DE10105866A1

DE10105866A1 - Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven, propargylischen, terminalen Epoxiden

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Publication number: DE10105866A1
Application number: DE2001105866
Authority: DE
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date: 2001-02-09
Filing date: 2001-02-09
Publication date: 2002-08-29
Also published as: WO2002064579A1; EP1358173A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enantioselektiven Darstellung von optisch aktiven, propargylischen, terminalen Epoxiden. Erfindungsgemäß werden im ersten Schritt des Verfahrens Verbindungen der Fomel 1 mit einer Alkoholdehydrogenase, die bevorzugt aus Pferdeleber oder thermophilen Mikroorganismen (wie z. B. Thermoanaerobium brockii oder Thermoanaerobacter ethanolicus) oder aus Lactobacillus stammt und in Escherichia coli rekombinant überexpremiert wird, in Anwesenheit von NAD(P)H umgesetzt. Bei dieser Reaktion wird die Oxogruppe enantioselektiv reduziert. Da sowohl (S)- als auch (R)-selektive Oxidoreduktasen eingesetzt werden können, ist die Synthese beider Enantiomere möglich. Die Darstellung beider Enantiomere unter Verwendung desselben Enzyms gelingt mit der Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus brevis, da diese Verbindungen mit R·1· = H und Verbindungen mit R·1· NOTEQUAL H zu Alkoholen mit entgegengesetzter Konfiguration umsetzen. Im zweiten Schritt des Verfahrens wird der alpha-halogenierte Alkohol mittels einer Base in das enantiomerenreine Epoxid überführt. DOLLAR F1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven, propargylischen, terminalen Epoxi den nach dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Optisch aktive, propargylische, terminale Epoxide stel len wichtige Zwischenprodukte bei der Synthese von Na tur- und Wirkstoffen dar (z. B. HMG-CoA-Reduktase Inhi bitoren in K. Takahashi, T. Minami, Y. Ohara, T. Hiyama, Bull. Chem. Soc. Jpn. 1995, 68, 2649). Bei der Darstellung dieser chiralen Verbindungen ist die optische Reinheit eine der wichtigsten Zielgrößen.

Für die Herstellung von chiralen, nicht racemischen propargylischen, terminalen Epoxiden sind nach dem Stand der Technik bereits einige Verfahren bekannt. In M. Lopp, T. Kanger, A. Müraus, T. Pehk, Ü. Lille, Tetrahedron: Asymmetry 1991, 2, 943 wird die Synthese von (R)-1-t-Butyldimethylsilyl-3,4-epoxy-but-1-in be schrieben. Es handelt sich hierbei um ein Verfahren, das von (S,S)-(+)-2,3-O-isopropyliden-L-threitol (einem Weinsäure-Derivat) ausgeht, welches in 6 unabhängigen und teilweise sehr aufwendigen Syntheseschritten in das Epoxid überführt wird. Das Produkt hat einen Enantiome renüberschuß (ee) < 99% und die Gesamtausbeute beträgt 20%. Da die Chiralität bereits auf der ersten Synthesestufe eingeführt wird, gehen insgesamt 80% der ein gesetzten optischen Aktivität im Verlauf der Darstel lung wieder verloren. Die Synthese ist sowohl in der oben aufgeführten Originalveröffentlichung sowie in der nachfolgenden Veröffentlichung T. Kanger, P. Niidas, A.-M. Müürisepp, T. Pehk, M. Lopp, Tetrahedron: Asym metry 1998, 9, 2499 lediglich mit der t-Butyldimethyl silyl-Gruppe als Substituent durchgeführt worden.

Nachteilig hierbei sind die hohe Zahl von Synthese schritten (6), die mäßige Gesamtausbeute (20%) und das frühe Einführen der optischen Aktivität, die Verbesse rungen zu wünschen übrig lassen. Die Anwendbarkeit wur de bisher nur für ein einziges Beispiel gezeigt, so daß keine universelle Anwendbarkeit des Verfahrens zu er kennen ist.

In R. Sanchez-Obregon, B. Ortiz, F. Walls, F. Yuste, J. L. Garcia Ruano, Tetrahedron: Asymmetry 1999, 10, 947 wird ein weiteres Verfahren beschrieben, in dem (kommerziell nicht erhältliche) propargylische Ester und (R)-(+)-Methyl p-tolylsulfoxid zu β-Ketosulfoxiden umgesetzt werden und die entstandene Ketofunktion dia stereoselektiv syn bzw. anti reduziert wird. Abschlie ßend wird das Sulfoxid reduziert und die Verbindung durch Abspalten der Sulfid-Gruppe in das Epoxid über führt. Der schwerwiegendste Nachteil dieses Verfahrens ist der niedrige ee der dargestellten Epoxide, da die erzielten Enantiomerenüberschüsse bei nur 66-78% liegen. Selbst beim besten aufgeführten Beispiel konn ten nur 88% ee erreicht werden, welche für eine Anwen dung in der Wirkstoffsynthese bei weitem nicht ausreichend sind. Auch die Gesamtausbeute ist mit 20-30%, die Darstellung der propargylischen Ester nicht mit einbezogen, eher mäßig zu beurteilen. Weiterhin handelt es sich um ein Verfahren, bei dem die Rückgewinnung der abgespaltenen chiralen Hilfsgruppe nicht möglich ist. Als Substituenten an der Dreifachbindung sind lediglich die Reste Phenyl, Methyl und n-Propyl getestet worden, die alle keine funktionellen Gruppen enthalten.

Die geringe optische Reinheit (ee's von 66-88%)und die mäßige Gesamtausbeute von 20-30% (bei der die Synthese der Ausgangsverbindung nicht mit einbezogen ist) sind die gravierendsten Nachteile dieser Methode. Auch die Reaktionsführung bedingt Nachteile, da bei spielsweise eine Rückgewinnung des chiralen Auxiliars nicht möglich ist. Die Anwendbarkeit wurde bisher nur stark eingeschränkt gezeigt, so daß eine Übertragbar keit auf ein breites Spektrum von funktionellen Gruppen nicht getestet ist.

Der Anmelderin ist lediglich ein einziger optisch akti ver α-Chlor- bzw. Bromsubstituierter, propargylischer Alkohol in der Literatur bekannt. In C. J. H. Helal, P. A. Magriotis, E. J. Corey, J. Am. Chem. Soc. 1996, 118, 10938 wird 1-Chlor-4-tri-i-propylsilyl-3-butin-2- on mit 0.05 Äquivalenten eines Oxazaborolidin-Kataly sators und 1.2 Äquivalenten Catecholboran in Dichlor methan zu dem entsprechenden Alkohol reduziert. Die Synthese verläuft nicht absolut enantioselektiv (ee = 95%) bei einer Ausbeute von 97%. Die sterisch anspruchsvolle Tri-i-propylsilylgruppe ist notwendig, um den ee von 95% zu erreichen, da in derselben Veröffentlichung gezeigt wurde, daß z. B. beim entsprechen den nicht chlorierten Keton der Austausch der Tri-i- propylsilylgruppe gegen die gängigere Trimethylsi lylgruppe eine deutliche Verschlechterung des Enantio merenverhältnisses von 39 : 1 (ee = 95%) auf 14 : 1 (ee = 87%) zur Folge hat. Auch in zwei weiteren von Corey et al. aufgeführten Beispielen wird diese Tendenz bestätigt.

Nachteilhafterweise ist der Alkohol nicht enantiomeren rein und ein sterisch anspruchsvoller Substituent an der Dreifachbindung ist notwendig, um einen ee von 95% zu erreichen. Weiterhin wurde die Reaktion nur an einem einzigen Beispiel gezeigt.

