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Anwendungsgebiet der Erfindung:
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Die Erfindung betrifft ein enzymkatalysiertes enantioselektives Syntheseverfahren für Nitroalkane vom allgemeinen Typ 1, insbesondere Vertreter dieser Verbindungsklasse vom Typ 2, als Vorstufen für die Herstellung von enantiomerenangereicherten bzw. enantiomerenangereicherten Aminen vom Typ 3. Enantiomerenreine Amine vom Typ 3 sind von industrieller pharmazeutischer Bedeutung aufgrund der Verwendung von Vertretern dieser Verbindungsklasse als Wirkstoffe bzw. Wirkstoffintermediate. Als ausgewählte Wirkstoffe auf Basis solcher Amine seien hierbei stellvertretend Amphetamin, Tamsulosin und Selegilin genannt.
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Abbildung 1. Allgemeine Struktur von Nitroalkanen vom Typ 1, insbesondere Vertreter dieser Verbindungsklasse vom Typ 2, als Vorstufen für Amine vom Typ 3
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Beschreibung des Stands der Technik:
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Ein Syntheseweg zu den enantiomerenreinen Aminen (S)- oder (R)-3 basiert auf dem Einsatz von chiralen Aminen als Hilfsstoffen (chirale Auxiliare) in stöchiometrischen Mengen und der Ausbildung von Iminen mit (substituiertem) Arylaceton, gefolgt von einer anschließenden diastereoselektiven Reduktion des Imins zum Amin und nachgeschalteter Abspaltung des chiralen, für die stereoselektive Induktion verantwortlichen Substituenten. Als chirales Auxiliar wird beispielsweise enantiomerenreines 1-Phenylethylamin eingesetzt. Wesentliche Nachteile dieser Synthesestrategie liegen unter annderem in der Länge der Gesamtsynthese umfassend viele Synthesestufen, dem Bedarf an stöchiometrischen, nicht recyclisierbaren Mengen an chiralen Auxiliaren und des zusätzlichen Schritts der späteren Abspaltung der „chiralen Hilfsgruppe”.
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Der bisherige Stand der Technik bei dieser Syntheseroute sowie die damit verbundenen Nachteile seien exemplarisch im Folgenden für das von Yamanouchi Pharmaceuticals entwickelte Herstellungsverfahren für Tamsulosin verdeutlicht (Abbildung 2). 1
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- a) A. Kleemann, J. Engel, B. Kutscher, D. Reichert, Pharmaceutical substances, 5th Ed., Thieme Verlag, Stuttgart, New York, 2009, 1318 f.; b) EP 257 787 (Yamanouchi Pharmaceuticals Co. Ltd.).
Hierbei erfolgt ausgehend von einem entsprechenden Aldehyd 4 als leicht zugängliche Ausgangsmaterial-
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Komponente sowie einem chiralen, enantiomerenreinen Amin die Bildung eines Imins 5, das anschließend durch Hydrierung zum entsprechenden Amin(R,R)-6 umgesetzt wird. Das benötigte stereogene Zentrum wird hierbei somit durch eine diastereoselektive Reaktion erzeugt, welche zudem aufgrund vieler Umkristallisierungs- und Reinigungsschritte nur zu Ausbeuten von 51–54% führt.
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Abbildung 2. Mehrstufensynthese von Tamsulosin gemäß dem Stand der Technik
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Außerdem muss Methylbenzylamin als chirales Auxiliar in stöchiometrischen Mengen eingesetzt werden, was zu einer erhöhten Abfallmenge und zudem mit einem zusätzlichen Syntheseschritt zur nachträglichen Abspaltung der im Zielmolekül Tamsulosin-Hydrochlorid, (R)-8, nicht enthaltenen „chiralen Hilfsgruppe” führt. Das chirale Auxiliar kann dabei zudem nicht wieder gewonnen werden.
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Als ein weiterer industriell favorisierter Herstellungsweg zu diesen Aminen (S)- oder (R)-2 in enantiomerenangereicherter Form als Schlüsselintermediate bei der Darstellung entsprechender Arzneistoffe gilt bis heute die Herstellung der entsprechenden Racemate rac-1, gefolgt von einer Racematspaltung. Die Racemate rac-1 können in vorteilhafter Weise aus den korrespondierenden racemischen Nitroalkanen synthetisiert werden, welche wiederum durch Reduktion aus Nitroalkenen zugänglich sind. Hierbei stellen Nitroalkene attraktive, leicht zugängliche und auf preiswerten Chemikalien beruhende Substrate dar.
