DE10019967A1 - Antikörper gegen natives gp96, deren Herstellung und Verwendung - Google Patents

Antikörper gegen natives gp96, deren Herstellung und Verwendung

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Abstract

Die Erfindung betrifft rekombinante Antikörper gegen natives gp96, Verfahren zu deren Herstellung, ihre Verwendung, Trennmaterialien, Vorrichtungen und Kits, die die genannten Antikörper umfassen, an natives gp96 gebundene Peptide und deren Isolierung, Nucleinsäuresequenzen, die die genannten rekombinanten Antikörper codieren, und Wirtszellen, die die genannte DNA beinhalten und die Herstellung entsprechender Antikörper ermöglichen.

Description

Die Erfindung betrifft rekombinante Antikörper gegen natives gp96, Verfahren zu deren Herstellung, ihre Verwendung, Trennmaterialien, Vorrichtungen und Kits, die die genannten Antikörper umfassen, an natives gp96 gebundene Peptide und deren Isolierung, Nucleinsäurese­ quenzen, die die genannten rekombinanten Antikörper codieren, und Wirtszellen, die die genannte DNA beinhalten und die Herstellung entsprechender Antikörper ermöglichen, sowie weitere unten be­ schriebene Aspekte.
Hintergrund der Erfindung
Das zur Gruppe der Hitzeschock-Proteine ("heat shock proteins") gehörende gp96 ist ein Protein, welches in der Lage ist, im Endo- plasmatischen Retikulum (ER) mit Peptiden zu assoziieren und so mit diesen einen immunogenen Kontext zu bilden. Werden solche gp96/Peptid-Komplexe in Mäuse injiziert, können starke Immunantworten induziert werden. Diese Immunantworten sind spezifisch für die assoziierten Peptide, wie durch Induktion spezifischer Antworten durch cytotoxische T-Lymphozyten belegt werden kann. Die hohe Effektivität insbesondere von gp96 ist möglicherweise durch die Tatsache erklärbar, dass antigenpräsentierende Zellen (z. B. Makrophagen, dendritische Zellen) Rezeptoren tragen, die spezifisch sind für Hitzeschock-Proteine und ihre effiziente Aufnahme ermög­ lichen. Basierend auf diesen Anwendungen können Hitzeschockproteine zur Krebs-Immuntherapie in Mäusen verwendet werden (siehe Tamura et al., Science 278, 117-120 (1994)). Weiter erscheinen sie als ideale Adjuvantien für auf individuelle Patienten massgeschneiderte Immunotherapie-Protokolle.
Um diese vielversprechenden Anwendungen zu ermöglichen, ist es jedoch erforderlich, das entsprechende Hitzeschock-Protein aus einer be­ grenzten Menge von Probenmaterial in sehr hoher Reinheit und in nativer Form zu erhalten. Hochspezifische monoklonale Antikörper (mAb), im Falle von gp96 gegen dieses Molekül, wären hierfür das ideale Hilfsmittel. Die bisher durch herkömmliche Immunisierungs­ protokolle hergestellten Antikörper sind jedoch von sehr begrenzter Eignung, da sie nur schwach mit dem nativen gp96 reagieren - mög­ licherweise, weil das native gp96 in den zur Immunisierung verwende­ ten Tieren intrazellulär im ER vorliegt, die im resultierenden B- Zell-Hybridom vorliegenden Antikörper jedoch ebenfalls im ER vor­ liegen und so eine Interferenz mit der normalen gp96-Funktion in den Hybridomzellen durch Reaktion von nativem gp96 mit dem gebildeten Antikörper vorliegt, die die entsprechenden Hybridomzellen nicht ihre Funktion wahrnehmen lässt.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Antikörper zur Verfügung zu stellen, welche die praktisch ausschließliche Erkennung von nati­ vem gp96 ermöglichen. Durch Verwendung rekombinanter Antikörper konnte nun diese Aufgabe gelöst werden.
Überblick über die Erfindung
Die vorliegende Offenlegung beschreibt die Konstruktion antigen-bin­ dender Domänen von gp96-spezifischen Antikörpern ausgehend von einer semi-synthetischen Immunglobulingen-Bibliothek. Die resultierenden Einzelketten-Antikörper (scFv Abs) werden für eine rasche Ein- Schritt-Methode zur chromatographischen Reinigung für die Isolierung von gp96-Molekülen verwendet. Diese sind immer noch in der Lage, spezifische Immunantworten auszulösen, wie native gp96-Moleküle, die mittels aufwendigerer konventioneller Protokolle gewonnen werden, bei denen ConA-Sepharose-Säulenchromatographie und weitere Reini­ gungsschritte Einsatz finden. Die ConA-Sepharose-Behandlung führt zu einer Kontaminierung mit ConA infolge von "Säulenbluten". Da ConA ein T-Zell-Mitogen ist, kann es störend mit dem Immunsystem einer zu impfenden Person oder eines zu impfenden Tieres interferie­ ren. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß Proteasen, wie Cathepsin E, in auf konventionelle Weise gereinigten gp96-Präparationen enthalten sind. All die potentiellen Risiken, die wegen der Kontaminatiorten von gp96 vorliegen, können vermieden werden durch Verwendung der erfindungsgemässen Affinitätsreinigung mittels re­ kombinanter scFv-Antikörper. Ausserdem beschleunigen diese den Reinigungprozess und erlauben die Prozessierung kleiner Tumorproben. Diese Merkmale machen die rekombinanten anti-gp96-Antikörper zu einem idealen Werkzeug für die Reinigung von gp96, das dann auch selbst in der Behandlung eingesetzt werden kann, beispielsweise von Krebs und Infektionserkrankungen.
Abbildungen (für weitere Details siehe auch Beispiele)
Fig. 1 zeigt die Sequenzanalyse der recombinanten scFv-Antikörper. Es werden die Aminosäuresequenzen der VH- und der VL-Kettenabschnitte gezeigt. Die VH-Segmente der B10C-, G12D- und H11B-Klone gehören zur VH1-Genfamilie und sind vom Keimbahngen DP-3 derivatisiert. Die VL-Gensegmentsequenzen sind identisch in allen Klonen und passen zum Vλ3-Gensegment IGLV3S1 /DPL16. Die bestimmten VH- und VL-Sequenzen wurden verglichen mit Sequenzen aus der V Base (Medical Research Council, Cambridge, U. H.), der GenBank und der EMBL-Sequenzdatenbank. Gezeigt werden jeweils die variablen VH- und VL-Regionen der schweren und leichten Kettenabschnitte; (FR = Gerüstregion; CDR = Komplementa­ ritätsdeterminierende Region). Die Unterbrechungen innerhalb der Sequenzdarstellung jeweils innerhalb der Sequenz der schweren und der leichten Kette sollen nicht fehlende Bindung bedeuten, sondern nur ermöglichen, unterschiedliche Abschnitte (FR1, CDR1 etc.) leichter zu erkennen. Tatsächlich bilden jeweils die Abschnitte FR1 bis FR4 der schweren und FR1' bis FR4' der leichten Kette eine zusammenhängende Kette. Es bedeuten (im Einbuchstabencode für Aminosäuren): Schwere Kette:
Bei Klon B10C: CDR3 = MPVSQMPH = SEQ ID NO: 1; CDR2 = LVDPEDGETIYA­ EKFQG = SEQ ID NO: 4; CDR1 = DYYMH = SEQ ID NO: 5. Gesamtsequenz von Anfang FR1 bis Ende FR4 = SEQ ID NO: 10.
Bei Klon G12D: CDR3 = IPLFGRDH = SEQ ID NO: 2; CDR2 LVDPEDGETIYA­ EKFQG = SEQ ID NO: 4; CDR1 = DYYMH = SEQ ID NO: 5. Gesamtsequenz von Anfang FR1 bis Ende FR4 = SEQ ID NO: 11.
Bei Klon H11B: CDR3 = LAAGN = SEQ ID NO: 3; CDR2 = LVDPEDGETIYAEKFQG = SEQ ID NO: 4; CDR1 = DYYMY = SEQ ID NO: 6. Gesamtsequenz von Anfang FR1 bis Ende FR4 = SEQ ID NO: 12.
Leichte Kette:
Bei allen drei Klonen: CDR1' = QGDSLRSYYAS = SEQ ID NO: 7; CDR2' = GKNNRPS = SEQ ID NO: 8; CDR3' = NSRDSSGNHVV = SEQ ID NO: 9. Gesamtsequenz von Anfang FR1' bis Ende FR4' = SEQ ID NO: 13.
Fig. 2: Diese Abbildung zeigt die den Aminosäuresequenzen in Fig. 1 zugrundeliegenden DNA-Sequenzen. Über den codierenden Tripletts ist jeweils der Beginn der Gerüst- und komplementaritätsdeterminier­ enden Regionen (FR1, CDR1 etc.) angegeben.