In C. W. Bradshaw, W. Hummel, C.-H. Wong, J. Org. Chem. 1992, 57, 1532 sowie im United States Patent 5,342,767 von C.-H. Wong, C. W. Bradshaw Aug. 30, 1994 wird die Aktivität der Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus kefir bei der Reduktion von Ketonen beschrieben. Die Aktivität des Enzyms bei dem Substrat 1-Chlor-4-tri methylsilyl-3-butin-2-on wird mit 52% bezogen auf den Standard 1-Phenoxy-2-propanon angegeben. Dieser Wert wurde in einem UV-Assay bestimmt. Es handelt sich hier bei um einen indirekten Nachweis, bei dem lediglich die Abnahme von NADPH verfolgt wird. Eine hierbei mögli cherweise beobachtete Nebenreaktion wird in D. D. Tan ner, A. R. Stein, J. Org. Chem. 1988, 53, 1642 und in L. M. Aleixo, M. de Carvalho, P. J. S. Moran, J. A. R. Rodrigues, Bioorg. Med. Chem. Lett. 1993, 3, 1637 beschrieben. In beiden Arbeiten konnte gezeigt werden, daß bei der Umsetzung von α-Halogenketonen mit Oxidoreduktasen über einen Radikalmechanismus die ent halogenierten Ketone gebildet werden können. Auch bei dieser Reaktion wird NAD(P)H verbraucht und damit Akti vität im UV-Assay gemessen, ohne daß jedoch zwingend der gewünschte Alkohol entsteht. Die tatsächliche Bil dung des halogenierten Alkohols ist somit von Bradshaw et al. nicht nachgewiesen worden. Dementsprechend konn te auch keine Bestimmung der optischen Reinheit erfol gen oder eine andere Charakterisierung des Produktes bezüglich Stabilitäten etc. durchgeführt werden.

In C. Heiss, R. S. Phillips, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 2000, 2821 wird zum ersten mal von einer for malen Konfigurationsumkehr bei der Reduktion von pro pargylischen Ketonen mit isolierten Oxidoreduktasen be richtet. Die Alkoholdehydrogenase aus Thermoanaerobac ter ethanolicus TE-ADH reduziert Ketone der allgemeinen Struktur:

Die Verbindungen mit den Resten R = Methyl (ee des ge bildeten Alkohols = 60%), Ethyl (ee = 80%), Isopropyl (ee < 98%), t-Butyl (ee = 85%) und Propyl (ee = 51%) werden zu Produkten mit (S)-Konfiguration umgesetzt, während Ketone mit den Resten R = Isobutyl (ee = 50%), Neopentyl (ee = 66%), n-Butyl (ee = 42%), Isopentyl (ee = 80%) sowie diverse Keto-Ester (ee = 82 → 98%) zu (R)-konfigurierten Alkoholen reduziert werden.

Nachteilig hierbei ist, daß die formale Konfigurations umkehr nicht präzise definiert werden kann. Es ist le diglich bekannt, daß mit R = Propyl noch (S)-konfigu riertes Produkt gebildet wird, während der größere Iso butyl-Rest bereits zum (R)-Alkohol führt. Somit läßt sich für weitere mögliche Substrate, z. B. für Ketone mit halogenierten Alkyl-Resten, nicht eindeutig vorher sagen, wie sich das Substitutionsmuster auf die Stereo selektivität des Enzyms auswirkt. Die ee-Werte der er haltenen Alkohole sind bis auf wenige Ausnahmen niedrig bis mäßig (42-80%), weshalb die chiralen Alkohole für den Einsatz in der Natur- und Wirkstoffsynthese nicht geeignet sind. Weiterhin ist für TE-ADH kein Bei spiel für die Reduktion eines Ketons beschrieben, das an der Dreifachbindung substituiert ist. Die überwie gend mäßigen ee-Werte und die schlecht voraussagbare Konfiguration der Produkte machen die Reduktion mittels TE-ADH für die gezielte Naturstoffsynthese ungeeignet, zumal in der Literatur keine TE-ADH Reduktion von Keto nen mit substituierten Dreifachbindungen beschrieben sind.

In M. H. Ansari, T. Kusumoto, T. Hiyama, Tetrahedron Lett. 1993, 34, 8271 wird die Reduktion von 3-Keto-4- pentinsäuremethylestern mit Bäckerhefe beschrieben. Während das Derivat mit der terminalen Dreifachbindung in 46% Ausbeute zu dem (S)-Enantiomer (ee = 80%) reduziert wird, führt die Reduktion des entsprechenden Ketons mit einem Trimethylsilyl-Substituenten an der Dreifachbindung in 48% Ausbeute zu dem (R)-Produkt (ee = 82%). Hierbei handelt es sich jedoch um eine Ganzzellbiotransformation, bei der die oben genannten Reduktionen vermutlich von unterschiedlichen Enzymen katalysiert werden. Es handelt sich somit um keine for male Konfigurationsumkehr bei Alkoholen, deren Synthese von derselben Oxidoreduktase katalysiert wird, sondern vielmehr um Produkte, die durch Reduktion eines Sub strates durch zwei oder mehr Enzyme entstanden sind. Die dabei erzielten mäßigen Ausbeuten und optischen Reinheiten spiegeln ebenfalls wieder, daß vermutlich verschiedene Biokatalysatoren konkurrierend an der Re duktion beteiligt sind.

Die Bildung eines propargylischen, terminalen Epoxides aus einem α-Halogen-Alkohol ist bislang dreimal in der Literatur beschrieben worden. In allen drei Darstellun gen werden jedoch racemische Verbindungen als Edukte verwendet. In M. R. Lespieau, Bull. Soc. Chim. Fr. 1928, 4, 203 wird 1-Chlor-3-butin-2-ol mit KOH in Ether ohne Angabe zur Ausbeute zum Epoxid umgesetzt. Die gleiche Reaktion wird in H. Kleijn, J. Meijer, G. C. Overbeek, P. Vermeer, J. R. Neth. Chem. Soc. 1982, 101, 97 beschrieben. Die Reaktion wird bei 70°C durchge führt und die Ausbeute beträgt 45%. In D. Bernard, A. Doutheau, J. Gore, J. Moulinoux, V. Quemener, Tetra hedron 1989, 45, 1429 wird 5-Amino-1-chlor-5-methyl-3- hexin-2-ol mit t-BuOK in lediglich 5% Ausbeute in das Epoxid überführt. Substrate mit empfindlicheren funkti onellen Gruppen dürften aufgrund der stark basischen Bedingungen für die beschriebenen Reaktionen wenig ge eignet sein, was deren allgemeine Anwendbarkeit stark einschränkt. Ein weiterer Nachteil ist die Tatsache, daß alle Beispiele bislang ausgehend von racemischen Edukten durchgeführt worden sind. Somit kann keine Aussage darüber getroffen werden, ob bei optisch aktiven Alkoholen durch die Einwirkung der verwendeten starken Basen eine Racemisierung eintritt. Die drei Verfahren sind mit Ausnahme eines Amin-Substituenten nicht für Substrate mit funktionellen Gruppen getestet worden, und die Ausbeuten sind mit 5% bzw. 45% niedrig. Weiter hin sind die Synthesen ausschließlich an racemischen Edukten und Produkten durchgeführt worden.

Für nicht propargylische, terminale Systeme sind in der Literatur eine Vielzahl von Reaktionen beschrieben, bei denen α-Halogen-Alkohole in Epoxide überführt werden. Hierfür stehen eine große Bandbreite von Reagenzien zur Verfügung, die jedoch keine allgemeine Anwendbarkeit besitzen. Somit müssen für jede neue Epoxid-Bildung Be dingungen ausgearbeitet werden, die den entsprechenden Aktivierungsgrad, die Funktionalisierungen des Alkohols und mögliche Reaktivitäten der Substituenten berück sichtigen.

Den nach dem Stand der Technik bekannten Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven, propargylischen, ter minalen Epoxiden ist gemeinsam, daß sie zu einer mäßi gen bis niedrigen Gesamtausbeute bei teilweise geringem Enantiomerenüberschuß führen.

