellt werden: ee = Betrag (%S - %R) = (S - R)/(S + R). Hierunter ist der Betrag der Differenz der prozentualen Ausbeuten der beiden vorkommenden Isomere ((S)- und (R)-Enantiomer) im Produkt zu verstehen. Liegt z. B. das eine Isomer zu 20% vor und das andere Isomer zu 80%, so ergibt sich ein Enantiomerenüberschuß von 60%.
In einer weiteren Variante der vorliegenden Erfindung zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren dadurch aus, daß es in einer sogenannten "fed-batch" oder auch in kontinuierlicher Reaktionsführung durchgeführt wird. Geeignete Vorrichtungen hierzu sind zahlreich aus der Literatur bekannt. Beispielsweise eignet sich als Reaktionsbehälter ein klassischer Rührkessel (Fermenter), welcher mit einem geeigneten Medium zur Kultivierung von Zellen enthaltend eine erfindungsgemäße Benzaldehyd-Lyase beschickt ist. Durch den kontinuierlichen Zufluß von Aldehydgruppen enthaltenden Verbindungen der allgemeinen Formel I und gegebenenfalls kontinuierlicher oder diskontinuierlicher Zudosierung einer lösungvermittelnden Verbindung kann das enzymatisch synthetisierte, stereospezifische Produkt einer (R)-2-Hydroxyketongruppen enthaltenden Verbindung kontinuierlich hergestellt und aus dem Fermenter abgeführt werden.
In einer weiteren Verfahrensvariante der vorliegenden Erfindung erfolgt die Synthese von 2-Hxdroxyketongruppen enthaltenden Verbindungen in einem Enzym-Membran- Reaktor, wie er beispielsweise bei Kula et al. (J. Biotechnol., 1981, 23: 2789-2802) beschrieben ist.
Erfindungsgemäß können Produktausbeuten im Bereich von 96-100%, bevorzugt von 97%, besonders bevorzugt von 99% und insbesondere von mehr als 99% erreicht werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Verfahren, das sich dadurch auszeichnet, daß eine Benzaldehyd-Lyse oder ein biologisch aktiver Teil davon kodiert durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 oder ein Allel, Homolog oder Derivat dieser Nukleotidsequenz oder eine mit dieser hybridisierende Nukleotidsequenz eingesetzt wird. Die vorliegende Erfindung umfaßt dabei auch ein Verfahren, bei dem eine Benzaldehyd-Lyase mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2 oder ein biologisch aktiver Teil davon, eine modifizierte Form, Isoenzyme oder Mischungen davon eingesetzt werden.
Unter Allelen sind erfindungsgemäß funktionell äquivalente, d. h. im wesentlichen gleichwirkende Nukleotidsequenzen zu verstehen. Funktionell äquivalente Sequenzen sind solche Sequenzen, welche trotz abweichender Nukleotidsequenz, beispielsweise durch die Degeneriertheit des genetischen Codes noch die gewünschten Funktionen besitzen. Funktionelle. Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z. B. durch chemische Synthese erhaltene und gegebenenfalls an den Kodon-Gebrauch des Wirtsorganismus angepaßte Nukleotid-Sequenzen. Darüber hinaus umfassen funktionell äquivalente Sequenzen solche, die eine veränderte Nukleotidsequenz aufweisen, welche dem Enzym beispielsweise eine Desensitivität oder Resistenz gegenüber Inhibitoren verleiht. Funktionelle Äquivalente (Allele) sind auch solche Varianten, deren Funktion, verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Genfragment, abgeschwächt oder verstärkt ist.
Unter einem Allel versteht man insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten Sequenz, welche weiterhin die gewünschte Funktion zeigen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Inbegriffen sind hier auch sogenannte Sinnmutationen (sense mutations), die auf Proteinebene beispielsweise zum Austausch konservierter Aminosäuren führen können, welche aber zu keiner grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Proteins führen und somit funktionsneutral sind. Dies beinhaltet auch Veränderungen der Nukleotidsequenz, die auf Proteinebene den N- oder C-Terminus eines Proteins betreffen, ohne jedoch die Funktion des Proteins wesentlich zu beeinträchtigen. Diese Veränderungen können sogar stabilisierenden Einfluß auf die Proteinstruktur ausüben. Inbegriffen sind ferner Veränderungen, die beispielsweise eine spätere Proteinaufreinigung erleichtern, wie z. B. ein sogenannter aus mehreren aufeinander folgenden Histidin-Resten bestehender "His-tag".