Codieren der Abschnitt für Schwere Kette:
Bei Klon B10C:
CDR3 = ATG CCG GTT AGT CAG ATG CCT CAT = SEQ ID NO: 14;
CDR2 = CTT GTT GAT CCT GAA GAT GGT GAA ACA ATA TAC GCA GAG AAG TTC
CAG GGC = SEQ ID NO: 17;
CDR1 = GAC TAC TAC ATG CAC = SEQ ID NO: 18.
Gesamtsequenz von Anfang FR1 bis Ende FR4 = SEQ ID NO: 23.
Bei Klon G12D:
CDR3 = ATT CCG TTG TTT GGG CGG GAT CAT = SEQ ID NO: 15;
CDR2 = CTT GTT GAT CCT GAA GAT GGT GAA ACA ATA TAC GCA GAG AAG TTC
CAG GGC = SEQ ID NO: 17;
CDR1 = GAC TAC TAC ATG CAC = SEQ ID NO: 18.
Gesamtsequenz von Anfang FR1 bis Ende FR4 = SEQ ID NO: 24.
Bei Klon H11B:
CDR3 = CTT GCT GCT GGT AAT = SEQ ID NO: 16;
CDR2 = CTT GTT GAT CCT GAA GAT GGT GAA ACA ATA TAC GCA GAG AAG TTC
CAG GGC = SEQ ID NO: 17;
CDR1 = GAC TAC TAC ATG TAC = SEQ ID NO: 19.
Gesamtsequenz von Anfang FR1 bis Ende FR4 = SEQ ID NO: 25.
Leichte Kette: Bei allen drei Klonen:
CDR1' = CAA GGA GAC AGC CTC AGA AGC TAT TAT GCA AGC = SEQ ID NO: 20;
CDR2' = GGT AAA AAC AAC CGG CCC TCA = SEQ ID NO: 21;
CDR3' = AAC TCC CGG GAC AGC AGT GGT AAC CAT GTG GTA = SEQ ID NO: 22.
Gesamtsequenz von Anfang FR1' bis Ende FR4' = SEQ ID NO: 26.
Fig. 3: Bindungsaktivität der rekombinanten Einzelketten (= Single Chain)-Fv-anti-gp96-Antikörper. Gereinigte scFv Abs werden auf die Bindung an Maus-gp96 untersucht, wobei auf einer Nitrocellulosemem­ bran (1) unter reduzierenden Bedingungen (SDS plus β-Merkaptoetha­ nol), (2) denaturierenden Bedingungen (SDS) und (3) nativen (PBS) Bedingungen untersucht wird. Die Membran wird mit monoklonalem Maus- IgG-Anti-Human-c-myc, polyklonalem Peroxidase-konjugiertem Kaninchen- Anti-Maus-IgG und Substrat entwickelt. Der monoklonale Ratten-IgG- Anti-gp96-Antikörper (SPA-850) dient als positive, ein scFv-Oestra­ diol-Antikörper als negative Kontrolle. Alle rekombinanten scFv-An­ tikörper binden nur an das native Antigen. neg. ctr. = negative Kontrolle, pos.ctr. = positive Kontrolle.
Fig. 4: Präzipitation von nativem gp96 von Maus-Tumorzelllysaten. Hypotone Lsyate radioaktiv markierter IGELa2-Zellen werden mit den genannten Antikörpern inkubiert, gefolgt von Protein-G-Sepharose- Präzipitation und SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese. Die Kontroll­ bahn zeigt Präzipitation nur mit Protein-G-Sepharose alleine als Kontrolle. (1) = Kontrolle, (2) = Anti-BiP (SPA-847), (3) = Anti-gp96 (SPA-850), (4) = scFv (Klon H11B).
Fig. 5: Chromatographische Reinigung von nativen gp96-Molekülen. Hypotone Lysate von radiomarkierten IGELa2- und humanen C1R-Zellen werden mit rekombinanten anti-gp96-scFv-Antikörpern oder BSA als Negativkontrolle, jeweils immobilisiert auf Sepharose-Beads, inkubiert. Die Immunkomplexe werden durch SDS-Polyacrylamidgelelek­ trophorese getrennt. (5) = BSA-Sepharose, (6) = Anti-gp96scFv- Sepharose, (7) = BSA-Sepharose, (8) = Anti-gp96scFv-Sepharose.
Fig. 6: Aktivierung von CTL durch scFv-gereinigte gp96-Moleküle. C57BL/6-Mäuse werden i. p. mit PBS (A), gp96 gebunden an anti-gp96- scFv-Sepharose (B), unbehandelte (C), gp96, gereinigt nach Standardmethoden (D), pH 10,5-eluierten gp96-Molekülen (E) und 1,3 M NaCl eluierten gp96-Molekülen immunisiert. Nach 9 Tagen werden Splenocyten mit bestrahlten BALB.B-Zellen während 5 Tagen inkubiert und die CTL-Aktivität auf C57BL/6 (gefüllte Kreise) und BALB.B (gefüllte Dreiecke) ConA-Blasts gemessen. (9) = % spezifische Lyse, (10) = E : T-Verhältnis.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung betrifft rekombinante Antikörper, die natives gp96 binden, insbesondere solche, welche die dritte Komplementarität determinierende Region (CDR3) aus einem variablen Anteil einer schweren Kette eines Antikörpers gemäss SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 umfassen (Fig. 1), insbesondere solche, welche in Fig. 1 (a) die vom variablen Teil einer schweren Kette abgeleiteten Abschnitte CDR3 der Sequenzen SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3; CDR2 der Sequenz SEQ ID NO: 4; und CDR1 der Sequenz SEQ ID NO: 5 (oder insbesondere SEQ ID NO: 6) und (b) die vom variablen Teil einer leichten Kette abgeleiteten Abschnitte CDR1' der Sequenz SEQ ID NO: 7, CDR2' der Sequenz SEQ ID NO: 8 und CDR3' der Sequenz SEQ ID NO: 9 umfassen.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der genannten rekombi­ nanten Antikörper zur Reinigung oder Markierung von gp96.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der genannten rekombinan­ ten Antikörper zur (raschen) Reinigung von intakten gp96/Peptid-Kom­ plexen aus kleinen Mengen von Tumormaterial oder infizierten Zellen, die anschliessend zur autologen oder ferner heterologen Immunothe­ rapie verwendet werden können.
Die Erfindung betrifft auch gp96 mit gebundenen Peptiden, welches durch die oben beschriebene Reinigungsmethode gewinnbar ist bzw. vorzugsweise gewonnen worden ist, insbesondere zur Anwendung in einem Verfahren zur (vorzugsweise autologen) Immunisierung, sowie pharmazeutische Formulierungen, die einen nach der oben beschriebenen Reinigungsmethode gewinnbaren, insbesondere gewonnenen, gp96/Peptid- Komplex und ggf. weitere Trägermaterialien umfassen.
Die Erfindung betrifft auch gp96 mit gebundenen Peptiden nach dem letzten Absatz zur Anwendung in einem Verfahren zu therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers, insbesondere zur heterologen oder vor allem autologen Immunisierung; die Verwen­ dung des entsprechenden gp96 mit gebundenen Peptiden zur Herstellung eines Arzneimittels zur (insbesondere autologen) Immunisierung bei Patienten, die an einer Tumorerkrankung oder einer Infektion leiden, sowie die Verwendung des entsprechenden gp96 mit gebundenen Peptiden zur Immunisierung dieser Patienten bzw. Methoden zur (insbesondere autologen) Immunisierung von Patienten mittels Verabreichung von gp96 gemäss dem vorausgehenden Absatz an einen Patienten, der an einer Tumorerkrankung oder einer Infektion leidet und einer derartigen Behandlung bedarf.
Die Erfindung betrifft auch die Isolierung von Peptiden, welche an natives gp96 aus Warmblüterzellen gebunden sind, insbesondere bei Warmblütern, die an einer Erkrankung leiden, z. B. einer Ischämie (etwa infolge eines Infarktes oder von Atherosklerose), einer Tumorerkrankung oder einer Infektion, sowie entsprechende Peptide, soweit sie neu sind, und deren Verwendung.
Die Erfindung betrifft auch Trennmaterialien (Matrices) und Vorrich­ tungen zur Reinigung von nativem gp96, die die erfindungsgemässen rekombinanten Antikörper umfassen.
Die Erfindung betrifft auch Kits zur Reinigung oder zum Nachweis von nativem gp96, welche die erfindungsgemässen rekombinanten Anti­ körper umfassen.
Die Erfindung betrifft auch Nucleinsäuresequenzen, insbesondere DNA-Sequenzen, welche für erfindungsgemässe rekombinante Antikörper kodieren.
Die Erfindung betrifft auch Wirtszellen, insbesondere Prokaryonten, wie E. coli, welche für erfindungsgemässe rekombinante Antikörper codierende Sequenzen umfassen.