Es ist daher die Aufgabe der Erfindung, ein Herstel lungsverfahren für optisch aktive, propargylische, ter minale Epoxide zu schaffen, welches in hoher Gesamtaus beute einen hohen Enantiomerenüberschuß liefert. Das Verfahren sollte daher in wenigen Synthesestufen, verbunden mit einer einfachen Aufarbeitung der Zwischen produkte, zu den Epoxiden führen und somit die im Stand der Technik genannten Nachteile nicht aufweisen.

Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Auf gabe erfindungsgemäß gelöst durch die im kennzeichnen den Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmale.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es nunmehr mög lich, optisch aktive, propargylische, terminale Epoxide in hoher Gesamtausbeute und hohem ee herzustellen.

Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.

Im Folgenden soll die Erfindung erläutert und weitere Vorteile beschrieben werden.

Die Tabellen und die Figur zeigen Ergebnisse und ein Reaktionsschema für die formale Konfigurationsumkehr gemäß der Erfindung.

Es zeigt:

Tabelle 1: Erfindungsgemäße Substrate mit der Aktivi tät von LB-ADH sowie dem Enantiomerenüber schuß und der Konfiguration der Produkte (Alkohol) in % für α-halogenierte Substra te.

Tabelle 2: Vergleich α-halogensubstituierter Substrate mit strukturgleichen nicht α-halogensub stituierten Substraten.

Tabelle 3: Aktivitäten der LB-ADH mit weiteren Alkinonen.

Tabelle 4: Substrate der LB-ADH, bei denen eine forma le Konfigurationsumkehr eintritt.

Tabelle 5: Aktivitäten weiterer Oxidoreduktasen am Beispiel des Substrates 4-t-Butyldimethyl silyl-1-chlor-3-butin-2-on.

Fig. 1: Ein Reaktionsschema für die Anwendung der formalen Konfigurationsumkehr zur Darstel lung beider Enantiomere von propargyli schen, terminalen Epoxiden.

In den Tabellen 1 bis 5 werden die Aktivitäten von Lac tobacillus brevis Alkoholdehydrogenase sowie weiterer Oxidoreduktasen in % bezogen auf den jeweils angegebe nen Standard genannt.

Die Bezeichnung Nb bedeutet "nicht bestimmt".

Erfindungsgemäß wird ein α-halogensubstituiertes pro pargylisches Keton mittels einer Alkoholdehydrogenase zu einem Alkohol reduziert, wonach durch Umsetzung mit einer Base unter Abspaltung der entsprechenden Halogen wasserstoffsäure ein Ringschluß zu einem propargyli schen Epoxid erfolgt.

Die Alkoholdehydrogenase kann beispielsweise aus ther mophilen Mikroorganismen, wie z. B. Thermoanaerobium brockii oder Thermoanaerobacter ethanolicus, aus Pfer deleber oder aus Lactobacillus, vorzugsweise Lactoba cillus brevis oder Lactobacillus kefir, vorzugsweise rekombinant, abstammen. Es sollen dabei auch die ent sprechenden Muteine umfaßt sein, welche durch ein Al lel, Homolog oder Derivat der zugehörigen Nucleotidse quenz exprimiert werden können. Von den Alkoholdehydro genasen von Lactobacillus brevis und Lactobacillus ke fir können auch biologisch aktive Teile, eine modifi zierte Form (z. B. zur Erhöhung der Temperaturstabili tät), Isoenzyme oder Mischungen davon eingesetzt wer den. Unter modifizierten Enzymen sind Alkoholdehydroge nasen, vorzugsweise aus Lactobacillus, vorzugsweise Lactobacillus brevis oder Lactobacillus kefir, zu ver stehen, bei denen Änderungen in der Sequenz, beispiels weise am N- und/oder C-Terminus des Polypeptids oder im Bereich konservierter Aminosäuren vorliegen, ohne je doch die Funktion des Enzyms zu beeinträchtigen. Diese Veränderungen können durch den Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren nach bekannten Methoden vorgenom men werden.

Unter Isoenzymen sind Enzyme mit gleicher oder ver gleichbarer Substrat- und Wirkungsspezifität zu verste hen, die jedoch eine unterschiedliche Primärstruktur aufweisen.

Die Alkoholdehydrogenase, die bevorzugt aus Pferdeleber oder thermophilen Mikroorganismen (wie z. B. Thermoanaerobium brockii oder Thermoanaerobacter ethanolicus) oder aus Lactobacillus stammt, und in einer besonders bevorzugten Ausführungsform in Escherichia coli rekom binant überexpremiert wird, setzt die Verbindungen der allgemeinen Formel 1 um. Wird die Reaktion nicht in einer Ganzzelltransformation durchgeführt, so wird ein Cofaktor, wie beispielsweise NAD(P)H, zugesetzt.

Formelbild 1 zeigt den Reaktionsablauf für das erfin dungsgemäße Verfahren, bei dem R¹ ein Rest R, R² ein Halogen, vorzugsweise Chlor oder Brom ist, ADH eine Al koholdehydrogenase, vorzugsweise aus Lactobacillus, vorzugsweise Lactobacillus brevis oder Lactobacillus kefir, ist und als isoliertes Enzym, als zellfreier Rohextrakt oder in einer Ganzzelltransformation einge setzt werden kann, und die Base vorzugsweise eine Amin- Base oder Amidin-Base, vorzugsweise DBU ist.

Formelbild 1

Vorteilhafterweise werden die Alkohole und Epoxide in enantiomerenreiner Form (ee < 99%) gebildet. Die Epoxi de werden aus kommerziell erhältlichen Edukten, ausge hend von einem dem Formelbild 1 vorgelagerten Schritt, in nur drei Synthesestufen dargestellt. Die Epoxide werden in guter Gesamtausbeute (70-90% bezogen auf die Reduktion und Epoxidierung) gebildet, so daß das erfindungsgemäße Verfahren besonders wirtschaftlich ist. Die Chiralität wird durch eine katalytische Reak tion eingeführt, wobei die Aufarbeitung durch Extrakti on einfach und effizient durchgeführt werden kann. Für die erfindungsgemäße Synthese kann eine Vielzahl von Alkinonen eingesetzt werden, welche sich durch eine Vielfalt an Substituenten an der Dreifachbindung unter scheiden. Diese Substituenten können auch reaktive funktionelle Gruppen einschließen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.

Im ersten Syntheseschritt des Verfahrens wird ein α- Halogen-, bevorzugt α-Chlor- oder α-Brom- substituier tes propargylisches Keton, wie es in Formelbild 2 dar gestellt ist, reduziert. Die Reduktion wird durch eine Alkoholdehydrogenase, vorzugsweise aus Lactobacillus, vorzugsweise Lactobacillus brevis oder Lactobacillus kefir, katalysiert. Die Umsetzung erfolgt hoch enantio selektiv, wodurch die prochiralen, propargylischen Ke tone zu Alkoholen mit einem ee < 99% reduziert werden. Hierbei können unterschiedlichste Substituenten und funktionelle Gruppen an der Dreifachbindung des Ketons eingesetzt werden, wobei auch Verbindungen mit reakti ven funktionellen Gruppen ohne Nebenreaktionen in 100% Umsatz zu den gewünschten Produkten reduziert werden. Diese große Toleranz gegenüber Substituenten an der Dreifachbindung eröffnet einen allgemeinen Zugang zur Synthese von optisch aktiven, propargylischen, termina len Epoxiden. Da die enzymatische Reduktion durch kontinuierliche oder diskontinuierliche Extraktion aufge arbeitet wird, können die Alkohole in hohen Ausbeuten isoliert werden.