Ferner werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfaßt, welche man durch Modifikation der Nukleotidsequenz, resultierend in entsprechenden Derivaten, erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z. B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen kodierenden Sequenz oder auch die Einfügung weiterer Erkennungsschnittstellen für Restriktionsenzyme oder der Einbau seltener Nukleotide sein.
Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen Gegenstand der vorliegenden Erfindung, solange sie, wie oben beschrieben, die gewünschten Eigenschaften vermitteln.
Solche artifiziellen DNA-Sequenzen können beispielsweise durch Rückübersetzung von mittels computergestützten Programmen (molecular modelling) erstellten Proteinen oder durch in-vitro-Selektion ermittelt werden. Besonders geeignet sind kodierende DNA-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für den Wirtsorganismus spezifischen Kodon-Nutzung erhalten wurden. Die spezifische Kodon-Nutzung kann ein mit molekulargenetischen Methoden vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer, bereits bekannter Gene des zu transformierenden Organismus leicht ermitteln.
Unter homologen Sequenzen sind erfindungsgemäß solche zu verstehen, die zu den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen komplementär sind und/oder mit diesen hybridisieren. Der Begriff hybridisierende Sequenzen schließt erfindungsgemäß substanziell ähnliche Nukleotidsequenzen aus der Gruppe von DNA oder RNA ein, die unter an sich bekannten stringenten Bedingungen eine spezifische Wechselwirkung (Bindung) mit den zuvor genannten Nukleotidsequenzen eingehen. Hierzu zählen auch kurze Nukleotidsequenzen mit einer Länge von beispielsweise 10 bis 30, bevorzugt 12 bis 15 Nukleotiden. Dies umfaßt erfindungsgemäß u. a. auch sogenannte "Primer" oder Sonden.
Erfindungsgemäß sind auch die den kodierenden Bereichen (Strukturgenen) vorausgehenden (5'- oder upstream) und/oder nachfolgenden (3'- oder downstream) Sequenzbereiche eingeschlossen. Insbesondere sind hierin Sequenzbereiche mit regulatorischer Funktion inbegriffen. Sie können die Transkription, die RNA-Stabilität oder das RNA processing sowie die Translation beeinflussen. Beispiele für regulatorische Sequenzen sind u. a. Promotoren, Enhancer, Operatoren, Terminatoren oder Translationsverstärker.
Unter einem biologisch aktiven Teil des erfindungsgemäßen Enzyms ist erfindungsgemäß jede Polypeptidsequenz zu verstehen, die über die erfindungswesentliche und spezifische Enzymaktivität zur Knüpfung von C-C- Verbindungen verfügt. Die Länge eines biologisch aktiven Teils einer erfindungsgemäßen Benzaldehyd-Lyase kann zum Beispiel im Bereich von 560 ± 10 Aminosäurereste bis 560 ± 250 Aminosäurereste, bevorzugt von 560 ± 50 bis 560 ± 100 und besonders bevorzugt von 560 ± 25 bis 560 ± 50 Aminosäurereste variieren.
Dabei entspricht die "Basiszahl" von 560 Aminosäureresten erfindungsgemäß einer Polypeptidsequenz einer Benzaldehyd-Lyase gemäß SEQ ID NO. 2 kodiert durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO. 1. Folglich kann die "Basiszahl" des Polypeptids in Abhängigkeit von der sie kodierenden Nukleotidsequenz ebenfalls variieren.
Unter modifizierten Formen sind erfindungsgemäß Enzyme zu verstehen, bei denen Änderungen in der Sequenz, beispielsweise am N- und/oder C-Teminus des Polypeptids oder im Bereich konservierter Aminosäuren vorliegen, ohne jedoch die Funktion des Enzyms zu beeinträchtigen. Diese Veränderungen können durch den Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren nach an sich bekannten Methoden vorgenommen werden.
Eine besondere Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung umfaßt Varianten der erfindungsgemäßen Polypeptide, deren Aktivität und/oder Spezifität beispielsweise durch Aminosäureaustausch, verglichen mit dem jeweiligen Ausgangsprotein, abgeschwächt oder verstärkt ist. Gleiches gilt für die Stabilität der erfindungsgemäßen Enzyme in den Zellen, die beispielsweise gegenüber dem Abbau durch Proteasen verstärkt oder vermindert anfällig sind.
Ferner sind Polypeptide mit der Funktion einer Benzaldehyd-Lyase Gegenstand der vorliegenden Erfindung, die in ihrer Aminosäuresequenz derart verändert sind, daß sie gegenüber regulatorisch wirkenden Verbindungen, beispielsweise Endprodukte des Stoffwechselweges, desensitiv sind (feedback-desensitiv).