Die vor- und nachstehend genannten allgemeinen Ausdrücke haben vor­ zugsweise die folgenden Bedeutungen, wenn nicht anders angegeben, wobei allgemeine Begriffe stets durch entsprechende speziellere Begriffe oder Beschreibungen ersetzt werden können, was zu bevor­ zugten Ausführungsformen der Erfindung führt:
Ein rekombinanter Antikörper, der natives gp96 bindet, ist ein aus einer oder mehreren nichtkovalent oder kovalent miteinander verbun­ denen Peptidketten aufgebautes Protein, welches die an natives gp96 bindenden komplementaritätsbestimmenden Regionen (CDR) umfasst, wobei auch Glykosylierungen oder andere Derivatisierungen vorliegen können; es handelt sich insbesondere um in üblicher Weise aus einer schweren und einer leichten Kette, die beispielsweise über Disulfid­ brücken oder auf andere Weise kovalent miteinander verbunden sind, aufgebaute Antikörper, oder vorzugsweise ein Fragment eines derar­ tigen Antikörpers, insbesondere des F(ab)2-Typs, oder insbesondere Einzelketten-Antikörper (sc Abs) mit allen komplementaritätsdeter­ minierenden Regionen auf einer Polypeptidkette, die noch weitere Sequenzen, wie Gerüstsequenzen, Linker-Sequenzen, Marker-Sequenzen (z. B. c-myc) oder Sequenzen, die eine spezifische Trennung erlauben, z. B. für IMAC (Immobilisiertes Metall-Affinitätschromatographie), umfassen kann und/oder auch als Aggregat von zwei oder mehr derar­ tigen Ketten vorliegen kann, wie es häufig gefunden wird (sowohl die tatsächlichen Einzelketten als auch deren Aggregate sind nach­ folgend gemeint, wenn von scFv-Antikörpern (Abs) die Rede ist) - das Minimum für derartige Einzelketten besteht aus den sogenannten Fv-Fragmenten, welches die hypervariablen Regionen der schweren und der leichten Antikörperkette umfassen (derartige Fv-Fragmente sind schwer durch proteolytische Techniken herzustellen, da die entsprechenden variablen Domänen nach Verdünnung zur Dissoziation tendieren). Auch Gemische solcher Antikörper sind möglich. Rekom­ binant bedeutet, daß mindestens ein Teil der Sequenz des entspre­ chenden Antikörpers durch Methoden der rekombinanten Gentechnologie modifiziert ist, wobei der entsprechende Antikörper auch auf enzy­ matischem oder chemischem Wege hergestellt werden kann oder vor­ zugsweise durch Expression geeigneter Nucleinsäuresequenzen in einem Wirtsorganismus.
Komplementaritätsdeterminierende Regionen (CDR) (auch hypervariable Regionen genannt) sind solche, die für die spezifische Bindung des jewiligen rekombinanten Antikörpers an gp96 verantwortlich sind (die also den Idiotyp ausmachen).
Bevorzugt sind solche Antikörper, welche die dritte Komplementarität determinierende Region (CDR3) der schweren Kette eines Antikörpers gemäss SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 umfassen (Fig. 1), insbesondere solche, welche in Fig. 1 (a) die aus variablen Schwerketten-Sequenzen abgeleiteten Teile CDR3 (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3), CDR2 (SEQ ID NO: 4) und CDR1 (SEQ ID NO: 5 oder insbesondere SEQ ID NO: 6) und (b) die aus variablen Leichtketten-Sequenzen abgeleiteten der CDR1' (SEQ ID NO: 7), CDR2' (SEQ ID NO: 8) und CDR3' (SEQ ID NO: 9) umfassen. Möglich sind auch solche Antikörper, bei denen diese CDR durch andere als die in Fig. 1 gezeigten Gerüstregionen (FR) voneinander separiert sind.
Die Erfindung betrifft auch natives gp96 bindende Antikörper, die Varianten der als bevorzugt gekennzeichneten Sequenzen beinhalten, z. B. Varianten, die aus einer DNA resultieren, die einer in-vitro- Mutagenese unterworfen worden sind, wobei die Bedingung ist, dass diese noch die genannte Bindungsfähigkeit besitzen, insbesondere bei üblichen Messmethoden zur Affinitätsbestimmung mindestens zweimal, vorzugsweise mindestens 10-mal stärkere Affinität zu leicht denaturiertem oder insbesondere nativem gp96 haben als der Antikörper SPA-850, der eine primäre (Sequenz-) Struktur des gp96 erkennt, die sowohl in nativem als auch in denaturiertem gp96 vorhanden ist und so nicht selektiv ist für natives gp96, (s. u.). Solche Modifika­ tionen können in einer Addition, Substitution oder Deletion von Aminosäuren, vorzugsweise von bis zu 5, beispielsweise von einer Aminosäure, bestehen - besonders bevorzugt sind solche rekombinanten Antikörper, die eine optimale Affinität haben, die hoch genug ist für starke gp96-Bindung, aber dennoch wieder die Freisetzung dessel­ ben aus gp96/Antikörperkomplexen erlaubt, um so das gebundene gp96 wieder freisetzen zu können, was z. B. für die unten beschriebenen Reinigungsmethoden essentiell ist. Soweit die Modifikationen die CDR betreffen, sind konservative Austausche bevorzugt, z. B. der Austausch einer hydrophoben Aminosäure durch eine andere, einer sauren durch eine andere, einer basischen durch eine andere, von Ser durch Thr, einer armatischen durch eine andere oder dergleichen, oder ferner Addition einer homologen Aminosäure, so dass eine Ami­ nosäure durch zwei homologe Aminosäuren ersetzt wird, oder Deletion einer Aminosäure.
Daneben können vorzugsweise noch Gerüstregionen FR (wie z. B. die in Fig. 1 gezeigten FR1 bis FR4 auf der schweren Kette, FR1' bis FR4' auf der leichten Kette, oder andere Aminosäuresequenzen, die die Fähigkeit der Antikörper zur Bindung an leicht denaturiertes oder insbesondere natives gp96 haben) vorliegen.
Besonders bevorzugte rekombinante Antikörper sind solche, die minde­ stens eine der Sequenzen für die variablen Teile der schweren Ketten gemäss Fig. 1 für einen der Klone G12D, H11B oder B10C (SEQ ID NO: 10; SEQ ID NO: 11; oder SEQ ID NO: 12), insbesondere die Mutante mit einer CDR 1 der Sequenz DYYMY (SEQ ID NO: 6), welche bei der in den Beispielen beschriebenen Methode nicht erwartet werden konnte, also die Sequenz für den variablen Abschnitt einer schweren Kette des Klons H11B (SEQ ID NO: 12); und die Sequenz für den variablen Abschnitt der leichten Kette gemäss Fig. 1 (SEQ ID NO: 13) umfassen, welche erforderlichenfalls durch einen geeigneten Spacerabschnitt voneinander getrennt sind.
Natives gp96 ist solches, das dem in der Zelle normalerweise im ER vorliegenden in der Konformation im wesentlichen entspricht und noch in der Lage ist, die unter physiologischen Bedingungen gebundenen antigenen Peptide zu binden, so dass diese im Komplex mit gp96 isoliert werden können - mit anderen Worten, die 3D-Faltung ist soweit erhalten (oder sogar unverändert), daß die Beladung mit den antigenen Peptiden noch möglich ist, auch bei Reinigung des gp96 wie unten als Teil der Erfindung beschrieben - im Gegensatz hierzu scheint die klassische Methode nach Srivastava, METHODS: A Companion to Methods in Enzymology 12, 165-171 (1997) mindestens auch beträchtliche denaturierte Anteile zu enthalten.
Die Reinigung von gp96 gelingt nach üblichen Methoden, beispielsweise durch Präzipitation des gp96 aus Lösungen, wie Zelllysaten, sofern mindestens zwei Bindungsstellen pro rekombinantem Antikörper für gp96 vorliegen oder Aggregate von solchen rekombinanten Antikörpern vorliegen, oder wenn weiter Anti-Antikörper eingesetzt werden, die mehr als eine Bindungsstelle für Sequenzen auf den erfindungsgemässen rekombinanten Antikörpern (beispielsweise c-myc-Sequenzen) haben und so zur Vernetzung in der Lage sind, insbesondere, wenn die Anti- Antikörper polyklonal sind; bevorzugt ist die Reinigung nach Bindung eines erfindungsgemässen Antikörpers an ein geeignetes partikuläres Trägermaterial mit ausreichend grosser Oberfläche, z. B. an eine auf Kohlenhydraten oder Kunststoffen basierende Gelmatrix, wie insbeson­ dere Sepharose. Die Reinigung kann dann durch Bindung in Suspension oder durch Auftragen der zu reinigenden Probe auf eine Säule, die mit einer gebundenen rekombinanten Antikörper umfassenden Matrix gefüllt ist, erfolgen. Möglich ist auch die Bindung an Membranen, z. B. Nitrozellulose, die mit dem entsprechenden rekombinanten Anti­ körper belegt sind, oder entsprechende andere Trägermaterialien. Die Elution des so gebundenen gp96 erfolgt mit geeigneten Lösungen, insbesondere mit leicht basischen (pH vorzugsweise zwischen 7,2 und 12, insbesondere zwischen 7,2 und 10,5; eingestellt beispiels­ weise mit Hilfe organischer Basen, insbesondere Stickstoffbasen, wie Triethanolamin) und/ oder salzhaltigen Eluenten, insbesondere 0,3 bis 4, vorzugsweise 0,5 bis 1,5 M Salzlösungen, wie 0,7 bis 1,5 M Salzlösung, vorzugsweise mit Kochsalz (NaCl) als Salz. Sollen native Komplexe aus gp96 und daran gebundenen Peptiden (z. B. aus geschädigten Geweben, wie ischämischen Geweben oder Geweben mit Krankheitserregern oder Krebsmarkern) isoliert werden, so wird vorzugsweise ein pH im Bereich zwischen 6 und 8 gewählt und eine erhöhte Salzkonzentration, insbesondere 0,7 bis 1,5 M Kochsalzlösung in Gegenwart von Puffer, wie Phosphatpuffer.
