KR101314959B1 - 결장직장선종 및/또는 결장직장암종에 대한 생체표지로서엔도플라스민 단편 및 그 유도체의 사용； 검출 방법 및시험 시스템 - Google Patents

결장직장선종 및/또는 결장직장암종에 대한 생체표지로서엔도플라스민 단편 및 그 유도체의 사용； 검출 방법 및시험 시스템 Download PDF

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Abstract

본 발명은 결장직장선종 및/또는 결장직장암종을 검출하기 위한 방법에 관한 것으로서 하기 단계를 포함한다: a) 하나의 개체로부터 취해진, 분리된 샘플 재료를 준비하는 단계, b) 상기 분리된 샘플 재료 내의 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 수치를 측정하는 단계, c) 상기 측정된 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 수치를 하나 이상의 참조값과 비교하는 단계. 본 발명은 또한 결장직장선종 및 결장직장암종 사이를 식별하기 위한 방법 및 결장직장선종 및/또는 결장직장암종의 발생 및/또는 경과의 모니터링 및/또는 결장직장선종 및/또는 결장직장암종의 치료를 위한 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이들 방법에서의 사용을 위한 시험 시스템 및 어레이에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 개체에서 결장직장선종 및/또는 결장직장암종의 검출을 위한 생체표지로서 엔도플라스민 단편의 사용에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 결장직장선종 및/또는 결장직장암종에서 화합물의 유효성을 판단하기 위한 방법에 관한 것이다.

Description

결장직장선종 및/또는 결장직장암종에 대한 생체표지로서 엔도플라스민 단편 및 그 유도체의 사용； 검출 방법 및 시험 시스템{USE OF AN ENDOPLASMIN FRAGMENT AND DERIVATIVES THEREOF AS A BIOMARKER FOR COLORECTAL ADENOMA AND/OR CARCINOMA； METHOD FOR DETECTION AND TEST SYSTEM}
본 발명은 결장직장선종(colorectal adenoma) 및/또는 결장직장암종(colorectal carcinoma) 검출(detection) 분야에 관한 것이다.
결장직장암종(colorectal carcinoma)은 전 세계적으로 세 번째로 많이 진단되는 암(9.4%)이다. 2003년에 전 세계적으로 거의 945000 건의 새로운 결장직장암종 사례가 진단되었고 대략 492000명이 이 질병으로 사망했다. 결장직장암종의 발병률은 증가하고 있는 반면 결장직장암종의 사망률은 감소하고 있다. 결장직장암종의 발병률은, 40세 부근에서 시작하여, 연령에 따라 증가하고 여성에 비해 남성에 대하여 더 높다(1년에 100000명 당, 남성은 40.6명, 여성은 30.6명)(World cancer report, 2003, Ed. BW. Stewart and P. Kleihues. IARC Press, Lyon).
환자 대부분에서, 결장직장암종의 발생은 전암성 선종(premalignant adenoma)으로부터 전이 경향의 침습성 악성종양(invasive malignancies)까지 다단 계로 진행된다(multistep progression).
지금까지는 단지 결장경검사(colonoscopy)와 같은 불쾌한 직장결장 스크리닝 검사만이 초기 단계 결장직장암종 및 그의 전구체(precursors)의 검출을 달성하는 것으로 보여왔다. 그러나, 10 mm 지름보다 더 작은 평평한 종양성 병변(neoplastic lesions) 및 용종상 병변(polypoid lesions)에 대하여 높은 위음성률(false negative rates)이 관찰되었다(Kudo S. (1997) Gastrointest. Endosc. Clin. N.Am. 7:87-98). 따라서, 서로 상이한 종양 단계들(tumor stages) 사이의 특정한 식별뿐만 아니라 결장직장선종 및/또는 결장직장암종의 조기 검출을 가능하게 하는 검사 시스템을 갖는 것이 소망된다. 이는 또한 치료의 특정한 적용을 가능하게 할 것이다.
혈액 샘플 내의 종양표지(tumor marker) 검출에 기초한 현재 알려진 스크리닝 검사는 요구되는 감도(sensitivity) 및 특이성(specificity)이 없다. 예를 들어, 혈액 샘플 내의 CEA-(Carcinoembryonic antigen)-수치가 결장암종(colon carcinoma)을 검출하는 데 사용되어 왔다. 그러나, CEA 수치는 결장암종에서 특이적으로 상승하지 않고 다른 악성 종양 질환(예컨대, 위암, 췌장암, 유방암, 및 폐암) 및 다양한 비-악성종양 병태(예컨대, 알코올성 간 질환, 염증성 장 질환, 극심한 흡연, 만성 기관지염, 및 췌장염)가 있는 환자에서도 상승하는 것으로 나타난 바 있다(Posner MR, Mayer RJ: The use of serologic tumor markers in gastro intestinal malignancies. Hematol Oncol CNn North Am 8:533, 1994). 또한, CEA-수치는 결장선종에서는 상승하지 않는다. 게다가, CEA-수치는 결장직장선종을 결장직장암종 또는 상이한 종양 단계와 구별하는 데 적합하지 않다.
본 발명의 목적은 결장암종 및/또는 결장선종의 조기 검출을 가능하게 하는 수단 및/또는 상이한 종양 단계의 식별을 가능하게 하는 수단을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가적인 목적은 결장직장선종 및/또는 결장직장암종의 검출에 사용될 수 있는 생체표지 및/또는 상이한 종양 단계의 식별에 사용될 수 있는 생체표지를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 결장직장선종 및 결장직장암종을 검출하기 위한 검사 시스템 및/또는 상이한 종양 단계의 식별을 위한 검사 시스템으로서, 비용효율적이고 널리 사용 가능한 것을 제공하는 것이다.
게다가, 상기 검사 시스템은 다루기 쉬워야 한다.
본 발명의 추가적인 목적은 종양의 특정 단계에 따른, 선종 및/또는 암종의 치료에 대해 특이적인 화합물의 유효성을 검출하기 위한 스크리닝 시스템을 제공하는 것이다.
본 발명의 기본적인 목적은, 하나의 개체 내의 결장직장선종 및/또는 결장직장암종의 검출 및/또는 상이한 종양 단계의 식별을 위한 생체표지로서의 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 사용에 의해 해결된다. 상기 검출은 생체 내에서(in vivo) 및 시험관 내에서(in vitro) 수행될 수 있다. 바람직한 구체예에 따르면, 상기 검출은 시험관 내에서 수행된다.
상기 목적은 하기 단계를 포함하는, 결장직장선종 및/또는 결장직장암종의 검출을 위한 방법에 의해 추가적으로 해결된다:
a) 개체(individual)로부터 취해진, 분리된 샘플 재료를 준비하는 단계,
b) 상기 분리된 샘플 재료 내의 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 수치를 측정하는 단계,
c) 상기 측정된 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 수치를 하나 이상의 참조값(reference values)과 비교하는 단계.
상기 목적은 하기 단계를 포함하는, 결장직장선종 및 결장직장암종의 식별 및/또는 추가의 종양상태(tumor states)의 식별을 위한 방법에 의해 추가적으로 해결된다:
a) 개체로부터 취해진, 분리된 샘플 재료를 준비하는 단계,
b) 상기 분리된 샘플 재료 내의 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 수치를 측정하는 단계,
c) 상기 측정된 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 수치를 하나 이상의 참조값과 비교하는 단계.
상기 목적은 또한, 하기 단계를 포함하는, 결장직장선종 및/또는 결장직장암종의 발달(development) 및/또는 경과(course) 및/또는 치료(treatment)의 모니터링을 위한 식별 방법에 의해 해결된다:
a) 개체로부터 취해진, 분리된 샘플 재료를 준비하는 단계,
b) 상기 분리된 샘플 재료 내의 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 수치를 측정하는 단계,
c) 상기 측정된 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 수치를 하나 이상의 참조값과 비교하는 단계.
바람직한 구체예에서, 결장직장선종 및/또는 결장직장암종이 완전히 제거되었는지 여부를 결정하기 위하여 수술상 또는 치료상 절차의 유효성이 제어된다. 다른 구체예에서, 치료의 유효성을 제어하기 위하여, 하나 이상의 화학 물질, 항체, 단백질, 펩티드, 저분자 약물(small molecular drug), 안티센스-RNA(antisense-RNA), 방사선(radiation), 예컨대 X-선, 또는 이들의 조합을 사용하여 환자를 치료함으로써 결장직장선종 및/또는 결장직장암종 환자의 치료가 제어된다.
본 발명의 근원적인 목적은,
a) 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 에피토프(epitope)에 결합하는 항체 또는 수용체,
b) 상기 항체 또는 수용체를 지지하는 고체 지지체,
c) 상기 항체 또는 수용체로의 상기 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 에피토프의 결합을 검출하기 위한 시약
을 포함하는, 개체의 샘플 내에서 결장직장선종 및/또는 결장직장암종의 검출 및/또는 상이한 종양 단계의 식별을 위한 시험 시스템을 제공함으로써 해결된다.
본 발명의 목적은 또한
a) 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체를 인코딩하는 mRNA에 결합하고 이를 검출하기 위한 고체 지지체에 고정된 핵산 탐침(probe), 또는
b) 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 에피토프에 결합하고 이를 검출하기 위한 고체 지지체에 고정된 항체, 또는
c) 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 에피토프에 결합하고 이를 검출하기 위한 고체 지지체에 고정된 수용체
를 검출분자(detection molecule)로서 포함하는, 하나의 개체 내에서 결장직장선종 및/또는 결장직장암종의 검출 및/또는 상이한 종양 단계의 분화(differentiation)를 위한 검출분자를 포함하는 어레이(array)를 제공함으로써 해결되며,
여기서 바람직하게는 정량(quantification)의 정확성을 증가시키기 위하여 상이한 양의 검출분자가 상기 고체 지지체에 고정된다.
상기 핵산 탐침은 예를 들어 단일가닥(single-stranded) 또는 이중가닥 DNA 또는 RNA, 압타머(aptamers) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 압타머는 높은 특이성(specificity) 및 친화성(affinity)으로 단백질 표적(targets)에 결합하며 특정한, 서열-의존적(sequence-dependent) 형상을 나타내는 단일가닥 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides)이다. 압타머는 SELEX 프로세스를 사용하여 확인된다(Tuerk C. and Gold L. (1990) Science 249: 505-510; Ellington AD. and Szostak JW (1990) Nature 346, 818 -822).
상기 목적은 또한, 하기 단계를 포함하는, 화합물이 결장직장선종 및/또는 결장직장암종의 치료에 효과적인지 여부를 판단하는 방법 및/또는 상이한 종양 단계의 분화를 위한 방법에 의해 해결된다:
a) 결장직장선종 또는 결장직장암종 환자를 화합물로 치료하는 단계,
b) 상기 환자의 샘플 재료 내에서 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 수치를 측정하는 단계, 및
c) 상기 측정된 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 수치를 하나 이상의 참조값과 비교하는 단계.
바람직한 구체예들은 종속 청구항에 개시된다.
본 발명에 따른 용어 "샘플 재료"는 "샘플"로도 지칭된다.
본 발명에 따른 용어 "생체표지(biomarker)"는 결장직장선종 및/또는 결장직장암종의 발병을 나타내는 단백질 또는 단백질 단편 또는 핵산을 지칭하는 의미이다. 이는 상기 "생체표지"가 결장직장선종 및/또는 결장직장암종을 검출하기 위한 수단으로 사용된다는 의미이다.
용어 "개체(individual)" 또는 "개체들(individuals)"은 포유류를 지칭하는 의미이다. 바람직하게는, 상기 포유류는 환자와 같은 인간이다.