Unter Isoformen sind Enzyme mit gleicher oder vergleichbarer Substrat- und Wirkungsspezifität zu verstehen, die jedoch eine unterschiedliche Primärstruktur aufweisen.
Erfindungsgemäß werden in dem vorliegenden Verfahren eine isolierte Benzaldehyd- Lyase der zuvor beschriebenen Art oder Zellextrakte oder ganze Zellen enthaltend eine Benzaldehyd-Lyase eingesetzt.
Erfindungsgemäß kann eine isolierte Benzaldehyd-Lyase und/oder Zellextrakt enthaltend eine erfindungsgemäße Benzaldehyd-Lyase z. B. in einem Enzym- Membran-Reaktor zum Einsatz kommen. Darüber hinaus sind auch andere in-vitro Systeme zur erfindungsgemäß stereoselektiven Herstellung von 2- Hydroxyketongruppen enthaltenden Verbindungen umfaßt.
Als geeignete Systeme für den Einsatz von ganzen Zellen enthaltend eine erfindungsgemäße Benzaldehyd-Lyase sind an dieser Stelle beispielhaft gängige Kultivierungsverfahren im batch-Betrieb, fed-batch-Betrieb oder kontinuierliche Fermentationen zu nennen.
Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich ferner dadurch aus, daß eine Benzaldehyd-Lyase aus Mikroorganismen, bevorzugt der Gattung Pseudomonas oder Acinetobacter eingesetzt wird. Bevorzugt wird eine Benzaldehyd-Lyase aus Pseudomonas fluorescens und insbesondere aus Pseudomonas fluorescens Biovar I eingesetzt. Hierbei umfaßt die vorliegende Erfindung auch eine Benzaldehyd-Lyase aus sogenannten Produktionsstämmen. Diese können entweder auf natürliche oder künstliche Weise erhalten werden. Letztere schließt klassische Mutageneseverfahren oder beispielsweise gentechnische Methoden ein.
Ebenfalls sind die 2-Hydroxyketongruppen enthaltenden Verbindungen (kurz: 2- Hydroxyketone), hergestellt nach einem Verfahren der zuvor beschriebenen Art, Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die vorliegende Erfindung umfaßt ferner eine Benzaldehyd-Lyase zum Einsatz in ein zuvor genanntes Verfahren, kodiert durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO. 1 oder ein Allel, Homolog oder Derivat dieser Nukleotidsequenz oder eine mit dieser hybridisierende Nukleotidsequenz. Dies schließt ebenfalls eine Benzaldehyd- Lyase mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2 oder ein biologisch aktiver Teil oder eine modifizierte Form davon oder Isoenzyme oder Mischungen daraus ein.
Die erfindungsgemäße Benzaldehyd-Lyase kann aus Mikroorganismen, bevorzugt der Gattung Pseudomonas oder Acinetobacter isoliert werden. Bevorzugt handelt es sich erfindungsgemäß um eine Benzaldehyd-Lyase isoliert aus der Spezies Pseudomonas fluorescens, besonders bevorzugt der Art Pseudomonas fluorescens Biovar I. Diese Ausführungen sind exemplarisch, jedoch keinesfalls limitierend für die vorliegende Erfindung. Ebenso sind durch die vorliegende Erfindung sogenannte Produktionsstämme für die Isolierung einer entsprechenden Benzaldehyd-Lyase umfaßt. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner eine Nukleotidsequenz kodierend für eine Benzaldehyd-Lyase isoliert aus Organismen der zuvor beschriebenen Art.
Unter einer Nukleotidsequenz oder einem Nukleinsäurefragment ist erfindungsgemäß ein Polymer aus RNA oder DNA zu verstehen, das einzel- oder doppelsträngig sein kann und optional natürliche, chemisch synthetisierte, modifizierte oder artifizielle Nukleotide enthalten kann. Der Begriff DNA-Polymer schließt hierbei auch genomische DNA, cDNA oder Mischungen davon ein.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner eine Genstruktur enthaltend eine zuvor beschriebene Nukleotidsequenz kodierend für eine erfindungsgemäße Benzaldehyd-Lyase sowie mit dieser operativ verknüpfte regulatorische Sequenzen, welche die Expression der kodierenden Sequenzen in der Wirtszelle steuern.
Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung beispielsweise von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulatorischer Elemente derart, daß jedes der regulatorischen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Diese regulatorischen Nukleotidsequenzen können natürlichen Ursprungs sein oder durch chemische Synthese erhalten werden. Als Promotor ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Genexpression in dem entsprechenden Wirtsorganismus steuern kann. Hierbei kann es sich erfindungsgemäß auch um einen chemisch induzierbaren Promotor handeln, durch den die Expression der ihm unterliegenden Gene in der Wirtszelle zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Beispielhaft sei hier ein durch IPTG (Isopropyl-β-thiogalactosid) induzierbarer Promotor genannt.
Die Herstellung einer Genstruktur erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit wenigstens einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratury, Cold Spring Harbor, NY (1994) beschrieben sind.
Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung einen Vektor enthaltend eine Nukleotidsequenz der zuvor beschriebenen Art kodierend für eine Benzaldehyd- Lyase, mit diesen operativ verknüpfte regulative Nukleotidsequenzen sowie zusätzliche Nukleotidsequenzen zur Selektion transformierter Wirtszeilen, für die Replikation innerhalb der Wirtszelle oder zur Integration in das entsprechende Wirtszell-Genom. Ferner kann der erfindungsgemäße Vektor eine Genstruktur der vorgenannten Art enthalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner einen transformierten ein- oder mehrzelligen Organismus zum Einsatz in ein Verfahren der zuvor genannten Art, welcher eine Benzaldehyd-Lyase und/oder eine Nukleotidsequenz der zuvor genannten Art enthält.
Die Übertragung von Nukleinsäuresequenzen in eine Wirtszelle erfolgt nach gängigen gentechnischen Methoden. Als bevorzugtes Verfahren sei hier die Transformation und besonders bevorzugt die Übertragung von DNA durch Elektroporation genannt.
Erfindungsgemäß zeichnet sich dieser transformierte ein- oder mehrzellige Organismus dadurch aus, daß er ein Mikroorganismus, eine Hefe, ein Pilz, eine tierische oder eine pflanzliche Zelle ist. Bevorzugt gehört der erfindungsgemäß transformierte Organismus zu der Gruppe der Enterobacterien. Besonders bevorzugt handelt es sich um einen transformierten Organismus der Art Escherichia coli. In der vorliegenden Erfindung inbegriffen sind ferner auch sogenannte Produktionsstämme, die sich zur Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen eignen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner die Verwendung der erfindungsgemäßen 2-Hydroxyketongruppen enthaltenden Verbindungen zur Herstellung von Verbindungen mit antiviraler und/oder antifungaler Wirkung und/oder mit der Wirkung von Enzyminhibitoren, die in Bereichen der Pharmazie und/oder Medizin, beispielsweise zur Behandlung von Immunkrankheiten (AIDS) oder neurodegenerativen Erkrankungen (Epilepsie), eingesetzt werden können.
Hierbei kann es sich beispielsweise um (chirale) Vorstufen oder Bestandteile von Antibiotika, wie z. B. Chloramphenicol handeln. Als Beispiele für Verbindungen mit antifungaler Wirkung seien hier z. B. Genaconazole genannt (Gala D. et al., 1996, Tetrahedron Letters, 37 (5): 611-614 oder Leuenberger H. G. W. et al., 1999, Chimia, 53: 536-540). Diese Aufzählungen sind nur zur Erläuterung der Verwendung der erfindungsgemäß hergestellten 2-Hxdroxyketone zu verstehen, die sich jedoch keinesfalls limitierend auf die vorliegende Erfindung auswirkt.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Ausführungsbeispiele näher charakterisiert, die jedoch nicht limitierend sind.
Allgemeine genetische Methoden
Die Isolierung von gemomischer DNA und Plasmid-DNA sowie alle Techniken zur Restriktion, Klenow- und alkalische Phosphatasebehandlung, ferner Methoden zur Klonierung und Sequenzierung von DNA sowie die Transformation, Kultivierung und Selektion von Wirtszellen wurden nach T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratury, Cold Spring Harbor, NY (1994)) durchgeführt.
Proteinexoression und Reinigung
Die Isolierung des für die Benzaldehyd-Lyase kodierenden Gens erfolgte nach bekannten Methoden aus Pseudomonas fluorescens. Anschließend wurde das für die Benzaldehyd-Lyase kodierende Gen in den induzierbaren Vektor pKK322-2 (Pharmacia Biotech) kloniert und an seinem 3-Ende mit sechs für Histidin kodierenden Tripletts versehen.