Die Markierung (d. h., qualitative oder quantitative Bestimmung) von gp96 kann beispielsweise mit üblichen Assays zum Nachweis von Antigenen mit Antikörpern durchgeführt werden. So können die erfin­ dungsgemässen rekombinanten Antikörper vorzugsweise selbst direkt Sequenzen enthalten, die eine Markierung ermöglichen (beispielsweise Sequenzabschnitte, die Enzymfunktion haben und so direkt durch Umsetzung mit entsprechenden Substraten die Detektion ermöglichen, oder durch dagegen gerichtete Antikörper erkannt werden können, die ihrerseits durch Standardmethoden nachgewiesen werden können), beispielsweise als Phosphatase, z. B. alkalische Phosphatase aus E. coli oder alkalische Phosphatase aus Säugetieren (z. B. aus Rind), Peroxidasen, wie Meerettichperoxidase (mit z. B. 4-Chlor-1-naphthol oder 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin als Substrat), β-D-Galactosidase, Glucoseoxidase, Glucoamylase, Carboanhydrase, Acetylcholinesterase, Lysozym, Malatdehydrogenase oder Glucose-6-phosphatase; ein Molekül mit spezifischen Bindungseingenschaften, wie Streptavidin, das an Biotin bindet, oder andere charakteristische antigene Abschnitte, wie c-myc-Sequenzen oder -teilsequenzen, die insbesondere immuno­ logisch nachgewiesen werden können.
Auf diese Weise können die mit Antikörpern üblichen Nachweismethoden für Antigene ("Immunoassays"), insbesondere Radioimmunoassays und vor allem Immunfluoreszenzmarkierung, Immunoblotting, Enzym-Immunoas­ says, insbesondere EIA oder ELISA, oder Dot-Assays durchgeführt werden, um gp96 qualitativ und/oder quantitativ nachzuweisen.
Die rasche Reinigung gelingt vorzugsweise durch Auftrennung eines (erforderlichenfalls durch Ultrazentrifugation vorgeklärten) Zell­ lysates über eine Säule, die mit einer Matrix beladen ist, die ge­ bundene rekombinante Antikörper gemäss der Erfindung trägt (siehe oben unter Reinigung, dort werden auch geeignete Elutionsbedingungen angegeben), insbesondere über entsprechend modifizierte Sepharose. Zunächst wird aufgetragen, dann Verunreinigungen ausgewaschen, und zuletzt eluiert, wie oben für die Reinigung von gp96 beschrieben.
Die Immunotherapie bedient sich des so gewonnenen gp96, das im we­ sentlichen in nativer Form vorliegt, wenn entsprechende Elutionsbe­ dingungen gewählt werden (siehe oben oder in den Beispielen), und noch gebundene Peptide aus den Tumorzellen oder den infizierten Zellen vorliegen, die charakteristisch für Krankheitszustände, wie Ischämien, Krebs oder Infektionen sind. Im Prinzip ist auch hetero­ loge Immuntherapie möglich, beispielsweise, wenn mehrere Patienten durch das gleiche Pathogen infiziert sind oder die gleiche Tumor­ erkrankung haben.
"Tumorerkrankung" bedeutet eine proliferative Erkrankung, beispiels­ weise solide Tumoren oder Blutkrebs, einschliesslich ggf. vorliegen­ der Metastasen. Die zur Isolierung des gp96 verwendeten Zellen soll­ ten dann insbesondere Tumorzellen umfassen. "Infiziert" bedeutet, dass die entsprechenden Zellen durch einen Mikroorganismus, wie ein Virus, Bakterien, Mycoplasmen, einen Pilz oder einen Parasiten, wie Protozoen, infiziert sind.
Die Immuntherapie erfolgt durch enterale (z. B. nasale) oder vorzugs­ weise durch parenterale, insbesondere intramuskuläre, subkutane oder ferner intrakraniale oder intralumbale Verabreichung eines wie oben beschrieben gereinigten gp96/Peptid-Komplexes an einen Patienten, vorzugsweise einen solchen, der einer solchen Behandlung bedarf, in Abwesenheit oder Gegenwart von weiteren Adjuvantien, wie Aluminiunhydroxid, Lysolecithin, Pluronic-Polyolen, Polyanionen, Peptiden, Muramyldi- oder -tripeptiden, Squalenmischungen (SAF-1), Saponinderivaten, Zellwandpräparationen von Mycobakterien, Quil A, Untereinheit B aus Choleratoxin, Proteine oder Ölemulsionen, oder Kombinationen von zwei oder mehr davon.
Die Erfindung betrifft somit auch die Verwendung der erfindungs­ gemässen rekombinanten Antikörper zur Reinigung von gp96 aus Zellen oder Gewebsproben insbesondere aus einem Patienten, der an einer Erkrankung, wie einer Ischämie (z. B. infolge eines Infarktes), einem Tumor oder einer Infektion leidet, und (vor allem im Falle einer Infektion oder einer Tumorerkrankung) die nachfolgende Verabreichung des so gewonnenen gp96 an einen Patienten, insbesondere einen, der einer derartigen Behandlung bedarf, zur autologen oder ferner hete­ rologen Immunisierung.
Die Erfindung betrifft auch gp96 mit gebundenen Peptiden, welches durch die oben beschriebene Reinigungsmethode gewinnbar ist bzw. vorzugsweise gewonnen worden ist, insbesondere zur Anwendung in einem Verfahren zur (vorzugsweise autologen) Immunisierung, sowie pharmazeutische Formulierungen, die ein nach der oben beschriebenen Reinigungsmethode gewinnbaren, insbesondere gewonnenen, gp96/Peptid- Komplex und ggf. weitere Trägermaterialien umfassen. Als Trägermate­ rialien kommen insbesondere physiologisch annehmbare Trägermateria­ lien in Frage, insbesondere physiologische Kochsalzlösung, Phosphat- gepufferte physiologische Kochsalzlösung, steriles Wasser und ggf. Adjuvantien, wie oben genannt, in Frage. Andere Pufferungs- und dispergierend wirksame Trägermaterialien können verwendet werden. Der Fachmann kennt die möglichen Zusammensetzungen, Beispiele finden sich in Remington's Pharmaceutical Sciences (Alfonso R. Gennaro, Hrg., 18th Edition, 1990), hiermit durch Bezugnahme inkorporiert. Die Zusammensetzungen werden nach üblichen Methoden sterilisiert und verpackt, z. B. in Ampullen oder Gläschen, oder direkt verab­ reicht. Die Konzentration an gp96/Peptidkomples kann variieren, beispielsweise von ca. 0,001 bis 20 Gew.-%, vorzugsweise von 0,01 bis 0,5%.
Als "Patienten" kommen vor allem Warmblüter, in erster Linie Säuger, vor allem der Mensch, in Betracht.
Bei der Administration wird eine Dosis verabreicht, die normalerweise zum Stimulieren einer Immunantwort (insbesondere basierend auf cyto­ toxischen T-Lymphozyten) geeignet ist. Die Dosis ist abhängig von den individuellen Patientenparametern wie Grösse, Alter, Geschlecht und Zustand, wird sich aber normalerweise vorzugsweise im Bereich von 0,001 bis 20 000 µg, vorzugsweise 0,005 bis 4000 µg gp96/Peptid­ komplex pro kg Patientengewicht bewegen.
Es ist auch möglich, mit erfindungsgemässen rekombinanten Antikörpern Warmblüter zu immunisieren, um so Anti-Idiotyp-Antikörper, die anti­ gene Bereiche von gp96 imitieren, herzustellen. Die Immunisierung erfolgt analog wie oben für gp96/Peptidkomplexe beschrieben.