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Ein solches Syntheseverfahren ist in nachfolgender Abbildung 3 in allgemeiner Form im Detail dargestellt. Zunächst erfolgt ausgehend von dem entsprechenden aromatischen Aldehyd, der (wie obig erwähnt) generell eine attraktive Ausgangskomponente darstellt, in einer Kondensationsreaktion mit Nitromethan die Ausbildung des Nitroalkens trans-11. Die Herstellung solcher Nitroalkene ist vielfältig beschrieben und ist auch technisch als äußerst attraktiv anzusehen, da zum einen einfach zugängliche Substrate (aromatische Aldehyde, Nitroethan) verwendet werden und zum anderen die Synthese ohne komplizierte Hilfsstoffe in einer präparativ einfach durchführbaren Reaktion mit hohen Umsätzen und Selektivitäten zum gewünschten Produkt führt. Entsprechend stellen solche Nitroalkene vom Typ trans-11 wertvolle Substrate für die weiteren Umsetzungen dar.
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In dem bisherigen Stand der Technik wiederum wird anschließend die attraktive Nitroalkenreduktion einer nicht-stereoselektiven Reduktion unterzogen, wobei sich das racemische Nitroalken rac-2 bildet. Anschließend wird durch Reduktion gemäß bekannter Standardverfahren das racemische Amin rac-3 gebildet. Der entscheidende, stereoselektive Schlüsselschritt besteht dann in der nachfolgenden Racematspaltung des racemischen Amins rac-3, wobei das gewünschte enantiomerenreine Amin (R)-3 in lediglich einer Ausbeute von maximal 50% erhalten werden kann und zudem ein Trennschritt zur Abtrennung vom ungewünschten Enantiomers benötigt wird. Das ungewünschte Enantiomer (S)-3 muss anschließend entweder entsorgt oder – sofern möglich – in einem mit Zusatzaufwand verbundenen Schritt racemisiert werden.
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Abbildung 3. Synthesestrategie via Racematspaltung eines Nitroalkens als Schlüsselschritt
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Der wesentliche Nachteil bei diesem grundsätzlich auf ökonomisch attraktiven Chemikalien basierenden Verfahren besteht somit in der Notwendigkeit der Racematspaltung mit einer maximalen Ausbeute von 50% in einem relativ späten Syntheseschritt. Dadurch werden sowohl Gesamtökonomie als auch Abfallbilanz des Gesamtsyntheseverfahrens deutlich ungünstig und die Attraktivität einer solchen Verfahrensweise deutlich vermindert.
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Ein weitaus günstigerer, ökonomisch attraktiver und nachhaltigerer Syntheseweg zur industriellen Gewinnung von benötigten chiralen Amine der Struktur (S)- und (R)-1 (bei dem zugleich die Vorteile der obig genannten Syntheseroute gemäß Abbildung 3 enthalten sind wie u. a. günstige Edukte und Intermediate) läßt entsprechend eine Synthesestrategie erscheinen, bei dem der Schlüsselschritt der Ausbildung des chiralen Nitroalkans ausgehend vom Nitroalken in einer enantioselektiven katalytischen Reduktion der C=C-Bindung des Nitroalkens durchgeführt werden kann. Das Syntheseprinzip eines solchen enantioselektiven Schlüsselschritts ist in Abbildung 4 dargestellt. Hierdurch würden obig genannte gravierende Nachteile heutiger Verfahrensvarianten vermieden werden.
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Abbildung 4. Syntheseprinzip der enantioselektiven katalytischen Reduktion von Arylsubstituierten Nitroalkenen vom Typ trans-11
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Grundsätzlich ist hierbei eine solche enantioselektive Reduktion von Nitroalkenen in Gegenwart chiraler Katalysatoren bekannt, wobei hierzu Enzyme als Biokatalysatoren sich als grundsätzlich geeignet erwiesen, eine asymmetrische Induktion zu erzielen. Allerdings sind die erzielten Enantioselektivitäten für eine technische Anwendung unattraktiv. Für die enantioselektive biokatalytische Reduktion von prochiralen (β-monosubstituierten) α-methylierten Nitroalkenen sind in den bisherigen (wenigen) literaturbekannten Reaktionen nur nicht zufriedenstellenden Enantioselektivitaten von lediglich unter 80% ee, meist sogar unter 50% ee, beschrieben. 2
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- a) K. Sakai, A. Nakazawa, K. Kondo, H. Ohta, Agric. Biol. Chem. 1985, 49, 2331; b) A. Fryszkowska, K. Fisher, J. M. Gardiner, G. M. Stephens, J. Org. Chem. 2008, 73, 4295; c) H. Korbekandi, P. Mather, J. Gardiner, G. Stephens, Enzyme Microb. Technol. 2008, 42, 308.
Ein Indiz für die Schwierigkeit der hochenantioselektiven Reduktion von Nitroalkenen kann zudem auch darin gesehen werden, dass die enzymkatalysierte Reduktion von Nitroalkenen bislang in der Literatur nur mäßig beschrieben und oftmals auf β-methylierte Nitroalkene beschränkt ist. 3 - 3
- Reviews: a) H. S. Toogood, J. M. Gardiner, N. S. Scrutton, ChemCatChem 2010, 2, 892; b) R. Stuermer, B. Hauer, M. Hall, K. Faber, Curr. Op. Chem. Biol. 2007, 11, 203.