Formelbild 2

Überraschenderweise führt die Reduktion von Propargyl- Ketonen mit einer terminalen Dreifachbindung (R¹ = H, R² ≠ H), insbesondere bei der Verwendung von ADH aus Lactobacillus brevis, zu einer formalen Konfigurations umkehr bei den Produkten. Auch diese Alkohole besitzen einen ee < 99%. Die Dreifachbindung kann anschließend deprotoniert und mit vielfältigen Substituenten ver knüpft werden. Durch diesen zusätzlichen Synthese schritt ergibt sich ein einfacher Zugang zu beiden Enantiomeren propargylischer Alkohole in hohen opti schen Reinheiten, wobei die Einführung der Chiralität jeweils vom selben Enzym katalysiert wird.

α-Halogen-substituierte Propargylalkohole bilden die Zwischenstufe des vorliegenden Verfahrens. In einem UV- Assay sind verschiedene α-Chlor- bzw. α-Brom-substi tuierte Propargylketone (Formelbild 2) mit der Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus brevis umgesetzt worden (Tabelle 1). Bei allen von uns getesteten Alkinonen zeigte dieses Enzym eine hohe Reduktionsaktivität. Um die gemessenen Aktivitäten zu bestätigen, wurden die Ketone anschließend in Batch-Ansätzen präparativ zu den entsprechenden Alkoholen in 100% Umsatz reduziert. Die Cofaktorregenerierung kann über ein Coenzym (z. B. Formiatdehydrogenase, Formiat) erfolgen. Alternativ kann der Cofaktor NADPH in Anwesenheit eines sekundären Alkohols (z. B. i-Propanol) von der LB-ADH selbst rege neriert werden. Hierdurch ergibt sich ein weiterer Vor teil, da viele Enzyme von den hier eingesetzten α- Halogen-Ketonen alkyliert und dadurch inhibiert bzw. desaktiviert werden können, wodurch Probleme bei der Anwendung von Coenzymen entstehen. In allen durchge führten Batch-Ansätzen konnten die zuvor bestimmten ho hen Aktivitäten bestätigt werden. Die Charakterisierung der propargylischen Alkohole ergab einen ee < 99%. Ein Vergleich der Aktivitäten bei den chlorierten mit den entsprechenden nicht chlorierten Ketonen zeigte, daß die Aktivität durch einen α-Chlor-Substituenten überra schenderweise um nur maximal 50% verringert wird (s. Tabelle 2). Dies ist ein unerwartet gutes Ergebnis, da für die enzymatische Umsetzung α-halogensubstituierter Keton-Substrate geringere Aktivitäten erwartet werden, bzw. aufgrund des hohen Alkylierungspotentials der Sub strate eine Deaktivierung der Alkoholdehydrogenase ver mutet werden könnte. Weitere Substrat-Screenings (s. Tabelle 3) wurden daher mit den nicht chlorierten pro pargylischen Ketonen durchgeführt, da diese meist kos tengünstiger zugänglich sind. Die hohen Aktivitäten [bei weiterhin einheitlichem ee von < 99%] der unter schiedlichen nicht chlorierten Substrate zeigen, daß auch bei diesen vielfältigen Substituenten an der Drei fachbindung die entsprechenden α-chlorierten bzw. α- bromierten Ketone für das vorliegende Verfahren verwen det werden könnten.

Der Rest R¹ ist eine Komponente aus der Gruppe gesät tigter oder ungesättigter aliphatischer, aromatischer oder heteroaromatischer Kohlenwasserstoffe, die einfach oder mehrfach substituiert sein kann, wobei die Substi tuenten Alkyl- (beispielsweise geradkettiges, verzweig tes, gesättigtes, ungesättigtes, cyclisches Alkyl), Aryl- (beispielsweise Phenyl-, Tosyl-, Naphthyl-, kon densierter Aromat, Heteroaromat) oder Aralkyl-Gruppen oder Heteroatome, wie z. B. F, Cl, Br, I oder O, S, P, N oder Kombinationen davon sein können. Weiterhin kann der Rest R¹ eine Komponente aus der Gruppe der Silyl- Verbindungen (beispielsweise Trialkylsilyl-, Dialkyl arylsilyl-, Diarylalkylsilyl-), der Carbonyle (bei spielsweise Ester), der Amine (beispielsweise tert. Amin, sec Amin, prim. Amin, cyclisches Amin) oder ein Proton sein.

Die Auflistung soll jedoch nur beispielhaft und nicht beschränkend sein.

R² kann eine Komponente aus der Gruppe der Halogene, bevorzugt Cl und Br sein.

Die Reduktion zeichnet sich somit neben der hohen Enan tioselektivität durch ein sehr breites Substratspektrum aus, da alle von uns eingesetzten propargylischen Keto ne, welche an der Dreifachbindung unterschiedlichste Substituenten und funktionelle Gruppen R¹ tragen, umge setzt wurden.

Alle Alkohole, die am Acetylen-Rest substituiert sind (R¹ ≠ H), besitzen (R)-Konfiguration, wenn sie nicht α- halogeniert sind (R² = H) und (S)-Konfiguration im Fal le der α-halogenierten Produkte (R² = Halogen).

Die Reduktion kann in einem Temperaturbereich zwischen 0°C und 90°C, vorzugsweise 5-70°C, besonders be vorzugt 15-40°C, durchgeführt werden.

Der pH-Wert kann zwischen 4 und 10 liegen, idealerweise liegt er bei 5-8, bevorzugt 6,5.

Die enzymatische Reaktion kann in wäßriger Lösung durchgeführt werden, jedoch können auch organische Lö sungsmittel, vorzugsweise wasserlösliche Lösungsmittel, vorzugsweise niederkettige Alkohole, vorzugsweise 1- Propanol oder Ethanol, beigemischt sein. Die Beimi schung kann bis zu ca. 30% des organischen Lösungsmit tels betragen und hat zur Folge, daß die organischen Reaktionskomponenten besser gelöst werden. Weiterhin kann die enzymatische Reaktion auch ohne Lösungsmittel, z. B. in der Gasphase, durchgeführt werden.

Die milden Bedingungen der enzymatischen Reduktion von (pH = 5-8, Raumtemperatur) in Zusammenhang mit der einfachen Aufarbeitung (die Produkte können durch Ex traktion bzw. Adsorption-Elution, z. B. an Harzen, rein erhalten werden) stellen einen schonenden Produktzugang dar, der auch die Darstellung von Alkoholen mit reakti ven Substituenten ermöglicht.

Die besonderen Vorteile dieses Reaktionsschrittes sind die Enantiomerenreinheit der Produkte (ee < 99%) sowie das extrem breite Substrat-Spektrum der eingesetzten ADH. Weiterhin ist für die Cofaktorregenerierung nicht zwingend ein Coenzym notwendig (die eingesetzte ADH kann bei Zugabe von Cosubstrat den Cofaktor selber re generieren) und es liegen milde Reaktionsbedingungen, wie pH = 5-8 und Raumtemperatur, vor. Außerdem ist die Isolierung der Produkte besonders einfach.

Die Reduktion von Propargyl-Ketonen mit einer termina len Dreifachbindung (R¹ = H, R² ≠ H) führt überraschen derweise zu einer formalen Konfigurationsumkehr bei den Produkten, insbesondere bei der Reduktion mit LB-ADH. Auch diese Alkohole werden hochenantioselektiv gebildet (Ausnahme: R² = CH₃; ee = 34%). Die terminale Drei fachbindung kann anschließend deprotoniert und vielfäl tig substituiert werden. Das entsprechende Synthese schema ist in Fig. 1 dargestellt. Durch diesen zusätz lichen Syntheseschritt ergibt sich ein einfacher Zugang zu beiden Enantiomeren propargylischer Alkohole in ho hen optischen Reinheiten, wobei die Einführung der Chi ralität jeweils vom selben Enzym katalysiert wird.