Der resultierende Vektor pkk322-2::BAL-His wurde dann in den E. coli Stamm SG13009prep4 (Quiagen, Hilden) transformiert. Die transformierten Zellen wurden in LB-Medium in Gegenwart von Ampicillin (100 mg/ml) bei 37°C vermehrt. Die Induktion der Proteinexpression erfolgt bei einer erreichten optischen Dichte der Zellen von OD600 = 0.7 mit 1 mM Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG). Die Zellernte wurde nach weiteren 16 h mittels Zentrifugation durchgeführt. Der Zellaufschluss erfolgte je nach Maßstab des Kulturansatzes mechanisch mit Glasperlen oder in einer Kugelmühle. Der erhaltene Zell-Rohextrakt wurde durch Zentrifugation und anschließende Filtration von Zelitrümmern befreit und auf eine Nickelchelatchromatographiesäule (bevorzugt: Ni-NTA-Agarose; Qiagen, Hilden) aufgegeben. Die Säule wurde zuvor mit 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7.0, equilibriert. Durch Waschen mit dem Equilibrierungspuffer werden nichtbindende Bestandteile ausgespült. Anschließend wurde derselbe Puffer mit einem Zusatz von 50 mM Imidazol verwendet, um schwach gebundene Proteine zu eluieren. Die Benzaldehyd-Lyase mit ihrem Histidin-Ende (BAL-His) eluiert selektiv in Gegenwart von 200 mM Imidazol. Die gesammelten Proteinfraktionen wurden anschließend durch eine Gelfiltration in 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 6.5, mit 1 mM MgSO4 und 0.01 mM Thiaminpyrophosphat (TPP) umgepuffert. Abschließend erfolgte eine Lyophilisation der Benzaldehyd-Lyase und Lagerung bei -20°C.
Synthese von (R)-Benzoin ausgehend von Benzaldehyd
318 mg (3 mM) Benzaldehyd werden in einer Mischung von 20 ml DMSO und 100 ml Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,0) enthaltend 2,5 mM MgSO4 und 0,15 mM TPP gelöst. Durch Zugabe von 1 mg (20 U) Benzaldehyd-Lyase wird die Umsetzung gestartet und der Reaktionsansatz für 48 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend werden nochmals 1 mg (20 U) Benzaldehyd-Lyase zugegeben. Die Beobachtung des Reaktionsverlaufs erfolgt mittels kombinierter Gaschromatographie/ Massenspektroskopie (GC-MS) oder Hochdruckflüssigkeits­ chromatographie (HPLC). Nach 62 Stunden wird eine 97%ige Umsetzung zu (R)- Benzoin erreicht. Der Reaktionsansatz wird mit 250 ml Dichlormethan extrahiert, die organische Phase mit 25 ml dest. Wasser und 25 ml gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und über Na2SO4 getrocknet. Anschließend wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Durch ein Umkristallisieren des Rohprodukts werden 305 mg (96%) (R)-Benzoin erhalten (Schmelzpunkt 134°C). Der Enantiomerenüberschuß liegt bei einem Wert von ee < 99%.
[α] 2|D2 = -115 (c = 1.5, CH3COCH3). HPLC (Chiralpac AD, iso-Hexan/iso-Propanol 90 : 10; 0.75 ml/min. 20°C, 21 bar) Rt: 26.95 min.
Werden unter vergleichbaren Bedingungen dem Reaktionsansatz statt 20 ml nur 10 ml DMSO zugesetzt, fällt ein Teil des Produkts (R)-Benzoin kristallin aus und kann durch Filtration separiert werden.
Gewinnung von (S)-Benzoin und (R)-2-HPP ausgehend von einem racemischen Benzoin-Gemisch
414 mg (2 mM) eines racemischen Benzoin-Gemisches werden in einer Mischung von 20 ml DMSO und 100 ml Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,0) enthaltend 2,5 mM MgSO4 und 0,15 mM TPP gelöst. Diesem Ansatz werden 88 mg (2 mM) Acetaldehyd zugesetzt. Durch Zugabe von 1 mg (20 U) Benzaldehyd-Lyase wird die Reaktion gestartet und bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 24 Stunden werden nochmals 1 mg (20 U) Benzaldehyd-Lyase und weitere 176 mg (4 mM) Acetaldehyd zugefügt. Die Beobachtung des Reaktionsverlaufs erfolgt mittels kombinierter Gaschromatographie/ Massenspektroskopie (GC-MS) oder Hochdruckflüssigkeits­ chromatographie (HPLC). Diese Vorgehensweise wird alle 24 Stunden wiederholt bis das vorhandene (R)-Benzoin vollständig umgesetzt ist. HPLC-Analysen ergeben, daß nach 4 Tagen ausschließlich die Produkte (S)-Benzoin und (R)-2-HPP in der Lösung vorliegen. Der Reaktionsansatz wird mit 250 ml Dichlormethan extrahiert, die organische Phase mit 25 ml dest. Wasser und 25 ml gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und über Na2SO4 getrocknet. Anschließend wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Die Aufreinigung des Rohprodukts erfolgt mittels Säulenchromatographie an Kieselgel (CH2Cl2). Es resultieren 279 mg (93%) (R)-2- HPP, wobei der Enantiomerenüberschuß ee < 99% beträgt ([α] 2|D2 = -123 (c = 2, CHCl3)) und 201 mg (95%) (S)-Benzoin, mit einem Wert für den Enantiomerenüberschuß von ebenfalls < 99% ([α] 2|D2 = 114 (c = 1.5, CH3COCH3); (Schmelzpunkt = 134°C).