Die Isolierung von Peptiden, welche an natives gp96 aus Warmblüter­ zellen gebunden sind, insbesondere bei Warmblütern, die an einer Erkrankung leiden, z. B. einer Ischämie (etwa infolge eines Infark­ tes), einer Tumorerkrankung oder einer Infektion, ist möglich, indem man erfindungsgemäss isoliertes natives gp96, das solche Peptide gebunden hat, aus entsprechenden gp96/Peptidekomplexen freisetzt (z. B. durch Änderung der Ionenstärke, Erhöhung der Basizität, bei­ spielsweise mittels Stickstoffbasen, wie Triethanolamin, auf einen pH-Wert zwischen 7,4 und 12, vorzugsweise zwischen 9 und 11,5), und erforderlichenfalls beispielsweise durch Gelfiltration vom gp96 trennt. Die Peptide können dann weiter untersucht (z. B. sequenziert) werden und auf ihre biologischen Wirkungen untersucht werden (z. B. Immunogenität) und so auch das Erkennen pathogener Mechanismen, beispielsweise bei Ischämie, ermöglichen. Soweit sie neu sind, sind auch entsprechende Peptide Gegenstand der vorliegenden Erfindung, sowie deren Verwendung, beispielsweise in Immunisierungsprotokollen.
Als Vorrichtung zur Reinigung sind insbesondere chromatographische Säulen zu nennen, die mit einer Matrix gefüllt sind, welche einen erfindungsgemässen rekombinanten Antikörper umfasst. Für die Herstellung der Matrix finden insbesondere solche Grundmatrices mit funktionellen Gruppen, wie Hydroxy-, Carboxy-, Amino-, Epoxy-, Dien- oder Mercaptogruppen, die eine Kopplung mit einem erfindungs­ gemässen Antikörper erlauben, insbesondere solche auf Polymerbasis, wie auf Basis von Polyacryl oder Polyacrylderivaten (insbesondere Oxiran-modifiziert), wie im Falle von Eupergit (Röhm Pharma, Darm­ stadt) oder insbesondere auf Basis aktivierter polymerer Kohlen­ hydrate, wie cyanogenbromid-aktivierter Sepharose (vor allem Sepha­ rose 4, 4B oder 6MB), Verwendung. Entsprechend sind die antikörper- modifizierten Matrices gemäss der Erfindung auf der Basis von Poly­ meren, wie Polyacryl oder dessen Derivaten (z. B. Eupergit), oder auf der Basis polymerer Kohlenhydrate aufgebaut, welche erfindungs­ gemässe Antikörper (vorzugsweise kovalent gebunden) tragen. Eine geeignete Säule hat insbesondere ein inneres Volumen (inklusive Säulenmaterial) von 0,01 bis 10 ml, z. B. von 0,05 bis 5 ml, bei­ spielsweise von 0,05 bis 0,1 ml. Weitere zur Vorrichtung gehörige Komponenten können z. B. Schläuche, Vorratsgefässe für Eluenten und Waschlösungen und dergleichen sein. Eine Matrix (Trägermaterial), wie oben beschrieben - insbesondere Sepharose - die einen erfin­ dungsgemässen Antikörper trägt, insbesondere, wenn dieser kovalent gebunden ist, ist selbst Gegenstand der Erfindung. Vorzugsweise umfasst eine entsprechende Vorrichtung auch eine Säule, die eine mit einem unspezifischen Material, insbesondere Serumalbumin, wie Rinderserumalbumin, belegte Matrix (wie oben beschrieben, jedoch mit einem anderen Liganden als dem rekombinanten Antikörper), die zur Vorreinigung geeignet ist (als Vorsäule) und vorzugsweise direkt der eigentlichen, mit dem rekombinanten Antikörper belegten Säule vorgeschaltet ist.
Kits zur Reinigung oder zum Nachweis von nativem gp96, welche die erfindungsgemässen rekombinanten Antikörper umfassen, sind insbe­ sondere solche, die eine wie im letzten Absatz beschriebene chroma­ tographische Säule und erforderliche weitere Komponenten, wie eine ebenfalls vorstehend beschriebene Vorsäule und ggf. Puffersalze oder Pufferlösungen, Eluenten, oder dergleichen, und gewünschtenfalls auch Nachweissysteme für isoliertes natives gp96 oder daran gebundene Peptide, wie Komponenten entsprechender Immunoassays oder derglei­ chen, enthalten können, z. B. Antikörper gegen c-myc, Anti-Antikörper gegen diese Antikörper, die z. B. mit einem Enzym als Komponente eines enzymatischen Nachweissystems, wie einer Peroxidase, markiert sind, sowie entsprechende Reagenzlösungen und Substrate für diese Enzyme.
Die Erfindung betrifft auch Nucleinsäuresequenzen, insbesondere DNA-Sequenzen, welche für erfindungsgemässe rekombinante Antikörper kodieren. Bevorzugt sind solche Nukleinsäuresequenzen, die als für den variablen Abschnitt einer schweren Kette codierende Nucleinsäure­ sequenz eine der in Fig. 2 und deren Legende für die CDR 3 aus den Klonen B10C (SEQ ID NO: 23), G12D (SEQ ID NO: 24) oder H11B (SEQ ID NO: 25) genannten umfassen, und/oder als für den variablen Abschnitt einer leichten Kette codierende Nucleinsäuresequenz die für die CDR3' in Fig. 2 und deren Legende gezeigte (SEQ ID NO: 22) umfassen, wie in Klammer jeweils vorstehend angegeben; sowie jeweils beliebige für Gerüstregionen codierende Sequenzen FR1 bis FR4 und FR1' bis FR4'.
Bevorzugt sind insbesondere solche Nukleinsäuresequenzen, die als für den variablen Abschnitt einer schweren Kette codierende Nucleinsäuresequenzen für die CDR1 eine der in Fig. 2 und deren Legende mit SEQ ID NO: 18 oder insbesondere SEQ ID NO: 19 genannten Sequenzen umfassen, für die CDR2 die Sequenz gemäss SEQ ID NO: 17 und für die CDR3 eine der Sequenzen gemäss SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 und SEQ ID NO: 16, und/oder als für den variablen Abschnitt einer leichten Kette codierende Nucleinsäuresequenz die für die CDR1' gemäss SEQ ID NO: 20, für die CDR2' gemäss SEQ ID NO: 21 und für die CDR3' gemäss SEQ ID NO: 22 in Fig. 2 und deren Legende gezeigten Sequenzen umfassen; sowie jeweils beliebige für Gerüstregionen codierende Sequenzen FR1 bis FR4 und FR1' bis FR4', insbesondere die in Fig. 2 und deren Legende genannten.
Am stärksten bevorzugt sind solche Nukleinsäuresequenzen, welche als für den variablen Teil der schweren Kette codierende Sequenz die in Fig. 2 gezeigte des Klons S10C (SEQ ID NO: 23), des Klons G12D (SEQ ID NO: 24) oder insbesondere des Klons H11B (SEQ ID NO: 25) umfassen und/oder als für den variablen Teil der leichten Kette codierende Sequenz die in Fig. 2 für alle alle Klone gezeigte (SEQ ID NO: 26).
Bei allen Ausführungsformen sind solche der oben genannten Nucleinsäuresequenzen besonders bevorzugt, bei denen die für die variablen Abschnitte der schweren und der leichten Kette codierenden Sequenzen in ein und demselben Nucleinsäurestrang umfasst sind (Codierung für Einzelketten-Antikörper).
Besonders bevorzugt sind jeweils solche Nucleinsäuresequenzen, die ferner für noch weitere Sequenzen, wie Gerüstsequenzen, Linker- Sequenzen, Marker-Sequenzen (z. B. c-myc) oder Sequenzen, die eine spezifische Trennung erlauben, z. B. für IMAC (Immobilisertes Metall- Affinitätschromatographie), codierende Sequenzabschnitte umfassen.
Neben den gezeigten Nucleinsäuresequenzen können auch alle Varianten vorliegen, die durch Ersetzung von Nucleinsäuren im Rahmen der Dege­ neration des genetischen Codes oder des wobbling für dieselben Amino­ säuren codieren, sowie ferner solche Sequenzen, die für die oben beschriebenen möglichen Abweichungen der Aminosäuren codieren.
Zu den erfindungsgemässen Nucleinsäuresequenzen zählen auch solche, die für die oben für Antikörper, die Varianten der als bevorzugt gekennzeichneten Sequenzen beinhalten, genannten Aminosäuredeletio­ nen, -insertionen oder -substitutionen codieren, also selbst ent­ sprechende Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Nuclein­ säuren enthalten. Insbesondere sind bis zu 15, vorzugsweise bis zu 3 Nucleinsäuren variiert (deletiert, inseriert oder substituiert).
Ebenfalls bevorzugt sind Vektoren, wie Plasmide, Cosmide oder der­ gleichen, die eine der genannten Sequenzen umfassen und in geeigneten Wirtszellen zur Expression bringen können. Ein bevorzugter Vektor basiert auf dem Vektor pHEN1 oder pHOG21 (siehe Beispiele).
Als Wirtszellen kommen solche in Betracht, welche in vitro kultivier­ bar sind. Geeignet sind eukaryotische oder insbesondere prokaryoti­ sche Zellen, z. B. Hefen, wie Saccharomyces cerevisiae, Säugetierzel­ len, Hybridome oder insbesondere Bakterien, wie E. coli, welche durch geeignete Vektoren transformiert sind. Für die Herstellung glykosy­ lierter Antikörper sind eukaryotische Wirtszellen erforderlich, für die Herstellung von Einstrang-Antikörpern sind besonders Bakte­ rien gut geeignet. Beispiele für Bakterien sind insbesondere solche, die arm an Restriktions- oder Modifikationsenzymen sind, wie E. coli, z. B. E. coli X776, E. coli TG1 oder insbesondere E. coli XL1-Blue (Stratagene).