용어 "건강한 개체" 또는 "건강한 개체들"은 결장직장선종 및/또는 결장직장암종에 걸리지 않은 개체(들)을 지칭하는 의미이다. 즉, 용어 "건강한 개체(들)"은 결장직장선종 및/또는 결장직장암종의 병리학상 상태에 관해서만 사용되며 결장직장선종 및/또는 결장직장암종 이외의 질병에 걸린 개체를 배제하지는 않는다.
본 발명에 따른 용어 "상이한 종양 단계의 식별(discrimination of different tumor stages)"은 결장직장선종과 결장직장암종의 식별 및/또는 상이한 종양 단계, 예컨대 TNM I, II, III 및 IV의 식별을 의미한다.
용어 "이의 유도체(derivative thereof)"는, 예컨대 절단된 유전자(truncated gene), 상기 유전자의 단편, 돌연변이된 유전자(mutated gene), 또는 변형된 유전자(modified gene) 또는 이들 각각의 유전자 산물을 포함하는, DNA, mRNA 또는 단백질 수준에서의 임의의 변형물(modification)을 설명하기 위한 의미이다. 용어 "이들의 유도체"는 DNA, RNA, mRNA와 같은, 핵산 서열 또는 단백질 서열 또는 펩티드 서열을 포함한다. 상기 유도체는 유전자에서의 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)의 결과인 변형일 수 있다. 상기 유전자 변형은 자연적으로 발생하는 유전자 변동성(variability)의 결과일 수 있다. 용어 "자연적으로 발생하는 유전자 변이성(naturally occurring gene variability)"은 유전자공학의 결과가 아닌 변형을 의미한다. 상기 유도체는 신체 내에서의 유전자 또는 유전자 산물 및/또는 퇴화 산물(degradation product)을 처리한 결과일 수 있다. 단백질 수준에서의 변형은 신체 내에서의 효소 변형 또는 화학 변형 때문일 수 있다. 예를 들어, 상기 변형은 글리코실화(glycosylation) 또는 인산화(phosphorylation) 또는 파네실화(farnesylation)일 수 있다.
본 발명에 사용된 용어 "엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체"는 또한 돌연변이된 엔도플라스민 단편 또는 변형된 엔도플라스민 단편 또는 변형된 엔도플라스민의 단편을 포함한다. 상기 "엔도플라스민 단편"의 변형은 효소 변형 또는 화학 변형 때문일 수 있다.
"종양(tumor)" 및 "암(cancer)"은 상호 교환하여 사용될 수 있으며 동일한 의미를 갖는다.
하나의 구체예에서 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체는 엔도플라스민의 N-말단(N-terminal) 단편 또는 C-말단 단편을 포함하는 단백질이다. 상기 용어 N-말단 단편 또는 C-말단 단편은, 각각, 이들 서열이 엔도플라스민의 완전한 N-터미너스(N-terminus) 또는 C-터미너스를 포함하는 것을 의미하는 것이 아니고, 상기 단편이 엔도플라스민의 N-말단 또는 C-말단 영역에서 생성되는 것으로 이해되어야 한다.
상기 단편은 또한 엔도플라스민의 단백질 서열의 중간 부분(middle part)으로부터 생성될 수도 있다.
엔도플라스민의 단편의 서열 길이(SEQ ID NO.1)는 엔도플라스민에 대해 특정될 수 있도록 충분히 길어야 한다. 엔도플라스민 서열(SEQ ID NO.1)의 적어도 7개의 연속하는(contiguous) 아미노산, 바람직하게는 적어도 8개의 연속하는 아미노산을 포함하는 엔도플라스민의 단편은 엔도플라스민에 대하여 높은 특이성을 갖는 것으로 나타났다. 본 발명의 바람직한 구체예에 따르면 상기 단편은 엔도플라스민(SEQ ID NO. 1)의 적어도 9개의 연속하는 아미노산을 포함한다.
Grp94라고도 지칭되는 총-길이(full-length) 엔도플라스민(SEQ ID NO. 1)의 특정한 절단(cleavage)으로 인해 약 10-14 kDa 및 80 kDa의 두 단편이 생성된다. 엔도플라스민-절단은 칼페인(Calpain)에 의해 유도되는 것으로 여겨진다(도 4).
본 발명의 하나의 구체예에서, 상기 엔도플라스민 단편은 분자량이 약 80 kDa인 C-말단 단편 또는 분자량이 약 10 내지 14 kDa인 N-말단 단편을 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에 따르면 분자량이 상기 약 10 내지 14 kDa이거나 약 80 kDa인 단편은 칼페인에 의한 절단에 의해 유도된다.
본 발명의 구체예에서 상기 엔도플라스민 단편은 서열 SEQ-ID-NO.1의 부분을 포함한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서 상기 엔도플라스민 단편은 N-말단 단편을 포함한다. 바람직하게는 상기 단편은 펩티드 서열 SEQ ID-NO.2 및/또는 펩티드 서열 SEQ-ID NO.3을 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에 따르면 상기 단편은 펩티드 서열 SEQ-ID NO.4를 포함한다.
본 발명의 다른 구체예에서 상기 엔도플라스민 단편은 분자량이 10 내지 14 kDa이고, 더욱 바람직하게는 10.3 kDa이다.
본 발명의 추가의 구체예에서 엔도플라스민 단편은, SEQ ID NO.2, SEQ ID NO.3 또는 SEQ ID NO.4(도 1)와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%로 서열 동일성(sequence identity)을 갖는 아미노산 서열이거나 이를 포함하며 결장직장선종 및/또는 결장직장암종을 명확하게 검출할 수 있는, 펩티드 또는 단백질이다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면 상기 엔도플라스민 단편은, 상기 단편의 서열에 기초하여 SEQ ID NO.1과 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 95%로 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
글루코오스-관련 단백질(Glucose-related proteins)(grps)은 스트레스 유도(stress induction) 후에 합성된 고도로 보존된(conserved) 단백질 군이다. Grp는 그들 각각의 표적 단백질을 전달, 폴딩 및 처리하는 것을 돕는 분자 샤페론(molecular chaperones)으로서 행동한다. 면역조직화학적 염색(staining)은 주로 세포질 내에서 grp94를 검출한다. Grp94는 엔도플라스민으로도 지칭된다. Grp94(엔도플라스민)은 관강(luminal) 단백질 및 내재(integral) 단백질의 이중적인 특성을 나타내는데, 이는 소포체(endoplasmic reticulum) 내에서 두 개의 다른 형태로 존재한다는 점을 시사한다.
용어 "에피토프(epitope)"는 항체, 항체 단편, 단백질 또는 펩티드 구조 또는 수용체의 특정 결합을 가능하게 하는 임의의 단백질 구조 또는 단백질 또는 펩티드의 임의의 구성 요소를 지칭하는 의미이다.
본 발명의 방법은 인체로부터 사전에 분리된 체액(body fluids) 또는 조직 샘플과 같은 샘플 재료를 사용하여 수행된다. 바람직하게는, 상기 샘플 재료는 조직 샘플이다. 그 후에 상기 샘플 재료는 분류 및/또는 정제될 수 있다. 예를 들어, 시험될 샘플 재료를 냉동실에 보관하고 각각의 샘플 재료를 해동시킨 후에 적절한 시점에서 본 발명의 방법을 수행하는 것이 가능하다.
놀랍게도, 엔도플라스민 단편 및 이의 유도체는 결장직장선종 및/또는 결장직장암종의 검출을 위한 생체표지로서, 바람직하게는 조기 생체표지로서 사용될수 있다는 점이, 본 발명자들에 의해 발견되었다.
본 발명자들은 놀랍게도, 조직 샘플 또는 체액과 같은 샘플 재료 내의 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 단백질 수치가 결장직장선종 및/또는 결장직장암종에 걸린 개체 내에서 높아진다는 점을 발견했다. 더욱이, 본 발명자들은 놀랍게도, 조직 샘플 또는 체액 내의 엔도플라스민 단편 단백질 수치 또는 이들의 유도체가 결장직장선종 및/또는 결장직장암종에 걸린 사람과 건강한 사람의 구별뿐 아니라 결장직장암종과 결장직장선종의 구별을 위해 사용될 수 있다는 점을 발견했다. 더욱이, 엔도플라스민 단편의 수치는 상이한 종양 단계, 예컨대 TNM I, II, III 및/또는 IV 사이를 식별하기 위해 사용될 수 있다. 상기 엔도플라스민 단편은 결장직장선종 및 결장직장암종 및/또는 상이한 종양 단계를 식별하기 위해 사용될 수 있는 특정 생체표지이다. 상기 상이한 종양 단계는 예를 들어 TNM I, II, III 및/또는 IV일 수 있다. 상기 엔도플라스민 단편은 조직병리학에 의해 얻어진 진단을 확인하기 위해 사용될 수 있는 선택적인 특정 표지이다.
본 발명자들은, 그러나, 조직 또는 생체액(biological fluids), 예컨대 혈청 또는 혈장과 같은 샘플 재료 내에서 완성된(complete) 엔도플라스민의 높아진 수치가 결장직장선종에 대하여 특이적이라는 점도 발견했다. 따라서, 완성된 엔도플라스민의 높아진 수치는 또한 결장직장선종을 나타낸다. 이러한 관점에서, 상기 및 하기에 주어진 모든 설명은 각각 완성된 엔도플라스민에 대하여 적용한다.
그러나, 본 발명자들은 또한 놀랍게도, 조직 또는 체액과 같은 샘플 채료 내의 엔도플라스민 단편의 높아진 수치가 결장직장선종 및/또는 결장직장암종에 대하여 훨씬 더 특이적이고 감도가 좋은 생체표지라는 점을 발견했다.
본 발명에 따르면, 샘플 재료는 조직, 세포 또는 체액일 수 있다. 상기 샘플 재료는 혈액, 혈장, 혈청, 골수(bone marrow), 대변(stool), 관절낭액(synovial fluid), 림프액(lymphatic fluid), 뇌척수액(cerebro spinal fluid), 객담(sputum), 소변(urine), 모유(mother milk), 정액(sperm), 삼출물(exudate) 및 이들의 혼합물과 같은 체액일 수 있다. 본 발명의 구체예에서 상기 체액은 크로마토그래피에 의해 분류된다.
바람직하게는, 상기 체액은 본 발명의 방법을 수행하기 전에 분리된다. 본 발명의 방법은 바람직하게는 실험실에서 기술자에 의해 시험관 내에서(in vitro) 수행된다.
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 엔도플라스민 단편의 수치는 혈장, 혈청 또는 소변에서 측정된다. 혈청은 의학적으로 진찰될 개체로부터 혈액을 채취하고 상청액(supernatant)을 응혈(clotted blood)에서 분리함으로써 용이하게 얻어질 수 있다.
엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 수치는 결장직장선종의 점진적 형성(progressive formation)시에 더 높다. 상기 결장직장선종은 악성으로 될 수 있는 양성 신생물종양(benign neoplasma)이다. 양성 결장직장선종으로부터 결장직장암종이 발생할 경우, 체액, 바람직하게는 혈청에서 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 수치가 더욱 증가한다.
결장직장선종이 결장직장암종으로 변형된 후, 병에 걸린(afflicted) 개체의 병리학상 병태는 전이(metastasis)의 형성에 의해 더욱 악화될 수 있다. 더 높은 엔도플라스민 단편 수치는 결장직장선종 및/또는 결장직장암종 및/또는 종양의 발병과 관련이 있다.
본 발명은 초기 및/또는 아직 양성인 단계 및/또는 초기 종양 단계에서 종양성 질환을 검출하게 하는, 초기 단계 생체표지를 제공한다. 초기 검출은 내과 의사가 적시에 결장직장선종을 제거할 수 있게 해주어 개체가 생존할 수 있는 기회를 급격하게 증가시킨다.
더욱이, 본 발명은 혈청과 같은 체액 내에서, 수년과 같은 연장된 시간에 걸쳐서 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 수치를 모니터링할 수 있도록 한다.