Der größte Nachteil bei der Reduktion von Ketonen mit einer Oxidoreduktase ist, daß nur eines der beiden ge wünschten Enantiomere zugänglich ist. Durch die Reduk tion mit der Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus brevis oder Lactobacillus kefir ist eine Vielzahl von propargylischen Alkoholen mit unterschiedlichsten Res ten an der Dreifachbindung zugänglich (R¹ ≠ H, R² = R). Diese Alkohole besitzen die (R)-Konfiguration (bzw. (S) im Falle der α-halogenierten Substrate). Überraschen derweise führt jedoch der Einsatz von Ketonen mit einer terminalen Dreifachbindung (R¹ = H), insbesondere bei der Reduktion mit ADH aus Lactobacillus brevis, zu einer formalen Konfigurationsumkehr bei den Produkten, sobald R² ≠ H ist (Tabelle 4). Die formale Konfigurati onsumkehr findet bereits bei 1-Pentin-3-on (R¹ = H, R² = CH₃) statt. Hier ist der Größenunterschied der Substituenten allerdings noch nicht αusreichend, um einen ee < 99% zu erreichen. Überraschenderweise wer den alle anderen von uns getesteten Ketone mit termina ler Dreifachbindung (R¹ = H, R² ≠ H) zu den enantiome renreinen (S)-Alkoholen (bzw. (R) im Falle der α- halogenierten Substrate) reduziert (s. Tabelle 4).

Dieses ist die erste Beschreibung einer Oxidoreduktase, die Alkohole mit gegensätzlicher Konfiguration enantio merenrein (ee < 99%) erzeugen kann. Durch einen zu sätzlichen chemischen Schritt wird diese Fähigkeit dazu verwendet, beide Enantiomere desselben Propargyl- Alkohols unter Verwendung nur einer Alkoholdehydrogena se optisch rein zu synthetisieren (s. Fig. 1): Nach der enzymatischen Reduktion von 1-Chlor-3-butin-2-on zu (R)-1-Chlor-3-butin-2-ol (oder der entsprechenden Brom verbindungen) kann die terminale Dreifachbindung mit einer Base deprotoniert und mit vielfältigen Funktiona litäten substituiert werden. Jedoch ist diese Reihen folge nicht zwingend, vielmehr kann auch der Ringschluß gemäß Reaktionsschritt 2 des Formelbildes 1 zum Epoxid zuerst und danach der Ersatz des Protons der terminalen Alkingruppe erfolgen.

Als Base kommen beispielsweise Metallorganyle, vorzugs weise Lithiumorganyle, (z. B. n-Butyl-Lithium), Alkoho late (z. B. Kalium-t-Butylat), Amide (z. B. LDA) in Be tracht. Die Deprotonierung wird dabei in einem vorzugs weise inerten, nicht protischen organischen Lösungsmit tel, beispielsweise Ethern (z. B. Diethylether, THF) oder Alkanen (z. B. Pentan, Hexan) bei einer Temperatur in einem Bereich von vorzugsweise -150°C bis 50°C, besonders bevorzugt -80°C bis 10°C, durchgeführt. An Stelle des Protons kann ein beliebiger Substituent an die Position R^1' eingeführt werden.

Als R^1' kommen praktisch alle Substituenten in Be tracht, welche nach der aufgezeigten Vorgehensweise eingeführt werden können, beispielhaft können jedoch dieselben Substituenten genannt werden, welche für R¹ angeführt wurden. Dieser allgemeine Zugang ermöglicht die Synthese einer großen Zahl propargylischer Alkoho le. In Verbindung mit der enzymatischen Reduktion von Ketonen, die an der Dreifachbindung substituiert sind, ergibt sich erstmals die Möglichkeit, beide Enantiomere einer Vielzahl von α-Halogen-propargylalkoholen optisch rein darzustellen.

Zum ersten Mal ist es möglich, mittels nur einer Oxido reduktase, Alkohole mit gegensätzlicher Konfiguration enantiomerenrein (ee < 99%) zu erzeugen. Es kann eine Vielzahl von Substituenten an die Dreifachbindung ein geführt werden, und es ist eine präzise Vorhersage der absoluten Konfiguration der Alkohole möglich.

Die enzymatische Reduktion der propargylischen α- Halogen-Ketone kann alternativ zu ADHs aus Lactobacil lus auch mit anderen Oxidoreduktasen durchgeführt wer den. Sowohl Pferdeleber-ADH (HL-ADH), Thermoanaerobium brockii-ADH (TB-ADH), Candida boidinii-ADH (CB-ADH) als auch Candida parapsilosis-Carbonyl Reduktase (CPCR) re duzieren beispielsweise 4-Phenyl-1-chlor-3-butin-2-on und 4-t-Butyldimethylsilyl-1-chlor-3-butin-2-on zu dem entsprechenden Alkohol (s. Tabelle 5). Bei allen aufge führten Enzymen konnte die Aktivität in Batch-Ansätzen bestätigt werden, indem die Bildung der chiralen pro pargylischen Alkohole chromatographisch und spektrosko pisch nachgewiesen wurde.

Der zweite und abschließende Schritt des vorliegenden Verfahrens ist die Überführung des enantiomerenreinen Alkohols in das Epoxid. Der Schritt erfolgt durch Eli mination von HX (X = Halogen) mittels einer Base unter Erhalt der Enantiomerenreinheit.

Als Basen können beispielsweise Hydroxide, Alkoholate, Cyanid-Ionen, Aminbasen, wie primäre, sekundäre oder tertiäre Amine, cyclische Amine, Amidin-Basen wie DBN oder vorzugsweise DBU, oder allgemein bevorzugt milde Basen eingesetzt werden.

Die Reaktion gelingt unter Verwendung von DBU als scho nende Base bereits bei Raumtemperatur und verläuft mit 100% Umsatz (s. Formelbild 3). Je nach Funktionalisie rung beträgt die isolierte Ausbeute 60-80%. Sämtli che getesteten Substituenten und funktionellen Gruppen an der Dreifachbindung sind unter den sehr milden Be dingungen stabil. Somit können die (durch die enzymati sche Reduktion in großer Vielfalt zugänglichen) α-halo genierten, propargylischen Alkohole für die Epoxidbil dung eingesetzt werden, wodurch die Reaktion allgemeine Anwendbarkeit besitzt. Die Reaktion verläuft racemesie rungsfrei, wodurch der ee von < 99% erhalten bleibt.

Formelbild 3

Vorteilhafterweise ist dieser Reaktionsschritt allge mein anwendbar, liefert gute bis hohe Ausbeuten bei milden Bedingungen und es findet keine Racemisierung statt.

Der Rest R¹ ist eine Komponente aus der Gruppe gesät tigter oder ungesättigter aliphatischer, aromatischer oder heteroaromatischer Kohlenwasserstoffe, die einfach oder mehrfach substituiert sein kann, wobei die Substi tuenten Alkyl- (beispielsweise geradkettiges, verzweig tes, gesättigtes, ungesättigtes, cyclisches Alkyl), Aryl-(beispielsweise Phenyl-, Tosyl-, Naphthyl-, kon densierter Aromat, Heteroaromat) oder Aralkyl-Gruppen oder Heteroatome, wie z. B. F, Cl, Br, I oder O, S, P, N oder Kombinationen davon sein können. Weiterhin kann der Rest R¹ eine Komponente aus der Gruppe der Silyl- Verbindungen (beispielsweise Trialkylsilyl-, Dialkyl arylsilyl-, Diarylalkylsilyl-), der Carbonyle (bei spielsweise Ester), der Amine (beispielsweise tert. Amin, sec Amin, prim. Amin, cyclisches Amin) oder ein Proton sein.

Die Auflistung soll jedoch nur beispielhaft und nicht beschränkend sein.

R² kann eine Komponente aus der Gruppe der Halogene, bevorzugt Cl und Br sein.

Die Reaktion kann in zahlreichen Lösungsmitteln durch geführt werden. Beispielsweise kommt Wasser sowie wäß rige Puffersysteme oder ein protisches oder aprotisches Lösungsmittel oder ein Lösungsmittelgemisch in Be tracht, die Reaktion kann aber auch ohne Lösungsmittel (z. B. in der Gasphase) stattfinden.