Besonders bevorzugt als solche oder zum Einsatz bei allen vorstehend genannten Aspekten der Erfindung sind: Leicht denaturiertes oder insbesondere natives gp96 bindende sc (Einzelketten)-Fv-Antikörper oder Aggregate von zwei oder mehr davon, bei denen je der variable Teil einer leichten Kette und der einer schweren Kette innerhalb ein und derselben Peptidsequenz vorliegen, insbesondere in der Reihenfolge (variabler Teil der schweren Kette, z. B. Sequenz Anfang FR1 bis Ende FR4 in Fig. 1) - (Peptidlinker, z. B. Gly-Ser- Peptidlinker) - (variabler Teil der leichten Kette, z. B. Sequenz Anfang FR1' bis Ende FR4' in Fig. 1) - (c-myc-Marker-Sequenz) - (His-Marker mit mehreren Histidinresten in Folge, z. B. 6 × His).
Die Herstellung der Antikörper, Wirtszellen (inkl. Kultivierung und Transformation), markierten Antikörper, Vorrichtungen, etc. erfolgt nach an sich bekannten Verfahren, beispielsweise analog zu den in den Beispielen genannten Verfahren.
Besonders bevorzugt sind die in den Beispielen genannten leicht denaturiertes oder natives GP96 bindenden Antikörper, Verfahren, Vektoren und Vorrichtungen.
Die nachfolgenden Beispiele dienen der Illustration der Erfindung, ohne ihren Umfang einschränken zu sollen:
Mäuse und Antikörper: C57BL/6-Mäuse sind von Charles River WIGA (Sulzfeld, Deutschland). BALB.B-Mäuse sind von Harlan Winkelmann (Borchen, Deutschland). Beide Maustypen werden in den Tieranlagen des Instituts für Zellbiologie, Tübingen, Deutschland, gehalten. Die Monoklonalen Antikörper gegen gp96 (anti-Grp94, SPA-850, Klon 9G10) und gegen BiP (SPA-827, Klon 10C3) sind von StressGen Biotechnologies Corp., Victoria, BC, Canada. Zellkultur und CTL- Assay: Die Mauszelllinie IGELa2 und die humanen C1R-Zelllinien sind von ATCC, Rockville, MD, USA; sie werden in RPMI 1640, enthaltend 10% Fötales Kälberserum und supplementiert mit 0,3 mg/ml L-Glutamin, Penicillin/Streptomycin (100 Einheiten/ml) und 2-Mercaptoethanol (2 µl/ml) kultiviert. CTL-Linien werden erhalten durch wöchentliche Stimulationen mit(mittels einer Cäsium-γ-Strahlenquelle) bestrahlten Milz-Zellen aus BALB.B-Mäusen. CTL-Assays werden wie in der Literatur beschrieben durchgeführt (Arnold et al., J. Exp. Med. 182, 885-889 (1995)) unter Verwendung von ConA Blasts (Concanavalin A-aktivierte T-Zellen) aus Milzzellen als Zielzellen. Auch Con A Blasts werden ebenfalls wie in der zuletzt genannten Publikation beschrieben her­ gestellt.
Die Standard-Methode zur Reinigung von gp96 wird beschrieben in P. K. Srivastava, METHODS: A Companion to Methods Enzymol. 12, 165-71 (1997) und umfasst die Reinigung mittels ConA-Sepharose- und MonoQ- Anionenaustausch-Chromatographie.
Beispiel 1 Herstellung rekombinanter Einzelketten-Fv (scFv)-Anti- gp96-Antikörper
Eine semisynthetische Phagendisplay-Bibliothek, welche aus 50 ver­ schiedenen humanen Keimbahngenen für schwere Ketten mit in der Se­ quenz randomisierten CDR3-Schleifen und einem konstanten humanen Vλ3-Gen einer leichten Kette besteht und eine Komplexizität von mehr als 108 Klonen hat (Nissim et al., EMBO. J 13, 692-698 (1997), findet Verwendung zur Selektion von Einzelketten-Fv(scFv)-Antikörpern (Abs). Für die Herstellung der Bibliothek werden synthetische CDR3- Schleifen, welche randomisierte Sequenzen von 4-12 Aminosäuren haben, in 50 variable Abschnitte aus schweren Ketten eingefügt. Anschlies­ send wird das erhaltene Repertoire an Abschnitten aus schweren Ketten in den Phagemid-Vektor pHEN1 (siehe Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res. 19, 4133-4137 (1991)) mit dem unmutierten, umgeordneten Vλ3- Leichtkettengen IGLV3S1/DPL16 (siehe Frippat et al., Nucl. Acids Res. 18, 7134 (1990) und Williams et al., Eur. J. Immunol. 23, 1456-1461 (1993)) eingebaut. Nach Herstellung scFv-exprimierender Phagen­ partikel in E. coli TG1 werden 5 × 1012 koloniebildende Einheiten (c.f.u.) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS; 150 mM NaCl, 150 mM Natriumphosphat, pH 7,2) mit 2% Magermilchpulver (MPBS) in Nunc Maxisorb-Immunröhrchen (Nunc, Roskilde, Dänemark), die mit 80 µg gp96 aus Maus (mgp96) beschichtet sind, zum Panning eingeführt. Unspezifisch gebundene Phagen werden durch intensives Waschen ent­ fernt. Spezifische Phagen werden mit 100 mM Triethylamin (pH12) eluiert und nach Neutralisation expandiert und für weitere Selek­ tionsschritte, bis insgesamt vier davon durchgeführt sind, verwendet. Die Bindungsspezifität wird durch ELISA ermittelt: Mikrotiterplatten werden mit mgp96 beschichtet (0,5 µg/Bohrung), mit 2% Magermilchpul­ ver-Lösung blockiert und dann mit Phagenpartikeln (1010 c.f.u.) ver­ setzt.KommerziellerhältlichespolyklonalesHühnchen-anti-gp96-Serum (1 : 500) dient als positive und PBS als negative Kontrolle. Das System wird durch Zugabe von Kaninchen-anti-M13-Phagen-Antikörper (Strata­ gene), PO-konjugiertem Ziegen-Antikaninchen-Immunglobulin und Sub­ strat (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin) entwickelt. Die Absorbanz wird bei 620 nm gemessen (Selektierte Phagen nach der vierten Selek­ tion: A620nm = 1,406; negative Kontrolle A620 = 0,065). Mit jedem Selektionsschritt wird erhöhte Bindungsaktivität festgestellt. Nach der vierten Selektionsrunde werden Einzelkolonien (n = 77) herge­ stellt und die Antikörperdiversität durch Verdauung von Plasmid-DNA mit dem Restriktionsenzym BstN1 ermittelt. Drei Restriktionsmuster werden identifiziert und deren Nucleinsäuresequenzen ermittelt (377 DNA Sequencer, Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) (Fig. 2). Drei Antikörperklone mit drei unterschiedlichen CDR3-Regionen (B10C mit Sequenz der CDR3-Region der SEQ ID NO: 1; G12D mit Sequenz der CDR3-Region der SEQ ID NO: 2; und H11B mit Sequenz der CDR3-Region der SEQ ID NO: 3) werden gefunden, siehe Fig. 1. Im ELISA werden die Absorptionen bei 620 nm für Klon B10C zu 1,297, für Klon G12D zu 0,651 und für Klon H11B zu 0,557, für die positive Kontrolle zu 0,557, für die negative Kontrolle zu 0,003 A620nm ermittelt.
Beispiel 2 Herstellung von löslichen, für natives gp96 spezifischen scFv-Antikörpern
Die Gensegmente der drei spezifischen scFv-Abs (B10C, G12D und H11B) werden durch NcoI-NotI-Verdau erhalten, in das Plasmid pHOG21 (siehe Kipryanov et al., J. Immunol. Meth. 200, 60-77 (1997)) einligiert und in E. coli XL1-Blue (Stratagene) exprimiert. Die lösliche Frak­ tion des periplasmatischen Extrakts und der Kulturüberstand werden kombiniert, konzentriert und gegen 50 mM Tris-HCl, 1 M NaCl, pH 7,0, dialysiert. Alle der hergestellten scFv Abs enthalten poly-His-Mar­ kierungen, welche die Reinigung durch IMAC (Immobilized Metall Affi­ nity Chromatography = Affinitätschromatographie an immobilisierten Metallen) erlauben. Die Proben werden auf eine Säule des Typs "Chela­ ting Sepharose Fast Flow Column" (Amersham Pharmacia Biotech, Upsala, Schweden) aufgetragen, die zuvor mit Ni2+-Ionen beladen und mit Dia­ lysepuffer äquilibriert worden ist. Nach ausgiebigem Waschen wird das gebundene Material mit 250 nM Imidazol eluiert und gegen PBS dialysiert. Die Reinheit wird mittels Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) überprüft (nicht gezeigt).