장기간 모니터링은 결장직장선종과 결장직장암종 사이를 구별할 수 있도록 한다. 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 수치는, 예컨대, 일년에 한번 또는 두번 체액에서 정기적으로 체크될 수 있다. 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 수치 증가가 검출된다면 이는 결장직장선종을 나타내는 것이다. 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 수치의 추가적인 증가는 악성 결장직장암종으로의 전이를 나타낼 수 있다.
더욱이, 질병 및/또는 치료의 경과가 모니터링될 수 있다. 예컨대 결장직장선종을 제거한 후, 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 수치가 추가로 증가하는 경우, 이는 병리학상 상태의 악화를 나타낼 수 있다.
이는, 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 수치가 결장직장선종 및/또는 결장직장암종의 검출 및/또는 모니터링을 위한 유용한 임상적 변수(clinical parameter)라는 것을 의미한다. 체액에서의 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 수치는 결장직장선종의 발병 후에 증가한다. 따라서, 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 수치는 상기 질병의 초기 진단 및, 결과적으로, 초기 치료를 가능하게 하는 중요한 임상적 변수이다. 게다가, 엔도플라스민 단편의 수치는 외과적 처치 및/또는 다른 치료의 효과를 체크하기 위해 사용될 수 있다.
결장직장선종 및/또는 결장직장암종을 검출하기 위한, 및/또는 상이한 종양 단계들 사이를 식별하기 위한 본 발명의 방법은 개체로부터 취해진 분리된 샘플 재료를 준비하는 단계, 그리고 상기 분리된 샘플 재료 내의 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 수치를 측정하는 단계, 마지막으로, 측정된 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 수치를 하나 이상의 참조값과 비교하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 개체로부터 취해진 분리된 샘플 재료에서 하나 이상의 추가의 생체표지(들)가 추가적으로 검출되고, 생체표지(들)의 수치가 측정되고 하나 이상의 참조값(들)과 비교된다.
상기 참조값은 건강한 개체들 또는 결장직장선종 및/또는 결장직장암종에 걸린 개체들의 다수의 분리된 샘플에서 측정된 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 평균 수치로서 계산될 수 있다. 이 참조값은, 정상으로 생각되는 범위를 커버하는 건강한 사람으로부터 정해질 수 있거나, 결장직장선종 및/또는 결장직장암종에 걸린 환자로부터 높아진다고 생각되는 범위로부터 정해질 수 있다. 보통, 상기 참조값은 참조값의 범위로 주어진다. 따라서, 본 발명에서 사용되는 참조값 및 참조값의 범위는 동일한 의미를 갖는 것으로 정의된다.
참조값의 범위 내의 특정 값은 건강한 상태 또는 결장직장선종 및/또는 결장직장암종의 병리학상 상태를 나타낼 수 있다. 이러한 참조값의 범위는, 예컨대 혈당과 같은 임의의 다른 의학적 변수에 대해 행해지는 것과 같이, 건강한 개체 및 결장선종 및/또는 결장암에 걸린 개체의, 통계적으로 유의한 수의 조직 샘플 또는 혈청 샘플과 같은 체액 샘플을 취함으로써 정해질 수 있다. 건강한 상태에 대한 참조값은 결장직장선종 및/또는 결장직장종양 환자의 건강한 조직으로부터 수득될 수도 있다.
바람직하게는, 음성 대조군 및 양성 대조군 1로 지칭되는 두 개의 참조값이 계산된다. 상기 음성 대조군의 참조값은 건강한 개체 또는 결장직장선종 및/또는 결장직장종양 환자의 건강한 조직으로부터 계산되고, 양성 대조군은 결장직장선종 또는 결장직장암종에 걸린 개체로부터 계산된다. 더욱 바람직하게는, 음성 대조군 및 양성 대조군 1 및 양성 대조군 2를 가리키는 3 개의 참조값이 계산된다. 양성 대조군 1은 결장직장암종에 걸린 개체로부터 계산될 수 있고, 양성 대조군 2는 결장직장선종으로부터 계산될 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 참조값은 일정 시간에 걸쳐 개체로부터 취해진 다수의 분리된 샘플에서 측정된 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 평균 수치로서 계산된 개별적인 참조값일 수 있다.
수개월 또는 수년과 같이, 연장된 일정 시간에 걸쳐 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 수치를 모니터링하면, 개체 평균 수치를 정할 수 있다. 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 수치는, 예컨대, 혈당을 측정할 때와 동일한 혈청 샘플로부터 측정될 수 있고, 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 수치의 어떠한 개별적 증가를 명확하게 검출하게 하는 개별적인 교정 곡선을 정하기 위해 사용될 수 있다.
추가의 생체표지를 위한 참조값은 엔도플라스민에 대해 기술된 것과 같은 방법으로 계산될 수도 있다. 엔도플라스민 단편 또는 추가의 생체표지의 평균 수치는 평균 또는 중앙값 수치일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 한 개체의 분리된 샘플 재료 내에서 결장직장선종 및/또는 결장직장암종을 검출하기 위한 시험 시스템을 제공한다. 상기 시험 시스템은 에피토프(epitope)에 특정하게 결합하는 항체 또는 수용체의 특이성 또는 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 적합한 구조적 요소에 기초한다. 수용체는 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체에 특정하게 결합할 수 있는 임의의 구조일 수 있다. 상기 수용체는, 예를 들어, Fab 단편 또는 F(ab')2 단편과 같은 항체 단편 또는 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체에 특정하게 결합할 수 있는 임의의 다른 단백질 또는 펩티드 구조일 수 있다. 상기 수용체는 또한 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체에 특정하게 결합할 수 있는 압타머일 수 있다.
상기 항체, 항체 단편 또는 수용체는, 예컨대 플라스틱 표면 또는 비드(beads)와 같이 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 결합 및 검출을 가능하게 하는 고체 지지체에 결합된다. 예를 들어, 기존의 미량역가판(microtiter plate)이 플라스틱 표면으로 사용될 수 있다. 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 결합의 검출은, 예컨대, 검출 가능한 집단(detectable group)으로 분류된 이차 항체를 사용함으로써 이루어질 수 있다. 상기 검출 가능한 집단은, 예컨대, 적합한 기질을 가하여 예컨대 색 또는 형광 신호를 생성함으로써 검출 가능한 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 또는 양고추냉이 페록시다아제(horseradish peroxidase) 같은 방사성 동위원소나 효소일 수 있다.
상기 시험 시스템은 효소-결합 면역흡착측정법(enzyme-linked immunosorbentassay)(ELISA) 또는 방사 면역측정법(radio immunoassay)(RIA) 또는 형광 면역측정법(luminescence immunossay)(LIA)와 같은 면역측정법일 수 있다. 그러나, 웨스턴 블러팅(Western blotting) 또는 침강법(immuno precipitation)과 같이, 항체 또는 항체 단편의 특정에 사용되는 임의의 다른 면역학적 시험 시스템이 사용될 수 있다.
본 발명은 또한, 한 개체 내에서 결장직장선종 및/또는 결장직장암종의 검출을 위한 검출분자(detection molecules)로서, 상기 검출 분자는 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체를 인코딩하는 mRNA에 결합하고 이를 검출하기 위한 고체 지지체에 고정된 핵산 탐침(probe)일 수 있는 것, 또는 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 에피토프에 결합하고 이를 검출하기 위한 고체 지지체에 고정된 항체, 또는 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 에피토프에 결합하고 이를 검출하기 위한 고체 지지체에 고정된 수용체를 포함하는 어레이(array)를 제공한다. 바람직하게는, 상기 어레이는 결장직장선종 및/또는 결장직장암종을 검출하기 위한 생체표지에 대한 추가적인 검출 분자를 포함한다. 바람직하게는, 상기 핵산 탐침은 SEQ-ID-NO.2 및/또는 SEQ-ID-NO.3 또는 SEQ-ID-NO.4에 따른 핵산 서열로 이루어진 군에서 선택되는 핵산 서열을 포함한다.
대안적으로, 본 발명은 또한 상기 정의된 검출 분자에 의해 검출될 수 있는 고체 지지체에 고정된 환자 샘플을 포함하는 역 어레이(inverse array)를 포함한다.
바람직하게는 상기 어레이는 확인 가능한 위치에서 고체 표면에 고정되는 검출 분자를 포함한다.
본 발명에 사용된 용어 "어레이(array)"는, 반드시 일정한 배열이 아닌, 분류(grouping) 또는 배열(arrangement)을 지칭한다. 하나의 어레이는 바람직하게는 적어도 2개, 더욱 바람직하게는 5개, 가장 바람직하게는 10개의 상이한 검출 분자 세트를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 어레이는 적어도 50개의 검출 분자 세트, 더욱 바람직하게는 적어도 100개의 검출 분자 세트를 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에 따르면 본 발명의 어레이는 적어도 500개의 검출 분자 세트를 포함한다. 상기 검출분자는 상기에서 이미 기술한 바와 같이 예를 들어 핵산 탐침 또는 항체 또는 수용체일 수 있다.
상기 핵산 탐침은 임의의 천연 또는 합성 올리고뉴클레오티드, 압타머 뿐만 아니라 cDNA, cRNA 등일 수 있다.
상기 기술된 어레이는 본 발명에 따른 시험 시스템에 사용될 수 있다. 본 발명에 사용된 용어 "어레이"는 매크로어레이(macroarrays) 및 마이크로어레이(microarrays) 모두에 관한 것이다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 수치는 질량 분석법에 의해 측정될 수 있다.
질량분석법은 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체를 분자량으로 특정하게 검출할 수 있으며 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 양을 매우 쉽게 정량할 수 있다.
엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체, 분자, 단편, 돌연변이(mutations), 변형(variant) 또는 이들의 유도체를 이온화하기 위해, 본 기술 분야에 알려진 질량 분석법 분야에서 임의의 적절한 이온화 방법이 채용될 수 있다. 상기 이온화 방법은 전자 충돌(electron impact)(EI), 화학 이온화(chemical ionization)(CI), 장 이온화(field ionization)(FDI), 전기분무 이온화(electrospray ionization)(ESI), 레이저 탈착 이온화(laser desorption ionization)(LDI), 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화(matrix assisted laser desorption ionization)(MALDI) 및 표면 증대 레이저 탈착 이온화(surface enhanced laser desorption ionization)(SELDI)를 포함한다.
엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 분자량을 측정하기 위하여 본 기술 분야에 알려진 질량 분석법 분야에서 임의의 적절한 검출 방법이 채용될 수 있다. 상기 검출 방법은 사중극 질량분석법(quadrupol mass spectroscopy)(QMS), 푸리에 변환 질량분석법(fourier transform mass spectroscopy)(FT-MS) 및 비행시간형 질량분석법(time-of-flight mass spectroscopy)(TOF-MS)을 포함한다.
바람직하게는, 상기 질량 분석법은 표면 증대 레이저 탈착 이온화-비행시간형 질량분석법(surface enhanced laser desorption ionization-time of flight-mass spectroscopy)(SELDI-TOF-MS)이다. SELDI-TOF-MS를 수행하기 전에, 분리된 샘플 내의 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체는 바람직하게는 칩 또는 고체 지지체 상에서 활성화된 표면과 함께 고정된다. 상기 활성화된 표면은 바람직하게는, 예컨대, 토끼 다클론항체(polyclonal-antibodies)와 같은 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체에 대하여 고정된 항체를 포함한다. 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체가 상기 항체에 결합된 후에, 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체 수치를 측정하기 위한 강도(intensity) 신호를 전달하는, SELDI-TOF 질량 분석기에서의 비행시간형 분석이 수행된다.
더욱이, 질량 분석법은 결장직장선종 및/또는 결장직장암종의 검출에 대하여 관련성을 갖는 다른 단백질을 동시에 검출할 수 있게 한다.