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Entsprechend stellt nach wie vor die Entwicklung eines Verfahrens, das die Bildung des chiralen α-methylierten Nitroalkans vom Typ 1 in hochenantiomerenangereicherter Form (mit einem Enantiomerenüberschuss von > 90% ee) durch enantioselektive Reduktion des korrespondierenden Nitroalkens vom Typ 11 ermöglicht, eine bislang ungelöste Herausforderung dar. Eine solche effiziente enantioselektive katalytische Transformation zur Ausbildung des gewünschten Stereozentrums ohne die Notwendigkeit des Bedarfs an chiralem Auxiliar und ohne eine Limitierung der Ausbeute von 50% würde die Atomökonomie und Gesamteffizienz der Synthese von enantiomerenangereicherten Nitroalkanen deutlich verbessern und eine hochattraktive Perspektive für industrielle Anwendungen bieten.
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Zielsetzung der Erfindung:
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Die erfindungsgemäße Aufgabe bestand in der Entwicklung eines Verfahrens zur effizienten und vorteilhaften Synthese der Zielverbindungen (S)- und (R)-1 sowie (S)- und (R)-2 in enantiomerenangereicherter Form, bei der (1) unter Vermeidung einer Racematspaltung eine theoretische Ausbeute von 100% erreichbar sein soll, (2) keine chiralen Auxilare in stöchiometrischen Mengen benötigt werden sowie (3) obig genannte Nachteile, insbesondere die geringen Enantioselektivitäten bei der Reduktion der Nitroalkene, vermieden werden.
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Beschreibung der Erfindung:
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Die obig genannte Aufgabe wurde erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von enantiomerenangereicherten Nitroalkanen vom Typ (R)- oder (S)-1
ausgehend von prochiralen Nitroalkenen vom Typ 11
, das in Gegenwart eines geeigneten Biokatalysators in hochenantioselektiver Weise erfolgt, wobei Enantiomerenüberschüsse des gewünschten Produkts vom Typ (R)- oder (S)-1 mit > 90% ee erhalten werden.
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In einer bevorzugten Ausführungsform wird das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Vertretern vom Typ 2
der Verbindungsklasse vom Typ 1 herangezogen.
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Als Ausgangsverbindungen vom allgemeinen Typ 11 sind dabei insbesondere deren trans-Vertreter vom Typ trans-11
geeignet.
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Besonders bevorzugt ist dabei eine Verfahrensvariante, bei der als Biokatalysatorkomponente eine gereinigte Enzymkomponente, die in rekombinanter Form hergestellt wird, eingesetzt wird. Überraschenderweise hat sich dadurch gezeigt, dass im Vergleich zu Versuchen analog dem Stand der Technik unter Einsatz von rekombinanten Enzymen als Rohextrakt deutlich verbesserte Enantiomerenüberschüsse erzielt werden können. So wird im Vergleichsversuch bei der Reduktion des Nitroalkens trans-11a unter Einsatz einer rekombinanten Enoatreduktase aus Gluconobacter oxydans in der für die meisten Biotransformationen typischen Form des Rohextrakts eine Enantioselektivität von 78% ee beobachtet, während überraschenderweise die Verwendung der über einen His-Tag gereinigten Form dieses Enzyms zu einer erhöhten Enantioselektivität von 83% ee führt. Beide Versuche sind in Abbildung 5 dargestellt.
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Abbildung 5. Versuche mit einer rekombinanter Enoatreduktase in Abhängigkeit von der „Formulierung” (als Rohextrakt bzw. in gereinigter Form)
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Überraschenderweise führten die Änderungen von zwei weiteren Parametern, denen typischerweise bei asymmetrische Biokatalyse-Reaktionen sonst wenig Bedeutung beigemessen wird, zu weiteren Verbesserungen. So konnte die Enantioselektivität weiter gesteigert werden auf hohe ee-Werte von > 90% ee, wenn die gereinigte rekombinante Enoatreduktase bei einer verminderten Reaktionstemperatur von 5–15°C eingesetzt wird, wobei allerdings ein leicht verminderter Umsatz von 93% ee nach 48 Stunden Reaktionszeit erhalten wurde (Abbildung 6).
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Abbildung 6. Enzymatische Reduktion von trans-11a bei verminderter Reaktionstemperatur
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Besonders überraschend zeigte sich zudem ein Einfluss der Reaktionszeit auf die Enantioselektivität, was besonders an der enzymatischen Reduktion des Brom-substituierten Nitroalkens trans-11b aufgezeigt werden kann. Ergibt die Synthese unter Einsatz von gereinigter Enoatreduktase nach 48 Stunden eine Enantioselektivität von 86% ee, so wurde diese deutlich auf 93% ee nach Verkürzung auf der Reaktionszeit auf 5 Stunden gesteigert (Abbildung 7). Ein solcher signifikanter Einfluss der Verkürzung einer Reaktionszeit auf eine Verbesserung der Enantioselektivität ist äußert ungewöhnlich und als überraschend anzusehen.