(R)-2-HPP
1H NMR (300 MHz, CDCl3, 20°C): δ = 1.47 (d, 3H, 3J(H,H) = 7.0 Hz; CH3), 3.81 (br, 1H; OH), 5.19 (q, 1H, 3J(H,H) = 7.0 Hz; CHOH), 7.52 ("t", 2H, 3J(H,H) = 7.5 Hz; ar-H), 7.64 (tt, 1H, 3J(H,H) = 7.5 Hz, 4J(H,H) = 1.3 Hz; ar-H), 7.95 (dd, 2H, 3J(H,H) = 7.5 Hz, 4J(H,H) = 1.3 Hz; ar-H); 13C NMR (75.5 MHz, CDCl3, 20°C): δ = 22.74 (CH3), 69.73 (CHOH), 129.09, 129.31 (CH), 133.71 (Cq), 134.44 (CH), 202.82 (CO); GCMS: Rt = 7.70 min; m/z (%) = 150 (0.2) [M+], 135 (1.3) [M+-CH3], 105 (100) [C7H5O+], 77 (57) [C6H5 +], 51 (17) [C5H3 +]; HPLC: (Chiralpac AD, iso-Hexan/iso- Propanol 90 : 10; 0.75 ml/min, 20°C, 21 bar) Rt: 15.78 min.
(S)-Benzoin
1H-NMR (300 MHz, CDCl3, 20°C, TMS): δ = 4.56 (br, 1H; OH), 5.95 (s, 1H; CHOH), 7.5 (m, 6H; ar-H), 7.9 (m, 4H; ar-H); GCMS: Rt = 11.29 min; m/z (%) = 212 (0.5) [M+], 105 (100) [C7H5O+], 77 (40) [C6H5 +], 51 (9.8) [C4H3 +]; HPLC(Chiralpac AD, iso-Hexan/iso-Propanol 90 : 10; 0.75 ml/min, 20°C, 21 bar) Rt: 33.36 min.
Synthese von (R)-2-HPP ausgehend von Benzaldehyd
318 mg (3 mM) Benzaldehyd werden in einer Mischung von 20 ml DMSO und 100 ml Kaliumphosphatpuffer (50 mM, pH 7,0) enthaltend 2,5 mM MgSO4 und 0,15 mM TPP gelöst. Durch Zugabe von 1 mg (20 U) Benzaldehyd-Lyase wird die Umsetzung gestartet und bei Raumtemperatur inkubiert. Diesem Reaktionsansatz werden 88 mg (2 mM) Acetaldehyd zugegeben. Nach Zugabe von weiteren 1 mg (20 U) Benzaldehyd-Lyase wird der Reaktionsansatz weiter bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 24 Stunden werden weitere 1 mg Benzaldehyd-Lyase und 88 mg Acetaldehyd zugegeben. Die Beobachtung des Reaktionsverlaufs erfolgt mittels kombinierter Gaschromatographie/ Massenspektroskopie (GC-MS) oder Hochdruckflüssigkeits­ chromatographie (HPLC). Diese Vorgehensweise wird alle 24 Stunden wiederholt, bis das vorhandene (R)-Benzoin vollständig umgesetzt ist. HPLC-Analysen ergeben, daß nach insgesamt 62 Stunden ausschließlich das Produkt (R)-2-HPP vorliegt, wobei eine 97%ige Umsetzung erfolgt ist. Der Reaktionsansatz wird mit 250 ml Dichlormethan extrahiert, die organische Phase mit 25 ml dest. Wasser und 25 ml gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und über Na2SO4 getrocknet. Anschließend wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Die Aufreinigung des Rohprodukts erfolgt mittels Säulenchromatographie an Kieslgel (CH2Cl2). Es resultieren 214 mg (95%) (R)-2-HPP, wobei der Enantiomerenüberschuß ee < 99% beträgt ([α] 2|D2 = -122 (c = 2, CHCl3)).