본 발명의 일 구체예에서, 결장직장선종 및/또는 결장직장암종 검출의 감도 및/또는 특이성은 하나 이상의 추가적인 생체표지를 추가함으로써 증대된다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 상기 방법, 어레이, 시험 시스템 및 용도의 감도 및 특이성은 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체뿐만 아니라 알파-디펜신(alpha-defensin) 1, 2 또는 3 또는 이들의 유도체의 검출의 조합에 의해 증가된다.
본 발명에 사용된 용어 "알파-디펜신(alpha-defensin) 1, 2, 3 또는 이의 유도체"는 또한 절단된(truncated) 알파-디펜신 1, 2 또는 3, 알파-디펜신 1, 2 또는 3의 단편, 돌연변이된(mutated) 알파-디펜신 1, 2 또는 3, 또는 변형된(modified) 알파-디펜신 1, 2 또는 3을 포함한다. "알파-디펜신 1, 2 또는 3"의 변형은 효소 변형 또는 화학 변형 때문일 수 있다. 알파-디펜신 1, 2 또는 3은 각각 인간 호중성 펩티드(human neutrophil peptides)(HNP) 1, 2 및 3을 가리킨다. 상기 3 개의 펩티드는 3445±10, 3374±10 및 3489±10의 질량/전하비(mass/charge ratios)(m/z)를 갖는다.
HNP 1-3 펩티드는, 면역 체계의 기초 성분이며 넓은 범위의 병원체를 죽이거나 비활성화시키는 능력을 갖는, 펩티드의 디펜신류(defensin family) 중 일부이다. 디펜신은 선천성(innate) 및 적응성(adaptive) 면역 체계 모두를 조절하는 기능을 하는 것으로도 알려져 있다.
이전의 연구는 종양에서의 HNP 1-3 발현이 호산구(eosinophils) 및 호중성구(neutrophils)를 침범하는 종양에서 주로 비롯된다는 점을 제안한다. 그러나, 이는 암세포(예컨대, 방광암세포)에 의해서 생성될 수도 있다.
(Albrethsen J, Bogebo R, Gammeltoft S, Olsen J, Winther B, Raskov H. Upregulated expression of human neutrophil peptides 1, 2 and 3 ( HNP 1-3) in colon cancer serum and tumours : a biomarker study . BMC Cancer . 2005, 5:8.)
본 발명의 추가의 구체예에서, 결장직장선종 및/또는 결장직장암종의 검출 및/또는 상이한 종양 단계의 식별의 감도 및/또는 특이성은, 알파-디펜신 1, 2, 또는 3, 트랜스티레틴(transthyretin), p53, C3a, CEA(암배아 항원(carcinoembryonic antigen)), CA 19-9, CA 15-3, CA-125, 크라스(Kras), β-카테닌(β-Catenin), Her-2/neu, C-반응성 단백질(C-reactive protein) 혈장 및 이들의 유도체, 및 E-카드헤린(E-cadherin), MSH2, MSH3, MLH1, PMS1, PMS2, MSH6 유전자 내의 돌연변이, 및 MHL1 또는 MSH2의 초위성체 불안정성(microsatellite instability)) 및
SNP(단일 뉴클레오티드 다형성) 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 생체표지(들)와 조합된 엔도플라스민 단편의 검출에 의해 증대된다.
결장직장선종 및/또는 결장직장암종에 대한 다른 생체표지는 분자량이 4,838 ± 25 Da, 바람직하게는 4,838 ± 10 Da인 단백질 또는 펩티드를 포함할 수 있다. 바람직한 구체예에서, 엔도플라스민 단편 및 분자량이 4,838 ± 25 Da, 바람직하게는 4,838 ± 10 Da인 단백질 또는 펩티드가 결장직장선종 및/또는 결장직장암종 모두를 검출하기 위해 사용된다.
일 구체예에서, C3a 또는 유도체 및/또는 트랜스티레틴 또는 이의 유도체와 조합된 엔도플라스민의 단편 또는 이들의 유도체가 결장직장선종 및/또는 결장직장암종을 검출하기 위한 및/또는 상이한 종양 단계를 식별하기 위한 생체표지로서 사용된다.
본 발명에 사용된 용어 "트랜스티레틴 또는 이의 유도체"는 또한 절단된 트렌스티레틴, 트랜스티레틴의 분획, 돌연변이된 트랜스티레틴, 또는 변형된 트랜스티레틴을 포함한다. "트랜스티레틴"의 변형은 효소 또는 화학 변형 때문일 수 있다. 더욱이, 상기 용어 "트랜스티레틴"은 또한 트랜스티레틴의 단량체 형태 또는 다량체 형태를 지칭하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 용어 "트랜스티레틴"은 특히 일반적으로 균일 4량체(homotetrameric) 단백질 트랜스티레틴의 일부인 단량체 단백질 사슬을 포함한다.
트랜스티레틴은 또한 프레알부민(prealbumin)을 나타내기도 한다. 트랜스티레틴은 주로 간에서 합성되는, 분자량 약 54,000 Da인 4량체 단백질이다. 트랜스티레틴은 보통 각각의 분자량이 약 14,000 Da인 4개의 단백질 사슬을 포함하는 균일 4량체이다. 질량분석법을 사용하여 본 발명자들은 분자량이 특히 13,776 Da, 13,884 Da 또는 14,103 Da인 다수의 트랜스티레틴 단백질 변형을 검출했다. 본 발명자들은, 결장직장선종 및/또는 결장직장암종 발병의 경우 혈청과 같은 체액 내에서 특히 분자량이 13,776 Da 및 13,884 Da인 트랜스티레틴의 분자 변형의 수치가 감소한다는 점을 발견했다.
본 발명에 사용된 용어 "C3a 또는 이의 유도체"는 또한 절단된 C3a, C3a의 단편, 돌연변이된 C3a, 변형된 C3a 또는 전구체 C3(도 2, SEQ ID NO.5) 또는 C3의 단편을 포함한다. 일 구체예에서 상기 유도체는, 서열 SEQ-ID-NO. 6(도 3A, SEQ ID NO. 6)와 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 일치하는 단백질 서열을 갖거나 포함한다.
"C3a"의 변형은 효소 변형 또는 화학 변형 때문일 수 있다. 특히, 상기 용어 C3a 또는 이의 유도체는 특히 바람직하게는 분자량이 8,950 ± 25 Da 범위이고; 더욱 바람직하게는 8,950 ± 20 Da 범위인 절단된 C3a-단백질을 포함한다. 바람직한 구체예에서 절단된 C3a-단백질은 분자량이 8,939 Da이다. 바람직하게는, 상기 C3a-단백질에는 C-말단 아르기닌이 없고 임의적으로 분자량이 8,950 ± 20 Da 범위이다. 일 구체예에서 상기 C3a 유도체는 C3a-desArg(도 3B, SEQ ID NO. 7)이다. 일 구체예에서 상기 C3a 유도체는 비만세포-키마제(mastcell-chymase)에 의한 C3a의 분열(cleavage)에 의해 수득된다. 다른 구체예에서 상기 C3a는 C3-전환효소(C3-convertase)에 의한 C3의 분열에 의해 수득된다. 본 발명은 또한 상기 언급된 구체예들의 조합을 포함한다.
C3a는 아나필라톡신군(group of anaphylatoxins)에 속한다. C3a, C4a 및 C5a는 보체계(complement system)의 세린프로테아제(serine proteases)의 가수분해(proteolytic) 생성물이다. C3a(SEQ-ID-NO.6)는 보체활성화(complement activation) 중에 혈액 보체계의 제3성분(C3)(SEQ-ID-NO.5)으로부터 유래된다. C3a는 국소적으로 효과가 있는 호르몬이다. C3a 내 약 40%의 아미노산 잔류물이 나선 구조에 개입된다. 혈청 아나필라톡신은 다양한 세포면역반응에 개입할 뿐만 아니라, 강력한 향염증제(proinflammartory agents)이기도 하다. C3a는 혈관벽에 강한 효과를 제공하는데, 부드러운 근육의 수축 및 혈관 투과성(vascular permeability)의 향상이다. C3a 내 C-말단 아르기닌은 그의 생물학적 활성을 위해 필수적으로 중요하다. 아나필라톡신은 카르복시펩티다아제 N(아나필라톡신 비활성화제)에 의해 조절되는데, 이는 수초 내에 카르복시말단 아르기닌을 제거한다. 이 메커니즘은 원래의 아나필라톡신을 더 낮은 활성의 C3a-desArg 형태(SEQ ID NO.7)로 변환시킨다.
이는, 향상된 감도 및/또는 특이성으로 결장직장선종 및/또는 결장직장암종의 검출을 가능하게 하며/하거나 상이한 종양 상태의 식별을 가능하게 한다. 또한, 이들 방법이 결장경검사만큼 불쾌하지 않기 때문에 본 발명의 방법은 환자에게 잘 받아들여질 수 있다. 본 발명에 따르면, 예컨대 혈장 또는 혈청인 조직 표본 또는 생체액일 수 있는, 개체로부터 분리된 샘플 재료는 본 발명의 방법으로 스크린될 수 있다. 상기 샘플 재료는 예컨대 혈액 채취 또는 생검(biopsy)에 의하여 수득될 수 있다.
감도 및 특이성은 하기와 같이 정의된다:
감도는 모든 환자의 수(100%)에 대한 진양성(true positive)으로 검출된 환자의 수(%)이다. 환자는 결장직장선종 및/또는 결장직장암종에 걸린 개체일 수 있다.
특이성은 모든 건강한 개체의 수(100%)에 대한 진음성(true negative)으로 검출된 개체의 수(%)이다.
감도 및 특이성은 하기 공식에 의해 대안적으로 정의될 수 있다.
Figure 112008019580533-pct00001
TP: 진양성(True positive)(시험 양성, 진단 정확)
FP: 위양성(False positive)(시험 양성, 진단 부정확)
TN: 진음성(True negative)(시험 음성, 진단 정확)
FN: 위음성(False negative)(시험 음성, 진단 부정확)
감도는 하기 공식에 의해 계산된다:
TP/(TP + FN)
그리고 특이성은 하기 공식에 의해 계산된다:
TN/ (TN + FP)
TP, FP, TN, FN에서 선택되는 각 분석 집단의 결과는 건강한 개체, 결장직장선종 환자 및/또는 결장직장암종 환자로 이루어진 군에서 선택되는 다수의 분리된 샘플에 대하여 계산된다. TP, FP, TN, FN은 각각 진양성, 위양성, 진음성, 위음성 상태와 관련된 개체들의 수와 관계가 있다.
전체적인 감도 및/또는 특이성을 증가시키기 위하여, 본 발명의 방법은 결장직장선종 및/또는 결장직장암종의 검출을 위한 다른 진단 방법과 조합하여 수행될 수 있다. 엔도플라스민 단편의 검출은 결장직장선종을 매우 초기에 검출할 수 있게 하고 따라서 매우 초기의 생체표지로서 사용될 수 있다. 더욱이, 엔도플라스민 단편의 검출은 상이한 종양 단계의 식별을 가능하게 한다.
바람직하게는, 본 발명의 방법은 조기 검출 및/또는 모니터링 방법으로서 수행될 수 있다. 본 발명의 방법의 결과가 체액 샘플에서의 결장직장선종 및/또는 결장직장선종의 발병을 나타내야 한다면, 결장경검사와 같은 추가의 검사가 수행될 수 있다. 조직 샘플을 가지고 조직화학에 의해 얻어진 결과가 결장직장선종 및/또는 결장직장선종의 발병을 나타내는 경우, 상이한 종양 단계를 식별하기 위해서는, 임의적으로 추가의 생체표지와 조합하여 엔도플라스민 단편의 수치를 분석해야 한다.