Die nach dem Stand der Technik bekannten Verfahren zur Darstellung propargylischer, terminaler Epoxide sind bei den hier angegebenen Substraten nur bedingt anwend bar. Die Ausbeuten liegen meist bei kleiner als 10% und ein Teil der funktionalisierten Alkohole ist unter diesen Bedingungen nicht stabil.

Da dieses Verfahren den ersten allgemeinen Zugang zu optisch aktiven, propargylischen, terminalen Epoxiden in hohen optischen Reinheiten darstellt, ergeben sich eine Vielzahl an neuen Anwendungsmöglichkeiten z. B. für die Naturstoff- und Wirkstoff-Synthese. Die nucleophile Öffnung der Epoxide eröffnet Zugang zu einer Reihe interessanter Verbindungen. So bildet sich beispielsweise bei Zugabe von 1.2 Äquivalenten KCN in Ethanol/Wasser (4/1) bei RT bereits nach 12 h das entsprechende Nitril unter 100% Umsatz. Nach Extrakti on wird ohne weitere Aufarbeitung das reine Produkt er halten. Für die Synthese des Nitrils ist die vorherige Isolierung des Epoxides nicht notwendig, da es unter den beschriebenen Bedingungen auch direkt aus dem halo genierten Alkohol gebildet werden kann (Formelbild 4). Die Zwischenstufe des Epoxides wurde mittels GC-MS nachgewiesen, wird jedoch sofort in situ umgesetzt. Das erhaltene Nitril kann z. B. in der Synthese von HMG-CoA Reduktase Inhibitoren eingesetzt werden. Diese Synthese wird in K. Takahashi, T. Minami, Y. Ohara, T. Hiyama, Bull. Chem. Soc. Jpn. 1995, 68, 2649 beschrieben, wobei das verwendete Nitril (R¹ = TBDMS; s. Formelbild 4) in einer 7 Stufen-Synthese dargestellt wurde.

Formelbild 4

Experimenteller Teil Methoden

Alle Lösungsmittel wurden in p. a. Qualität verwen det und falls nötig nach Standardmethoden getrocknet. Die Chemikalien wurden von Aldrich, Lancaster, TCI und Fluka bezogen. HL-ADH, TB-ADH und CB-ADH wurden von Sigma bezogen; LB-ADH und CPCR wurden am Institut für Enzymtechnologie der Heinrich-Heine Universität Düsseldorf isoliert (für LB-ADH s.: B. Riebel, Dissertation, Heinrich-Heine-Universität Düs seldorf, 1996; für CPCR s.: J. Peters, Dissertation, Hein rich-Heine-Universität Düsseldorf, 1993). DC: Kieselgel 60 F254 (Merck). Säulenchromatographie: Kieselgel 60 (Merck). NMR-Spektren: AMX-300 (¹H: 300 MHz, ¹³C: 75.5 MHz) der Bruker Physik AG. Chemische Verschiebungen sind in ppm relativ zu CHCl₃ als internen Standard angegeben. GC: Chrompack CP9002 mit einer FS-Cyclodex-β-I/P (CS GmbH) und einer Lipodex E Säule (Macherey-Nagel). HPLC: Hewlett Packard Series 1100 mit einer Chiracel OB und einer Chiralpak AD Säule (Daicel Chem. Ind.) bei 20°C, 0.5 ml/min. GCMS: HP 6890 series GC- system ausgestattet mit einem HP 5973 Massendetektor (EI, 70 eV) und einer HP-5MS Säule (T_GC(Injektor) = 250°C, Zeitprogramm (Ofen): T_0min = 60°C, T_3min = 60°C, T_14min = 280°C (20°/min), T_19min = 280°C. Drehwerte: Polarimeter 241 (Perkin Elmer).

Substratdarstellung

Die propargylischen Ketone wurden nach literaturbekann ten Methoden dargestellt. Die Synthese kann über Depro tonierung eines terminalen Alkins mit anschließender Kupplung eines Weinreb-Amids(S. Nahm, S. M. Weinreb, Tetrahedron Lett. 1981, 22, 3815), über die Kupplung eines Trimethylsilyl-substituierten Alkins mit einem Säurechlorid (L. Birkofer, A. Ritter, H. Uhlenbrauck, Chem. Ber. 1963, 96, 3280) sowie über die Oxidation des entsprechenden Alkohols (K. Bowden, I. M. Heilbron, EL R. H. Jones, B. C. L. Weedon, J. Chem. Soc. 1946, 39) durchgeführt werden.

Reduktion Enzyme Assays

Für die photometrische Bestimmung der Enzym-Aktivität wurden folgende Lösungen zusammengege ben und die Abnahme der Extinktion bei 340 nm verfolgt (ε_NAD(P)H 6.22 L mol^-1 cm^-1), 20°C: 970 µL Lösung des Ke tons in TEA/NaOH-Puffer (5 mM Keton [2 mM bei aroma tisch substituierten Alkinonen aufgrund der geringeren Löslichkeit], 100 mM TEA, 1 mM MgCl₂) pH 7.0, 20 µL NAD(P)H (12.5 mM) und 10 µL Enzym-Lösung. Die Anfangs abnahme der Extinktion wurde aufgezeichnet und relativ zu den Werten des Standard-Substrats 5-Oxo-hexansäure ethylester gesetzt.

LB-Alkoholdehydrogenase katalysierte Reduktionen von propargylischen Ketonen (präparativer Maßstab)

Das Keton (1 mmol) wurde bei RT mit 50 mg NADP⁺, 1.5 mL 1-Propanol und 50 U LB-ADH (1 U Enzym reduziert 1 µmol Substrat pro Minute) in 100 mL TEA/NaOH-buffer (100 mM TEA, 1 mM MgCl₂; pH 6.5) gerührt. Nach 16 h wurde die Reaktionsmischung mit CH₂Cl₂ (3 × 40 mL) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat getrocknet, im Vakuum aufkonzent riert und über Kieselgel chromatographiert (Hexan/ Ethylacetat).

(R)-4-Phenyl-3-butin-2-ol

85% Ausbeute; ee < 99% bestimmt mittels HPLC auf Chiracel OB (i-Hexane : i-Propanol = 95 : 5), R_t = 24.3 min (R); ¹H-NMR (CDCl₃): δ = 1.55 (d, J = 6.6 Hz, 3H, CH₃), 2.13 (s, 1H, OH), 4.75 (q, J = 6.6 Hz, 1H), 7.31-7.42 (m, 5H, Ar-H). - ¹³C-NMR(CDCl₃): δ = 24.3 (CH₃), 58.7 (CH), 83.9, 90.9 (C_q), 122.5, 128.2, 128.3, 131.6 (C_ar). - GCMS: R_t = 8.0 min; m/z (%) = 146 (50) [M⁺], 131 (100) [M⁺ - CH₃], 103 (61) [M⁺ - CH₃ - CO], 77 (35) [C₆H₅ ⁺]. [α] 22|D +43.8 (c = 0.6, Et₂O) (Literaturwert von (S)-2a: [α] 25|D -44.8 (c = 1.0, Et₂O, ee = 97%); K. Nakamura, K. Takena ka, A. Ohno, Tetrahedron: Asymmetry 1998, 9, 4429.)