Beispiel 3 Western-Blot- und Dot-Blot (= Punktautoradioaramm)-Analyse löslicher scFv-Antikörper
Maus-gp96 (mgp96) wird durch SDS-Gelelektrophorese unter reduzieren­ den Bedingungen (100 mM β-Merkaptoethanol + 2% Natriumdodecylsulfat = SDS) getrennt und auf Nitrocellulose transferiert. Für die Dot- Blot-Analyse werden 500 ng mgp96 auf Nitrocellulosemembranen unter nativen (PBS), denaturierenden (2% SDS) oder reduzierenden (100 mM β-Mercaptoethanol) Bedingungen aufgetragen. Sowohl die Western- als auch die Dot-Blotmembranen werden mit 2% MPBS blockiert. Das mgp96 wird mittels Ratten-IgG-anti-Grp94 (SPA-850, StressGenBiotech­ nologies) und Peroxidase-konjugiertem Kaninchen-Anti-Ratten-IgG (DAKO, Glostrup, Dänemark) oder mit den scFv-Antikörpern detektiert. Alle scFv Abs tragen einen c-myc-Marker, der die Markierung mit Maus-IgG-Anti-Human-myc (Genosys, The Woodlands, USA) und Peroxidase- konjugiertem Kaninchen-anti-Maus-Antikörper (DAKO) erlaubt. Die Detektion löslicher scFv Abs kann mit einer Reihe von Konzentrationen ermittelt werden (1/1 bis 1/8192). Fig. 3 zeigt die Resultate der Dot-Blot-Analyse. Die gereinigten scFv Abs zeigen bei Analyse auf den mit reduziertem, denaturiertem oder nativen mgp96 markierten Nitrozellulosemembranen nur Bindung an das native Protein (Fig. 3). Die Daten der Western-Blot-Analyse (nicht gezeigt) bestätigen diesen Fund.
Beispiel 4 scFv-Antikörner präzipitieren native 9p96-Moleküle
Testet man die rekombinanten scFv Abs in einem ELISA, so erkennen sie nur gp96 in seiner nativen Form, während der kommerziell erhält­ liche Monoklonale Antikörper SPA-850 (Stresscen Biotechnologies) dies nur kaum tut, was seine Nützlichkeit für die Affinitätsreinigung von gp96 stark einschränkt. Zur Untersuchung der Fähigkeit der rekom­ binanten scFv Abs, mit nativem gp96 zu interagieren, werden Immuno­ präzipitationsexperimente nach Lysierung von radioaktiv markierten Zellen in einem hypotonischen Puffer durchgeführt, der es ermöglicht, dass die Proteine in ihrer nativen Konformation verbleiben.
Hierfür werden Maus-Tumorzelllysate aus IGELa2-Zellen verwendet. 107 Zellen werden metabolisch markiert in Gegenwart von 35S-Methionin (150 µCi) in 10 ml Methionin-freiem RPMI-Medium für 16 Stunden inku­ biert. Nach Lyse der Zellen in hypotonischem Puffer (30 mM NaHCO3 pH 7,1) werden die Lysate über Nacht an Protein G-Sepharose (Amersham Pharmaciaßiotech)vor-adsorbiert. SpezifischeMonoklonaleAntikörper oder scFv-Anti-gp96 Abs und anti-c-myc Abs werden zu den klaren Lysaten in einer Menge von 10 µg/ml zugegeben. Nach 90 min werden die Komplexe mit Protein-G-Sepharose isoliert. In einigen Fällen werden die Lysate mit an Sepharose-Beads gekoppeltem Rinderserumalbu­ min (BSA) vorgeklärt und die Kopplung direkt mit BSA-Sepharose als Kontrolle oder mit scFv-anti-gp96 Abs gekoppelt an Sepharose-Beads durchgeführt. Die Immunokomplexe werden wiederholt gewaschen und durch SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese gewaschen. Die fixierten Gele werden getrocknet und auf einem Phosphoimager-Bildschirm expo­ niert. Wie nach den vorherigen Ergebnissen zu erwarten, wird von SPA-850 nur eine schwache Bande, die der Molekülgrösse von gp96 entspricht, ausgefällt (Fig. 4, Bahn (3)). Im Gegensatz hierzu zeigen die Banden mit erfindungsgemässen scFv Abs starke Ausfällung der gp96-Moleküle (Fig. 4, Bahn (4)). Somit erkennen die rekombinanten erfindungsgemässen Antikörper native gp96-Moleküle viel besser als es ein monoklonaler Antikörper zu tun vermag. Die Klone B10C und G12D zeigen vergleichbare Ergebnisse (nicht gezeigt). Die scFv-anti- gp96 Abs sind auch effizienter bei der Präzipitation von gp96 als ein monoklonaler Antikörper gegen das in Endoplasmatischen Retikulum vorliegende Chaperon BiP, von dem bekannt ist, dass es mit einem unbekannten 40 kDa-Protein und auch mit gp96 kreuzreagiert (Fig. 4, Bahn (2)).
Beispiel 5 Reinigung von gp96 unter Verwendung von scFv-Antikörpern
Um gp96 in einem Schritt isolieren zu können, wird der scFv-Antikör­ per H11B an Sepharose-Beads gekoppelt. 5 mg davon oder BSA wird an 0,5 mg Cyanogenbromid-aktivierter Sepharose (Pharmacia) gekoppelt. Das BSA-gekoppelte Material dient als Vorsäule, um unspezifisch bindende Materialien zu entfernen. Vorgeklärte hypotonische Lysate der radioaktiv markierten Maus-Zelllinie IGELa2 werden direkt mit den scFv-Sepharose-Beads inkubiert. 1 ml IGELa2-Zellpellets werden bei 4°C im Dounce-Homogenisator (15-20 Auf- und Abbewegungen) in 20 ml hypotonischem Puffer homogenisiert (siehe Arnold et al., J. Exp. Med. 182, 885-889 (1995)). Die Homogenate werden während 60 min bei 100 000 × g zentrifugiert und die Überstände auf eine Kon­ troll-BSA-Sepharose-Säule aufgetragen, die direkt mit der scFv-Anti- gp96-Säule verbunden ist. Beide Säulen sind mit PBS voräquilibriert. Nach ausgiebigem Waschen mit PBS, das 0,5% NaCl enthält, wird gp96 mit 100 mM Natriumacetat (pH 4,5), das 0,15% NaCl enthält; oder 100 mM Diethanolamin (pH 10,5) mit 0,15 M NaCl; oder PBS (pH 7,4) mit 1,3 M NaCl eluiert. Die Fraktionen werden mittels SDS-Polyacryl­ amid-Gelelektrophorese und Western-Blot unter Verwendung des mono­ klonalen Antikörpers SPA-850 (StressGen Biotechnologies) untersucht. Um die ungefähre Konzentration an gp96 zu ermitteln, wird die opti­ sche Dichte (OD) bei 280 nm unter Verwendung eines Exktinktionsko­ effizienten von 1 gemessen.
Eine stark radioaktiv markierte Bande des Proteins, das nahe an der 94-kDa-Markerbande läuft, zeigt, daß der immobilisierte rekom­ binante scFv H11B in der Lage ist, gp96 spezifisch zu binden (Fig. 5, (8)). Diese Bande fehlt in der Kontroll-Bahn (7), in der lediglich BSA-Sepharose-Beads zur Immunpräzipitation verwendet werden. Zur Anwendung in einem klinisch anwendbaren gp96-Reinigungsverfahren sollte der rekombinante scFv-Antikörper auch in der Lage sein, huma­ nes gp96 zu erkennen. Um zu testen, ob dies möglich ist, werden die Immunpräzipitierungsexperimente mit hypotonen Lysaten menschli­ cher C1R-Zellen durchgeführt. Im Gegensatz zu immobilisiertem BSA (5) ist immobilisierter scFv-H11B-Antikörper fähig, humane gp96- Moleküle zu binden (6). Der Unterschied in den Intensitäten zwischen der Maus- und der Human-Bande in Fig. 5 kann durch die höheren Ex­ pressionsspiegel (Konzentrationen) von gp96 in IGELa2-Zellen im Vergleich zu C1R-Zellen erklärt werden (nicht gezeigt).
Auch immobilisierte B10C- oder G12D-scFv-Antikörper fällen Maus- und Human-gp96 in der gleichen Weise.