본 발명은, 화합물이 결장직장선종 및/또는 결장직장암종의 치료에 효과적인지 측정하기 위한 방법을 추가로 제공한다. 더욱이, 본 발명은 특정 종양 단계의 치료를 위해 유용한 특정 화합물을 선택하기 위한 방법을 제공한다.
바람직하게는, 화합물이 결장직장선종 및/또는 결장직장암종의 치료에 효과적인지 측정하기 위한 방법 및/또는 특정 종양 단계의 치료를 위한 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 결장직장선종 또는 결장직장암종 환자를 화합물로 치료하는 단계,
b) 상기 환자의 샘플 재료 내의 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 수치를 측정하는 단계, 및
c) 상기 측정된 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체의 수치를 하나 이상의 참조값과 비교하는 단계.
본 출원에 사용된 용어 "환자(patient)"는 인간뿐 아니라 동물과 같이 인간이 아닌 것도 포함한다. 상기 동물은 바람직하게는, 예컨대 생쥐(mouse), 쥐(rat), 햄스터, 및 다른 동물들, 예컨대 기니피그(guinea-pig), 토끼(rabbit), 산토끼(hare), 개 및 돼지로 이루어진 군에서 선택된다.
이들 동물은, 연구 목적으로, 결장직장선종 및 결장직장암종과 같은, 일정한 질병 상태를 특정하게 유발하기 위하여 사용될 수 있다. 상기 질병 상태의 유발은, 예를 들어, 결장직장암종 또는 결장직장선종 질병 상태를 유발하는 것으로 알려진, 예컨대, 방사성 물질 또는 화학 물질로 상기 동물을 처치함으로써 달성될 수 있다. 상기 질병 상태는 바이러스 감염(viral transfection)을 사용하여 유발될 수도 있다. 하나 이상의 특정 유전자 기능(들)이 달라진, 유전자 변형 동물 또는 특정 유전자 기능이 제거된 넉아웃 생쥐(knock-out mice)와 같은 넉아웃 동물을 사용하는 것도 가능하다.
결장직장선종 및/또는 결장직장암종의 치료를 위한 화합물은 하나 이상의 화학물질, 항체(들), 단백질, 펩티드(들), 저분자량 약물(drugs) 또는 안티센스(antisense) mRNA(들)일 수 있다. 대안적으로, 하나 이상의 화합물 방사(irradiation)가 단독 또는 하나 이상의 화합물과 조합으로 사용될 수 있다.
상기 환자의 샘플 재료 내의 엔도플라스민 단편 또는 이의 유도체 수치는 상기 기술된 검출 기술에 의해 측정될 수 있다.
하기 도면 및 실시예는 단지 설명 목적으로 제공된다. 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것으로 해석되어서는 안된다.
도 1은, 도 1A에서 엔도플라스민의 단백질 서열(SEQ-ID NO.1)을 보여주고, 도 1B에서 N-말단 엔도플라스민 단편의 각 부분인 세 개의 펩티드 서열(SEQ ID NO. 2, 3 및 4)을 보여준다.
도 2는 C3 단백질 서열(SEQ ID NO. 5)을 보여준다.
도 3은, 도 3A에서 3Ca 단백질 서열(SEQ ID NO. 6)을 보여주고, 도 3B에서 C3a-desArg 단백질 서열(SEQ ID NO. 7)을 보여준다.
도 4는 약 80 kDa 및 약 14 kDa 단편을 생성하기 위한, 칼페인(calpain)에 의한 엔도플라스민의 추정 분할 위치를 보여준다.
도 5는 보통의 결장, 선종 조직 및 종양 조직으로부터의 용해물(lysates)의 SELDI-TOF-MS 단백질 프로파일을 보여준다. p10.3(엔도플라스민의 N-말단 부분, 10,300 Da)의 강도는 건강한 환자로부터 선종 환자, 암 환자까지 조직 내에서 현저 하게 증가한다.
도 6은 SELDI-TOF-MS에 의한 엔도플라스민 단편 p10.3의 분석을 보여준다. 결장암으로부터의 30개 샘플 및 선종 조직으로부터의 29개 샘플뿐 아니라 상응하는 정상의 건강한 결장 조직을 분석했다. 엔도플라스민 단편 p10.3의 평균 농도는, 건강한 집단(N)에 비하여 선종 집단(A) 및/또는 암 집단(T)에서 현저하게 높다.
도 7은 SELDI TOF MS에 의한, 다른 암 타입에서의 p10.3의 검출을 보여준다. p10.3의 발현 수치는 다른 결장암종 단계에 비해 위암, 식도암, 폐암, 전립선암 및 유방암의 분석된 샘플에서 현저하게 낮았다. 용해물은 SAX Protein Chip®Array에서 분석되었다. 정상 조직과 종양 조직 사이의 p10.3의 발현 수치 차이는 통계학적으로 현저했다. N = 정상 조직(normal tissue), T = 암 조직(cancer tissue).
도 8은 정상 결장, 선종 조직 및 암 조직으로부터의 잔류물의 SELDI-TOF-MS 단백질 프로파일을 보여준다. p3489(알파-디펜신류의 구성원, p3.4)의 최고 강도는 결장직장선종 환자로부터 암 환자까지의 조직에서 현저하게 증가한다. N = 정상 조직, A = 선종 조직, T = 암 조직.
도 9는 정상 결장, 선종 조직 및 암 조직으로부터의 잔류물의 SELDI TOF MS 단백질 프로파일을 보여준다. p4838(p4.8)의 최고 강도는 건강한 대조군 및 결장직장암 조직에 비하여 결장직장선종 환자의 조직에서 현저하게 높다. N = 정상 조직, A = 선종 조직, T = 암 조직.
도 10은, 두 표지(p10.3과 p4.8 또는 p10.3과 p3.4)의 조합이 이질적인 환자 집단(heterogenous patient population)에서 선종 조직 및 암 조직에 대하여 감도 및 특이성을 모두 향상시켰다는 점을 보여준다. A) 검출이 p10.3과 p4.8의 조합에 기초한 경우, 암 조직에 대한 90%의 감도(선종에 대해서는 79%) 및 90%의 특이성이 달성되었다. B) p10.3 및 알파 디펜신류 구성원 p3.4의 조합을 사용하면, 90%의 특이성으로, 일치하는 수(according numbers)는 암 샘플에 대하여 70%(선종에 대해서는 82%)였다. N = 정상 결장 점막, T = 암 조직, A = 선종 조직. 문자 앞의 숫자는 분리된 개체들의 수를 나타낸다. 다른 숫자들은 컷오프(Cut-off) 값을 가리킨다.
다른 언급이 없으면, 모든 방법은 분석 시스템 제조사의 프로토콜에 따라 수행된 것이다.
실시예 1:
샘플 준비( Sample Preparation )
조직 샘플 선종 및 결장직장암 환자(TNM stage III)로부터의 종양 조직뿐 아니라 각각의 환자로부터의 대응되는 정상 결장 조직을 분석했다. 환자들: 윤리적 지침 및 환자 비밀을 엄격하게 보장하였으며 모든 환자들은 이 연구에 참여한다는 서면 동의를 제공했다. 모든 환자들은 수술 시간에 약물치료 및 금식시간과 같은 비교 가능한 수술전(preoperative) 준비를 했다.
조직 추출물 제조 조직병리학 및 종양/기질(stroma) 양의 제어를 위하여 신선한 냉동 종양 조직 및 정상 조직으로부터의 냉동절편(Cryostat sections)(5μm)을 헤마톡실린/에로신(hematoxilin/eosin)으로 염색했다. 50%가 넘는 종양 내용물(tumor content) 또는 선종 내용물이 있는 조직 블록뿐 아니라 정상 조직도 절편(8×20μm)으로 절단되었고 곧바로 500 μl 둘베코스(Dulbeccos) 인산염으로 완충된 염수(saline) 완충액(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 6.5 mM Na2HPO4·12H2O, 1.5 mM KH2PO4, pH 7.4)으로 옮겼다. 상기 절편을 10분간 4℃에서 13,200 rpm으로 원심분리했다. 펠릿을 150 μl 용해완충액(lysis buffer)(2OmM Tris, 5OmM NaCl, 0.5% Tween pH 7.2, 0.1% complete®(Roche, Mannheim, Germany))으로 10분간 얼음에서 추출했다. 강한 소용돌이(vortexing) 후에 상기 용해물을 10분간 13,200 rpm으로 원심분리했다. 상청액의 단백질 농도를 BCA 분석기(BCA Assay, Pierce, Rockford, IL, USA)로 측정하고 용해완충액을 사용하여 각각의 샘플을 5μg/50μl 농도로 맞추었다.
실시예 2
Ciphergen ProteinChip® 분석기 준비. 단백질 용해물을 강력한 음이온 교환 분석기(strong anionic exchanger array)(SAX; Ciphergen Biosystems, Femont, CA, USA)로 분석했다. SAX 단백질 분석기(strong anionic exchanger)는 바이오프로세서(bioprocessor)(Ciphergen Biosystems, Inc)에서 작동되었다. 칩을 결합 완충액(0.1 M Tris/HCl, pH 7.5)으로 2×5 분 동안 평형화하고 이어서 각각의 지점에서 50μl의 단백질 용해물과 함께 배양했다. 45분 후에 미결합 재료를 제거하고 상기 칩을 완충액으로 3회 및 물로 2회 세척했다. 건조 후에, 2 적용(2 applications)의 시나핀산(sinapinic acid)(1.0 μl)을 가하고 상기 칩을 Ciphergen Protein ChipReader(model PBSII)로 분석했다. 데이터 변동을 최소화하기 위해, 상기 칩에 임의로 분포된 모든 환자군으로부터의 샘플을 사용하여 2일 내에 측정을 실행했다. 정규화(normalization)를 위한 표준 대조군으로서, 암 환자로부터의 하나의 조직 추출물을 모든 측정에 대하여 병렬적으로 사용했다.
SELDI - TOF - MS 분석. 레이저 강도 180에서 평균 195 레이저 발사를 사용하여 단백질의 질량 스펙트럼을 생성했다. 검출기는 감도 6에서 동작시켰다. 데이터 획득을 위해, 검출 사이즈 범위는 2,000과 40,000 Da 사이였다. 레이저는 10,000 Da에 초점을 맞추었다. ProteinChip Data Analysis Program(version 3.1 , Ciphergen Biosystems) 및 Biomarker Wizard Program(version 3.1 , Ciphergen Biosystems)을 사용하여 데이터를 분석했다. 피크 강도는 총 이온 흐름(current)에 대하여 정규화되었다.
실시예 3
데이터의 통계적 측정
3개 환자 집단에 대하여, 의사결정트리 분석을 기초로 한 C&RT(CART) 알고리즘을 사용하여 컷오프값을 계산했다(Breiman, L., Friedman, J. H., Olshen, R. A., & Stone, C. J. (1984), Classification and regression trees. Monterey, CA: Wadsworth & Brooks/Cole Advanced Books & Software). 상기 컷오프값은 서로 다른 분석 집단 사이에서 한계값을 선정 및 특정하기 위하여 계산되었다. STATSOFT INC 사의 STATISTICA Software Vs 7.1를 사용하여 측정을 수행했고, Data-Miner Modul subprogram Standard Classification Trees(CAndRT)(StatSoft, Inc. (2005). STATISTICA(데이터 분석 소프트웨어 시스템), 버전 7.1. www.statsoft.com.)를 사용하여 의사결정트리 분석을 수행했다.