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Abbildung 7. Positiver Einfluss einer kürzeren Reaktionszeit auf die Enantioselektivität
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Als vorteilhaft erwies sich zudem die Durchführung der Reaktion unter Einsatz einer mit Ultraschall behandelten Mischung des Nitroalkens trans-11b in Puffer (vor Enzymzugabe). Durch eine solche Vorgehensweise sowie weiterer Ultraschallbehandlung der Reaktionsmischung nach 5 Stunden Reaktionszeit gelang eine weitere Steigerung insbesondere des Umsatzes. In einer vorteilhaften Ausführungsform wird die Reaktion zudem in vergrößertem Maßstab von > 50 mL, vorzugsweise mindestens 100 mL, durchgeführt, da hierbei bessere Ergebnisse erhalten werden. Eventuell könnte dies auf eine bessere Durchmischung zurückzuführen sein. Zwei repräsentative Versuche unter solchen optimierten Reaktionsbedingungen sind in nachfolgender Abbildung 8 dargestellt. Hierbei verlaufen die gewünschten enzymatischen Reduktionen der Nitroalkene trans-11b und trans-11c mit sowohl exzellenten Umsätzen von > 98% als auch hervorragenden Enantioselektivitäten von 95% bzw. 93% ee. Damit können nun erstmalig hohe Enantioselektivitäten von > 80% ee, insbesondere > 90% ee, für enzymatische Reduktionen von Nitroalkenen vom Typ trans-11 erreicht werden.
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Abbildung 8. Enzymatische Reduktion von trans-11b, c unter optimierten Bedingungen
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In einer weiteren bevorzugten Verfahrensvariante erfolgt die Biotransformation in Gegenwart eines rekombinanten Ganzzellbiokatalysators statt dem daraus resultierenden Rohextrakt. Hierbei hat sich gezeigt, dass bei Verwendung des Ganzzellkatalysators eine deutlich höhere Enantioselektivität erhalten wird im Vergleich zum Einsatz der korrespondierenden, nach Zellaufschluss erhaltenen Rohextrakte. Dies ist als äußerst überraschendes Erfgebnuls anzusehen, da typischerweise die erzielten Enantioselektivitäten in enantioselektiven Synthesen ausgehend von prochiralen Substanzen abhängig vom rekombinanten Enzym (und dessen Expressionsrate), aber nicht von der Einsatzform als Rohextrakt oder Ganzzellkatalysator sein sollte. Dies ist ein überraschender wie zugleich äußerst ungewöhnlicher Befund, der im Gegensatz zu alternativen Redoxreaktionen (z. B. bei Alkoholdehydrogenasen) steht. Dieser positive Effekt der Ganzzell-Form gegenüber der Rohextrakt-Form ist in nachfolgendem Synthesebeispiel verdeutlicht (Abbildung 9). So verläuft unter Einsatz des Rohextrakts (das nach Zellaufschluss aus der Ganzzell-Form gewonnen wird) als Katalysatorkomponente die Reduktion des Nitroalkens trans-11b unter annähernd vergleichbaren Reaktionsbedingungen mit lediglich 69% ee, während die Ganzzellkatalysator-Form desselben rekombinanten Enzyms die gleiche Reaktion mit einer Enantioselektivität von 94% ee katalysiert. Diese Ganzzell-Biotransformation sowie das exzellente wie überraschende Ergebnis sind in nachfolgender Abbildung 9 dargestellt.
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Abbildung 9. Nitroalkenreduktion unter Einsatz einer Enoatreduktase in Form eines Rohextrakts bzw. Ganzzellkatalysators
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Begriffserläuterungen:
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- • ee: Enantiomerenüberschuss (engl.: „erantiomeric excess)
- • enantiomerenangereichert: Produkt, bei dem eines der beiden Enantiomere im Überschuss im vorliegt.
- • enantiomerenrein: Produkt, bei dem ein Enantiomer mit > 99% ee vorliegt.
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Experimentelle Beispiele:
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Arbeitsvorschrift zur Herstellung der Enoatreduktase aus Gluconobacter oxydans als Rohextrakt (AV1):
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Um die Enoatreduktase aus Gluconobacter oxydans (YP190936; Abkürzung: GO-ER) rekombinant verfügbar zu machen, wurde die genomische DNA aus G. oxydans (DSM 2343) isoliert und in einer PCR-Reaktion als Template eingesetzt. Folgende Primer wurden für die Amplifikation verwendet; FFW (5'-AGGACATATG CCA ACC CTG TTC GAT CCC ATT GAT TTC GGT CCC ATT CAC -3') und REV (5'-ATA TGT CGA CTC AGT TGG GGC CGG AGG TGG CGG-3'). Die Primer wurden so konstruiert, dass die Restriktionsschnittstellen Ndel bzw. SalI an den Enden des Amplifikats angefügt werden. Als Expressionsvektor wurde pET28a(+) (Fa. Novagen, Merck KGaA, Darmstadt) verwendet. Dieser Vektor, der neben einem Kanamycin-Resistenzgen eine „multiple cloning site” enthält, ermöglicht die Expression eines Zielgens unter der Kontrolle eines T7 Promotors als Fusionskonstrukt mit N-terminalem Hexa-Hisitidin-Tag. Sowohl der Vektor als auch das PCR-Produkt wurden mit den Restriktionsenzymen Ndel und SalI restringiert und anschließend aufgereinigt. Die DNA wurden nach Ligation mit T4 DNA-Ligase in Zellen von Escherichia coli Stamm DH5α transformiert und auf LB-Agar (LB = 5 g/L Hefeextrakt; 10 g/L Pepton aus Casein; 10 g/L NaCl; als LB-Agar = Zusatz von 15 g/L Agar-Agar) ausplattiert; zur Selektion enthielt der LB-Agar in diesem Fall 50 mg/L Kanamycin. Einzelkolonien wurden anschließend in 5 ml Kulturen (LB/50 mg/L Kanamycin) über Nacht bei 37°C kultiviert. Aus den Kulturen wurde die Plasmid-DNA isoliert und mittels Restriktionsanalyse analysiert. Die Anwesenheit des go-er Gens wurde durch Sequenzierung verifiziert.