Beispiel 6 Aktivierung von CTLs (Cytotoxische T-Lymphozyten durch scFv-gereinigtes gp96 in vivo
Da native gp96-Moleküle durch die immobilisierten scFv-Abs erkannt werden, wird untersucht, ob sie immer noch mit antigenen Peptiden assoziiert sind und in der Lage sind, spezifische Immunantworten zu induzieren. 8 bis 10 Wochen alte C57BL/6-Mäuse werden mit 30 µg aus IGELa2-Zellen unter Verwendung von nach der Standard-Methode oder mittels der scFv-anti-gp96-Methode gereinigtem gp96 in 300 µl PBS, oder mit 80 µl Sepharose-Beads (bezogen auf das Beads-Vo­ lumen) gekoppelt an BSA oder an scFv, welches an gp96 komplexiert ist, in 300 µl PBS immunisiert. 10 Tage später werden die Milzen entfernt und die Splenocyten mit bestrahlten (33Gy) Milzzellen aus BALB.B-Mäusen während 5 Tagen stimuliert.
Beispielsweise werden Sepharose-Säulen, die mit rekombinantem scFv Antikörper gekoppelt sind, mit den hypotonen Lysaten aus IGELa2- Zellen (die aus BALB/c-Mäusen stammen und H2d exprimieren) beladen und die gp96/-scFv-Sepharose-Beads in C57BL/6-Mäuse injiziert. 10 Tage nach der Immunisierung werden die rezipierenden Splenocyten mit bestrahlten BALB.B-Milzzellen (des H2b-Haplotyps) stimuliert. Da Mäuse mit BALB-Herkunft sich von C57BL/6-Mäusen an mehreren Minor- H-Genen unterscheiden und gp96 in der Lage ist, ein Cross-Priming zu induzieren (siehe Arnold et al., J. Exp. Med. 182, 885-889 (1995), und J. Exp. Med. 186, 461-466 (1997)), sollte eine Immunisierung der C57BL/6-ZMäuse mit BALB/c-deriviertem gp96 die BALB.B-reaktiven CTLs in den Rezipienten aktivieren. Wie in Fig. 6B zu sehen, komple­ xiert die aus der mit den gp96/scFv-Sepharose-Beads immunisierten Maus erhaltene Kultur solche CTLs, die Minor-H-Antigene zeigen, welche auf BALB.B vorliegen, aber nicht auf C57BL/6-Blasten. Im Kontrollexperiment wird keine CTL-Aktivität gefunden (Fig. 6A). Diese Resultate zeigen, dass affinitätsgereinigtes gp96 immer noch mit antigenen Peptiden assoziiert ist, in diesem Falle mit Minor-H- Antigenen, und dass es in der Lag ist, eine spezifische Immunantwort hervorzurufen.
Um die Verwendbarkeit für klinische Anwendungen zu überprüfen, wird versucht, gp96-Moleküle aus den Sepharose-Beads unter Aufrechterhal­ tung ihrer Immunogenität zu eluieren. Mehrere Bedingungen zur Elution der gp96-Moleküle von den Affinitätssäulen werden untersucht. Nur der Diethanolamin-Puffer mit einem pH von 10,5 oder ein Puffer mit hoher Salzkonzentration (1,3 M NaCl) sind in der Lage, gp96-Moleküle erfolgreich freiszusetzen, wie durch Dot-Blot-Analyse gezeigt werden kann (nicht gezeigt). Ein Puffer mit pH 4,5 kann gp96 nicht von der H11B-Säule eluieren.
Um zu testen, ob die eluierten gp96-Moleküle immer noch immunogen sind, werden Cross-Priming-Experimente durch Immunisierung von C57BL/6-Mäusen, jetzt mit chromatographisch gereinigtem IGELa2 gp96, wie durch Elution von den gp96/Scfv-Sepharose-Beads erhalten, durchgeführt. Wie in den Fig. 6C bis 6F gezeigt, sind mit dem Hoch­ salz-Puffer (1,3 M NaCl) eluierte gp96-Moleküle tatsächlich in der Lage, CTLs zu generieren, die spezifisch Minor-H-Antigene aus BALB.B- Zellen erkennen (Fig. 6F). Die affinitätsgereinigten gp96-Moleküle sind genauso effizient bei der Generierung einer CTL-Antwort wie das gp96, welches aus denselben Maus-IGELa2-Zellen unter Verwendung des Standardprotokolls stammt (Fig. 6D). Dagegen wird bei der Maus mit gp96, das von der scFv-Säule mittels des pH 10,5-Puffers eluiert ist, keine CTL-Antwort festgestellt (Fig. 6E). Dies kann durch den Verlust vom gp96 gebundener Peptide während des Elutionsvorgangs bei basischem pH erklärt werden. Im selben Experiment verursachen nicht immunisierte C57BL/6-Mäuse keine CTL-Antwort (Fig. 6C).
Sequenzprotokoll - freier Text
SEQ ID NO: 1: Randomisierte CDR3-Schleife als Bestandteil einer schweren Kette eines Antikörpers, siehe Nissim et al. EMBO J. 13(3), 692-98 (1994); SEQ ID NO: 2 und 3: Zufallssequenz für CDR3 einer schweren Kette eines Antikörpers, Herstellung gemäss Nissim et al., 1994. SEQ ID NO: 10 bis 12: Rekombinante Sequenz für variablen Teil der schweren Kette von Antikörpern mit Zufallssequenz für CDR3 (Nissim, 1994); SEQ ID NO: 14 bis 16: Zufallssequenz, codiert für CDR3 einer schweren Kette eines Antikörpers, Herstellung siehe Nissim et al., 1994; SEQ ID NO: 23 bis 25: Rekomb. Sequenz, codiert für variablen Teil der schweren Kette von Antikörpern mit Zufallssequenz für CDR3 (Nissim, 1994).
SEQUENZPROTOKOLL

Claims (17)

1. Rekombinante Antikörper, die natives gp96 binden.
2. Antikörper gemäss Anspruch 1, welche die dritte Komplementarität determinierende Region (CDR3) der schweren Kette eines Antikörpers gemäss SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3 umfassen.
3. Antikörper gemäss einem der Ansprüche 1 und 2, welche (a) die vom variablen Teil der schweren Kete abgeleiteten Abschnitte CDR3 der Sequenz SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 3; CDR2 der Sequenz SEQ ID NO: 4; und CDR1 der Sequenz SEQ ID NO: 5 oder insbe­ sondere SEQ ID NO: 6 und (b) die vorm variablen Teil der schweren Kette abgeleiteten Abschnitte CDR1' mit der Sequenz SEQ ID NO: 7, CDR2' mit der Sequenz SEQ ID NO: 8 und CDR3' mit der SEQ ID NO: 9 umfassen.
4. Antikörper, vorzugsweise Einzelketten-Antikörper, gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3, welcher (a) die variable Sequenz der schweren Kette gemäss SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 oder SEQ ID NO: 12 und (b) die variable Sequenz der leichten Sequenz gemäss SEQ ID NO: 23 umfasst, getrennt durch einen Spacer.
5. Verwendung eines rekombinanten Antikörpers gemäss einem der An­ sprüche 1 bis 4 zur Reinigung oder Markierung von gp96.
6. Verwendung eines rekombinanten Antikörper gemäss einem der An­ sprüche 1 bis 4 zur Reinigung von intakten gp96/Peptid-Komplexen aus kleinen Mengen von Tumormaterial oder infizierten Zellen.
7. Verfahren zur Reinigung von gp96, dadurch gekennzeichnet, dass nach Zentrifugation zur Klärung eines Zellysates ein Trennungsschritt an einer Matrix vorgenommen wird, die gebundene Antikörper gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4 trägt, und anschliessend das gebundene gp96 freigesetzt wird.
8. gp96 mit gebundenen Peptiden, welches nach dem Reinigungsverfahren gemäss Anspruch 7 gewinnbar ist.
9. gp96 mit gebundenen Peptiden nach Anspruch 8 zur Anwendung in einem Verfahren zu therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers, insbesondere zur autologen Immunisierung.
10. Verwendung von gp96 mit gebundenen Peptiden gemäss Anspruch 8 zur Herstellung eines Arzneimittels zur (insbesondere autologen) Immunisierung bei Patienten, die an einer Tumorerkrankung oder einer Infektion leiden.
11. Verwendung von gp96 mit gebundenen Peptiden gemäss Anspruch 8 zur Immunisierung von Patienten.
12. Vorrichtung zur Reinigung von nativem gp96, welche einen rekombinanten Antikörper gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4 umfasst.
13. Kit zur Reinigung oder zum Nachweis von nativem gp96, umfassend einen rekombinanten Antikörper gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4.
14. Nucleinsäuresequenzen, insbesondere DNA-Sequenzen, welche für erfindungsgemässe rekombinante Antikörper gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4 kodieren.
15. Wirtszellen, insbesondere Prokaryonten, wie E. coli, welche für erfindungsgemässe rekombinante Antikörper gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4 codierende Sequenzen umfassen.
16. Eine Matrix, insbesondere Sepharose oder ein Gel auf Poly­ acrylamidbasis, die einen rekombinanten Antikörper gemäss einem der Ansprüche 1 bis 4 trägt.
17. Verfahren zur Isolierung von Peptiden, welche an natives gp96 aus Warmblüterzellen, das nach dem Verfahren in Anspruch 7 gewinnbar ist, gebunden sind, insbesondere aus Warmblütern, die an einer Er­ krankung leiden.
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