평균값 및 표준편차를 기초로 통계적 데이터를 측정했다. 또한, 도 6, 8 및 9는 평균 ± 0.95의 신뢰구간을 보여주는데, 이는 이 구간 내에서 95%의 확률로 관찰 환자 집단의 실제 평균값을 발견한다는 것을 나타낸다. 상기 통계적 측정은 T-테스트에 의해 수행되었다(표 1). 상기 테스트는 p-수치 < 0.05로 유의한 것으로 검토되었다. 박스 플롯의 위스커는 표준편차를 나타낸다.
실시예 4
실시예 1 및 2에 따라서, 한명의 선종 환자 및 한명의 결장직장암 환자로부터의 종양 조직(TNM 단계 II)의 단백질 샘플 및 정상 결장 조직의 단백질 샘플을 준비하고 분석했다. 도 5는 정상 결장, 선종 조직 및 종양 조직으로부터의 용해물의 SELDI-TOF 단백질 프로파일을 보여준다. p10.3의 강도는 건강한 환자로부터 암 환자까지의 조직 내에서 현저하게 증가한다.
도 6은 정상 조직, 선종 조직 및 결장암 조직에서의 p10.3(엔도플라스민 단편)의 평균 강도를 보여준다. 30개의 결장암 조직 샘플 및 29개의 선종 조직 샘플뿐 아니라 상응하는 정상 결장 조직을 실시예 1 내지 3에 따라 분석했다. 정상 조직 및 결장 종양 조직 내에서뿐 아니라 정상 조직 및 선종 조직 내에서의 p10.3의 평균 강도 차이가 통계적으로 유의했다. 종양 샘플의 식별에 대하여 특이성 97% 및 감도 93%가 달성됐다. 선종 샘플에 대한 특이성은 90%였고 동시에 감도는 86%였다.
도 8은 동일한 환자 집단에서 확인된 알파-디펜신규 구성원(피크 3,489) 중 하나의 평균 강도를 보여준다. 선종 및 결장암 집단 내의 평균 강도는 정상 결장 조직 수치에 비해 현저하게 높아졌다. 감도 52% 및 특이성 90%로 선종 샘플의 식별을 달성했다. 종양 샘플의 식별에 대한 각각의 값은 90% 및 89.6%였다.
도 9는 선종 집단 샘플에서 피크 4838의 특정하게 높아진 수치를 보여준다. 상기 선종 샘플은 종양 환자 샘플 및 정상 환자 샘플로부터 감도 76% 및 특이성 100%로 식별될 수 있었다.
표 1은 환자 집단에서 피크 10,324, 4,838에 대하여 추적된 피크 강도 및 디펜신류 구성원 피크 3,375, 3,445 및 3,489를 요약한 것이다.
[표 1]
Figure 112008019580533-pct00002
실시예 5
다른 조직에서의 p10.3의 발현
p10.3이 결장-특이적 생체표지(colon-specific biomarker)임을 확인하기 위하여, 다른 종양 조직 즉 유방, 위, 식도, 폐 및 전립선에 대하여 실시예 1 및 2에 따라 질량 분석법에 의하여 세포 추출물을 준비하고 분석했다. 도 7 및 표 2에 보이는 바와 같이 p10.3의 최고 강도는 결장직장암종에서 발견될 수 있다. (제I기 및 제III기). 그러나, 엔도플라스민 단편은 식도암, 폐암 및 전립선암 및 정상 조직에서 낮은 수치로 발현되었다.
[표 2]
Figure 112008019580533-pct00003
엔도플라스민 단편, 특히 겉보기 분자량(apparent molecular weight)이 10,300 Da(p10.3)인 단백질 단편이 결장암에 대하여 고특이성라는 점을 도 7에서 볼 수 있다. 유방, 폐, 위, 식도 또는 전립선의 종양과 반대로, 건강한 환자와 질병에 걸린 환자 사이에 p10.3 수치에서 현저한 차이가 있다. 더욱이, p10.3 수치는 암 단계(제I기 대 제III기)에 따라 증가한다.
실시예 6
제2 표지, 분자량이 4,838 Da(p4.8) 또는 분자량이 3,489(Da p3.4) 중 하나 인 단백질이, 엔도플라스민 단편 피크와 조합으로 사용되었다는 점을 제외하고는 실시예 1 내지 3에 기술된 바와 같이, 30개의 결장암 조직 샘플 및 29개의 선종 조직 샘플뿐 아니라 상응하는 정상 결장 조직도 분리되고 분석되었다. 제2 표지 단백질, 예컨대 4,838 Da(p4.8) 또는 3,489 Da(p3.4)와 조합하여, 선종 조직 및/또는 암 조직으로부터의 정상 조직의 동시 분리를 달성했다. 제1 표지로서 p10.3을 및 제2 표지로서 p4.8을 사용하여 19개의 정상 조직 샘플에서 26개(특이성 90%), 29개의 선종 샘플로부터 23개(특이성 79%) 및 30개의 암 샘플에서 27개(특이성 90%)를 정확하게 분리했다(도 10A). 피크 3489와의 조합은 선종 샘플에 대하여 특이성 90% 및 감도 82%, 그리고 종양 샘플에 대하여 감도 70%를 달성했다(도 10B).
결과
도 6에 나타난 바와 같이 엔도플라스민 단편의 양은 세 집단(N=정상 A=선종 T=암) 사이에 현저하게 다르다. 엔도플라스민 단편 수치는 건강한 개체로부터 결장직장 선종 환자, 결장직장암종 환자까지에 걸쳐서 증가한다.
이들 데이터는, 분자량이 4,838 Da(p4.8) 또는 3,489 Da(p3.4)인 단백질과 같은 다른 생체표지와 임의적으로 조합된, 엔도플라스민 단편이 결장직장선종 및/또는 결장직장암종의 검출에 대한 뛰어난 생체표지(들)라는 점을 보여준다.
이미 알려진 생체표지 CEA 및 CA 19-9와 대조적으로 건강한 개체 및 선종 환 자 사이를 식별하는 것이 가능하다. 더욱이, 선종 환자 및 결장직장암종 환자를 식별하는 것도 가능하다. 엔도플라스민 단편 시험의 감도과 특이성은 높고 선종의 조기 특정 검출 및 상이한 종양 단계 사이의 식별도 가능하게 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Indivumed GmbH <120> USE OF AN ENDOPLASMINFRAGMENT AND DERIVATIVES THEREOF AS A BIOMARKER FOR COLORECTAL ADENOMA AND/OR CARCINOMA; METHOD FOR DETECTION AND TEST SYSTEM <130> 47399WO <140> PCT/EP 2005/009005 <141> 2005-08-19 <160> 7 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 803 <212> PRT <213> human <400> 1 Met Arg Ala Leu Trp Val Leu Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Thr Phe 1 5 10 15 Gly Ser Val Arg Ala Asp Asp Glu Val Asp Val Asp Gly Thr Val Glu 20 25 30 Glu Asp Leu Gly Lys Ser Arg Glu Gly Ser Arg Thr Asp Asp Glu Val 35 40 45 Val Gln Arg Glu Glu Glu Ala Ile Gln Leu Asp Gly Leu Asn Ala Ser 50 55 60 Gln Ile Arg Glu Leu Arg Glu Lys Ser Glu Lys Phe Ala Phe Gln Ala 65 70 75 80 Glu Val Asn Arg Met Met Lys Leu Ile Ile Asn Ser Leu Tyr Lys Asn 85 90 95 Lys Glu Ile Phe Leu Arg Glu Leu Ile Ser Asn Ala Ser Asp Ala Leu 100 105 110 Asp Lys Ile Arg Leu Ile Ser Leu Thr Asp Glu Asn Ala Leu Ser Gly 115 120 125 Asn Glu Glu Leu Thr Val Lys Ile Lys Cys Asp Lys Glu Lys Asn Leu 130 135 140 Leu His Val Thr Asp Thr Gly Val Gly Met Thr Arg Glu Glu Leu Val 145 150 155 160 Lys Asn Leu Gly Thr Ile Ala Lys Ser Gly Thr Ser Glu Phe Leu Asn 165 170 175 Lys Met Thr Glu Ala Gln Glu Asp Gly Gln Ser Thr Ser Glu Leu Ile 180 185 190 Gly Gln Phe Gly Val Gly Phe Tyr Ser Ala Phe Leu Val Ala Asp Lys 195 200 205 Val Ile Val Thr Ser Lys His Asn Asn Asp Thr Gln His Ile Trp Glu 210 215 220 Ser Asp Ser Asn Glu Phe Ser Val Ile Ala Asp Pro Arg Gly Asn Thr 225 230 235 240 Leu Gly Arg Gly Thr Thr Ile Thr Leu Val Leu Lys Glu Glu Ala Ser 245 250 255 Asp Tyr Leu Glu Leu Asp Thr Ile Lys Asn Leu Val Lys Lys Tyr Ser 260 265 270 Gln Phe Ile Asn Phe Pro Ile Tyr Val Trp Ser Ser Lys Thr Glu Thr 275 280 285 Val Glu Glu Pro Met Glu Glu Glu Glu Ala Ala Lys Glu Glu Lys Glu 290 295 300 Glu Ser Asp Asp Glu Ala Ala Val Glu Glu Glu Glu Glu Glu Lys Lys 305 310 315 320 Pro Lys Thr Lys Lys Val Glu Lys Thr Val Trp Asp Trp Glu Leu Met 325 330 335 Asn Asp Ile Lys Pro Ile Trp Gln Arg Pro Ser Lys Glu Val Glu Glu 340 345 350 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Lys Gly Tyr Glu Val Ile Tyr Leu Thr Glu Pro Val Asp Glu Tyr Cys 565 570 575 Ile Gln Ala Leu Pro Glu Phe Asp Gly Lys Arg Phe Gln Asn Val Ala 580 585 590 Lys Glu Gly Val Lys Phe Asp Glu Ser Glu Lys Thr Lys Glu Ser Arg 595 600 605 Glu Ala Val Glu Lys Glu Phe Glu Pro Leu Leu Asn Trp Met Lys Asp 610 615 620 Lys Ala Leu Lys Asp Lys Ile Glu Lys Ala Val Val Ser Gln Arg Leu 625 630 635 640 Thr Glu Ser Pro Cys Ala Leu Val Ala Ser Gln Tyr Gly Trp Ser Gly 645 650 655 Asn Met Glu Arg Ile Met Lys Ala Gln Ala Tyr Gln Thr Gly Lys Asp 660 665 670 Ile Ser Thr Asn Tyr Tyr Ala Ser Gln Lys Lys Thr Phe Glu Ile Asn 675 680 685 Pro Arg His Pro Leu Ile Arg Asp Met Leu Arg Arg Ile Lys Glu Asp 690 695 700 Glu Asp Asp Lys Thr Val Leu Asp Leu Ala Val Val Leu Phe Glu Thr 705 710 715 720 Ala Thr Leu Arg Ser Gly Tyr Leu Leu Pro Asp Thr Lys Ala Tyr Gly 725 730 735 Asp Arg Ile Glu Arg Met Leu Arg Leu Ser Leu Asn Ile Asp Pro Asp 740 745 750 Ala Lys Val Glu Glu Glu Pro Glu Glu Glu Pro Glu Glu Thr Ala Glu 755 760 765 Asp Thr Thr Glu Asp Thr Glu Gln Asp Glu Asp Glu Glu Met Asp Val 770 775 780 Gly Thr Asp Glu Glu Glu Glu Thr Ala Lys Glu Ser Thr Ala Glu Lys 785 790 795 800 Asp Glu Leu <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> human <400> 2 Glu Glu Glu Ala Ile Gln Leu Asp Gly Leu Asn Ala Ser Gln Ile Arg 1 5 10 15 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> human <400> 3 Phe Ala Phe Gln Ala Glu Val Asn Arg 1 5 <210> 4 <211> 33 <212> PRT <213> human <400> 4 Glu Glu Glu Ala Ile Gln Leu Asp Gly Leu Asn Ala Ser Gln Ile Arg 1 5 10 15 Glu Leu Arg Glu Lys Ser Glu Lys Phe Ala Phe Gln Ala Glu Val Asn 20 25 30 Arg <210> 5 <211> 1641 <212> PRT <213> human <400> 5 Ser Pro Met Tyr Ser Ile Ile Thr Pro Asn Ile Leu Arg Leu Glu Ser 1 5 10 15 Glu Glu Thr Met Val Leu Glu Ala His Asp Ala Gln Gly Asp Val Pro 20 25 30 Val Thr Val Thr Val His Asp