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Für die Expression wurde das Ligationsprodukt pGO-ER in den E. coli Expressionsstamm BL21(DE3) transformiert und auf selektivern LB-Agar (50 mg/L Kanamycin) ausplattiert. Mit einer Einzelkolonie wurde eine 5 ml Kultur inokuliert und diese bei 37°C über Nacht inkubiert. Mit dieser Vorkultur wurde eine 500 ml LB (plus 50 mg/L Kanamycin) Hauptkultur 1%ig angeimpft und bis zu einer OD(600 nm) = 0.5 in einem Erlenmeyer-Kolben kultiviert. Zu diesem Zeitpunkt erfolgt die Induktion der Genexpression durch Zugabe von 0.5 mM IPTG (= Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid) als Endkonzentration. Die weitere Kultivierung erfolgte bei 25°C für 20 Stunden. Zur Gewinnung des Rohextrakts wurden die Zellen mittels Zentrifugation (17000 g/30 min/4°C) geerntet und als 25%ige Zellsuspension (3 mL TEA-Puffer 50 mM, pH 7 plus 1 g Zellen) durch Ultraschall (3 × 60 sec., 50% Cycle, 35% Intensität) aufgeschlossen. Zelltrümmer und unlösliche Zellbestandteile wurden mittels Zentrifugation abgetrennt, der Überstand wird als Rohextrakt bezeichnet. Die Aktivität der löslichen Enoat-Reduktase (GO-ER) wird durch einen photometrischen Standard-Test (photometrische Quantifizierung der NADPH-Abnahme) ermittelt, dabei wurden typischerweise 8.3 U/mL für die GO-ER (Test mit 10 mM trans-Hexenal/0.25 mM NADPH) gemessen. Der Proteingehalt wurde durch den Bradford-Test ermittelt und betrug 16.2 mg/mL.
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Arbeitsvorschrift zur Herstellung der Enoatreduktase aus Gluconobacter oxydans in gereiniger Form als His-tag (AV2):
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Da die rekombinante GO-ER mit einem N-terminalen His-Tag vorliegt, wurde eine Aufreinigung mittels „immobilized metal affinity chromatography” (Ni-NTA Superflow, Qiagen, Hilden) durchgeführt. Die Aufreinigung erfolgte mit Hilfe eines Äkta-Purifier-Chromatographiesystems (GE Healthcare Bio-Sciences AB; Uppsala, Schweden). Die Säule wurde vor dem Auftragen des enzymhaltigen Rohextrakts mit TEA-Puffer (50 mM/pH7) equilibriert. Nach Beladung der Säule mit der Probe (Rohextrakt) und Elution der nicht gebundenen Proteine durch Anwendung von Equilibirierungspuffer als mobiler Phase wurde ein linearer Gradient mit Imidazol (0–500 mM) in TEA (50 mM/pH7) angelegt. Die GO-ER eluiert bei ca. 130 mM Imidazol. Nach einem Entsalzungsschritt (Sephadex G 25 (GE Healthcare Bio-Sciences AB; Uppsala, Schweden), 110 mM TEA buffer pH 7.0]) wurde das Enzym Iyophilisiert und bei –20°C gelagert.