(R)-4-(4-Methoxy-phenyl-3-butin-2-ol

64% Ausbeute; ee < 99% bestimmt mittels HPLC auf Chiracel OB (i-Hexan : i-Propanol = 85 : 15), R_t = 29.0 min (R); ¹H-NMR (CDCl₃): δ = 1.55 (d, J = 6.5 Hz, 3H, CH₃), 1.90 (s, 1H, OH), 3.80 (s, 3H, OCH₃), 4.75 (q, J = 6.5 Hz, 1H), 6.82 (d, J = 9.5 Hz, 2H), 7.37 (d, J = 9.5 Hz, 2H, Ar-H). - ¹³C-NMR (CDCl₃): δ = 24.7 (CH₃), 55.5 (OCH₃), 59.1 (CH), 84.1, 89.8 (Cq), 114.1, 114.8, 133.3, 159.8 (C_ar). - GCMS: R_t = 10.3 min; m/z (%) = 176 (40) [M⁺], 161 (100) [M⁺ - CH₃], 145 (5) [M⁺ - 2CH₃], 133 (26) [M⁺ - CH₃ - CO], 118 (14) [M⁺ - 2CH₃ - CO]. [α] 22|D + 34.8 (c = 1.0, Et₂O) (Literaturwert von (S)-2b: [α] 25|D- 35.1 (c = 1.0, Et₂O, ee = 97%); K. Nakamura, K. Takenaka, A. Ohno, Tetrahedron: Asymmetry 1998, 9, 4429.)

(S)-1-Pentin-3-ol

81% Ausbeute; ee = 34% bestimmt mittels GC auf Lipodex E (T = 35°C), R_t = 30.5 min (S) + 32.0 min (R); ¹H-NMR (CDCl₃): δ = 1.01 (t, J = 7.2 Hz, 3H, CH₃), 1.72 (m, 2H, CH₂), 2.12 (s, 1H, OH), 2.40 (s, 1H, C1), 3.98 (t, J = 6.6 Hz, 1H, C3). - ¹³C-NMR (CDCl₃): δ = 9.4 (CH₃), 30.6 (CH₂), 63.3 (CHOH), 72.9 (CH), 84.9 (C_q). [α] 22|D -8.4 (c = 0.5, Et₂O) (Lite raturwert von (R)-6a: [α] 22|D +34.0 (c = 2.2, Et₂O, ee < 97%); O. Steiner, C. Tamm, Tetrahedron Lett. 1993, 34, 6729.)

(S)-1-Hexin-3-ol

86% Ausbeute; ee < 99% bestimmt mittels GC auf HP FS-Cyclodex-β-I/P (T = 60°C), R_t = 26.3 min (S); ¹H-NMR (CDCl₃): δ = 0.94 (t, J = 7.3 Hz, 3H, CH₃), 1.42 - 1.77 (m, 4H, CH₂), 2.10 (s, 1H, C1), 2.12 (s, 1H, OH), 4.27 (t, J = 6.5 Hz, 1H, C3). - ¹³C- NMR (CDCl₃): δ = 18.4 (CH₃), 25.5 (CH₂), 39.8 (CH₂), 64.5 (CHOH), 66.0 (CH), 72.9 (C_q). - GCMS (T = 60°C): R_t = 4.2 min; m/z (%) = 97 (5) [M⁺ - H], 83 (33) [M⁺ - CH₃], 70 (17) [M⁺ - H₂O], 55 (100) [M⁺ - CH₃ - CO]. [α] 22|D -35.1 (c = 1.5, Et₂O) (Literaturwert: [α] 22|D -24.0 (c = 2.4, Et₂O; ee = 68%); K. Mori, H. Akao, Tetra hedron 1980, 36, 91.)

(S)-4-t-Butyldimethylsilyl-1-chlor-3-butin-2-ol

55% Ausbeute; ¹H-NMR (CDCl₃): δ = 0.16 (s, 6H, Si-CH₃), 0.98 (s, 9H, t-bu), 2.51 (s, 1H, OH), 3.68 (d, J = 4.0 Hz, 2H, CH₂Cl), 4.51 (t, J = 4.0 Hz, 1H, CH). - ¹³C-NMR (CDCl₃): δ = - 1.3 (SiCH₃), 12.1 (t-bu-C_q), 23.4 (t-bu-CH₃), 48.6 (CH₂), 63.1 (CHOH), 92.0, 102.4 (Cq) - GCMS: R_t = 8.1 min; m/z (%) = 218 (5) [M⁺], 203 (1) [M⁺ - CH₃], 161 (21) [M⁺ - t-Bu], 95 (100) [M⁺ - t-bu - 2CH₃ - Cl]. (Der Drehwert wird nach der folgenden Syn thesestufe bestimmt; s. (S)-1-t-Butyldimethylsilyl-3,4- epoxy-1-butin)

Synthese der racemischen Alkohole und Trennung der Enantiomere (Analytischer Maßstab)

Das propargylische Keton (10 µmol) und 0.2 mg NaBH₄ (5 µmol) wurden in 1 ml EtOH 1 h bei 0°C gerührt. Die Reaktionsmischung wird mit 1 M HCl (1 ml) hydrolisiert, gesättigte NaCl-Lösung (4 ml) zugegeben und die Reakti onsmischung mit CH₂Ol₂ (1 ml) extrahiert. Alle Alkohole wurden in 100% Umsatz erhalten.

4-Phenyl-3-butin-2-ol

Die Enantiomere wurden mittels HPLC auf Chiracel OB getrennt (i-Hexan : i-Propanol = 95 : 5), R_t = 24.3 min (R) + 31.9 min (S).

4-(4-Methoxy-phenyl)-3-butin-2-ol

Die Enantiomere wur den mittels HPLC auf Chiracel OB getrennt (i-Hexan : i- Propanol = 85 : 15), R_t = 29.0 min (R) + 38.2 min (S).

1-Butin-3-ol

Die Enantiomere wurden mittels GC auf HP FS-Cyclodex-β-I/P (T = 35 0%) getrennt, R_t = 13.9 min (R) + 15.5 min (S).

1-Pentin-3-ol

Die Enantiomere wurden mittels GC auf HP Lipodex E (T = 35°C) getrennt, R_t = 30.5 min (S) + 32.0 min (R).

1-Hexin-3-ol

Die Enantiomere wurden mittels GC auf HP FS-Cyclodex-β-I/P (T = 60°C) getrennt, R_t = 26.3 min (S) + 28.4 min (R).

1-Octin-3-ol

Die Enantiomere wurden mittels GC auf HP FS-Cyclodex-β-I/P (T = 80°C) getrennt, R_t = 41.8 min (S) + 44.9 min (R). GCMS: R_t = 5.0 min; m/z (%) = 125 (3) [M⁺ - H], 111 (3) [M⁺ - CH₃], 107 (7) [M⁺ - H₂O - H], 97 (19) [M⁺ - C₂H₅], 83 (42) [M⁺ - CH₃ - CO], 55 (100) [C₄H₇]

1-Chloro-4-trimethylsilyl-3-butin-2-ol

GCMS: R_t = 7.0 min; m/z (%) = 176 (1) [M⁺], 161 (1) [M⁺ - CH₃], 127 (100) [M⁺ - CH₃ - Cl], 95 (93) [M⁺ - 3CH₃ - Cl].

1-Bromo-4-trimethylsilyl-3-butin-2-ol

GCMS: R_t = 7.7 min; m/z (%) = 221 (1) [M⁺], 206 (1) [M⁺ - CH₃], 139 (64) [M⁺ - Br], 127 (100) [M⁺ - CH₃ - Br].

Allgemeines Verfahren zur Analyse der 4-Silyl-3-butin- 2-ole

Die Silyl-Gruppe der Alkohole wurde durch die Zugabe von (Bu)₄NF (0.2 mL; 1 M in THF) in THF (1 mL) abgespalten. Nach 1 h wurde gesättigte NaCl-Lösung (2 mL) zugegeben und die Mischung mit CH₂C₂ extra hiert. Die Produkte wurden in 100% Umsatz erhalten und wie unten aufgeführt analysiert.

1-Chloro-3-butin-2-ol

Die Enantiomere wurden mittels GC auf Lipodex E (T = 60°C) getrennt, R_t = 59.1 min (S) + 65.4 min (R).

1-Bromo-3-butin-2-ol

Die Enantiomere wurden mittels GC auf Lipodex E (T = 70°C) getrennt, R_t = 67.2 min (S) + 70.7 min (R).