Phe Pro Gly Lys Lys Leu Val Leu Ser 35 40 45 Ser Glu Lys Thr Val Leu Thr Pro Ala Thr Asn His Met Gly Asn Val 50 55 60 Thr Phe Thr Ile Pro Ala Asn Arg Glu Phe Lys Ser Glu Lys Gly Arg 65 70 75 80 Asn Lys Phe Val Thr Val Gln Ala Thr Phe Gly Thr Gln Val Val Glu 85 90 95 Lys Val Val Leu Val Ser Leu Gln Ser Gly Tyr Leu Phe Ile Gln Thr 100 105 110 Asp Lys Thr Ile Tyr Thr Pro Gly Ser Thr Val Leu Tyr Arg Ile Phe 115 120 125 Thr Val Asn His Lys Leu Leu Pro Val Gly Arg Thr Val Met Val Asn 130 135 140 Ile Glu Asn Pro Glu Gly Ile Pro Val Lys Gln Asp Ser Leu Ser Ser 145 150 155 160 Gln Asn Gln Leu Gly Val Leu Pro Leu Ser Trp Asp Ile Pro Glu Leu 165 170 175 Val Asn Met Gly Gln Trp Lys Ile Arg Ala Tyr Tyr Glu Asn Ser Pro 180 185 190 Gln Gln Val Phe Ser Thr Glu Phe Glu Val Lys Glu Tyr Val Leu Pro 195 200 205 Ser Phe Glu Val Ile Val Glu Pro Thr Glu Lys Phe Tyr Tyr Ile Tyr 210 215 220 Asn Glu Lys Gly Leu Glu Val Thr Ile Thr Ala Arg Phe Leu Tyr Gly 225 230 235 240 Lys Lys Val Glu Gly Thr Ala Phe Val Ile Phe Gly Ile Gln Asp Gly 245 250 255 Glu Gln Arg Ile Ser Leu Pro Glu Ser Leu Lys Arg Ile Pro Ile Glu 260 265 270 Asp Gly Ser Gly Glu Val Val Leu Ser Arg Lys Val Leu Leu Asp Gly 275 280 285 Val Gln Asn Leu Arg Ala Glu Asp Leu Val Gly Lys Ser Leu Tyr Val 290 295 300 Ser Ala Thr Val Ile Leu His Ser Gly Ser Asp Met Val Gln Ala Glu 305 310 315 320 Arg Ser Gly Ile Pro Ile Val Thr Ser Pro Tyr Gln Ile His Phe Thr 325 330 335 Lys Thr Pro Lys Tyr Phe Lys Pro Gly Met Pro Phe Asp Leu Met Val 340 345 350 Phe Val Thr Asn Pro Asp Gly Ser Pro Ala Tyr Arg Val Pro Val Ala 355 360 365 Val Gln Gly Glu Asp Thr Val Gln Ser Leu Thr Gln Gly Asp Gly Val 370 375 380 Ala Lys Leu Ser Ile Asn Thr His Pro Ser Gln Lys Pro Leu Ser Ile 385 390 395 400 Thr Val Arg Thr Lys Lys Gln Glu Leu Ser Glu Ala Glu Gln Ala Thr 405 410 415 Arg Thr Met Gln Ala Leu Pro Tyr Ser Thr Val Gly Asn Ser Asn Asn 420 425 430 Tyr Leu His Leu Ser Val Leu Arg Thr Glu Leu Arg Pro Gly Glu Thr 435 440 445 Leu Asn Val Asn Phe Leu Leu Arg Met Asp Arg Ala His Glu Ala Lys 450 455 460 Ile Arg Tyr Tyr Thr Tyr Leu Ile Met Asn Lys Gly Arg Leu Leu Lys 465 470 475 480 Ala Gly Arg Gln Val Arg Glu Pro Gly Gln Asp Leu Val Val Leu Pro 485 490 495 Leu Ser Ile Thr Thr Asp Phe Ile Pro Ser Phe Arg Leu Val Ala Tyr 500 505 510 Tyr Thr Leu Ile Gly Ala Ser Gly Gln Arg Glu Val Val Ala Asp Ser 515 520 525 Val Trp Val Asp Val Lys Asp Ser Cys Val Gly Ser Leu Val Val Lys 530 535 540 Ser Gly Gln Ser Glu Asp Arg Gln Pro Val Pro Gly Gln Gln Met Thr 545 550 555 560 Leu Lys Ile Glu Gly Asp His Gly Ala Arg Val Val Leu Val Ala Val 565 570 575 Asp Lys Gly Val Phe Val Leu Asn Lys Lys Asn Lys Leu Thr Gln Ser 580 585 590 Lys Ile Trp Asp Val Val Glu Lys Ala Asp Ile Gly Cys Thr Pro Gly 595 600 605 Ser Gly Lys Asp Tyr Ala Gly Val Phe Ser Asp Ala Gly Leu Thr Phe 610 615 620 Thr Ser Ser Ser Gly Gln Gln Thr Ala Gln Arg Ala Glu Leu Gln Cys 625 630 635 640 Pro Gln Pro Ala Ala Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Leu Thr Glu Lys 645 650 655 Arg Met Asp Lys Val Gly Lys Tyr Pro Lys Glu Leu Arg Lys Cys Cys 660 665 670 Glu Asp Gly Met Arg Glu Asn Pro Met Arg Phe Ser Cys Gln Arg Arg 675 680 685 Thr Arg Phe Ile Ser Leu Gly Glu Ala Cys Lys Lys Val Phe Leu Asp 690 695 700 Cys Cys Asn Tyr Ile Thr Glu Leu Arg Arg Gln His Ala Arg Ala Ser 705 710 715 720 His Leu Gly Leu Ala Arg Ser Asn Leu Asp Glu Asp Ile Ile Ala Glu 725 730 735 Glu Asn Ile Val Ser Arg Ser Glu Phe Pro Glu Ser Trp Leu Trp Asn 740 745 750 Val Glu Asp Leu Lys Glu Pro Pro Lys Asn Gly Ile Ser Thr Lys Leu 755 760 765 Met Asn Ile Phe Leu Lys Asp Ser Ile Thr Thr Trp Glu Ile Leu Ala 770 775 780 Val Ser Met Ser Asp Lys Lys Gly Ile Cys Val Ala Asp Pro Phe Glu 785 790 795 800 Val Thr Val Met Gln Asp Phe Phe Ile Asp Leu Arg Leu Pro Tyr Ser 805 810 815 Val Val Arg Asn Glu Gln Val Glu Ile Arg Ala Val Leu Tyr Asn Tyr 820 825 830 Arg Gln Asn Gln Glu Leu Lys Val Arg Val Glu Leu Leu His Asn Pro 835 840 845 Ala Phe Cys Ser Leu Ala Thr Thr Lys Arg Arg His Gln Gln Thr Val 850 855 860 Thr Ile Pro Pro Lys Ser Ser Leu Ser Val Pro Tyr Val Ile Val Pro 865 870 875 880 Leu Lys Thr Gly Leu Gln Glu Val Glu Val Lys Ala Ala Val Tyr His 885 890 895 His Phe Ile Ser Asp Gly Val Arg Lys Ser Leu Lys Val Val Pro Glu 900 905 910 Gly Ile Arg Met Asn Lys Thr Val Ala Val Arg Thr Leu Asp Pro Glu 915 920 925 Arg Leu Gly Arg Glu Gly Val Gln Lys Glu Asp Ile Pro Pro Ala Asp 930 935 940 Leu Ser Asp Gln Val Pro Asp Thr Glu Ser Glu Thr Arg Ile Leu Leu 945 950 955 960 Gln Gly Thr Pro Val Ala Gln Met Thr Glu Asp Ala Val Asp Ala Glu 965 970 975 Arg Leu Lys His Leu Ile Val Thr Pro Ser Gly Cys Gly Glu Gln Asn 980 985 990 Met Ile Gly Met Thr Pro Thr Val Ile Ala Val His Tyr Leu Asp Glu 995 1000 1005 Thr Glu Gln Trp Glu Lys Phe Gly Leu Glu Lys Arg Gln Gly Ala 1010 1015 1020 Leu Glu Leu Ile Lys Lys Gly Tyr Thr Gln Gln Leu Ala Phe Arg 1025 1030 1035 Gln Pro Ser Ser Ala Phe Ala Ala Phe Val Lys Arg Ala Pro Ser 1040 1045 1050 Thr Trp Leu Thr Ala Tyr Val Val Lys Val Phe Ser Leu Ala Val 1055 1060 1065 Asn Leu Ile Ala Ile Asp Ser Gln Val Leu Cys Gly Ala Val Lys 1070 1075 1080 Trp Leu Ile Leu Glu Lys Gln Lys Pro Asp Gly Val Phe Gln Glu 1085 1090 1095 Asp Ala Pro Val Ile His Gln Glu Met Ile Gly Gly Leu Arg Asn 1100 1105 1110 Asn Asn Glu Lys Asp Met Ala Leu Thr Ala Phe Val Leu Ile Ser 1115 1120 1125 Leu Gln Glu Ala Lys Asp Ile Cys Glu Glu Gln Val Asn Ser Leu 1130 1135 1140 Pro Gly Ser Ile Thr Lys Ala Gly Asp Phe Leu Glu Ala Asn Tyr 1145 1150 1155 Met Asn Leu Gln Arg Ser Tyr Thr Val Ala Ile Ala Gly Tyr Ala 1160 1165 1170 Leu Ala Gln Met Gly Arg Leu Lys Gly Pro Leu Leu Asn Lys Phe 1175 1180 1185 Leu Thr Thr Ala Lys Asp Lys Asn Arg Trp Glu Asp Pro Gly Lys 1190 1195 1200 Gln Leu Tyr Asn Val Glu Ala Thr Ser Tyr Ala Leu Leu Ala Leu 1205 1210 1215 Leu Gln Leu Lys Asp Phe Asp Phe Val Pro Pro Val Val Arg Trp 1220 1225 1230 Leu Asn Glu Gln Arg Tyr Tyr Gly Gly Gly Tyr Gly Ser Thr Gln 1235 1240 1245 Ala Thr Phe Met Val Phe Gln Ala Leu Ala Gln Tyr Gln Lys Asp 1250 1255 1260 Ala Pro Asp His Gln Glu Leu Asn Leu Asp Val Ser Leu Gln Leu 1265 1270 1275 Pro Ser Arg Ser Ser Lys Ile Thr His Arg Ile His Trp Glu Ser 1280 1285 1290 Ala Ser Leu Leu Arg Ser Glu Glu Thr Lys Glu Asn Glu Gly Phe 1295 1300 1305 Thr Val Thr Ala Glu Gly Lys Gly Gln Gly Thr Leu Ser Val Val 1310 1315 1320 Thr Met Tyr His Ala Lys Ala Lys Asp Gln Leu Thr Cys Asn Lys 1325 1330 1335 Phe Asp Leu Lys Val Thr Ile Lys Pro Ala Pro Glu Thr Glu Lys 1340 1345 1350 Arg Pro Gln Asp Ala Lys Asn Thr Met Ile Leu Glu Ile Cys Thr 1355 1360 1365 Arg Tyr Arg Gly Asp Gln Asp Ala Thr Met Ser Ile Leu Asp Ile 1370 1375 1380 Ser Met Met Thr Gly Phe Ala Pro Asp