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Arbeitsvorschrift zur Herstellung eines rekombinanten Ganzzellkatalysators, überexprimierend eine Enoatreduktase aus Gluconobacter oxydans und eine Glukosedyhdrogenase (AV3)
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Konstruktion eines rekombinanten E. coli-Stamm für die Ganzzell-Katalyse:
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Als Ganzzell-Katalysator wurde ein rekombinanter E. coli-Stamm konstruiert, der sowohl das Gen für die Enoat-Reduktase aus Gluconobacter oxydans (GO-ER) als auch ein Gen für ein Enzym enthält, das die Regenerierung von NADPH übernehmen kann. Als Regenerierungsenzym wurde in diesem Fall die Glucose-Dehydrogenase (GDH) aus Bacillus subtilis eingesetzt, es können aber auch verschiedene andere Enzyme für diesen Zweck verwendet werden (für eine Übersicht über literaturbekannte Regenerierungssysteme für NADPH s. beispielsweise A. Weckbecker, H. Gröger, und W. Hummel, (2010) Regeneration of nicotinamide coenzymes: Principles and applications for the synthesis of chiral compounds; Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. Vol. 120, 195–242). Für die Coexpression von GO-ER und GDH wurde ein Zwei-Plasmid-System verwendet. Dieses System besteht aus zwei kompatiblen Expressionsvektoren. Für die Expression der GDH wurde der Vector pKA1 verwendet, hierbei handelt es sich um einen „medium copy number” Vector. Dieser Vektor trägt neben einem Chloramphenicol-Resistenzgen eine „multiple cloning site”, die es ermöglicht, Gene unter der Kontrolle des T7-Promotors zu exprimieren. Da dieser Vektor einen p15A Replikationsursprung besitzt, ist er kompatibel mit den „high copy number” pET-Vektoren (Fa. Novagen, Merck KGaA, Darmstadt). Für die Amplifikation des gdh-Gen wurden die nachfolgenden Primer verwendet: FFW (5'-AGGACAT ATG TAT CCG GAT TTA AAA GGA AAA GTC GTC GCT ATT ACA GGA GC-3') und REV (5'-ACGAGGATCCTTAACCGCGGCCTGCCTGGAATGAAG-3'), die dem Gen die Restriktionsschnittstellen Ndel und BamHl in einer PCR-Reaktion anfügen. Als Template diente genomische DNA von Bacillus subtilis. Das aufgereinigte PCR-Produkt, sowie der Vektor pKA1 wurden anschließend einem Restriktionsverdau mit den Restriktionsenzymen Ndel und BamHl unterzogen. Der linearisierte Vektor wurde mit alkalischer Phosphatase (aus Shrimps) dephosphoryliert. Die DNA wurde nach Ligation mit der T4 DNA Ligase in den E. coli Stamm DH5α transformiert. Nach Anzucht einiger Klone erfolgte die Isolierung der Plasmide mit nachfolgender Restriktion und gelelektrophoretischer Analyse. Die gdh-Sequenz einer der erhaltenen Klone wurde durch Sequenzanalyse bestätigt. Für die Expression des GO-ER Gens wurde der „high copy number” Vektor pET28a(+)(Fa. Novagen, Merck KGaA, Darmstadt) verwendet. Dieser Vektor trägt neben einem Kanamycin Resistenzgen eine „multiple cloning site”, die es ermöglicht, das Zielgen unter der Kontrolle des T7 Promotors zu exprimieren. Der ColE1 Replikationsursprung gewährleistet eine stabile Coexpression zusammen mit dem pKA1-Vektor. Die Isolierung und Klonierung des Gens, das für die Enoat-Reduktase aus G. oxydans codiert, ist bereits vorab beschrieben.
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Expression:
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Für die Expression wurden beide Vektoren in kompetente E. coli BL21(DE3)-Zellen transformiert. Eine Einzelkolonie von einer LB-Agarplatte (LB unter Zusatz von 50 mg/L Kanamycin und 20 mg/L Chloramphenicol) wurde zum Inokulieren einer 5 mL Kultur LB. Medium (unter Zusatz von 50 mg/L Kanamycin und 20 mg/L Chloramphenicol) verwendet. Diese Kulturen wurden über Nacht bei 37°C angezogen. Ein Erlenmeyerkolben mit 500 mL LB-Mediums (plus 50 mg/L Kanamycin und 20 mg/L Chloramphenicol) wurde mit 5 ml dieser Kultur angeimpft und bei einer Temperatur von 37°C bis zu einer OD(600 nm) 0.5 kultiviert. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Expression der Gene mit 0.5 mM IPTG (Endkonzentration) induziert und bei 30°C über 16 Stunden bei 120 rpm inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen mittels Zentrifugation bei 4°C (30 min, 17000 g) geerntet. Typischerweise konnten so aus 500 mL Medium 2,3 g Zellen gewonnen werden, die bei –20°C gelagert oder direkt verwendet wurden.
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Aktivitätsmessungen für die Enzyme GDH und GO-ER in den Ganzzellkatalysatoren:
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250 mg Zellen werden in 750 μl Kpi-Puffer (50 mM, pH 7.0) suspendiert und per Ultraschall (3 × 60 sec., 50% Cycle, 50% Intensität, je 60 sec. Pause) auf Eis aufgeschlossen. Nach Abzentrifugieren der unlöslichen Zellbestandteile wurde die Aktivität der löslichen Proteine mittels Standard-Tests am Photometer ermittelt, es wurden typischerweise 3 U/ml für die GO-ER (Test mit 10 mM trans-Hexenal/0.25 mM NADPH) und ca. 10,6 U/ml für die Glucose-Dehydrogenase (Test mit 5 mM Glucose, 0.25 mM NADP) ermittelt. Der Bradford-Test ergab einen Proteingehalt von 15.6 mg/ml.