Legende zu den Figuren
Fig. 1 Sequenzliste:
enthaltend die Nukleotidsequenz kodierend für eine Benzaldehyd-Lyase aus Pseudomonas fluorescens (SEQ ID NO. 1) und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz sowie eine separate Darstellung der Aminosäuresequenz (SEQ ID NO. 2) der Benzaldehyd-Lyse aus Pseudomonas fluorescens.
SEQUENCE LISTING

Claims (29)

1. Verfahren zur stereoselektiven Herstellung von 2-Hydroxyketonen, dadurch gekennzeichnet, daß eine Benzaldehyd-Lyase eingesetzt wird, die in Anwesenheit wenigstens einer lösungsvermittelnden Verbindung die Umsetzung von zwei Aldehydgruppen enthaltenden Verbindungen, von denen wenigstens eine kein Acetaldehyd ist, oder von einer Aldehydgruppen enthaltenden Verbindung mit einer 2-Hydroxyketongruppen enthaltenden Verbindung unter Beibehaltung der stereochemischen Anordnung der letzteren zu einer weiteren 2- Hydroxyketongruppen enthaltenden Verbindung katalysiert.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine erste Aldehydgruppen enthaltende Verbindung der allgemeinen Formel I
wobei R = eine Komponente aus der Gruppe aliphatischer, aromatischer oder heteroaromatischer Kohlenwasserstoffe ist, die in ortho-, meta- oder para- Stellung einfach oder mehrfach substituiert sein kann, wobei die Substituenten Alkyl-, Aryl- oder Aralkyl-Gruppen oder Heteroatome, wie z. B. Cl, F, Br oder S, N, P oder Kombinationen davon sein können und R ≠ -CH3 ist
mit einer zweiten Verbindung der Formel I zu einer 2-Hydroxyketongruppen enthaltenden Verbindung der allgemeinen Formel II umgesetzt wird,
wobei R1 und R2 gleich oder verschieden sein können und R1 und R2 die dieselbe Bedeutung haben wie R in Formel I.
3. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, bei dem Verbindungen der Formel II in Gegenwart von Aldehydgruppen enthaltenden Verbindungen der allgemeinen Formel III
wobei R3 = -CH3 oder eine Komponente aus der Gruppe aliphatischer, aromatischer oder heteroaromatischer Kohlenwasserstoffe ist, die in ortho-, meta- oder para-Stellung einfach oder mehrfach substituiert sein kann, wobei die Substituenten Alkyl-, Aryl- oder Aralkyl-Gruppen oder Heteroatome, wie z. B. Cl, F, Br oder S, N, P oder Kombinationen davon sein können
zu Verbindungen der Formel IV weiter umgesetzt werden
wobei R3 ≠ R4 und R3 = R3 der Formel III und R4 = R der Formel I.
4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ausgehend von einem racemischen Gemisch enthaltend Verbindungen der Formel II selektiv das Enantiomer der Formel II unter Beibehaltung der stereochemischen Anordnung zu einer Verbindung der Formel IV weiter umgesetzt wird.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß eine Aldehydgruppen enthaltende Verbindung der allgemeinen Formel I als ein erstes Substrat mit einem Acetaldehyd oder substituierten Acetaldehyd als ein zweites Substrat über eine Verbindung der Formel II als Zwischenstufe zu einer Verbindung der Formel IV umgesetzt wird.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß dem Reaktionsansatz oder dem Kulturmedium wenigstens 0,5-40%, bevorzugt 5-20%, besonders bevorzugt 7-12% und höchst bevorzugt 10% wenigstens einer lösungsvermittelnden Verbindung zugesetzt werden.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß als lösungsvermittelnde Verbindung ein mit Wasser mischbares und/oder wasserlösliches organisches Lösungsmittel und/oder eine lösungsmittelfreie Verbindung zugesetzt wird.
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß als lösungsvermittelnde Verbindung Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid, Ethanol und/oder ein Cyclodextrin zugesetzt wird.
9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß ein Enantiomerenüberschuß an Verbindung der Formel II von wenigstens 96%, bevorzugt von ≧ 97%, besonders bevorzugt von ≧ 99% und insbesondere von 99, 9% erreicht wird.