Thr Asp Asp Leu Lys Gln 1385 1390 1395 Leu Ala Asn Gly Val Asp Arg Tyr Ile Ser Lys Tyr Glu Leu Asp 1400 1405 1410 Lys Ala Phe Ser Asp Arg Asn Thr Leu Ile Ile Tyr Leu Asp Lys 1415 1420 1425 Val Ser His Ser Glu Asp Asp Cys Leu Ala Phe Lys Val His Gln 1430 1435 1440 Tyr Phe Asn Val Glu Leu Ile Gln Pro Gly Ala Val Lys Val Tyr 1445 1450 1455 Ala Tyr Tyr Asn Leu Glu Glu Ser Cys Thr Arg Phe Tyr His Pro 1460 1465 1470 Glu Lys Glu Asp Gly Lys Leu Asn Lys Leu Cys Arg Asp Glu Leu 1475 1480 1485 Cys Arg Cys Ala Glu Glu Asn Cys Phe Ile Gln Lys Ser Asp Asp 1490 1495 1500 Lys Val Thr Leu Glu Glu Arg Leu Asp Lys Ala Cys Glu Pro Gly 1505 1510 1515 Val Asp Tyr Val Tyr Lys Thr Arg Leu Val Lys Val Gln Leu Ser 1520 1525 1530 Asn Asp Phe Asp Glu Tyr Ile Met Ala Ile Glu Gln Thr Ile Lys 1535 1540 1545 Ser Gly Ser Asp Glu Val Gln Val Gly Gln Gln Arg Thr Phe Ile 1550 1555 1560 Ser Pro Ile Lys Cys Arg Glu Ala Leu Lys Leu Glu Glu Lys Lys 1565 1570 1575 His Tyr Leu Met Trp Gly Leu Ser Ser Asp Phe Trp Gly Glu Lys 1580 1585 1590 Pro Asn Leu Ser Tyr Ile Ile Gly Lys Asp Thr Trp Val Glu His 1595 1600 1605 Trp Pro Glu Glu Asp Glu Cys Gln Asp Glu Glu Asn Gln Lys Gln 1610 1615 1620 Cys Gln Asp Leu Gly Ala Phe Thr Glu Ser Met Val Val Phe Gly 1625 1630 1635 Cys Pro Asn 1640 <210> 6 <211> 77 <212> PRT <213> human <400> 6 Ser Val Gln Leu Thr Glu Lys Arg Met Asp Lys Val Gly Lys Tyr Pro 1 5 10 15 Lys Glu Leu Arg Lys Cys Cys Glu Asp Gly Met Arg Glu Asn Pro Met 20 25 30 Arg Phe Ser Cys Gln Arg Arg Thr Arg Phe Ile Ser Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Cys Lys Lys Val Phe Leu Asp Cys Cys Asn Tyr Ile Thr Glu Leu Arg 50 55 60 Arg Gln His Ala Arg Ala Ser His Leu Gly Leu Ala Arg 65 70 75 <210> 7 <211> 76 <212> PRT <213> human <400> 7 Ser Val Gln Leu Thr Glu Lys Arg Met Asp Lys Val Gly Lys Tyr Pro 1 5 10 15 Lys Glu Leu Arg Lys Cys Cys Glu Asp Gly Met Arg Glu Asn Pro Met 20 25 30 Arg Phe Ser Cys Gln Arg Arg Thr Arg Phe Ile Ser Leu Gly Glu Ala 35 40 45 Cys Lys Lys Val Phe Leu Asp Cys Cys Asn Tyr Ile Thr Glu Leu Arg 50 55 60 Arg Gln His Ala Arg Ala Ser His Leu Gly Leu Ala 65 70 75

Claims (28)

  1. a) 개체(individual)로부터 분리된 샘플 재료를 준비하는 단계,
    b) 상기 분리된 샘플 재료 내의 엔도플라스민(endoplasmin) 단편의 발현 수치를 측정하는 단계,
    c) 상기 측정된 엔도플라스민 단편의 발현 수치를 하나 이상의 참조값과 비교하는 단계
    를 포함하고,
    상기 엔도플라스민 단편은 펩티드 서열 SEQ ID-No. 2, SEQ ID-No. 3 또는 SEQ ID-No. 4 중 하나 이상을 포함하고,
    상기 참조값은 건강한 개체들 또는 직장결장선종(colorectal adenoma) 또는 결장직장암종(colorectal carcinoma)에 걸린 개체들의 다수의 분리된 샘플에서 측정된 엔도플라스민 단편의 평균 발현 수치인,
    결장직장선종 또는 결장직장암종 또는 둘 다의 검출 방법으로서, 상기 엔도플라스민 단편의 분자량은 10 내지 14 kDa인 것인, 검출 방법.
  2. a) 개체로부터 분리된 샘플 재료를 준비하는 단계,
    b) 상기 분리된 샘플 재료 내의 엔도플라스민 단편의 발현 수치를 측정하는 단계,
    c) 상기 측정된 엔도플라스민 단편의 발현 수치를 하나 이상의 참조값과 비교하는 단계
    를 포함하고,
    상기 엔도플라스민 단편은 펩티드 서열 SEQ ID-No. 2, SEQ ID-No. 3 또는 SEQ ID-No. 4 중 하나 이상을 포함하고,
    상기 참조값은 건강한 개체들 또는 직장결장선종(colorectal adenoma) 또는 결장직장암종(colorectal carcinoma)에 걸린 개체들의 다수의 분리된 샘플에서 측정된 엔도플라스민 단편의 평균 발현 수치인,
    결장직장선종과 결장직장암종 사이의 식별 방법으로서, 상기 엔도플라스민 단편의 분자량은 10 내지 14 kDa인 것인, 식별 방법.
  3. a) 개체로부터 분리된 샘플 재료를 준비하는 단계,
    b) 상기 분리된 샘플 재료 내의 엔도플라스민 단편의 발현 수치를 측정하는 단계,
    c) 상기 측정된 엔도플라스민 단편의 발현 수치를 하나 이상의 참조값과 비교하는 단계
    를 포함하고,
    상기 엔도플라스민 단편은 펩티드 서열 SEQ ID-No. 2, SEQ ID-No. 3 또는 SEQ ID-No. 4 중 하나 이상을 포함하고,
    상기 참조값은 건강한 개체들 또는 직장결장선종(colorectal adenoma) 또는 결장직장암종(colorectal carcinoma)에 걸린 개체들의 다수의 분리된 샘플에서 측정된 엔도플라스민 단편의 평균 발현 수치인,
    결장직장선종 또는 결장직장암종 또는 둘 다의 발달(development), 경과(course) 또는 치료(treatment) 중 하나 이상을 모니터링하는 방법으로서, 상기 엔도플라스민 단편의 분자량은 10 내지 14 kDa인 것인, 방법.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엔도플라스민 단편의 분자량은 10.3 kDa인 것인, 방법.
  5. 삭제
  6. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 결장직장선종 또는 결장직장암종 환자로부터 분리된 상기 샘플 재료 내의 상기 엔도플라스민 단편의 발현 수치가 건강한 개체의 샘플 재료에 비해 증가되는 것인, 방법.
  7. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 샘플 재료 내에서 상기 엔도플라스민 단편의 발현 수치의 제 1 증가는 결장직장선종을 나타내고, 상기 제 1 샘플 재료보다 시간상 늦은 지점에서 상기 개체로부터 분리된, 제 2 샘플 재료 내에서 상기 엔도플라스민 단편의 발현 수치의 제 2 증가는 결장직장암종을 나타내는데, 여기서 상기 제 2 증가는 상기 제 1 증가보다 강한 것임을 조건으로 하는, 방법.
  8. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 b)에서 결장직장선종 또는 결장직장암종 또는 둘 다를 검출하기 위한 하나 이상의 추가의 생체표지(biomarker)는 상기 분리된 샘플 재료에서 측정되고 상기 단계 c)에서 상기 측정된 생체표지의 발현 수치는 하나 이상의 각각의 참조값과 비교되는 것인, 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 결장직장선종 또는 결장직장암종 또는 둘 다를 검출하기 위한 상기 추가의 생체표지는
    알파-디펜신(alpha-defensin) 1, 2, 또는 3, 트랜스티레틴(transthyretin), p53, C3a, CEA(암배아 항원(carcinoembryonic antigen)), CA 19-9, CA 15-3, CA-125, 크라스(Kras), β-카테닌(β-Catenin), Her-2/neu, C-반응성 단백질(C-reactive protein) 혈장, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 엔도플라스민 단편의 참조값 및 상기 추가의 생체표지의 참조값은, 각각의 개체군(group of individuals)의 복수의 분리된 샘플 내에서 상기 엔도플라스민 단편 및 추가의 생체표지의 평균 수치로써 계산되며, 여기서 상기 개체군은 건강한 개체, 결장직장선종 환자 또는 결장직장암종 환자 중 하나 이상인 것인, 방법.
  11. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 참조값은, 일정 시간에 걸쳐 상기 개체로부터 분리된 다수의 샘플 재료 내에서 측정된, 엔도플라스민 단편의 평균 수치 및 추가의 생체표지의 평균 수치로써 계산된 개별적인 참조값인 것인, 방법.
  12. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분리된 샘플 재료는 체액(body fluid) 또는 조직이고 상기 체액은 혈액, 혈장, 혈청, 골수(bone marrow), 대변(stool), 관절낭액(synovial fluid), 림프액(lymphatic fluid), 뇌척수액(cerebro spinal fluid), 객담(sputum), 소변(urine), 모유(mother milk), 정액(sperm), 삼출물(exudate) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.
  13. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플 재료 내의 엔도플라스민 단편의 발현 수치 및 추가의 생체표지의 발현 수치는 DNA, mRNA 및 단백질 수준 중 하나 이상에서 측정되는 것인, 방법.
  14. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플 재료 내의 엔도플라스민 단편의 발현 수치 및 추가의 생체표지의 발현 수치는 핵산 교잡법(nucleic acid hybridisation technique), 면역학적 방법(immunological methods), 프로테오믹스(proteomics) 기술 및 질량분석법 중 하나 이상에 의해 측정되는 것인, 방법.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 삭제
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  25. 삭제
  26. a) 화합물로 치료된 결장직장선종 또는 결장직장암종 환자의 분리된 샘플 재료 내에서 엔도플라스민 단편의 발현 수치를 측정하는 단계, 및
    b) 상기 측정된 엔도플라스민 단편의 발현 수치를 하나 이상의 참조값과 비교하는 단계
    를 포함하고,
    상기 엔도플라스민 단편은 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 정의된 것이고,
    상기 참조값은 건강한 개체들 또는 직장결장선종(colorectal adenoma) 또는 결장직장암종(colorectal carcinoma)에 걸린 개체들의 다수의 분리된 샘플에서 측정된 엔도플라스민 단편의 평균 발현 수치이고,
    화합물이 결장직장선종, 결장직장암종 및 특정 종양 단계 중 하나 이상의 치료에 효과적인지 여부를 판단하는 방법.
  27. 청구항 26에 있어서, 상기 단계 a)에서 결장직장선종 또는 결장직장암종의 검출을 위한 하나 이상의 추가의 생체표지는 상기 분리된 샘플 재료에서 측정되고 상기 단계 b)에서 상기 측정된 생체표지의 발현 수치는 하나 이상의 각각의 참조값과 비교되는 것인, 방법.
  28. 청구항 27에 있어서, 상기 하나 이상의 추가의 생체표지는
    알파-디펜신 1, 2, 또는 3, 트랜스티레틴, p53, C3a, CEA(암배아 항원), CA 19-9, CA 15-3, CA-125, 크라스, β-카테닌, Her-2/neu, C-반응성 단백질 혈장 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.
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