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Allgemeine Arbeitsvorschrift zur biokatalytischen Reduktion mittels Enoatreduktase aus Gluconobacter oxydans im 10 mL-Maßstab (AV4; entsprechend den in den Abbildung 5, 6 und 7 aufgeführten Biotransformationen):
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In einem 20 mL-Titrino-Reaktionsgefäß werden zum Substrat vom Typ trans-11 (0.1 mmol, entsprechend einer Substratkonzentration von 10 mM) nacheinander 10 mL Puffer (pH 6; Herstellung des Puffers ausgehend von Phosphatpuffer, 10 mM, pH 7, der durch Zugabe von HCl, 100 mM, auf pH 6 eingestellt wurde), D-Glucose (0.1 mmol), Enoatreductase (als Rohextrakt aus Gluconobacter oxydans in Form einer 1:1-Mischung mit Glycerin bzw. als gereinigtes Enzym als Lyophilisat), Glukosedehydrogenase (GDH, 18 U, Amano Enzyme) gegeben. Die jeweilig eingesetzten Mengen sind, soweit nicht in dieser allgemeinen Arbeitsvorschrift enthalten, in den jeweiligen Abbildungen 5, 6 und 7 angegeben. Anschließend wird durch Zugabe von 10 mg Cofaktor NADPH oder NADP (12 mol-%) die Reaktion gestartet und bei der entsprechenden Reaktionstemperatur (siehe Abbildung 5, 6 und 7) gerührt. Optional wird die Lösung vor der Zugabe der Enzymkomponenten bzw. erneut nach einer bestimmten Reaktionszeit mit Ultraschall behandelt (siehe Abbildung 7). Nach der jeweilig in den Abbildungen 5, 6 und 7 angegebenen Reaktionszeit wird die Reaktionsgemisch mit Dichlormethan (3 × 10 mL) extrahiert. Das Lösungsmittel wird am Rotationsverdampfer entfernt. Aus dem erhaltenen Rohprodukt wird der Umsatz mit Hilfe von 1H-NMR-Spektroskopie bestimmt.
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Allgemeine Arbeitsvorschrift zur biokatalytischen Reduktion mittels Enoatreduktase aus Gluconobacter oxydans im 100 mL-Maßstab (AV5; entsprechend den in Abbildung 8 aufgeführten Biotransformationen):
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Die Reaktion wird in einem Gesamtvolumen von 100 mL durchgeführt. Es wird 1.0 mmol des entsprechenden Nitroalkens schrittweise in Phosphatpuffer (pH 6, 10 mM) im Ultraschallbad suspendiert. Die Suspension wird unter Rühren auf 9°C gekühlt und mit 0.2 mmol D-Glucose, 100 mg (0.1 mmol) NADP
+ und 2 mg GDH mit einer spezifischen Aktivität von 80 U/mg versetzt. Anschließend werden 111 mg gereinigter, lyophilisierter Enoatreduktase aus Gluconobacter oxydans mit einer spezifischen Aktivität von 0.36 U/mg zugegeben und die Reaktionsmischung wird bei 9°C für 5 h gerührt. Das Reaktionsgefäß wird für 10 Minuten im Ultraschallbad beschallt, es werden erneut 2 mg GDH mit einer spezifischen Aktivität von 80 U/mg zugegeben und für weitere 5 h bei 9°C gerührt. Der pH-Wert wird durch zutitrieren von 0.2 M NaOH konstant gehalten (pH 6). Nach einer Gesamtreaktionszeit von 10 h wird mit CH
2Cl
2 extrahiert (3 × 100 mL), über MgSO
4 getrocknet und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer bei 30°C entfernt. Der blassgelbe Rückstand wird mittels.
1H-NMR, chiraler HPLC und Polarimeter vermessen. Synthese von enantiomerenangereichertem 1-Chlor-3-(2-nitropropyl)benzol, 2b
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Die Durchführung erfolgte analog zur AV 4. Die jeweilig erhaltenen Umsätze sind in den Abbildungen 5 und 6 angegeben.
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Enantiomerenüberschuss: bestimmt via chiraler HPLC: Säule OJ-H, Hexan: i-Propanol 99:1, 0.8 mL/min, 220 nm): t
R = 28.30 min, t
R = 29,03 mm.
1H-NMR (500 MHz, CDCl
3): δ (ppm) = 1.55 (3H, d,
3J = 6.8 Hz, H-C1), 2.99 (1H, dd,
2J = 14.4 Hz,
3J = 6.4 Hz, H-C3), 3.28 (1H, dd,
2J = 14.0 Hz,
3J = 8.0 Hz, H-C3), 4.71-4.79 (1H, m, H-C2), 7.10 (2H, d,
3J = 13.6 Hz, H-aromatisch), 7.28 (2H, d,
3J = 13.6 Hz, H-aromatisch). Synthese von enantiomerenangereichertem 1-Brom-3-(2-nitropropyl)benzol, 2b
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Die Durchführung erfolgte analog zur AV 5 (siehe auch Abbildung 8). Das Produkt wurde säulenchromatographisch gereinigt (Cyclohexan: Dichlormethan 1:1) und als blassgelbes Öl erhalten.