Enzym katalysierte Reduktion propargylischer Alkohole (Analytischer Maßstab)

Das Keton (10 µmol) wurde bei RT mit 0.5 mg NAD(P)⁺, 15 µL 2-Propanol (bei HL-ADH: 12 µL Ethanol) und 0.5 U Enzym in 1 mL TEA/NaOH-Puffer (100 mM TEA, 1 mM MgCl₂; pH 6.5) vorsichtig geschüt telt. Nach 16 h wurde die Reaktionsmischung mit 200 µL CH₂Ol₂ extrahiert. Die Analyse der Ansätze wurde wie oben beschrieben durchgeführt; die Aktivitäten, Konfi gurationen und ee-Werte der Alkohole sind in den Tabel len 1-5 angegeben.

Epoxidierung (S)-1-t-Butyldimethylsilyl-3,4-epoxy-but-1-in

Zu einer Lösung von 100 mg (460 µmol) (S)-4-t-Butyldimethyl silyl-1-chlor-3-butin-2-ol in 50 ml CH₂Cl₂ wurden bei RT 216 mg (1.4 mmol) DBU gegeben und gerührt. Nach 22 h wird die Lösung mit Wasser gewaschen, über Natriumsul fat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Säulenchro matographie (Pentan : CH₂Cl₂ = 3 : 1) ergaben 58 mg (317 µmol, 69% Ausbeute) des Epoxids.
¹H-NMR (CDCl₃): δ = 0.12 (s, 6H, Si-CH₃), 0.94 (s, 9H, t-bu), 2.92 (d, J = 3.4 Hz, 2H), 3.38 (t, J = 3.4 Hz, 1H). - ¹³C-NMR (CDCl₃): δ = - 4.6 (SiCH₃), 16.7 (t-bu- C_q), 26.2 (t-bu-CH₃), 40.1 (CH), 49.2 (CH₂), 87.8, 102.7 (C_q). - GCMS: R_t = 7.5 min; m/z (%) = 182 (8) [M⁺], 167 (4) [M⁺ - CH₃], 125 (100) [M⁺ - t-Bu], 109 (14) [M⁺ - t-bu - CH₃], 97 (76) [M⁺ - t-bu - CO]. [α] 22|D + 71.6 (c = 1.02, CH₂Cl₂) (Literaturwert von (R)-1-t-Butyl dimethylsilyl-3,4-epoxy-but-1-in: [α] 20|D - 72.3 (c = 5.63, CH₂Cl₂); T. Kanger, P. Niidas, A.-M. Müürisepp, T. Pehk, M. Lopp, Tetrahedron: Asymmetry 1998, 9, 2499.)

Folgechemie (R)- 4-t-Butyldimethylsilyl-1-cyano-3-butin-2-ol

Zu einer Lösung von 100 mg (460 µmol) (S)-4-t-Butyl dimethylsilyl-1-chlor-3-butin-2-ol in 100 ml ETOH/H₂O (4/1) wurden 38 mg (575 mmol) KCN gegeben und bei 50°C gerührt. Nach 16 h wird das Ethanol im Vakuum entfernt. Anschließend wird mit Ethylacetat extrahiert, die orga nischen Phasen über Natriumsulfat getrocknet und im Va kuum konzentriert. Ohne weitere Aufreinigung wurden 73 mg (350 µmol, 76% Ausbeute) des reinen Nitrils er halten.
¹H-NMR (CDCl₃): δ = 0.16 (s, 6H, Si-CH₃), 0.98 (s, 9H, t-bu), 1.50 - 2.00 (s, 1H, OH), 2.78 (d, J = 5.8 Hz, 2H, CH₂CN), 4.66 (t, J = 5.8 Hz, 1H, CH). - ¹³C-NMR (CDCl₃): δ = - 4.6 (SiCH₃), 16.6 (t-bu-C_q), 26.2 (t-bu-CH₃), 27.6 (CH₂), 59.0 (CHOH), 91.3, 103.3 (C_q), 116.3 (CN). - GCMS: R_t = 9.5 min; m/z (%) = 191 (3) [M⁺ - H₂O], 176 (2) [M⁺ - H₂O - CH₃], 152 (64) [M⁺ - t-Bu], 134 (59) [M⁺ - t-Bu - H₂O], 111 (100) [M⁺ - t-Bu - CH₃ - CN].

Tabelle 1

Tabelle 2

Tabelle 3

Tabelle 4

Tabelle 5

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von optisch aktiven, pro pargylischen, terminalen Epoxiden der Formel 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß ein α-Halogen substituiertes propargylisches Keton mittels einer Alkoholdehydrogenase zu einem Alkohol reduziert wird und der resultierende op tisch aktive, propargylische Alkohol mit einer Base zu einem optisch aktiven, propargylischen, termina len Epoxid umgesetzt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Alkoholdehydrogenase eingesetzt wird, die von Lactobacillus, Thermoanaerobium, Thermoethano licus oder Pferdeleber abstammt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Alkoholdehydrogenase von Lactobacillus brevis oder Lactobacillus kefir abstammt.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Alkoholdehydrogenase von Thermoanaerobium brockii abstammt.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Alkoholdehydrogenase rekombinant ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß biologisch aktive Teile, eine modifizierte Form, Isoenzyme oder Mischungen der Alkoholdehydro genase einzeln oder in Kombination eingesetzt wer den.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Alkoholdehydrogenase in einer Ganzzell transformation oder isoliert eingesetzt wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das α-Halogen substituierte propargylische Ke ton eine Verbindung der allgemeinen Formel 2 ist:

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß R1 eine Komponente aus der Gruppe gesättigter oder ungesättigter aliphatischer, aromatischer oder heteroaromatischer Kohlenwasserstoffe, die einfach oder mehrfach substituiert sein kann, wobei die Substituenten Alkyl-, Aryl- oder Aralkyl-Gruppen oder Heteroatome, wie z. B. F, Cl, Br, I oder O, S, P, N oder Kombinationen davon sein können oder eine Komponente aus der Gruppe der Silyl-Verbindungen, der Carbonyle, der Amine oder ein Proton ist.

10. Verfahren nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß R2 ein Halogen, vorzugsweise Cl oder Br ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Base mindestens eine Komponente aus der Gruppe Hydroxyd, Alkoholat, Cyanid, Aminbase, Ami dinbase eingesetzt wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß als Base eine milde Base eingesetzt wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß als Base eine Amidin-Base, vorzugsweise DBU oder DBN eingesetzt wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Reduktion mittels der Alkoholdehydrogenase in einem Temperaturbereich zwischen 0°C und 90°C durchgeführt wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Reduktion in einem Temperaturbereich zwi schen 5°C bis 70°C durchgeführt wird.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Reduktion mit der Alkoholdehydrogenase bei einem pH-Wert von 4 bis 10 durchgeführt wird.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Reduktion mit der Alkoholdehydrogenase in wäßriger Lösung oder ohne Lösungsmittel durchge führt wird.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Reduktion mit der Alkoholdehydrogenase in der Gasphase durchgeführt wird.

19. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß der wäßrigen Lösung ein organisches Lösungsmit tel beigemischt wird.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung zu dem propargylischen Epoxid in einem Lösungsmittel durchgeführt wird.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung zu dem propargylischen Epoxid ohne Lösungsmittel durchgeführt wird.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß als α-Halogen substituiertes propargylisches Keton ein Keton mit einer terminalen Dreifachbin dung eingesetzt wird, wobei das Proton der termina len Dreifachbindung nach der Umsetzung mit der Al koholdehydrogenase durch einen Substituenten er setzt werden kann.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß das resultierende optisch aktive, propargyli sche, terminale Epoxid unter Öffnung des Epoxidrin ges als Ausgangsstoff für die Herstellung eines chiralen Produktes eingesetzt wird.