10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß ein Enantiomerenüberschuß an Verbindung der Formel IV von wenigstens 50 bis 60%, bevorzugt 60 bis 90%, besonders bevorzugt von 92 bis 97% und höchst bevorzugt 97 bis ≧ 99,9% erreicht wird.
11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß es in einer kontinuierlichen Reaktionsführung durchgeführt wird.
12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß eine Benzaldehyd-Lyase oder ein biologisch aktiver Teil davon kodiert durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 oder ein Allel, Homolog oder Derivat dieser Nukleotidsequenz oder eine mit dieser hybridisierende Nukleotidsequenz eingesetzt wird.
13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß eine Benzaldehyd-Lyase mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2 oder ein biologisch aktiver Teil davon, eine modifizierte Form, Isoenzyme oder Mischungen davon eingesetzt werden.
14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß eine isolierte Benzaldehyd-Lyase oder Zellextrakte oder ganze Zellen enthaltend eine Benzaldehyd-Lyase eingesetzt werden.
15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß eine Benzaldehyd-Lyase aus Mikroorganismen, bevorzugt der Gattung Pseudomonas oder Acinetobacter eingesetzt wird.
16. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß eine Benzaldehyd-Lyase aus Pseudomonas fluorescens eingesetzt wird.
17. 2-Hydroxyketone hergestellt nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16.
18. Benzaldehyd-Lyase zum Einsatz in ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 kodiert durch eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 oder ein Allel, Homolog oder Derivat dieser Nukleotidsequenz oder eine mit dieser hybridisierende Nukleotidsequenz.
19. Benzaldehyd-Lyase gemäß Anspruch 18 mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2 oder ein biologisch aktiver Teil oder eine modifizierte Form davon oder Isoenzyme oder Mischungen daraus.
20. Benzaldehyd-Lyase gemäß einem der Ansprüche 18 oder 19 isoliert aus Mikroorgansimen, bevorzugt der Gattung Pseudomonas oder Acinetobacter.
21. Benzaldehyd-Lyase gemäß einem der Ansprüche 18 bis 20 isoliert aus der Spezies Pseudomonas fluorescens.
22. Nukleotidsequenz kodierend für eine Benzaldehyd-Lyase gemäß einem der Ansprüche 19 bis 21.
23. Genstruktur enthaltend eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 oder ein Allel, Homolog oder Derivat dieser Nukleotidsequenz oder eine mit dieser hybridisierende Nukleotidsequenz kodierend für eine erfindungsgemäße Benzaldehyd-Lyase sowie mit dieser operativ verknüpfte regulatorische Sequenzen, welche die Expression der kodierenden Sequenz in der Wirtszelle steuern.
24. Vektor enthaltend eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 oder ein Allel, Homolog oder Derivat dieser Nukleotidsequenz oder eine mit dieser hybridisierende Nukleotidsequenz oder eine Genstruktur gemäß Anspruch 23, mit diesen Nukleotidsequenzen operativ verknüpfte regulative Nukleotidsequenzen sowie zusätzliche Nukleotidsequenzen zur Selektion von Wirtszellen, für die Replikation in Wirtszellen und/oder zur Integration in das Genom von Wirtszellen.
25. Transformierter ein- oder mehrzelliger Organismus zum Einsatz in ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 16 enthaltend eine Benzaldehyd-Lyase gemäß einem der Ansprüche 18 bis 21 und/oder eine Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 22 und/oder ein Genkonstrukt gemäß Anspruch 23 und/oder einen Vektor gemäß Anspruch 24.
26. Transformierter ein- oder mehrzelliger Organismus gemäß Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Mikroorganismus, eine Hefe, ein Pilz, eine tierische oder eine pflanzliche Zelle ist.
27. Transformierter ein- oder mehrzelliger Organismus gemäß einem der Ansprüche 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, daß er zu der Gruppe der Enterobacterien gehört.
28. Transformierter ein- oder mehrzelliger Organismus gemäß einem der Ansprüche 25 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß er zu der Gattung Escherichia, bevorzugt der Art Escherichia coli gehört.
29. Verwendung von 2-Hydroxyketonen gemäß Anspruch 17 zur Herstellung von Verbindungen mit antiviraler und/oder antifungaler Wirkung und/oder mit der Wirkung von Enzyminhibitoren, die in Bereichen der Pharmazie und/oder Medizin, beispielsweise zur Behandlung von Immunkrankheiten oder neurodegenerativen Erkrankungen verwendet werden.
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