Umsatz: > 99%.
Ausbeute: 205 mg (0.84 mmol, 84%).
Enantiomerenüberschuss: 95% ee (bestimmt via chiraler HPLC: Säule OJ-H, Hexan: i-Propanol 90:10, 0.8 mL/min, 230 nm): t
R = 15.07 min, t
R = 15.60 min).
Drehwert: [α]
D 25 (c 0.40, CHCl
3) = –53°.
1H-NMR (500 MHz, CDCl
3): δ (ppm) = 1.56 (3H, d, H-C1), 2.98 (1H, dd, H-C3), 3.30 (1H, dd, H-C3), 4.73-4.80 (1H, m, H-C2), 7.09-7.42 (4H, m, H-aromatisch). Synthese von enantiomerenangereichertem 1-Iod-3-(2-nitropropyl)benzol, 2c
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Die Durchführung erfolgte analog zur AV 5 (siehe auch Abbildung 8). Das Produkt wurde über Silica filtriert (Dichlormethan) und als blassgelbes Öl erhalten.
Umsatz: 99%;
(Roh-)Ausbeute: 227 mg (0.84 mmol, 84%).
Enantiomerenüberschuss: 93% ee (bestimmt via chiraler HPLC: Säule OJ-H, Hexan: i-Propanol 90:10, 0.8 mL/min, 230 nm): t
R = 16.03 min, t
R = 16.94 min).
Drehwert [α]
D 25 (c 0.15, CHCl
3) = –5°.
1H-NMR (500 MHz, CDCl
3): δ (ppm) = 1.56 (3H, d, H-C1), 2.95 (1H, dd, H-C3), 3.27 (1H, dd, H-C3), 4.72-4.79 (1H, m, H-C2), 7.04-7.62 (4H, m, H-aromatisch). Arbeitsvorschrift zur Synthese von enantiomerenangereichertem 1-Brom-3-(2-nitropropyl)benzol, 2b, durch biokatalytischen Reduktion von 1-Bromo-3-(2-nitroprop-1-enyl)benzol mittels eines rekombinanten Ganzzellkatalysators, überexprimierend eine Enoatreduktase aus Gluconobacter oxydans und eine Glukosedehydrogenase (AV5):
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Die Reaktion wird in einem Gesamtvolumen von 2.0 mL durchgeführt. Der Ganzzellkatalysator (hergestellt gemäß obiger Arbeitsvorschrift AV3) wird vor der Reaktion über Nacht gefroren gelagert. Die Enoatreduktase-Aktivität des Ganzzellkatalysators bezogen auf Cyclohexenon beträgt 12.4 U/g (Nassgewicht), die Glucosedehydrogenase-Aktivität bezogen auf D-Glucose beträgt 92.0 U/g (Nassgewicht). Es werden 4.48 mg (0.02 mmol) 1-Bromo-3-(2-nitroprop-1-enyl)benzene in 1.75 mL Phosphatpuffer (pH6, 50 mM) mittels Ultraschall emulgiert. Anschließend werden 16 μL einer D-Glucose Stammlösung (2.5 M), 142 μL einer Lösung aus Ganzzellkatalysator in Puffer (Phosphatpuffer (pH 6, 50 mM), 50% Zellgehalt, entspricht 71 mg Nassgewicht der Zellen) und 90.8 μL einer NADP+-Stammlösung (22 mM) zugegeben. Die Reaktionsmischung wird bei 9°C für 2.5 h bei 750 rpm inkubiert, nach der Reaktionszeit erneut mit Ultraschall behandelt und für weitere 2.5 h bei 9°C und 750 rpm inkubiert. Nach einer gesamten Reaktionszeit von 5 h wird mit Ethylacetat (3 × 2 mL) extrahiert. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels werden der Umsatz mittels 1H-NMR und der ee-Wert mittels chiraler HPLC bestimmt.
Umsatz: > 99%.
Enantiomerenüberschuss: 94% ee (bestimmt via chiraler HPLC: Säule OJ-H, Hexan: i-Propanol 99:1, 0.4 mL/min, 220 nm): tR = 65.2 min, tR = 68.0 min).
1H-NMR (400 MHz, CDCl3): δ (ppm) = 1.56 (3H, d, H-C1), 2,98 (1H, dd, H-C3), 3.30 (1H, dd, H-C3), 4.74-4.79 (1 H, m, H-C2), 7.09-7.42 (4H, m, H-aromatisch).
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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Zitierte Nicht-Patentliteratur
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- A. Weckbecker, H. Gröger, und W. Hummel, (2010) Regeneration of nicotinamide coenzymes: Principles and applications for the synthesis of chiral compounds; Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. Vol. 120, 195–242 [0025]